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“Desarrollo de una tecnología para el

control biológico de enfermedades de

implantación en leguminosas forrajeras”

Diciembre, 2004

Lic. Leticia QuagliottoLic. Gastón AzzizMSc. Natalia BajsaDra. Alicia AriasInstituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable

Ing. Agr. Carlos PérezIng.Agr. Fernando DucampIng. Agr. Mónica CadenazziEEMAC, Facultad de Agronomía, UdelaR Ing. Agr. Nora AltierTec. Agr. Alfredo FernándezINIA Las Brujas

Ejecutado por el Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable (IIBCE) y La Facultad deAgronomía, en el marco del Programa de Servicios Agropecuarios 1131-OC-UR (BID-MGAP-INIA),financiado por la Línea de Investigación Aplicada que administra el Instituto Nacional deInvestigación Agropecuaria (INIA).

Desarrollo de una tecnología para el control biológico de enfermedades de implantación en leguminosas forrajeras

LÍNEA DE INVESTIGACIÓN APLICADA (LIA-028)

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INDICE

Prólogo

Introducción

Antecedentes

Objetivo

Metodología y resultados

? Microorganismos utilizados

? Ensayos de campo

? Estudios en Alfalfa bajo condiciones controladas

? Desarrollo de un inoculante en base a Pseudomonas

Conclusiones

Anexos



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PROLOGO

Las leguminosas forrajeras cumplen un rol esencial en la productividad y sustentabilidad

bioeconómica de los sistemas de producción agropecuarios del Uruguay. La etapa del

establecimiento de estas especies es crítica para capitalizar las ventajas que ofrecen. Entre los

factores que limitan la productividad de las leguminosas, las enfermedades de implantación

causadas por hongos de suelo del género Pythium spp., ocupan un lugar importante.

Frecuentemente, provocan fallas en la emergencia y muerte de plántulas post-emergencia,

reduciendo el stand inicial de la pastura.

El empleo de pesticidas químicos no es una práctica común para el manejo de enfermedades en

especies forrajeras, debido a los efectos adversos sobre el medio ambiente, la salud animal y la

calidad de los alimentos de consumo humano. En los últimos años se ha prestado especial

atención al estudio de nuevas tecnologías que posibiliten el uso de prácticas de producción

sustentables, dirigidas hacia la explotación racional de los recursos naturales y tendientes a

reducir el uso de agroquímicos. En este contexto, el uso de bacterias nativas biocontroladoras es

una alternativa promisoria para el manejo de las enfermedades de implantación. Algunos

microorganismos rizosféricos tales como Pseudomonas pueden ser fácilmente aplicados a las

semillas con la tecnología existente para rizobio y actuar, así mismo, como promotores del

crecimiento vegetal.



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A partir de 1993, se consolidó una línea de trabajo multidisciplinaria, resultado de la conjunción

de esfuerzos de tres equipos de investigación: el Laboratorio de Ecología Microbiana del IIBCE,

con larga experiencia en el estudio de microorganismos promotores del crecimiento de

leguminosas forrajeras, la EEMAC (Facultad de Agronomía, UdelaR), y el Programa Nacional de

Plantas Forrajeras (Protección Vegetal – Fitopatología) de INIA, el cual ha sido responsable del

relevamiento de las enfermedades que afectan a nuestras pasturas y referente en el ámbito

nacional en dicha área de investigación. La colaboración entre estos equipos se ha afirmado a

través de una alianza estratégica que combina las capacidades y el soporte institucional del IIBCE,

Facultad de Agronomía e INIA, en cuanto a recursos humanos, infraestructura, materiales y

equipamiento disponible. La coordinación de actividades en diversos ámbitos ha fortalecido la

ejecutividad de diversos proyectos científicos y ha aportado un sólido contexto interinstitucional.

En una primer etapa, se realizó un relevamiento de Pseudomonas fluorescentes nativas presentes

en la rizósfera de plantas sanas de lotus, colectadas en diversas regiones agro-ecológicas del país.

Este trabajo llevó a la selección de tres cepas de Pseudomonas fluorescens (UP61, UP143 y

UP148) con capacidad de protección de enfermedad in vivo, en condiciones controladas.

La validación agronómica en una red de ensayos de campo, mediante la evaluación de la

efectividad de control de dichas cepas en lotus y en alfalfa, representa la etapa final para la

implementación práctica de esta alternativa tecnológica. Conjuntamente, se requiere el

desarrollo y ajuste de una formulación adecuada, compatible con la inoculación de rizobio. Con

estos objetivos, se propuso la ejecución del proyecto “Desarrollo de una tecnología para el



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control biológico de enfermedades de implantación en leguminosas forrajeras”, con financiación

BID-LIA. El mismo, además, contó con el apoyo de las empresas productoras de inoculantes de

rizobio ENZUR S.A, Calister S.A., y Lage & Cía. S.A.

Esperamos que los resultados del proyecto, presentados en esta publicación, resulten un aporte

de interés y provecho para el mejor manejo y utilización de las leguminosas forrajeras.

Ing. Agr. (M.Sc.) Diego F. Risso Ing. Agr. (Ph.D.) Nora Altier

Jefe Programa Nal. Plantas Forrajeras Fitopatología, Programa Nal. Plantas Forr



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INTRODUCCIÓN

Las leguminosas forrajeras juegan un papel importante en la producción agropecuaria de

nuestro país, constituyendo una fuente de alimento de alta calidad para el ganado. Su capacidad

de fijar nitrógeno en asociación simbiótica con rizobio les confiere la ventaja adicional de

suministrar este nutriente al suelo para ser utilizado por otras especies del tapiz o por cultivos

siguientes en la rotación.

Uno de los problemas en el uso de estas pasturas son las pérdidas debidas a enfermedades

de implantación ocasionadas por hongos fitopatógenos. La eficacia de varios agroquímicos,

especialmente para el tratamiento de semillas, ha sido evaluada en el control del damping-off de

leguminosas (Falloon and Skipp, 1982). Entre ellos está el metalaxil, fungicida sistémico activo

contra hongos del grupo de los oomicetes que incluye a Pythium spp. (Margot, 1983). Dicho

fungicida, en su formulación comercial Apron (Novartis), se aplica aproximadamente a un 50% de

la semilla de alfalfa comercializada en Estados Unidos, para la protección del damping-off

causado por Pythium y Phytophthora spp. (Leath et al, 1996). Sin embargo, la eficacia de esta

forma de control no es total, ya que existe variabilidad en la sensibilidad al metalaxil y se han

descripto cepas de Pythium resistentes al mismo (Cook and Zhang, 1985; Sanders, 1984).

En los sistemas de producción de pasturas corrientemente usados, el empleo de pesticidas

químicos está limitado por el costo de aplicación y los probables efectos adversos sobre el



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ambiente, la salud animal y la calidad de los alimentos de consumo humano. Además, se ha

demostrado que el uso de otros pesticidas para el tratamiento de semillas de leguminosas

forrajeras tiene un efecto perjudicial sobre Rhizobium, afectando la fijación biológica de

nitrógeno (Altier y Pastorini, 1988).

La resistencia genética de la planta huésped podría ofrecer una alternativa de control de

enfermedades efectiva, económica e inocua para el medio ambiente. Sin embargo, hasta el

momento, no hay cultivares de leguminosas con mayor resistencia comercialmente disponibles.

En los últimos años se ha prestado especial atención al estudio de nuevas tecnologías que

posibiliten el uso de prácticas de producción sustentables, dirigidas hacia la explotación racional

de los recursos naturales y tendiendo a reducir el uso de pesticidas sintéticos.

El control biológico de enfermedades de las plantas puede ser usado, dentro de un programa

de manejo integrado de pestes, como una alternativa que ofrece las características citadas

anteriormente. Varios géneros de bacterias y hongos han sido descriptos como antagonistas y

usados para el control biológico de patógenos de plantas. Actualmente diferentes agentes de

biocontrol están comercialmente disponibles y registrados en la Biopesticide and Pollution

Prevention Division de la Environmental Protection Agency, EE.UU (Ristaino y Thomas, 1997).

Entre las bacterias rizosféricas capaces de controlar microorganismos patógenos del suelo, el

género Pseudomonas es uno de los más promisorios (O'Sullivan y O'Gara, 1992). Estas bacterias son



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capaces de controlar diferentes géneros de hongos fitopatógenos tales como Pythium (Loper,

1988), Rhizoctonia (Howell y Stipanovic, 1979), Fusarium (Leath et al., 1989), y Gaeumannomyces

(Thomashow y Weller, 1988).

La investigación sobre el uso de microorganismos rizosféricos para el control de patógenos del

suelo en leguminosas es escasa (Kraft y Papavizas, 1983; Parke et al., 1991). La investigación en

leguminosas forrajeras es aun más escasa, si bien ha sido recomendada (Marten et al., 1989). Se

ha descripto el uso de Bacillus (Handelsman et al., 1990), Streptomyces (Jones y Samac, 1996) y

Pseudomonas (Orlandini y Signorini, 1993) para alfalfa.

El control biológico de patógenos del suelo en leguminosas se presentaría como una

alternativa válida en un sistema de control integrado por las siguientes razones: a) los

antagonistas pueden ser fácilmente aplicados a las semillas con la tecnología existente para

rizobio, siendo introducidos directamente en la zona de infección potencial, b) en la mayor parte

de los casos la protección es necesaria por un tiempo corto hasta que la planta desarrolla

defensas contra los patógenos causantes del damping-off.



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ANTECEDENTES

En 1993, el Laboratorio de Ecología Microbiana del IIBCE, en colaboración con INIA-La de

plantas sanas de Lotus corniculatus. Este trabajo llevó a la selección de tres cepas de

Pseudomonas fluorescens (UP61, UP143 y UP148) capaces de proteger in vivo, en condiciones

controladas, a plantas de L. corniculatus de la infección causada por Pythium ultimum y

Rhizoctonia solani (Bagnasco et al., 1998). Estas cepas presentan un amplio rango de antagonismo

in vitro frente a bacterias y otros hongos fitopatógenos. Se ha realizado el estudio de los

metabolitos implicados en su actividad antagónica. Todas las cepas producen HCN y sideróforos, y

la producción de otros factores antimicrobianos por dos de ellas fue demostrada por HPLC, NMR y

espectrometría de masas. P. fluorescens UP148 produce un compuesto antifúngico derivado de la

fenacina no descripto anteriormente. La participación de este compuesto en su acción

biocontroladora fue demostrada por la obtención de mutantes con capacidad reducida para su

producción, las cuales eran incapaces de proteger a L. corniculatus de la infección causada por

Pythium (Bagnasco, 1997). P. fluorescens UP61 produce tres compuestos antifúngicos: 2,4-

diacetilfloroglucinol, pioluteorina y pirrolnitrina y la presencia de los genes responsables de su

biosíntesis ha sido demostrada por PCR (De La Fuente et al., 2004). Este tipo de bacterias

productoras de múltiples antibióticos han sido ampliamente estudiadas a nivel mundial, ya que

esta característica les confiere la capacidad de antagonizar diferentes patógenos (Keel et. al,

1996).



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Ensayos de inoculación simultánea de semillas de L. corniculatus, alfalfa o trébol blanco con

cepas de Pseudomonas y de inoculantes comerciales específicos mostraron que la eficiencia de la

fijación biológica de nitrógeno, la cinética de nodulación, y la colonización no se ven afectadas

(Bagnasco et al., 1998; De La Fuente et al., 2002). Se demostró además la posibilidad de usar

turba estéril como vehículo para la inoculación de Pseudomonas fluorescentes en semillas de L.

corniculatus.

