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Manual de Prcticas de Biologa Celular

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MANUAL DE PRCTICAS DE

BIOLOGA CELULAR

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CONTENIDO Pgina

I. PRESENTACIN II. PRCTICAS

Prctica 1. Uso correcto del microscopio de campo claro, la iluminacin Koelher

Prctica 2. Estudio al microscopio de clulas vivas

Prctica 3. Conteo celular, uso de la cmara de Neubauer

III. BIBLIOGRAFA IV. ACTUALIZACIN

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Presentacin

En este manual de prcticas para el laboratorio de Biologa Celular se incluyen experimentos y actividades bsicos que por principio debe conocer el estudiante de medicina veterinaria y zootecnia, las cuales se complementan con el programa de estudios de la Unidad de aprendizaje.

La informacin contenida en el presente manual permitir al estudiante vincular los aspectos tericos con las actividades prcticas propuestas. Sin embargo, los temas propuestos corresponden a una pequea parte de la informacin que deber manejar el estudiante en forma prctica, por lo que al transcurrir el tiempo, ser necesario aumentar la propuesta de actividades prcticas.

La biologa celular es una ciencia fundamentada y reconocida como disciplina bsica , que explora los procesos internos de la clula, describiendo todas las estructuras y caractersticas de las clulas (animales, vegetales, y seres unicelulares), las modificaciones en el curso de la vida de las clulas, su diversidad dentro de estos seres o a lo largo del desarrollo embrionario.

Actualmente, la biologa celular, forma parte de los campos ms importantes de la biologa. El estudio de las propiedades de la clula permite comprender el funcionamiento y la constitucin de las estructuras pluricelulares. As, de ser una ciencia descriptiva, la biologa celular se ha transformado en ciencia experimental, con el objetivo esencial de mejorar la comprensin de las estructuras y de los mecanismos a nivel celular y molecular.

De esta manera, los experimentos incluidos estn diseados para realizarse en las instalaciones y con equipos de laboratorio con que cuenta la facultad. Asimismo, la metodologa incluida puede ser abordada por los estudiantes, permitindoles desarrollar sus habilidades en la medida de su propio inters e iniciativa, permitiendo el razonamiento, ya sea en trabajo individual o colectivo.

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Prctica 1. Uso del microscopio de campo claro Iluminacin Koelher Introduccin El estudio de las ciencias biolgicas siempre ha estado acompaado del uso del microscopio; su uso contribuy en la formulacin de la teora celular. Hooke estudi las clulas de la superficie de una hoja, y las paredes celulares del corcho, consideradas por primera vez como unidad del organismo. Durtrochet escribi que todos los tejidos orgnicos estaban formados por clulas globulosas pequesimas de adhesin simple. Schleiden dijo: Todos los organismos estn compuestos de clulas; Virchow dijo: Donde haya una clula, debi haber antes una clula precursora. Los detalles microscpicos de la clula se hicieron evidentes al mejorar el diseo del microscopio, de tal manera que para el siglo XIX se lograron identif icar casi todas las estructuras o componentes de la clula, las cuales actualmente pueden describirse con el uso de diferentes tipos de microscopios; sin embargo, el microscopio de luz es el ms utilizado, permitiendo observar la estructura bsica de la clula. Con el microscopio compuesto, se pudieron apreciar organismos vivos cuya existencia era desconocida para los primeros investigadores. Los microscopios estn formados por tres sistemas fundamentales: 1) el sistema mecnico, que es el sostn de los sistemas complementarios y que permite el ajuste del punto focal y las dioptras; 2) el sistema ptico, que permite magnificar a diferentes grados la muestra observada y 3) el sistema de iluminacin, que permite iluminar y concentrar los haces luminosos en el punto de inters, as como regular la intensidad de la iluminacin. Un aspecto clave para realizar una observacin adecuada es lograr que penetre en la muestra la mayor cantidad de luz; esto se logra al centrar y condensar los haces luminosos provenientes de la lmpara sobre la muestra. Para este fin se utiliza la iluminacin Koelher que como base fundamental est basada en dos diafragmas, un diafragma de campo situado sobre la lmpara y un diafragma de apertura situado debajo del condensador y en el uso de los tornillos para centrar la luz. Objetivos Que el alumno identif ique las partes y los diferentes sistemas que componen a un microscopio de campo claro. Que el alumno realice el ajuste del sistema de iluminacin mediante la tcnica de Koelher. Que el alumno describa diferencias al observar una muestra en el microscopio de campo claro a diferentes aumentos con el sistema de iluminacin no ajustado y con el sistema de iluminacin ajustado segn Koelher.