Resultados anteriores de ensayos de campo realizados en la EEMAC (Fac. de Agronomía)

indicaron que la inoculación de semilla de L. corniculatus con Pseudomonas permite lograr un

mayor número de plantas por área sembrada y un mayor peso seco por planta, resultando en un

mayor rendimiento de materia seca por área respecto a un testigo sin inocular (Pérez et al.,

2001). Estos resultados muestran el potencial de estas cepas para ser usadas como agentes de

biocontrol del damping-off producido por Pythium spp. en leguminosas forrajeras.

La alfalfa (Medicago sativa), es un cultivo importante en Uruguay, con un constante

aumento en el área sembrada en los últimos años, debido a sus características únicas: alto

rendimiento de forraje de calidad, tolerancia a déficit hídrico y buena persistencia. La etapa del

establecimiento del cultivo es crítica para lograr y capitalizar las ventajas que ofrece esta

forrajera. Frecuentemente se observan fallas en la emergencia asociadas a infecciones causadas

por Pythium spp. Por esta razón, se utilizan altas densidades de siembra, que aumentan

considerablemente los costos de implantación, si se tiene en cuenta además el alto precio de la

semilla de alfalfa. La posibilidad de extender al cultivo de alfalfa el uso de cepas de Pseudomonas



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fluorescentes ya caracterizadas, efectivas en el biocontrol del damping-off en L. corniculatus en

condiciones controladas, se presenta como una alternativa promisoria, en el marco de un sistema

de manejo integrado.



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OBJETIVO

Nuestra propuesta intenta resolver problemas sanitarios que afectan la implantación de las

principales leguminosas forrajeras en nuestro país. Las enfermedades producidas por hongos del

suelo tienen un severo impacto en la germinación y el desarrollo de las plántulas. En este

proyecto se propone el uso de una tecnología innovadora, alternativa al uso de agroquímicos y no

agresiva para el medio ambiente, como lo es el control biológico. Más aún, dada la amplia

adopción del uso de inoculantes en nuestro país, esta tecnología podrá ser rápidamente aplicada

por los productores agropecuarios.

El fin buscado por las investigaciones en biotecnología agrícola es la implementación de

productos que puedan ser utilizados para mejorar la producción. Por esto es necesario conocer

cómo se comporta el sistema en estudio en condiciones naturales. Para ello es fundamental tener

datos consistentes de ensayos en campo, en los que se somete a las plantas a la infección natural

causada por los patógenos presentes en el suelo. Esta etapa es necesaria para consolidar los

resultados obtenidos en condiciones controladas y validar la implementación práctica del control

biológico. En este sentido hay que tener en cuenta que en el campo actúan muchos factores de

manera compleja que dan origen a muy alta variabilidad. Se necesita estimar no sólo la magnitud

de las respuestas sino la repetibilidad/frecuencia de las mismas.



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Sin embargo, que un agente de biocontrol sea efectivo en condiciones controladas y en

ensayos de campo, no asegura un producto final exitoso: éste debe ser formulado para satisfacer

los requerimientos del mercado. Esta formulación debe ser compatible con las necesidades del

microorganismo y las prácticas agrícolas regulares. Los agentes biocontroladores propuestos

producen factores antimicrobianos y es necesario establecer cuáles son las concentraciones de

estos compuestos compatibles con rizobio. Su cuantificación por HPLC, es una etapa fundamental

para asegurar la calidad del inoculante. Estos análisis son realizados habitualmente en los

procesos de producción de inoculantes para control biológico y deben ser implementados para

cada sistema.



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OBJETIVO GENERAL

Mejorar el establecimiento de leguminosas forrajeras reduciendo las enfermedades de

implantación causadas por Pythium spp. mediante el uso de Pseudomonas fluorescentes nativas

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

? Evaluar en ensayos de campo la efectividad de tres cepas de Pseudomonas seleccionadas para

el control de enfermedades de implantación en L. corniculatus.

? Desarrollar un inoculante en base a Pseudomonas.

? Validar en el sistema alfalfa-Pythium la efectividad de cepas nativas de Pseudomonas

fluorescentes que presentan actividad biocontroladora en el sistema L. corniculatus-Pythium.



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METODOLOGÍA Y RESULTADOS

MICROORGANISMOS UTILIZADOS

Los microorganismos utilizados en este trabajo se describen en la Tabla 1. Los medios utilizadospara su crecimiento fueron: King's B (KB; King et al., 1954), Pigment Producing Médium (PPM;Rosales et al., 1995) y medio mínimo (MMPs; Loper, 1988) para Pseudomonas. Las diferentesespecies de rizobio fueron cultivadas en Tryptone Yeast Extract (TY; Beringer, 1974). Los ensayosen tubos con plantas se realizaron en medio Jensen (Vincent, 1970). En los casoscorrespondientes, los antibióticos rifampicina (Rif), kanamicina (Km) y benomyl (Ben) fueronadicionados luego de la esterilización.



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Tabla 1 - Microorganismos utilizados

Cepa Características Fuente/Referencia

Pseudomonas fluorescens

UP61.2 Mutante espontánea de UP61 Rifr (1) LEM, IIBCE



Mesorhizobium loti

U62M Mutante espontánea de B816 Kmr Rifr (1) LEM, IIBCE

Sinorhizobium meliloti

MCH3 Cepa comercial usada como inoculantepara alfalfa(2) MGAP

LP21 Cepa comercial usada como inoculantepara alfalfa(2) MGAP

M10 Mutante espontánea de MCH3 Kmr Rifr (1) LEM, IIBCE

L5 Mutante espontánea de LP21 Kmr Rifr (1) LEM, IIBCE

1Cepas resistentes a Rifampicina (Rif) y/o kanamicina (Km); 2Laboratorio de Microbiología deSuelos y Control de Inoculantes. Ministerio de Ganadería, Agricultura y Pesca, Uruguay.



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ENSAYOS EN CAMPO

Con el objeto de evaluar en ensayos de campo la efectividad de tres cepas de Pseudomonasfluorescens para controlar enfermedades de implantación en L. corniculatus o M. sativa, seinstalaron 20 ensayos, entre los años 2000 y 2003, en la Estación Experimental Mario A. Cassinoni,Facultad de Agronomía, Paysandú, y en la Estación Experimental del INIA - Las Brujas.

Los tratamientos probados para cada especie vegetal se describen a continuación:

? Testigo (rizobio específico)? Fungicida (rizobio específico + curasemilla)? UP61 (rizobio específico + P. fluorescens UP61.2)? UP143 (rizobio específico + P. fluorescens UP143.8)? UP148 (rizobio específico + P. fluorescens UP148.2)

Las semillas fueron inoculadas utilizando derivados de las bacterias previamente seleccionadospor resistencia espontánea a los antibióticos rifampicina (Rif) y kanamicina (Km).



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Las cepas de Pseudomonas fueron crecidas en placas de medio KB y los rizobios específicos (M.loti U62M o S. meliloti MCH3 y LP21 para L. corniculatus o alfalfa, respectivamente) en TY. Seutilizó metilcelulosa para adherir las bacterias a las semillas.

? Recuento de bacterias en semillasPara tener una idea aproximada de la población rizosférica inicial en los ensayos instalados en elcampo, se cuantificó el inóculo bacteriano adherido a las semillas. Se colocaron semillasbacterizadas en suero fisiológico estéril y se agitó vigorosamente (en Vortex) para desprender lasbacterias. Posteriormente se realizaron diluciones seriadas y alícuotas de éstas se sembraron enlos respectivos medios de cultivo selectivos para Pseudomonas y rizobio. Se contó el número decolonias características en cada placa y se determinó el número de unidades formadoras decolonia (UFC) por semilla para cada tratamiento. La tabla 2 muestra que los valores oscilaronentre 104 y 107 UFC/semilla.

Tabla 2: Resultado de los conteos bacterianos por semilla de L. corniculatus y alfalfa

UFC de P.fluorescens por semilla UFC de rizobio por semilla

Especie Trats. 2001 2002 2003 2001 2002 2003

UP61.2+ M* 6.2 x 106 1.9 x 107 1.8 x 107 7.0 x 105 2.2 x 105 7.7 x 106

UP143.8+M* 1.9 x 106 4.6 x 106 5.6 x 107 5.2 x 104 2.2 x 106 3.0 x 107

UP148.2+M* 2.8 x 104 8.8 x 106 3.0 x 107 2.5 x 104 1.1 x 106 1.9 x 107

L.corniculatus

M * - - - 1.2 x 103 2.4 x 106 2.1 x 107

UP61.2+ M* 7.7 X 107 4.3 x 107 8.2 x 107 4.5 X 106 4.0 x 105 9.1 x 106

UP143.8+M* 2.7 X 107 3.7 x 106 2.0 x 107 1.8 X 106 3.8 x 105 1.0 x 107

UP148.2+M* 4.0 X 106 5.3 x 108 2.9 x 107 2.7 X 106 3.3 x 105 1.5 x 107Alfalfa

M * - - - 1.4 X 106 4.6 x 105 1.0 x 107

* M: mezcla de mutantes espontáneas resistentes a Km y Rif



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? Instalación de los ensayos de campo

Los ensayos se sembraron en 2, 3 o 4 épocas por año en cada localidad (Tabla 3).Se consideró un ensayo (o ambiente) a cada época de siembra, en una localidad y en un añoespecífico.

El fungicida curasemillas utilizado fue metalaxil (producto comercial Apron), a una dosis de 3 g deingrediente activo por kg de semilla.

El diseño experimental utilizado consistió en bloques completos al azar (BCA) con 9 repeticiones.La unidad experimental consistió en 100 semillas viables de L. corniculatus o alfalfa sembradas en1 m lineal.

Fotografías correspondientes a los ensayos en campo de Lotus y alfalfarealizados entre los años 2000 y 2003 en las Estaciones ExperimentalesMario A. Cassinoni (Facultad de Agronomía, Paysandú) y Las Brujas (INIA,Canelones).



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Tabla 3. Fechas de siembra de L. corniculatus y alfalfa según año y localidad.

Año Localidad Época 1 Época 2 Época 3 Época 4Colonia 4 jul. 25 jul. ---- ----

2000Paysandú 4 jul. 28 jul. ---- ----

2001 Paysandú 8 jul. 26 jul. 4 ago. 12 ago.-16 set.

Canelones 13 jun. 20 jun. 26 jun. ----2002

Paysandú 14 jun. 26 jun. 17 jul. ----Canelones 11 jul. 12 jul. 22 jul. ----2003Paysandú 30 jun. 7 jul. 14-16 jul. ----

Se determinó el número de plántulas presentes y la producción de materia seca total de cadaunidad experimental, en los 20 ambientes y para las dos especies vegetales.

Estas variables determinadas a campo permitieron estimar otras: a) tasa diaria de crecimiento departe aérea al corte, b) tasa diaria de crecimiento de parte aérea a la cosecha, c) producción demateria seca total por planta a la cosecha, d) producción de materia seca de parte aérea porplanta a la cosecha

Además, para cada una de estas variables medidas y estimadas (total 10 variables), se generaronvariables en base 100, tomadas como incrementos porcentuales de cada tratamiento frente altestigo respectivo.

Esta amplia matriz de datos permitió ajustar la metodología periódicamente, de manera tal dedefinir las determinaciones a realizar, las variables a evaluar y estimar, y el análisis estadístico arealizar para dichas variables.

El mismo se realizó a dos niveles: análisis individual por experimento y análisis conjunto segúnuna serie de experimentos, combinando los ambientes y los tratamientos. Por ambiente seentiende la combinación de años x localidades x épocas de siembra.



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bbbc

a

0

20

40

60

80

100

120

140

Testigo

Fungicida

UP61

UP143

UP148

TratamientosBase 100 = 63 CV =

La media fue estimada de acuerdo al siguiente modelo:

,

considerando el efecto bloque anidado en ambiente, el efecto ambiente, el efecto tratamiento,el efecto interacción ambiente x tratamiento y el efecto error experimental. Dicho modelo fueanalizado mediante el procedimiento MIXED y el Modelo Lineal General (GLM) del SAS Institute.

Una vez realizado el análisis de todas las variables, a efectos de caracterizar los tratamientos, seseleccionaron tres: implantación a los 44 días post-siembra (base 100), producción de forraje alcorte (base 100) y producción de forraje a la cosecha (base 100). Las medias de los tratamientosfueron separadas usando Mínima Diferencia Significativa (LSD) de Fisher protegida (p<0.05).

EFECTO PROTECTOR DEL DAMPING-OFF

Para evaluar el efecto protector de las cepas de P. fluorescens inoculadas a las semillas, sedeterminó la evolución de la implantación (figuras 1 y 2) mediante el recuento de plántulas porunidad experimental cada 7 días, desde la emergencia hasta que se estabilizó el número deplántulas presentes (a excepción del año 2003, en el cual los conteos se realizaron cada 15 días).

Figura 1: Implantación promedio (%) de L. corniculatus (izq.) y alfalfa (der.) a 44 días de lasiembra. Letras diferentes indican diferencias significativas (p<0.05).

a

cb b b

0

20

40

60

80

100

120

140

Testigo Fungicida UP61 UP143 UP148

TratamientosBase 100 = 62pl/m

CV = 23.8



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Los resultados mostraron que los tratamientos que incluyeron las cepas de P. fluorescens tuvieronun comportamiento intermedio, presentando mayor número de plantas establecidas a los 44 díaspost-siembra respecto al testigo, y menor que en el tratamiento con fungicida (p<0.0001).

Esto evidencia el efecto protector de enfermedad de las cepas de P. fluorescens utilizadas, en laimplantación de L. corniculatus o alfalfa en las condiciones experimentales.

Sin embargo, no en todos los ensayos se verificaron las condiciones necesarias para la ocurrenciade enfermedad (ver Anexo: Registros climáticos registrados y su relación con el desarrollo de laenfermedad).

Figura 2: Porcentaje de implantación de L. corniculatus (izq.) y alfalfa (der.) a 44 días de la siembra, enfunción de la implantación media por ambiente para cada ensayo.

La figura 2 muestra que existió una variación importante en cuanto a las implantacionesalcanzadas en los ensayos.

Los bajos valores obtenidos en ambientes con una implantación en el entorno de 20-25 %indicarían la existencia de limitantes que no guardan relación con la ocurrencia de enfermedades.

0

20

40

60

80

100

120

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

I m p l a n t a c i ó n m e d i a p o r a m b i e n t e

Testigo Fungicida C61 C143 C148

0102030405060708090

100

20 30 40 50 60 70 80 90Implantación media por ambiente

Imp

lan

taci

ón

(%)




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En estos casos, si bien el tratamiento con fungicida superó a los restantes en la implantaciónlograda, los valores alcanzados son muy bajos para lograr un buen establecimiento de la pastura.

En otro sentido, la implantación media obtenida en otros ambientes fue superior al 80 %. Esto esindicador de una combinación de factores adecuada para lograr un buen establecimiento de lapastura.

En estos dos tipos de situaciones no sería necesario recurrir al uso de medidas de protección. Enel primer caso, porque la restricción existente es ajena a la problemática sanitaria, y en elsegundo, porque el nivel de implantación es alto, independientemente de los tratamientosaplicados.

Por otra parte, también se observaron algunos ambientes con valores promedio de implantaciónentre 40 y 70 %. En estos casos se justifica la aplicación de medidas de protección, tales comofungicidas curasemillas o agentes de biocontrol, que permitirían lograr un stand de plantas que nolimite el potencial productivo de la pastura.

EFECTO PROMOTOR DEL CRECIMIENTO

Con el objeto de estudiar el efecto promotor del crecimiento por las cepas de Pseudomonas, encada uno de los ensayos instalados se realizó un corte de la parte aérea (Tabla 4) y se determinóproducción de materia seca (figura 3).



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Tabla 4. Fechas de corte para cada año* y localidad.

Especie Año Localidad Época 1 Época 2 Época 3 Época 4

Colonia 8 nov. 8 nov. ---- ----2000Paysandú 25 oct. 25 oct. ---- ----

2001 Paysandú 22 oct. 10 nov. 11 nov. 18 nov.Canelones 14-15 nov. 18-20 nov. 25-28 nov. ----

Lotus corniculatus

2002 Paysandú 25 oct. 6 nov. 13 nov. ----

Colonia 25 oct. 25 oct. ----2000

Paysandú 25 oct. 25 oct. ----

2001 Paysandú 20 oct. 10 nov. 11 nov.Canelones 29 oct. 31 oct. 5 nov.

Alfalfa

2002Paysandú 23 oct. 5 nov. 12 nov.

? en 2003 no se realizó corte.

Figura 3: Producción de forraje de L. corniculatus (izq.) y alfalfa (der.) al corte. Letras diferentes indicandiferencias significativas (p<0.05).

ac

ab bc b

0

20

40

60

80

100

120

140


Tratamientos

Pro

ducc

ión

de f

orra

je(b

ase

100)

Base 100 = 106 g MS/m lineal CV = 27.3

bbbba

0

20

40

60

80

100

120

140


Tratamientos

Pro

du

cció

n d

e fo

rraj

e(b

ase

100)

Base 100 = 81 g MS/m linealCV = 32.3



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La figura 3 (izq.) muestra que la mayor producción de forraje de L. corniculatus al momento delcorte correspondió al tratamiento con fungicida. De los tratamientos con P. fluorescens, elinoculado con la cepa UP143 logró una producción de forraje similar al tratamiento con fungicida.Cabe destacar que, aunque ambos tratamientos tuvieron la misma producción de forraje al corte,el número de plantas a los 44 días post-siembra fue mayor con el uso de fungicida. Esto indicaríacierto efecto promotor del crecimiento por parte de la cepa UP143, ya que con menor número deplantas igualó la producción de forraje del fungicida.Todos los tratamientos inoculados con Pseudomonas superaron la producción de forraje conrespecto al testigo (aunque sólo en el caso de UP61, no significativamente).

En alfalfa (figura 3 der.) se aprecia un significativo aumento en la producción de forraje al cortede todos los tratamientos con respecto al testigo. El tratamiento con fungicida presentó unaproducción de forraje igual a la obtenida en los tratamientos con uso de Pseudomonas, mientrasque el número de plantas del mismo fue superior al de estos últimos (figura 1 der.). Esto indicaríaun cierto efecto promotor de las cepas utilizadas.

Dado que no se espera un efecto promotor del crecimiento vegetal por parte del fungicida, lamayor producción de forraje en este tratamiento se debe a un mayor número de plantas.

Posteriormente, se cosecharon los ensayos (Tabla 5) determinándose el número final de plantas yla producción de materia seca (figura 4).



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Tabla 5. Fechas de cosecha para cada año y localidad.

Especie Año Localidad Época 1 Época 2 Época 3 Época4

2000 Colonia 12 dic. 14 dic. ---- ----Paysandú 13 dic. 13 dic. ---- ----

2001 Paysandú 11 dic. 14 dic. 22 dic. ----

2002 Canelones22-24 en.

2003 27-29 en. 2003 3-5 feb. 2003 ----

Paysandú 2-27 en. 2003 21-23 en. 2003 9-21 en. 2003 ----

Lotuscorniculatus

2003 Canelones 29 oct. 3 nov. 27 nov. ----

Paysandú 15 nov. 23 nov. 30 nov. ----

2000 Colonia 27 nov. 27 nov. ----Paysandú 21 nov. 7 dic. ----

2001 Paysandú 5 dic. 14 dic. 22 dic.

2002 Canelones 12-20 dic.23 dic. 2002 - 7 en.

200310-17 en.

2003Paysandú 24-27 dic. 30-31 dic. 20 dic.

2003 Canelones 22 oct. 25 oct. 8 nov.

Alfalfa

Paysandú ---- ---- ----

Figura 4: Producción de forraje de L. corniculatus (izq.) y alfalfa (der.) a la cosecha del ensayo. Letrasdiferentes indican diferencias significativas (p<0.05).

ab b b b

0

20

40

60

80

100

120

140


Tratamientos

Pro

ducc

ión

de fo

rraj

e(b

ase

100)

Base 100 = 158 g MS/m linealCV = 32.6

a a a a a

0

20

40

60

80

100

120


Tratamientos

Pro

ducc

ión

de fo

rraj

e(b

ase

100)

Base 100 = 155 g MS/m lineal CV = 27.1



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En la figura 4 (izq.) se observa la ausencia de diferencias significativas en la producción deforraje de L. corniculatus al momento de la cosecha de los experimentos. En este momento seobservaron diferencias significativas entre los tratamientos, en cuanto al número de plantas, queno tuvieron efecto en la producción de forraje.

En el caso de alfalfa se observó el mismo comportamiento que en el momento del corte.

Es importante resaltar que, tanto para L. corniculatus como para alfalfa, en ningún momento sedetectaron efectos negativos de las cepas utilizadas sobre las variables cuantificadas.

RECUENTO DE BACTERIAS EN RIZOSFERA

La evolución de las poblaciones bacterianas rizosféricas en los ensayos de campo durante los años2002 y 2003 se determinó mediante la estimación del número de UFC/g fresco de raíces.

Como unidad experimental se tomaron 5 raíces de plantas pertenecientes a cada una de lasrepeticiones de cada tratamiento. Estas raíces se colocaron en NaCl estéril y se siguió el mismoprocedimiento que el descripto para el Recuento de bacterias en semillas.

El análisis estadístico de los resultados se llevó a cabo mediante el procedimiento GLM (SASInstitute) y las medias de los tratamientos fueron comparadas usando los tests de LSD o de Tukey,según se indica (p<0.05). Los ceros obtenidos en los recuentos en placa fueron sustituidos por elvalor del nivel de detección en cada caso.

Determinación de las poblaciones de P. fluorescens

En primer lugar cabe resaltar que se encontraron poblaciones de las cepas UP143.8 y/o UP148.2en los controles inoculados sólo con rizobio de todos los ensayos, si bien los niveles alcanzados nofueron estadísticamente comparables a los de los tratamientos co-inoculados.



Página 28

Por análisis morfológico de las colonias y por PCR (del inglés Polymerase Chain Reaction) sedeterminó que los tratamientos Testigo y Apron se contaminaron con las cepas UP143.8 yUP148.2. También se observó que las cepas que aparecieron en cada tratamiento con P.fluorescens fueron las que se habían utilizado para inocular las respectivas semillas.

Año 2002

En ambas especies vegetales, en cada momento de muestreo, las poblaciones de P. fluorescensen los tratamientos co-inoculados no fueron significativamente diferentes entre sí, excepto en eltratamiento UP61 del último muestreo de alfalfa que fue menor al resto (análisis estadístico nomostrado).

Por otro lado, las poblaciones de P. fluorescens de cada tratamiento en Lotus descendieronsignificativamente a lo largo del tiempo (más de un orden de magnitud en 54 días), excepto en eltratamiento Apron, cuya población se mantuvo, siendo siempre significativamente menor al restoal menos hasta los 40 días (Fig 5 izq.).

Las poblaciones de P. fluorescens presentes en rizósfera de alfalfa también descendieronsignificativamente a lo largo del tiempo en cada tratamiento, excepto en el caso de UP148, en elcual permaneció constaste (Fig 5 der.).