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Material Microscopio de campo claro Laminilla con cortes histolgicos Preparaciones citolgicas

Mtodo Se utiliza un microscopio de campo claro, que ser previamente revisado por el profesor para desajustar el sistema de iluminacin. Se observarn preparaciones citolgicas (proporcionadas por el profesor) realizadas en portaobjetos. Secuencia de la tcnica de observacin Antes de iniciar las observaciones revisar que el cable de conexin a la energa elctrica se encuentre en buen estado; comprobar que el microscopio se encuentre limpio y se encuentren fijas sus partes. Conectar el cable a la alimentacin elctrica. Colocar la muestra en la platina. Poner la muestra a la distancia focal apropiada para el alumno; se logra observando por los oculares y manipulando los tornillos macromtrico y micromtrico. Utilizar el objetivo de 10X. Identif icar el ocular con el tornillo de ajuste de dioptras (en algunos modelos de microscopios ambos oculares cuentan con tornillo de ajuste de dioptras). Cubrir con un papel el ojo correspondiente al ocular con tornillo de ajuste y ajustar con el tornillo micromtrico a la distancia focal del ojo descubierto. Cubrir con un papel el ojo correspondiente al ocular sin tornillo de ajuste y ajustar la distancia focal con el tornillo de ajuste de dioptras del ocular. Cerrar completamente el diafragma de campo. Ajustar la altura con el tornillo del condensador hasta observar ntidamente el contorno interno del diafragma de campo. Centrar el haz de luz con ayuda de los tornillos del condensador; el rea iluminada quedar al centro del campo visual. Abrir lentamente el diafragma de campo hasta que el rea iluminada cubra el 100% del campo visual. Al cambiar de objetivo debe regularse la profundidad de campo. Esto se logra regulando el diafragma del condensador. Cada estudiante deber realizar el procedimiento descrito y en cada ocasin el profesor responsable deber realizar desajustes a los microscopios. Ciertos modelos de microscopio cuentan con un seguro que impide que la platina con la muestra hagan contacto con los objetivos; sin embargo, otros modelos no cuentan con tal dispositivo, por lo que la platina debe desplazarse hacia el objetivo procurando evitar el contacto. Cuando ocurre contacto, se corre riesgo de que se rompan las preparaciones y se rayen las lentes de los objetivos.

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Precauciones Al preparar frotis de sangre completa deben observarse medidas de bioseguridad bsica como el uso de guantes de ltex. Evitar cambio inadecuado de aumentos con los objetivos, para esta accin deber realizar el movimiento usando el revlver del microscopio. Evitar que el objetivo tenga contacto directo con la muestra Mecanismos de evaluacin Para evaluar el desempeo del estudiante se debe considerar el uso adecuado del microscopio de campo claro, los resultados obtenidos, el respeto al reglamento de laboratorio as como la realizacin de las siguientes actividades: Reporte escrito de la prctica (individual), describir esquemticamente el centrado del sistema de iluminacin en un microscopio de campo claro y complicaciones durante el proceso. Cuestionario. Qu es lo que actualmente definimos como un microscopio? _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Qu es un microscopio simple? _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Cul es la diferencia entre microscopio simple y uno compuesto? ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Menciona las diferencias que observaste al utilizar los lentes de diferente aumento: ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Qu dificultades tendras si al iniciar un trabajo lo hicieras con la lente de mayor aumento? _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

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Cul es la importancia del uso del microscopio en el campo de la biologa celular? _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Por qu se utiliza aceite de inmersin con el objetivo 100X? _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Investigacin complementaria: Concepto de amplificacin Concepto de resolucin Diferencia entre amplificacin y resolucin Como se determina el aumento final de la muestra. En el siguiente esquema coloca el nombre de cada parte del microscopio:

Fuente: http://academic.uprm.edu/~jvelezg/lab4estudiantes.htm

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De qu estructuras est compuesto el sistema mecnico?

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De qu estructuras est compuesto el sistema ptico?

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De qu estructuras est compuesto el sistema de iluminacin?

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Prctica 2. Estudio al microscopio de clulas vivas Introduccin El ojo humano puede distinguir a 25 cm dos objetos separados entre s 0,2 mm. Esto es el poder separador o poder de resolucin del ojo. Sin embargo, las clulas animales suelen medir unos 0,01 mm, por lo que no es posible verlas a simple vista y mucho menos observar detalles estructurales en ellas. El microscopio permite su observacin al aumentar el poder de resolucin del ojo. El microscopio es, para el estudiante de medicina veterinaria y zootecnia, un instrumento muy til para conocer y comprender la estructura de las clulas. En esta prctica el estudiante utilizar el microscopio de campo claro para examinar clulas animales y vegetales. Primero, observar las clulas de un trozo de epidermis de cebolla, tambin observar algunas clulas descamadas de la parte interna de su mejilla. Material Cebolla Caja de cultivo bacteriolgico Microscopio compuesto Portaobjetos Cubreobjetos Agujas Palillos Pipeta o gotero Solucin de lugol Solucin de azul de metileno Aceite de inmersin Papel absorbente Pinzas Palillos de dientes Objetivo Que el alumno identifique las diferencias estructurales entre clulas animales y clulas vegetales. Habilidades y destrezas El alumno demostrar el correcto uso del microscopio de campo claro. Distinguir la estructura de la clula animal y la estructura de la clula vegetal en preparaciones frescas.