Año 2003

En Lotus las poblaciones de las distintas cepas de Pseudomonas no mostraron diferenciassignificativas entre ellas en el primer muestreo (10 días después de la siembra). Sin embargo, a30 días de la siembra, hubo diferencias significativas entre los tratamientos, siendo laspoblaciones de UP148.2 y UP61.2 las más y menos numerosas, respectivamente.

En el segundo muestreo de alfalfa (20 días post-siembra) el tratamiento UP61.2 presentó unnúmero de UFC significativamente menor al de las otras dos cepas, aunque a los 30 días no seobservaron diferencias (análisis estadístico no mostrado).



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Al igual que en el año anterior, en ambas especies vegetales las poblaciones de P. fluorescens detodos los tratamiento descendieron significativamente a lo largo del tiempo, mostrando eltratamiento UP61.2 un descenso más acentuado que las Pseudomonas de los otros tratamientosen Lotus.



Página 30

Figura 5: Poblaciones de P. fluorescens introducidas en rizósfera de L. corniculatus (izq.) y alfalfa (der.)en los ensayos de colonización realizados en la estación experimental del INIA-Las Brujas durante el año2002 (arriba) y 2003 (abajo). Diferentes colores representan distintos momentos de muestreo a 26, 33, 40,47 y 54 días después de la siembra para el año 2002, y a 10, 20 y 30 días después de la siembra para el año

aaa

aa

aa

a

aba

bb

b

ba

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

Testigo Apron UP61 UP143 UP148

log U

FC

/g ra

íces

aaa

a

a

ab

b

b

a

ab

bb

b

a

b

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Testigo Apron UP61.2 UP143.8 UP148.2

Lo

g10

(UF

C/g

raí

z)

a

ab

a

a

b

aa

a

b

a

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ab

aba

aab

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a

b

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5

5,5

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6,5

7

7,5

8


aaa

a

a

a

a

a

a

a b

b

bb

a

b c

b c

b

b

a

c

cb

c

a

c

5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

7,5

Test igo Apron UP61.2 UP143.8 UP148.2

Lo

g10

(U

FC

/g r

aíz)

Año 2002

Año 2003

Lotus corniculatus Alfalfa



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2003. El análisis estadístico fue realizado independientemente para cada tratamiento a lo largo deltiempo. Letras diferentes indican diferencias significativas según LSD (p<0.05).

DETERMINACIÓN DE LAS POBLACIONES DE RIZOBIO

Año 2002

En L. corniculatus las poblaciones de rizobio del ensayo en el INIA-Las Brujas permanecieronconstantes a lo largo del tiempo (figura 6 izq.), presentando números de UFC/g raíces similaresentre sí y al testigo. Las poblaciones del tratamiento Apron fueron significativamente menoresque las correspondientes al resto, excepto en el cuarto muestreo.

No se pudieron detectar las poblaciones de rizobio en rizósfera de alfalfa (figura 6 der.) en elprimer muestreo. A partir del segundo, las poblaciones permanecieron constantes, excepto en lostratamientos Testigo y UP148 en los que se observó un leve aumento a lo largo del tiempo. Enningún momento de muestreo, excepto en el último para el tratamiento con UP61.2, laspoblaciones de rizobio de los tratamientos coinoculados fue menor que la del testigo.A partir del día 40 no hubo diferencias significativas entre los distintos tratamientos (análisisestadístico no mostrado).

Debido a la presencia de Pseudomonas en la rizósfera de los tratamientos testigo, no se pudodeterminar la influencia de su presencia en la colonización de rizobio. De todos modos, de existirun efecto deletéreo en este aspecto, el mismo sería menor que el producido por el curasemillas.

Año 2003

En el año 2003 no se realizaron los recuentos de M. loti para ninguna localidad por no contar concepas resistentes al antifúngico utilizado.

En alfalfa las poblaciones fueron inferiores con respecto a las del año anterior (datos nomostrados). En los tres muestreos realizados hubo poblaciones por debajo del nivel de detección.Sin embargo, los análisis estadísticos no detectaron diferencias significativas en el número de



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UFC/g raíces entre los distintos tratamientos. Este resultado puede tener un sesgo hacia lahomogeneización de los datos, ya que los ceros obtenidos en los recuentos en placa fueronsustituidos por el valor del límite de detección.

Figura 6: Población de M. loti (izq.) y S. meliloti (der.) en rizosfera de plantas de L. corniculatus y alfalfaen condiciones experimentales de campo. Los datos de las gráficas representan los valores de losexperimentos realizados en el INIA-Las Brujas durante el año 2002. Diferentes colores representan distintosmomentos de muestreo a 26, 33, 40, 47 y 54 días después de la siembra. Los datos fueron analizados porGLM y los efectos significativos (p<0.05) se compararon usando LSD.

baa

ab

ab

a

aa

b abaaab

aaaa

a

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00


log

10 (

UF

C/g

raí

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a

a

a

a

a

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a

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ab aaa

ab

aa

a

a

ab

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

Testigo Apron UP61.2 UP143.8 UP148.2

Lo

g10

(U

FC

/g r

aiz)

L. corniculatus Alfalfa



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ESTUDIOS EN ALFALFA BAJO CONDICIONES CONTROLADAS

ENSAYOS DE PROTECCIÓN DE ENFERMEDAD

La alfalfa es una planta especialmente susceptible a P. ultimum en las etapas tempranas de sudesarrollo, incluyendo la pre-emergencia. En este proyecto se estudió la capacidad de las 3 cepasde Pseudomonas aisladas de L. corniculatus para controlar la infección causada por Pythium enesta leguminosa forrajera. Para ello, se empleó suelo natural no estéril, lo que aseguró unaaproximación a las condiciones de campo, en donde las interacciones entre microorganismos sonmuy complejas.

Preparación del inóculo fúngico

Un disco de micelio joven de Pythium debaryanum se colocó en el centro de una placa de agar-agua y se incubó durante 3 días a 22 ºC. Una vez colonizada la superficie de agar, se licuaron arazón de 8 placas por litro de agua.

Ensayo en almácigas

El ensayo se realizó en cámara de crecimiento a 12 ºC y con fotoperíodo 10 h luz-14 h oscuridad.Se utilizaron almácigas con celdas cuadriculares de 4 cm de lado y 8 cm de profundidad. Launidad experimental consistió en 12 celdas. Se sembraron 10 semillas de alfalfa por celda ensustrato vegetal comercial. El diseño experimental fue de bloques completos al azar con 4repeticiones y el ensayo fue repetido 3 veces.

Los tratamientos impuestos fueron:

-Control de germinación (sin Pythium, sin Pseudomonas)

-Control de enfermedad (inoculación con Pythium, sin Pseudomonas)



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-Inoculación con Pythium y con la cepa P. fluorescens UP61

-Inoculación con Pythium y con la cepa P. fluorescens UP143

-Inoculación con Pythium y con la cepa P. fluorescens UP148.

Para la inoculación con Pythium se sembraron 5 ml de inóculo/celda el día previo a la siembra y 3ml de inóculo/celda el día posterior a la misma. Para la inoculación con Pseudomonas secolocaron 3 ml de inóculo/celda el mismo día de la siembra.

La variable evaluada fue el número de plantas emergidas sanas los 7, 9, 11, 13, 15 y 21 días post-siembra. El análisis de datos se realizó mediante el procedimiento GLM del SAS Institute y lasmedias de los tratamientos fueron separadas usando LSD de Fisher protegida (p<0.05).

De la figura 7 se desprende que la inoculación con al menos una de las tres cepas deP.fluorescens mejoró el porcentaje de emergencia de alfalfa, respecto al tratamiento inoculadocon P. debaryanum (control de enfermedad).



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0,0

20,040,0

60,080,0

100,0

Control

Pythiu

mUP6

1UP1

43UP1

48

Em

erge

ncia

(%

)

24-Sep

26-Sep28-Sep

1-Oct

3-Oct

9-Oct

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

Contro

l

Pythiu

mUP6

1

UP143

UP148

Em

erge

ncia

(%

)19-Nov21-Nov

23-Nov

25-Nov

27-Nov4-Dic

Figura 7: Efecto protector del damping-off (P. debaryanum) de las tres cepas de Pseudomonas evaluadoen alfalfa, en condiciones controladas. Los colores indican el número de plantas emergidas sanas los 7, 9,11, 13, 15 y 21 días post-siembra, respectivamente.



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INTERACCIONES RIZOBIO-PSEUDOMONAS

En Uruguay, la alfalfa es inoculada con las cepas S. meliloti MCH3 y LP21, de acuerdo con lasrecomendaciones del Ministerio de Ganadería, Agricultura y Pesca.

El estudio de compatibilidad entre rizobio y Pseudomonas es absolutamente necesario en vistasde una efectiva inoculación conjunta. Nuestro laboratorio dispone de datos que muestran que laasociación M. loti B816 con Pseudomonas no afecta la simbiosis. Para verificar si esto se cumpletambién en alfalfa se estudiaron diferentes parámetros de la asociación simbiótica.

TASA DE NODULACIÓN EN ALFALFA CO-INOCULADA

Para evaluar si la presencia de cepas de P. fluorescens afecta las etapas iniciales de la simbiosisS. meliloti-alfalfa se determinó la tasa de nodulación para cada tratamiento y el número denódulos por planta, considerándose una planta nodulada cuando presentaba por lo menos unnódulo.

Se utilizaron tubos de vidrio conteniendo medio Jensen en los que sesembraron dos semillas de alfalfa estériles y pregerminadas. Las plantas secultivaron en condiciones controladas a 20 ºC y fotoperíodo de 16 horas.

Siete días después de la siembra, las plantas se inocularon según lossiguientes tratamientos: un control sin inocular, adicionado con NaCl estéril,un control al que se le agregó KNO3, tratamientos co-inoculados con S.meliloti y cada una de las tres cepas de P. fluorescens, y un tratamientoinoculado sólo con la mezcla de rizobio. Se usaron 10 repeticiones portratamiento.

A partir del quinto día posterior a la inoculación, se registró el número de nódulos por sistemaradicular diariamente durante tres semanas.



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En dos experimentos independientes no se encontraron diferencias en la tasa de nodulacióncuando las plantas de alfalfa fueron inoculadas sólo con la mezcla comercial de S. meliloti (M) oconjuntamente con las cepas de P. fluorescens.

La figura 8 presenta los resultados correspondientes a un ensayo. Las plantas de los tratamientosco-inoculados tuvieron similar número de nódulos que las plantas inoculadas sólo con rizobio.

Cinética de nodulación

04

812

1620

2428

0 10 20 30 40

días después de la inoculación

nº p

lant

as n

odul

adas

UP61.2R + M

UP143.8R + M

UP148.2R + M

M (MCH3 + LP21)

Figura 8: Tasa de nodulación de plantas de alfalfa co-inoculadas. El ensayo se realizó en tubosconteniendo medio Jensen bajo cámara de crecimiento. Las plantas fueron tratadas con una mezcla (M) delos inoculantes comerciales S. meliloti MCH3 y LP21 (2x107 UFC/tubo) únicamente o co-inoculadas con lamisma mezcla y UP61.2R, UP143.8R o UP148.2R (2x107 UFC/tubo de cada especie). También se incluyerondos controles: uno con KNO3 0,05% y otro con H2O estéril (datos no mostrados), cuyas plantas nopresentaron nódulos en ningún momento. El número total de plantas por tratamiento fue de 24, exceptopara el tratamiento con UP143.8R + M que fue de 22.

En otro experimento, si bien a 6 días de la inoculación el porcentaje de plantas noduladas en lostratamientos co-inoculados fue 15–20 % menor que en el control (M), a los 14 días todos lostratamientos alcanzaron el 100 % de nodulación (datos no mostrados).



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La figura 9 muestra el promedio de nódulos por raíz para los distintos tratamientoscorrespondiente al ensayo anterior.

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

5 1 0 1 5 20 2 5

Días después de la inoculaciónP

rom

edio

de

nó

du

los

po

r ra

íz

UP61.2+M UP143.8+M UP148.2+M M

Figura 9: Promedio de nódulos por raíz en función del tiempo para los distintos tratamientos, en uno delos experimentos para evaluar la tasa de nodulación. Los tratamientos y condiciones que se utilizaron eneste ensayo se describieron anteriormente.

El número de nódulos por raíz fue mayor para el tratamiento inoculado sólo con la mezcla de S.meliloti que en los demás tratamientos, durante todo el ensayo. Sin embargo, esto no se debió aun mayor número de plantas noduladas, sino a una mayor cantidad de nódulos por planta. Losresultados de los tratamientos co-inoculados fueron similares entre sí.



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EFICIENCIA EN LA FIJACIÓN BIOLÓGICA DE NITRÓGENO (EFBN)

ENSAYOS EN TUBOS

Se usaron las mismas plantas que en el experimento anterior. Se cultivaron en las condicionesindicadas durante 43 días, al cabo de los cuales se cortó la parte aérea, descartándose la raíz. Lasplantas cosechadas se dejaron secar toda la noche y se determinó su peso. Los datos fueronanalizados según el procedimiento GLM (SAS Institute) y las medias separadas usando el test deTukey.

Los resultados de la figura 10 muestran que al cabo de 43 días no hay diferencias significativasentre el peso de la parte aérea de las plantas co-inoculadas y aquellas inoculadas solamente conla mezcla de S. meliloti (M). Los mismos resultados se obtuvieron para los tres ensayos llevados acabo.



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Eficiencia de la fijación biológica de N (tubos)

bb

bba

c

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

Pes

o s

eco

pro

med

io/p

lan

ta (m

g)

H2O KNO3 M UP 61.2 UP 148.2UP 143.8+ M + M+ M

Figura 10: Peso seco de la parte aérea de plantas de alfalfa del Ensayo de EFBN en tubos. Se utilizaron 10tubos conteniendo medio Jensen para cada tratamiento y se sembraron dos semillas por tubo. Se dejaronbajo condiciones controladas por 43 días, al cabo de los cuales se seccionó la parte aérea de las plantas yse determinó su peso seco. UP61.2+M, UP143.8+M, UP148.2+M: tratamientos co-inoculados con cada cepade P. fluorescens y una mezcla de cepas de S. meliloti. M: tratamiento inoculado sólo con la mezclaanterior, H2O: control, KNO3: tratamiento suplementado con nitrógeno. Diferentes letras indicandiferencias significativas (p<0.05) según test de Tukey.

La presencia de las cepas de P. fluorescens no afectó la producción de materia seca. La FBNllevada a cabo por S. meliloti tuvo la misma eficiencia en los tratamientos co-inoculados que enel tratamiento M. La diferencia en el número de nódulos observada anteriormente entre lostratamientos co-inoculados y el inoculado sólo con S. meliloti no incidió en el peso seco de lasplantas.



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ENSAYOS EN MACETAS

Para determinar si alguna de las cepas de P. fluorescens tiene incidencia en la EFBN en suelonatural, se colocó una mezcla de arena y suelo comercial en macetas de plástico, en la que sesembraron 15 semillas de alfalfa por maceta. Noventa días después de la siembra se cortó laparte aérea de las plantas y se determinó el peso seco como se indicó para el ensayo en tubos.Algunas raíces de cada tratamiento fueron examinadas superficialmente para constatar lapresencia o no de nódulos efectivos.Se llevaron a cabo tres ensayos independientes con 6 repeticiones de cada tratamiento, los cualesconsistieron en: semillas inoculadas con cada una de las tres cepas de P. fluorescens y la mezcla(M) de cepas de S. meliloti, semillas inoculadas sólo con M, y semillas sin inocular.

Los resultados del primer ensayo (figura 11), analizados por GLM (p<0.05, Tukey), mostraron queno hubo diferencias significativas entre los tratamientos. La presencia de cepas nativas de rizobioen el suelo utilizado explicaría el alto rendimiento en materia seca en el control sin inocular.



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Eficiencia Fijación N en macetas

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0,16

Tratamientos

pes

o s

eco

aér

eop

rom

edio

/pla

nta

(g)

UP148R + M

UP143.8R + M

UP61.2R + M

M (MCH3+LP21)

Control

A A A

A

A

Figura 11: Efecto de la inoculación con cepas de P. fluorescens en la eficiencia de la simbiosis rizobio-alfalfa en macetas. El ensayo fue realizado en cámara de crecimiento. Los datos de la gráfica representanlos valores promedio de un ensayo. Las plantas fueron tratadas con una mezcla (M) de los inoculantescomerciales S. meliloti MCH3 y LP21 (9.3 x 105 UFC/semilla) únicamente, co-inoculadas con la mismamezcla y UP61.2R, UP143.8R o UP148.2R (3.3 x 105, 2.7 x 105 y 1.5 x 104 UFC/semilla, respectivamente) yse incluyó un control sin inocular. Los datos fueron analizados por ANOVA. Letras diferentes indicandiferencia significativa (Tukey, p<0.05).

En los otros dos experimentos (datos no mostrados) la tendencia fue la misma: el peso seco aéreopromedio fue igual o significativamente mayor en los tratamientos cuyas semillas habían sido co-inoculadas que en el tratamiento M.

Sin embargo, mientras en uno, el tratamiento UP148.2+M resultó en medias superiores altratamiento M, en el otro, el peso seco del tratamiento inoculado sólo con S. meliloti fuesignificativamente mayor.



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Por lo tanto, las diferencias entre estos resultados muestran que el efecto del tratamientoUP148.2+M no es definido, ya que depende en gran medida de las condiciones experimentales (loscomponentes del sistema que variaron de un ensayo a otro fueron los stocks de semillas y desuelo).

En resumen, los resultados indican que la presencia de las cepas de P. fluorescens en la rizósferade alfalfa puede o no incidir en el número de nódulos que se producen en la raíz y en la velocidadde aparición de los mismos. Sin embargo, se demostró que la co-inoculación con las cepas UP61 oUP143 no afecta la EFBN por las cepas comerciales de S. meliloti.

ENSAYOS DE COLONIZACIÓN

Para determinar las poblaciones de S. meliloti y P. fluorescens presentes en rizosfera de alfalfade ensayos realizados bajo condiciones controladas, se utilizaron almácigas de 72 hoyos como semuestra en la figura 12. Se llenaron con una mezcla de arena y suelo comercial, como sedescribió para el ensayo de EFBN en macetas. Se colocaron 5 semillas de alfalfa previamentebacterizadas como se describió para los ensayos en campo. Cada tratamiento se sembró en unafila de 4 repeticiones y se dispusieron en 5 bloques no al azar. Las almácigas se dejaron encondiciones controladas como se describió en el ensayo de EFBN en tubos y se regaron cada 2-3días con 5 ml de agua corriente.

Se realizaron tres experimentos independientes con siete tratamientos: semillas bacterizadas concada una de las tres cepas de P. fluorescens, semillas co-inoculadas con cada cepa de P.fluorescens y la mezcla (M) de S. meliloti, o semillas inoculadas sólo con M.

Las plantas fueron cosechadas a los 4, 7, 10, 16 y 21 días después de la siembra. Se cortó ydescartó la parte aérea y las raíces se sumergieron en NaCl estéril. Se agitaron en vórtex y sehicieron diluciones seriadas. Para determinar el número de unidades formadoras de colonia porgramo de raíz, se sembró cada dilución en KBr o TYrkb y se incubó como se describióanteriormente. Posteriormente, las raíces se secaron con papel absorbente y se determinó elpeso fresco de las raíces de cada repetición.



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Los análisis estadísticos se llevaron a cabo mediante GLM y las medias de los tratamientos fueroncomparadas usando el test de Tukey (p<0.05).

Los diferentes tratamientos permitieron determinar la incidencia de la inoculación con unaespecie en la población de la otra. La tabla 6 presenta el número de bacterias adheridas a lassemillas utilizadas.

Figura 12: Almácigas de alfalfa de losensayos de colonización en condicionescontroladas. Se sembraron cincosemillas de cada tratamiento en cadauno de los hoyos conteniendo suelocomercial. El experimento se llevó acabo en cámara de crecimiento concontrol de temperatura y fotoperíodo ylas plantas se regaron diariamente conagua corriente



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Tabla 6: Resultado de los conteos de UFC/semilla de alfalfa para los tres ensayos de colonizaciónen cámara

TRATAMIENTOS UFC de P. fluorescens / semilla UFC de S. meliloti / semillaExperimento

IExperimento

IIExperimento

IIIExperimento

IExperimento

IIExperimento

IIIUP61.2 2.7 x107 1.55 x 107 1.33 x 107 - - -UP61.2 + M* 7.7 x 107 1.67 x 107 1.89 x 107 4.5 X 106 1.33 x 106 1.78 x 105

UP143.8 4.5 x 06 1.11 x 107 1.67 x107 - - -UP143.8 + M* 2.7 x 107 8.89 x 106 3.33 x 106 1.8 X 106 1.00 x 106 7.78 104

UP148.2 3.0 x 106 8.89 x 106 5.11 x 105 - - -UP148.2 + M* 4.0 x 106 1.00 x 107 2.11 x 107 2.7 X 106 1.11 x 106 2.22 x 105

M* - - - 1.4 X 106 7.78 x 105 1.11 x 105

* M: mezcla de mutantes espontáneas resistentes a Km y Rif

Se determinó el número de UFC/g fresco de raíz como una medida de la densidad de laspoblaciones de cada una de las cepas de P. fluorescens y de rizobio. La figura 13 muestra losresultados obtenidos en uno de los ensayos.



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Población de UP148.2

0

2

4

6

8

10

4 7 10 16 21días post-siembra

log1

0 U

FC/G

raíz

log UFC UP148.2/g log UFC UP148.2+M/g


0

2

4

6

8

10


log

10 U

FC

/G r

aíz



0

2

4

6

8

10


log

10 U

FC

/g r

aíz


Poblaciones de rizobio (M)

0

2

4

6

8


log1

0 U

FC/g

raí

z

log UFC M/g log UFC UP61.2+M/g log UFC UP143.8+M/g log UFC UP148.2+M/g

Figura 13: Densidades poblacionales de P. fluorescens y S. meliloti en rizosfera de alfalfa en un ensayo decolonización bajo condiciones controladas. Las plantas fueron incubadas en cámara bioclimática ycosechadas después de 4, 7, 10, 16 y 21 días después de la siembra, determinándose el número de UFC/gfresco de raíz. Las tres primeras gráficas comparan las poblaciones rizosféricas de cada una de las trescepas de P. fluorescens previamente inoculadas en las semillas únicamente o en conjunto con rizobio. Laúltima muestra las poblaciones de S. meliloti en las rizosferas co-inoculadas contra el control sinPseudomonas (barras amarillas).

En este ensayo, casi todas las poblaciones de Pseudomonas disminuyeron significativamente(p<0.05) a lo largo del tiempo, excepto en el tratamiento UP148.2+M que se mantuvo constante,



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independientemente de la presencia o no de rizobio. Las poblaciones de rizobio se mantuvieronconstantes.

Contrastes entre Pseudomonas de tratamientos co-inoculados y tratamientos inoculados sólo conuna de las tres cepas, mostraron que el número de UFC/g de raíz de las poblaciones co-inoculadases igual o mayor que en los controles sin rizobio. En un sólo muestreo la población deltratamiento UP143.8 fue mayor que la del tratamiento co-inoculado.