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Mtodo 1.- Colocar una gota de agua destilada en el centro de un portaobjetos. Con unas pinzas, desprender la epidermis de la superficie cncava de una capa de la cebolla. La capa epidrmica deber ser transparente. 2.- Colocar en el portaobjetos el trozo de epidermis de cebolla no mayor que el dimetro de la gota de agua. Con agujas o con los palillos, extienda cualquier doblez de la epidermis sin romperla. Coloque un cubreobjetos sobre esa epidermis. NO aplique presin alguna sobre el cubreobjetos. 3.- Con un trozo de papel absorbente, seque el agua que aparezca fuera del cubreobjetos. Nota: La parte superior del cubreobjetos y las lentes del microscopio debern estar, siempre, libres de agua. 4.- Coloque la preparacin sobre la platina del microscopio de campo claro y observarla con objetivos 4X, 10X, 40X y 100X En los espacios de abajo, dibuja como se observa su preparacin en los diferentes objetivos. 5.- Realice otra preparacin hmeda de epidermis de cebolla. Pero ahora coloque en el portaobjetos una gota de solucin colorante, como solucin de lugol o azul de metileno en lugar de la gota de agua. Examine las preparaciones, por separado, obsrvelas con los objetivos 4X, 10X, 40X y 100X y dibuja lo que se observ.

4X

10X

40X

100X

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Notas: ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

4X

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40X

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Preparacin de clula animal 6.- Poner una gota de solucin de azul de metileno o de lugol en el centro de un portaobjetos. Frotar suavemente el interior de su mejilla con un palillo de dientes. No frote hacia atrs y hacia adelante, sino en una sola direccin, separando el palillo despus de cada movimiento (nota: aunque no se vea material en el palillo se habrn colectado muchas clulas). 7.- Separar el material colectado, golpeando suavemente el palillo en la gota de colorante del portaobjetos. Con el palillo, extienda el material en la gota del colorante. 8.- Cubrir la preparacin cuidadosamente con un cubreobjetos y secar la superficie de alrededor. 9.- Colocar la preparacin sobre la platina del microscopio de campo claro y observarla con los objetivos 4X, 10X, 40X y 100X. Dibujar en los espacios de abajo como se observa la preparacin. Modo de evaluacin El desempeo del estudiante se evaluar considerando el uso adecuado del microscopio de campo claro, los resultados obtenidos de las preparaciones de las diferentes clulas, el respeto al reglamento de laboratorio as como la realizacin y entrega de las siguientes actividades: a) Reporte por escrito de la prctica b) Evaluacin de sus observaciones (dibujos)

4X

10X

40X

100X

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Cuestionario: En cul de las preparaciones se observan ms detalles de la estructura celular? ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Por qu se usan colorantes en las preparaciones celulares? ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Por qu la pared celular es ms fcil de observar que las estructuras de las reas internas de la clula? ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Cmo puede distinguirse el citoplasma granular de las vacuolas celulares? ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

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Prctica 3 Conteo celular, uso de la cmara de Neubauer Introduccin En Biologa Celular es comn trabajar en situaciones donde es necesario conocer el nmero de clulas presentes en un volumen dado; por ejemplo, cuando se realizan cultivos celulares se precisa saber cuantas clulas se encuentran en un momento x (t1) con respecto al nmero de clulas que inicialmente se sembraron (t0), o cuando se requiere que un determinado nmero de clulas sean expuestas a tratamientos distintos y ver sus efecto. Otro ejemplo es cuando se aplica en reproduccin de animales y se desea saber cuntos espermatozoides hay en los eyaculados. En tales casos se requiere de un instrumento que permita contar directamente, o bien, calcular la concentracin celular en un medio. Para resolver el problema de conteo celular, se ha optado, en algunos casos por calibrar sistemas espectrofotomtricos, cuyo fundamento se finca en las propiedades de absorcin de la luz por parte de las clulas; sin embargo, tales sistemas son poco exactos y los resultados que se obtienen son difciles de repetir. Una alternativa a este problema es contar directamente el nmero de clulas presentes en un volumen conocido; esto puede ser un trabajo agobiante si consideramos, por ejemplo, a las clulas procariontes que miden generalmente menos de 10 micras (>1X10-6 metros o 1X10-3 milmetros o bien 0.010 milmetros) y por lo tanto se pueden encontrar muchas en un volumen muy pequeo. No obstante, se cuenta con la cmara de Neubauer, la cual es un instrumento muy til que permite contar clulas de distintos tamaos. El hemocitmetro tiene la apariencia de un portaobjetos grueso, que en una cara tiene una placa muy delgada de metal, la cual se encuentra grabada con un par de cuadriculas muy finas y de medidas definidas (Figura 1). Esta cmara cuenta tambin con un par de muescas que permiten colocar la muestra a analizar en dos compartimientos. Por ltimo, la cmara de Neubauer se complementa con un cubreobjetos cuyo grosor es mayor, tambin, que el de los cubreobjetos convencionales. La altura entre el portaobjetos y el cubreobjetos se encuentra definida, as como el rea de la cuadricula en el portaobjetos; por lo tanto, es posible calcular el volumen contenido en cada compartimiento de la cmara de Neubauer. De esta manera, es posible conocer el volumen de muestra celular que se coloca en la cmara, ahora solo resta conocer el nmero de clulas presentes en ese volumen. Ver la Nota 1. Objetivos