Por otro lado, ninguna de las dos especies bacterianas se vio negativamente afectada por lapresencia de la otra.

Los datos de los otros ensayos realizados mostraron las mismas tendencias. Las sutiles diferenciasobservadas (no mostradas) entre todos los resultados podrían deberse a los distintos valores depoblaciones bacterianas en las semillas y a la variabilidad e inconsistencia naturales que surgen apartir de datos obtenidos de experimentos en suelo.

P. fluorescens fue capaz de colonizar eficientemente la rizosfera de alfalfa en condiciones desuelo natural no estéril, alcanzando las tres cepas niveles comparables dentro de cada ensayo.



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DESARROLLO DE UN INOCULANTE EN BASE A PSEUDOMONAS

OPTIMIZACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO PARA PSEUDOMONAS

CRECIMIENTO EN DIFERENTES MEDIOS

En este trabajo se probaron medios de cultivo con diferentes fuentes de carbono y nitrógeno,variando las concentraciones relativas de ambas. Como sustratos aceptables para uso industrial,se incluyeron sacarosa, glicerol, extracto de malta, extracto de levadura, suero de quesodesecado, etc. Los ensayos se realizaron creciendo P. fluorescens UP148 a 28 ºC en placas demicrotitulación, tubos de ensayo, tubos tipo Falcon® de 50 ml o matraces Erlenmeyer de 250 mlconteniendo 0.250, 6, 25 o 50 ml de medio, respectivamente. En todos los experimentos elinóculo inicial fue de 1x107 UFC/ml y se determinó la densidad óptica (D.O.) de los cultivos a lolargo del tiempo como medida de la producción de biomasa. En algunos casos se realizó elrecuento en placa de los microorganismos inoculados. Los medios utilizados se detallan acontinuación:



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Tabla 7: Medios de cultivo para el crecimiento de P. fluorescens UP148

MEDIO FuenteC* g/l Fuente N g/l YE

(g/l)K2HPO4

(g/l)MgSO4

(g/l)*NaH2PO4

(g/l)*KNO3

(g/l)*NaCl(g/l)

Fuente oreferencia

M1 Sacarosa 10 - - 2 1,5 1,5 - - - Este trabajoM 2S Sacarosa 10 Extracto Malta 10 2 1,5 1,5 - - - Este trabajoM 2G Glicerol 10 Extracto Malta 10 2 1,5 1,5 - - - Este trabajoM 3 Sacarosa 10 Extracto Malta 5 1 1,5 1,5 - - - Este trabajoM 4 Glucosa 4,4 Glutamato* 0,75 1,6 1,5 1,5 - - - Este trabajoM 5 Glucosa 5,2 NH4Cl 0,25 1,46 1,5 1,5 - - - Este trabajoM 6 Glicerol 10 - - 2 1,5 1,5 - - - Este trabajoM 7 Glicerol 4 Glutamato* 0,25 3,3 1,5 1,5 - - - Este trabajoM 8 Glicerol 4 NH4Cl 0,75 3 1,5 1,5 - - - Este trabajo

M 9 Glicerol 10 Suero quesodeshidratado 2 2 1,5 1,5 - - - Este trabajo

YEM Manitol 10 - - 1 0,5 0,2 - - 0,1 Vincent, 1970

KB Glicerol 10 Proteosapeptona 10 - 1,5 1,5 - - - King et al.,

1954MMPs Glicerol 15 NH4Cl 1 - 3 0.2 1 - - Loper, 1988

PPM Glicerol 20 peptona 20 - - - - 1 5 Rosales etal., 1995

*Se agregaron las soluciones estériles luego de esterilizar los medios en autocave. YE: extracto de levadura

En primer lugar, se realizaron ensayos preliminares creciendo las bacterias a 30 ºC en placas demicrotitulación conteniendo 12 medios de cultivo con diferentes fuentes de carbono y nitrógeno(Tabla 7). A partir de éstos, se seleccionaron los medios que presentaban mayor rendimiento enbiomasa y se evaluó el crecimiento bacteriano en tubos Falcon® con 20 ml de medio durante 24 haproximadamente.



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De los resultados obtenidos en estos ensayos se seleccionó el medio M2S para comparar laproducción de biomasa en relación con medios estándares (KB y PPM - Tabla 7). Para ello, sesembró un inóculo de la cepa UP148 en matraces de 250 ml con 50 ml de medio. Los cultivos seincubaron a 30 ºC en agitador rotatorio por aproximadamente 120 h y se midió la D.O. a 620 nmde una dilución 1/10 de los mismos, a intervalos regulares. El número de UFC/ml fue determinadoa las 0, 50 y 120 h después de la inoculación, sembrando diluciones de los cultivos anteriores enplacas con medio KB y contando el número de colonias presentes luego de 24 h de incubación a 25ºC.

Las figuras 14 a 16 presentan resultados que indican que el Medio 2 (Tabla 7) promueve unaproducción de biomasa comparable a la de los medios estándares (KB o PPM). Por lo tanto, seseleccionó este medio y, para estudios posteriores, se le realizaron modificaciones tales comovariación de la fuente de carbono de sacarosa (M2S) a glicerol (M2G), comparando los resultadosentre ambos medios, KB, PPM o MMPs.



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Curva Crecimiento UP148 en placas de ELISA

00,20,40,60,8

11,21,4

1,61,8

0 3 6 9 12 15 18 21 24Tiempo de cultivo (h)

D.O

. 620

nm

M 1

M2S

M 3

M 4

M 5

M 6

M 7

M 8

M 9

YEM

KB

P P M

Curva crecimiento UP148 en tubos de ensayo

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

3,50

0 5 10 15 20 25 30Tiempo de cultivo (h)

D.O

. 620

nm

KB

PPM

M2G

M2S

MMPs

Curva crecimiento UP148 en tubos FALCON

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

0 5 10 15 20 25 30

Tiempo de cultivo (h)

D.O

. 620

nm

M2

M6

M7

M8

KB

PPM

Figura 14: Crecimiento de P.fluorescens UP148 en placas deELISA con medios conteniendodiferentes fuentes de C y N. Loscultivos se llevaron a cabo conagitación a 30 ºC en placas demicrotitulación con 0.250 ml demedio. Se determinó la D.O. a620 nm como medida de laproducción de biomasabacteriana. Se realizaron dosexperimentos independientesque mostraron la mismatendencia.

Figura 15: Crecimiento de P.fluorescens UP148 en tubos deensayo conteniendo diferentesmedios. Los cultivos se llevarona cabo con agitación a 30 ºC entubos de ensayo con 6 ml decada medio. Se determinó laD.O. a 620 nm como medida dela producción de biomasabacteriana.

Figura 16: Crecimiento de P.fluorescens UP148 en tubosFalcon® conteniendo diferentesmedios. Los cultivos se llevarona cabo con agitación a 30 ºC entubos Falcon con 20 ml demedio. Se determinó la D.O. a620 nm como medida de laproducción de biomasabacteriana. Se realizaron tresexperimentos independientesque mostraron la mismatendencia.



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Curva crecimiento UP148 en matraces

0

2

4

6

8

10

12

0 25 50 75 100 125 150

tiempo de cultivo (h )

D.O

. (62

0nm

)

PPMKBM2

Recuentos de UP148 durante CC en matraces

0,002,004,006,008,00

10,0012,00

0 50 120

tiempo de cultivo (h)

log

10 U

FC

/ml PPM

KB

M2

A continuación se presentan los resultados obtenidos a partir de un experimento en matraces de250 ml que comparó el crecimiento de la cepa P. fluorescens UP148 en el medio M2S con respectoa los estándares.

Según la lectura de D.O. de los cultivos medida a 620 nm, la cepa UP148 alcanzó nivelespoblacionales diferentes dependiendo del medio. Mientras en KB tuvo una máxima producciónque sobrepasó las 1010 UFC/ml, en PPM alcanzó 107 UFC/ml y en M2S llegó a 103 bacterias por ml,transcurridas 50 h de cultivo (figura 17). Esto no se vio reflejado en la producción de biomasamedida a través del recuento en placa de bacterias viables. En los tres medios se observó unaproducción bacteriana que alcanzó 1010 UFC/ml a las 50 h de cultivo y se mantuvo así al menoshasta las 120 h (figura 18).

Figura 17: Crecimiento de P. fluorescens UP148en matraces. Los cultivos se llevaron a cabo conagitación a 30 ºC en matraces de 250 ml con 50ml de los medios KB, PPM y M2S. Se determinó laD.O. a 620 nm de una dilución 1/10 de loscultivos.

Figura 18: Recuento de P. fluorescens UP148 encultivos líquidos en matraces. Se determinó elnúmero de UFC/ml a las 0, 50 y 120 h de cultivosembrando diluciones de los cultivos anterioresen placas conteniendo medio KB y contando elnúmero de colonias presentes luego de 24 h deincubación a 25 ºC.



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ANTAGONISMO IN VITRO

P. fluorescens UP148 vs. Pythium debaryanum

Se realizaron ensayos duales en placas de Petri conteniendo KB, PPM, M2S, M2G o MMPs. En elcentro de las mismas se colocó un disco de medio Potato Dextrose Agar (PDA Difco®) conteniendoel inóculo de P. debaryanum. Como controles se utilizó una placa de cada medio y en otras dos sesembró un inóculo bacteriano proveniente de un cultivo de 24 h de la cepa UP148. Las placas seincubaron a 25 ºC por 48 h.

Los resultados de este experimento mostraron que en placas conteniendo los medios KB o PPM nose observó crecimiento de Pythium, tanto para las placas inoculadas con la cepa UP148 como paralos controles. En presencia de P. fluorescens se observó crecimiento del micelio hasta el borde delas placas en los medios M2G o M2S a las 48 h. En las placas de MMPs el crecimiento fue más lentocuando P. fluorescens estaba presente, cubriendo la totalidad de la placa a las 96 h. En la figura13 se muestran los resultados obtenidos.



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UP148 C UP148

MMPs

PPM

KB

Figura 19: Evaluación de la actividad antagónica in vitrode P. fluorescens UP148 frente a P. debaryanum. Lasplacas de arriba contienen el medio M2S. En ambas seobserva que Pythium crece hasta el borde de las placasdespués de 48 h. Derecha: Bioensayos en MMPs, PPM oKB. Se observa muy poco o ningún crecimiento micelialen el mismo tiempo. C: controles sin inocular con P.fluorescens UP148.

Sobrenadantes de cultivos de P. fluorescens UP148 vs. P. debaryanum

Se centrifugaron 50 ml de cultivos líquidos enmatraces conteniendo los medios anteriormentemencionados. Los sobrenadantes fueron filtrados yse tomaron 0.5, 1 o 2 ml para mezclarlos conagua-agar (2 %) y colocar 5 ml en los hoyos de unaplaca para cultivos celulares. En el centro de losmismos se colocó un disco de agar conteniendomicelio de P. debaryanum y se incubó a 25 ºC por48 h.

Como control se incluyó una fila de hoyos conteniendo 2 ml de cada medio.



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Con los sobrenadantes de los cultivos incluidos en agar se observó crecimiento micelial en casitodos los medios, excepto en PPM. Sin embargo, en el caso del medio M2G hubo un efecto noesperado de las concentraciones empleadas.

Tabla 8: Actividad antagónica de los sobrenadantes de cultivos de P. fluorescens UP148 endiferentes medios.

-: inhibición total del crecimientodel micelio.+++: crecimiento del micelio hastael borde de la placa.C: 2 ml de cada medio en agua-agar.

Extractos orgánicos de cultivos de P. fluorescens UP148 vs P. debaryanum

Extractos orgánicos de cultivos de la cepa UP148 enlos mismos medios (ver Extracción y análisis decompuestos antifúngicos) fueron resuspendidos enacetonitrilo (AcCN) y se sembró el equivalente a2.5, 5 o 10 ml de cada cultivo en discos de papel defiltro estériles de 1 cm de diámetro. Como controlse sembraron 60 µl de AcCN. Se dejó evaporar elacetonitrilo y se colocaron los discos hacia el bordede cada hoyo de una placa para cultivo celular.

Medios de cultivo Volumen incluido

en el agar (ml)

M2S M2G KB PPM MMPs

2 +- +++ +- -- +-

1 +++ ++ +- - +

0.5 +++ + +- -+ ++

C +++ +++ ++ ++ +-



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Para permitir la difusión de los compuestos, se incubó a 25 ºC por 24 h al término de las cuales sesembraron discos de agar conteniendo el inóculo de Pythium. Las placas se incubaron a 25 ºC por72 h.

Cuando se evaluó la actividad antagónica de estos extractos se observó que con cantidadesequivalentes a 10 y 5 ml del cultivo original en los medios KB, PPM o MMPs no hubo crecimientode Pythium. En los extractos de cultivos en medios M2G o M2S no se observó crecimiento micelialcon un volumen equivalente a 10 ml, pero sí cuando se utilizaron 5 ml, aunque en menor medidaque en el control con AcCN .

Tabla 9: Actividad antagónica de los extractos orgánicos de cultivos de P. fluorescens UP148 endiferentes medios

-: inhibición total delcrecimiento del micelio+: crecimiento normal delmicelio hasta el borde de laplacaC: 0.6 ml de AcCN

EXTRACCIÓN Y ANÁLISIS DE COMPUESTOS ANTIFÚNGICOS

A partir de cultivos crecidos 48 h en matraces conteniendo 50 ml de KB, PPM, MMPs, M2S o M2G sehicieron extracciones orgánicas de los compuestos producidos por la bacteria. Los sobrenadantesde los cultivos se acidificaron con ácido trifluoro acético (TFA) hasta pH 2.0 y se extrajeron dosveces con un volumen y medio de acetato de etilo cada vez. La fase orgánica conteniendo loscompuestos antimicrobianos se secó en evaporador rotatorio y bajo corriente de nitrógeno, se

Medios de cultivo Volumen del cultivo

original (ml)

M2S M2G KB PPM MMPs

10 - - - - -

5 +- +- - - -

2.5 + + -+ -+ +

C +



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resuspendió en AcCN 25 %-TFA 0.1 %, y se centrifugó para descartar residuos insolubles. Paraevaluar la producción del antibiótico fenazínico producido por esta cepa, cuya actividadantagónica in vitro ha sido demostrada (Bagnasco, 1997; De La Fuente, 2000), los extractos seanalizaron por cromatografía líquida de alta presión (HPLC) usando una columna de fase reversaC18. La fase móvil consistió en un gradiente lineal de AcCN-TFA 0.07 % en H2O-TFA 0.1 % en dospasos: de 0 a 10% entre 0 y 5 min y de 10-50% de 5 a 65 min. El flujo fue 1 ml/min y la velocidaddel papel del registrador 2 mm/min. La detección se realizó a 285 nm y el máximo en la escala deregistro equivalía a 3.0 unidades de absorbancia (AUFS).

El antibiótico producido por P. fluorescens UP148 se obtuvo a partir de extracciones orgánicas desobrenadantes de cultivos en diversos medios, los cuales fueron sometidos a separación por HPLCde fase reversa. En todos los cromatogramas se observó un pico principal con un tiempo deretención de 52 min, que eluyó con 42 % de AcCN. Cabe destacar una producción mínima delcompuesto en el medio M2S (Fig. 14).



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Cuando se midió el espectro de absorción UV del compuesto eluído correspondiente a los picos dela figura 14, se observó que coincidían con el esperado. La absorbancia máxima anteriormentereportada para el antibiótico fenazínico producido por P. fluorescens UP148 fue de 286 nm (Bajsa,2000).

PPM KB M2G MMP

M2SFigura 20: Perfiles de elución de HPLC de los extractos orgánicos decultivos de P. fluorescens UP148 crecida en PPM, KB, M2G, MMPs(cromatogramas superiores) o M2S (cromatograma inferior). En lasdiferentes corridas se inyectaron 0.9 ml de muestra correspondientes alextracto de 9 ml de cultivo resuspendido en AcCN 25%-TFA 0.07%. Elpico señalado con la flecha corresponde al compuesto fenazínicoproducido por esta cepa.



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286.6

285.6

286.4

PPM M2S KBFigura 21: Espectros de absorción UV de los picos eluídos de los HPLC de la figura 14, para los mediosPPM, M2S y KB. Para los otros medios utilizados el máximo de absorción fue a 286.6 nm.

ENSAYO DE PROTECCIÓN DE ENFERMEDAD

En la estación experimental Las Brujas del INIA se llevó a cabo un ensayo para determinar laprotección de plantas de Lotus corniculatus frente a la infección causada por P. debaryanum encondiciones controladas.

Preparación del inóculo fúngico

Un disco de Corn Meal Agar (CMA Difco®) conteniendo micelio joven de P. debaryanum se colocóen el centro de una placa de agar-agua (1.8 %), y se incubó durante 3 días a 22 ºC. Una vezcolonizada la superficie de agar, se procedió a licuar con agua estéril, a razón de 20 placas/litrode agua.

Bacterización de las semillas

Se sembraron 1 x 107 UFC/ml de la cepa UP148 en 20 ml de KB, PPM, MMPs, M2S o M2G. A las 24 hse centrifugó para bajar las células y el pellet resultante fue resuspendido en 0.67 ml de una



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solución de metilcelulosa 1.5 %. Se mezcló con 3 g de semillas de L. corniculatus las cuales fueronesparcidas en una placa de Petri y secadas bajo flujo laminar.

Conteo de bacterias en semillas de Lotus

Para cuantificar el inóculo bacteriano adherido a las semillas, 30 de éstas se colocaron en 10 mlde NaCl 0.15 M estéril, y se agitaron durante 10 min en Vortex. Se realizaron diluciones seriadas yse sembraron en placas conteniendo KB.

El recuento bacteriano en las semillas de L. corniculatus que fueron utilizadas para el ensayo deprotección de enfermedad en condiciones controladas se muestra en la Tabla 9.

Tabla 10: Recuento bacteriano en las semillas de L. corniculatus usadas para el ensayo deprotección en condiciones controladas.

Medios de cultivo UFC de P. fluorescens UP148/semillaKB 1.4 x 106

M2G 7.8 x 105

M2S 1.9 x 105

PPM 1.3 x 106

MMPs 4.9 x 104

Ensayo en almácigas

El ensayo se realizó en cámara de crecimiento a 12 ºC y confotoperíodo 11 horas luz-13 horas oscuridad. Se utilizaronalmácigas de espumaplast, con celdas cuadriculares de 4 cm delado y 8 cm de profundidad, como se muestra en la figura. Launidad experimental consistió en 12 celdas. Se sembraron 10semillas de L. corniculatus por celda, en sustrato vegetalcomercial.



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Los tratamientos impuestos consistieron en la inoculación con P. debaryanum en presencia de lacepa P. fluorescens UP148 crecida en los cinco medios de cultivo anteriormente mencionados, uncontrol de germinación (sin Pythium, sin Pseudomonas) y un control de enfermedad (con Pythium,sin Pseudomonas). Se incluyó un control de enfermedad con semillas de alfalfa. Para lainoculación con Pythium se aplicó 5 ml de inóculo/celda el día previo a la siembra y 3 ml deinóculo/celda el día posterior y 10 días después de la siembra. El diseño experimental fue debloques completos al azar con 4 repeticiones. La variable evaluada fue el número de plantasemergidas sanas a los 8, 10, 14, 16, 18 y 25 días después de la siembra. El análisis de los datos fuerealizado mediante el procedimiento GLM del SAS Institute y las medias de los tratamientosfueron separadas usando LSD (p<0.05).

El ensayo de protección mostró que 25 días después dela siembra, sólo emergieron y permanecieron sanas el23 % de las semillas inoculadas sólo con el patógeno.

En presencia de P. fluorescens UP148 previamentecrecida en los medios MMPs o M2S, no se observarondiferencias significativas con el control deenfermedad.

En los tratamientos PPM y M2G la inoculación con Pseudomonas mejoró el porcentaje deemergencia respecto al control con Pythium, aunque no de forma significativa, llegando a más de30 el porcentaje de plantas emergidas sanas. En el tratamiento KB las plantas sanas alcanzaron el45 % (Fig. 16). Por otra parte, sólo el 7.7 % de las semillas de alfalfa inoculadas con Pythiumestaban sanas (datos no mostrados), lo cual demostró el elevado potencial de infección delaislamiento de Pythium utilizado.



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BCC

C

B

BCC

A

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

CG CE PPM KB MMPs M2S M2G

Tratamientos

Por

cent

aje

de p

lant

as s

anas 08-Jun

10-Jun

14-Jun

16-Jun

18-Jun

25-Jun

Figura 22: Efecto protector del damping-off causado por P. debaryanum de P.fluorescens UP148 evaluado en L.corniculatus, bajo condicionescontroladas. La siembra se realizó el día31 de mayo. Los colores indican losmomentos de lectura de plantas sanas.Letras diferentes indican diferenciassignificativas, según LSD de Fisherprotegida (p<0.05), 25 días después de lasiembra. CG: control de germinación. CE:control de enfermedad.

En otro experimento realizado en lasmismas condiciones anteriores (figura 16

a), con dos bloques y con la misma cantidad de inóculo por semilla en todos los tratamientos (106 UFC), el nivel deprotección alcanzó el 37 % en el tratamiento MMPs, 28 % en PPM y M2S y 17.5 % en KB y M2G, siendo el número deplantas emergidas sanas significativamente mayor que en el control de enfermedad (10 %), para todos los casos.

Figura 23: Efecto protectordel damping-off causadopor P. debaryanum de P.fluorescens UP148evaluado en L.corniculatus, bajocondiciones controladas. Lasiembra se realizó el día 2de mayo. Los coloresindican los momentos delectura de plantas sanas.Letras diferentes indicandiferencias significativas,según LSD de Fisherprotegida (p<0.05), 25 díasdespués de la siembra.

99,1

9,6

27,617,5

37,328,5

17,5

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

CG CE PPM KB MMPs M2S M2GTratamientos

Po

rcen

taje

pla

nta

s sa

nas

10-May

12-May

14-May

18-May

20-May

27-May



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Además, la producción del antibiótico fenazínico en casi todos los medios estudiados y laactividad antagónica de los extractos de todos los medios (en cantidades equivalentes a 10 ml delcultivo orginial) sugieren que la falta de protección de la cepa UP148 crecida en los medios MMPso M2S (Fig 16) se explicaría por el bajo número de UFC/semilla en los inóculos iniciales (Tabla 9).En dichos tratamientos el número de UFC/semilla estuvo por debajo del valor aceptado comoumbral para un biocontrol efectivo (105-106 UFC/semilla), según Iswandi et al, 1987

PRODUCCIÓN DE BACTERIAS EN FERMENTADOR A ESCALA PILOTO

En la empresa fabricante de inoculantes Calister S.A. se realizó una prueba piloto creciendo lacepa UP148 por 48 h en los medios 1, 3 y 5 (Tabla 6) o en medios de uso común en la producciónde inoculantes de rizobio que contenían glicerol (G) o sacarosa (S) como fuente de carbono yextracto de levadura (E) o extracto de malta (EM) como fuente de nitrógeno (medios GE, SE oSEEM, respectivamente). El ensayo se llevó a cabo en fermentador industrial conteniendo 10 l demedio, con agitación, temperatura y pH controlados.