Que el estudiante conozca y realice un conteo celular con el uso correcto de una cmara de Neubauer Que el dicente realice los clculos necesarios para estimar el nmero celular de una suspensin celular

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Habilidades y destrezas Uso correcto de la cmara de Neubauer Calculo correcto del nmero de clulas presentes en distintas diluciones de una suspensin celular Material Microscopio de campo claro Cmara deNeubauer Cubreobjetos Agua destilada Micropipeta 250 l Mtodo Diluir en 100 mL de agua destilada un gramo de levadura seca comercial. Agitar hasta que la muestra se vea homognea. Pipetear 100 l de la muestra celular con una micropipeta y colocar en una muesca de la cmara de Neubauer y permitir que la suspensin ingrese a la cmara por capilaridad. Evitar que se formen burbujas. Colocar la cmara en la platina de un microscopio de campo claro con iluminacin Kohler y utilizar el objetivo de 10X para localizar el cuadro central de la cmara. La cuadrcula que se utiliza como gua para el conteo es la e 0,2 X 0,2 mm. Tener cuidado de no contar dos veces la misma clula. Para conocer el nmero de clulas en la muestra original realizar el siguiente clculo: A X B X C Donde A= Clulas en la cmara B= Factor de dilucin C= Factor de correccin (proporcionado por el fabricante de la cmara) Considerar: Que el rea central de la cmara es de 1mm2. Esta rea est subdividida en 25 cuadrados pequeos (1/25 mm2); cada uno de los cuales est delimitado por lneas triples y con una subdivisin de 16 (1/400 mm2). Que generalmente la cmara tiene una profundidad de 0,1 mm. El factor de correccin de 104 convierte 0,1 mm3 a 1 mL (0,1 mm3 = 1 mm2 X 0,1). Mecanismos de evaluacin Para evaluar el desempeo del estudiante se debe considerar el uso adecuado del equipo de laboratorio, los resultados obtenidos, el respeto al reglamento de laboratorio as como la realizacin de las siguientes actividades:

1) Reporte escritos de la prctica 2) Bsqueda de dos artculos cientficos en donde se utilice la cmara de Neubauer 3) Problema: en una cmara de Neubauer se contaron 167 y 186 espermatozoides de una

suspensin celular diluida 1:25. Pregunta: Cul es el nmero de espermatozoides/mL en la suspensin original?

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Nota 1. La altura entre el portaobjetos y el cubreobjetos puede cambiar en funcin del fabricante; por lo tanto, tambin puede variar el volumen de la muestra contenida en los compartimientos de la cmara. Lo anterior tiene dos implicaciones: 1) los clculos que deben realizar para conocer el nmero de clulas presentes en una muestra sern distintos en funcin del fabricante de la cmara, y 2) siempre se deber citar al fabricante de la cmara y de ser posible tambin el modelo, con objeto de dar a conocer las condiciones exactas del trabajo realizado. Bibliografa

Jimnez L F y Merchant H.: Biologa Celular y Molecular. Prentice Hall. 2003. Mxico

Karp G.: Biologa Celular y Molecular. McGraw-Hill Interamericana. 1996. Mxico

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IV. ANEXOS Sin anexos V. ACTUALIZACIN Manual de Prcticas de Laboratorio de Biologa Celular. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Autnoma del Estado de Mxico. Toluca, estado de Mxico; 27 de mayo de 2013. Primera Edicin FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA Director: Dr. en C. Jos Mauro Victoria Mora Elabor: M en C. Luis Fernando Vega Castillo Dr. Csar Ortega Santana Revis: Dr. Rafael Cano Torres Dr. Ral Cuauhtmoc Fajardo Muoz