La cepa UP148 demostró tener una producción de biomasa similar en todos los medios utilizados,independientemente de las fuentes de carbono y nitrógeno, observándose un sensible aumento enel rendimiento cuando se usó glicerol (Tabla 10).

Tabla 11: Recuento de P. fluorescens UP148 luego de 48 h de fermentación industrial endiferentes medios

MEDIO Fuente deC

Fuente de N(adicional al extracto de

levadura)

PseudomonasUFC/ml (48h)

pH del medio(48h)

1 sacarosa - 5.3 x 109 73 sacarosa extracto de malta 5.2 x 109 6.965 glucosa NH4Cl 8.7 x 109 6.49

GE glicerol - 2.4 x 1010 6.98



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CONCLUSIONES FINALES

ENSAYOS EN CAMPO

? En los ensayos en campo se observó efecto protector del “damping-off” de las tres cepas de P.fluorescens utilizadas, en la implantación de L. corniculatus o alfalfa en las condicionesexperimentales en que se produjo enfermedad.

? Todos los tratamientos inoculados con Pseudomonas superaron, o al menos igualaron, laproducción de forraje del tratamiento testigo, al momento del corte y a la cosecha delensayo.

? De los resultados obtenidos en campo, en ningún momento se detectaron efectos negativos delas cepas bacterianas utilizadas sobre las variables cuantificadas.

? En todos los experimentos en campo se encontraron poblaciones de las cepas P. fluorescensUP143.8 y/o UP148.2 en los controles inoculados sólo con rizobio de los ensayos, aunque losniveles alcanzados fueron mucho menores que los de los tratamientos co-inoculados. Portanto, no se pudo determinar la influencia de su presencia en la colonización de rizobio,aunque de existir un efecto deletéreo en este aspecto, el mismo sería menor que el producidopor el curasemillas.

? Las poblaciones rizosféricas de P. fluorescens de cada tratamiento descendieronsignificativamente a lo largo del tiempo.

? Las poblaciones de rizobio permanecieron constantes a lo largo del tiempo durante el año2002. Las poblaciones del tratamiento Apron fueron significativamente menores que las



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correspondientes al resto. En ningún momento de muestreo las poblaciones de rizobio de lostratamientos coinoculados fue menor que la del testigo inoculado sólo con rizobio.

? En el año 2003, en alfalfa, las poblaciones de rizobio fueron inferiores con respecto a las delaño anterior. En los tres muestreos realizados hubo poblaciones por debajo del nivel dedetección. Sin embargo, los análisis estadísticos no detectaron diferencias significativas en elnúmero de UFC/g raíces entre los distintos tratamientos.

ESTUDIOS EN ALFALFA BAJO CONDICIONES CONTROLADAS

? En ensayos de protección contra la infección causada por P. debaryanum realizados bajocondiciones controladas, la inoculación con al menos una de las tres cepas de P. fluorescensmejoró el porcentaje de emergencia de alfalfa, respecto al control de enfermedad.

? En experimentos in vitro e in vivo que estudiaron la interacción entre Pseudomonas y rizobio,los resultados indicaron que la presencia de las cepas de P. fluorescens en la rizósfera dealfalfa puede o no incidir en el número de nódulos que se producen en la raíz y en la velocidadde aparición de los mismos. Sin embargo, la co-inoculación no afecta la eficiencia en lafijación biológica de nitrógeno por las cepas comerciales de S. meliloti.

? Experimentos de colonización rizosférica por Pseudomonas y rizobio demostraron que mientraslas poblaciones de Pseudomonas disminuyeron significativamente a lo largo del tiempo,independientemente de la presencia de rizobio, las poblaciones de este último se mantuvieronsiempre constantes.

? Contrastes entre tratamientos co-inoculados y tratamientos inoculados sólo con una de las trescepas de Pseudomonas, mostraron que el número de UFC de éstas/g de raíz en plantas co-inoculadas es igual o significativamente mayor que en los controles sin rizobio.



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? Ninguna de las dos especies bacterianas se vio negativamente afectada por la presencia de laotra. Las sutiles diferencias observadas entre todos los resultados podrían deberse a losdistintos valores de poblaciones bacterianas en las semillas y a la variabilidad e inconsistencianaturales que surgen a partir de datos obtenidos de experimentos en suelo.

? P. fluorescens fue capaz de colonizar eficientemente la rizosfera de alfalfa en condiciones desuelo natural no estéril, alcanzando las tres cepas niveles comparables dentro de cada ensayo.

DESARROLLO DE UN INOCULANTE EN BASE A PSEUDOMONAS

? El medio de cultivo M2G, con glicerol como fuente de carbono y extractos de malta y delevadura como fuentes de nitrógeno, es adecuado para la producción de biomasa bacteriana aescala industrial.

? En este medio se produjo el antibótico fenazínico característico de la cepa P. fluorescensUP148 implicado en su acción antagonista.

? El efecto protector de enfermedad en Lotus es independiente del medio de cultivo utilizadopara crecer el inóculo bacteriano y de la producción de antibiótico en el mismo.



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ANEXO

REGISTROS CLIMÁTICOS Y SU RELACIÓN CON EL DESARROLLO DE LA ENFERMEDAD

Se obtuvieron registros diarios de temperatura media del suelo (a 10 cm de profundidad),temperatura media del aire y precipitaciones, para cada año y localidad en el períodocomprendido entre la siembra y 10, 20, 30 y 40 días posteriores a la misma (Tablas 16, 17 y 18).



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Tabla 12. Temperatura media del suelo.Año Localidad Días post-

siembraÉpoca 1 Época 2 Época 3 Época 4

2000 Colonia 0 – 10 8.5 10.0 ---- ----0 – 20 7.6 10.6 ---- ----0 – 30 8.4 11.7 ---- ----0 – 40 9.0 11.6 ---- ----

Paysandú 0 – 10 10.3 10.8 ---- ----0 – 20 s/d 11.3 ---- ----0 – 30 s/d 12.7 ---- ----0 – 40 s/d 12.7 ---- ----

2001 Paysandú 0 – 10 13.2 14.2 15.8 16.00 – 20 12.2 14.9 15.7 16.30 – 30 13.3 15.1 16.0 16.00 – 40 14.0 15.5 15.9 s/d

2002 Canelones 0 – 10 10.1 9.6 10.9 ----0 – 20 9.9 10.2 10.3 ----0 – 30 10.0 10.1 10.6 ----0 – 40 10.2 10.3 10.5 ----

Paysandú 0 – 10 10.8 11.8 12.8 ----0 – 20 10.9 11.4 11.9 ----0 – 30 11.0 11.9 12.0 ----0 – 40 11.4 11.7 12.8 ----

2003 Canelones 0 – 10 9,9 10.8 10.5 ----0 – 20 10.2 11.1 11.0 ----0 – 30 10.7 11.4 11.1 ----0 – 40 10.7 11.6 11.0 ----

Paysandú 0 – 10 13.4 10.8 10.9 ----0 – 20 12.1 10.9 11.7 ----0 – 30 11.9 11.6 11.6 ----0 – 40 12.0 11.5 11.7 ----



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Tabla 13. Temperatura media del aireAño Localidad Días post-


2000 Colonia 0 – 10 9.0 8.9 ---- ----0 – 20 7.8 9.5 ---- ----0 – 30 8.3 11.0 ---- ----0 – 40 8.7 10.7 ---- ----

Paysandú 0 – 10 9.4 11.1 ---- ----0 – 20 7.9 10.9 ---- ----0 – 30 8.7 12.6 ---- ----0 – 40 9.1 12.5 ---- ----

2001 Paysandú 0 – 10 13.4 16.7 15.8 15.00 – 20 11.0 16.0 15.0 15.60 – 30 13.3 15.4 15.4 14.80 – 40 14.1 15.5 14.9 s/d

2002 Canelones 0 – 10 8.3 7.7 10.7 ----0 – 20 8.3 8.4 9.6 ----0 – 30 8.3 9.0 10.2 ----0 – 40 9.3 9.5 9.9 ----

Paysandú 0 – 10 8.5 12.0 12.6 ----0 – 20 9.7 10.7 11.0 ----0 – 30 9.5 11.5 11.1 ----0 – 40 10.4 10.9 12.7 ----

2003 Canelones 0 – 10 9.6 9.6 10.0 ----0 – 20 9.5 9.8 10.2 ----0 – 30 9.9 9.9 10.8 ----0 – 40 10.3 10.5 10.1 ----

Paysandú 0 – 10 11.0 8.5 10.5 ----0 – 20 10.9 9.8 12.0 ----0 – 30 10.9 10.9 11.6 ----0 – 40 11.1 10.8 11.7 ----



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Tabla 14. PrecipitacionesAño Localidad Días post-


2000 Colonia 0 – 10 110.0 0.0 ---- ----0 – 20 110.0 4.1 ---- ----0 – 30 110.0 35.3 ---- ----0 – 40 114.1 44.0 ---- ----

Paysandú 0 – 10 85.8 1.0 ---- ----0 – 20 86.0 13.2 ---- ----0 – 30 87.0 66.2 ---- ----0 – 40 98.8 66.6 ---- ----

2001 Paysandú 0 – 10 23 0.2 19.6 77.20 – 20 28.2 41.4 85.2 139.40 – 30 34 85.6 150.2 152.60 – 40 108.6 150.4 160.2 s/d

2002 Canelones 0 – 10 0.0 8.0 65.9 ----0 – 20 8.5 67.9 68.9 ----0 – 30 68.9 68.9 81.7 ----0 – 40 74.2 81.7 83.3 ----

Paysandú 0 – 10 1.0 76 44 ----0 – 20 38.6 77.4 6.8 ----0 – 30 78.2 82 11.8 ----0 – 40 82.6 84 34.4 ----

2003 Canelones 0 – 10 10.5 10.5 16.6 ----0 – 20 27.1 27.1 72.6 ----0 – 30 83.1 83.1 72.6 ----0 – 40 83.1 83.1 89.6 ----

Paysandú 0 – 10 9.2 13.4 33.7 ----0 – 20 22.6 16.2 200.7 ----0 – 30 31 193.6 215.3 ----0 – 40 204.2 195.6 225.3 ----

s/d – sin datos



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Las tablas 12 a 14 ofrecen información relevante para caracterizar las condiciones climáticas enlas etapas iniciales de los diferentes ensayos (ambientes).

Los ambientes más favorables para la ocurrencia de enfermedades de implantación causadas porfitopatógenos del suelo son aquellos en los cuales la temperatura de suelo es baja y lasprecipitaciones son abundantes hasta 20 días después de la siembra.

Observando los registros se puede apreciar que, exceptuando el año 2001, en todos los años almenos en una época de siembra se cumplieron los requerimientos de temperatura yprecipitaciones que favorecen la ocurrencia de “damping-off”. Esto evidencia cuán frecuentepuede llegar a ser esta problemática, en la medida que el período de implantación de la pasturaocurra en aquellos meses del año en los cuales existe una alta probabilidad de bajas temperaturasy abundantes precipitaciones.

Si bien el número de ambientes en los que se registraron condiciones favorables para laocurrencia de enfermedad fue considerable (11 en un total de 20), el análisis estadísticoindividual por experimento determinó que el número de ambientes en los que se observarondiferencias significativas entre el testigo y los tratamientos protegidos fue bajo (6 para L.corniculatus y 2 para alfalfa).

Las diferencias registradas no siempre fueron estadísticamente significativas. Sin embargo, en lafigura 28 se observa que los tratamientos protegidos siempre tuvieron una implantación superioral testigo. En especial, cabe señalar que del análisis individual y conjunto de la serie deexperimentos no se desprenden efectos negativos de las cepas utilizadas sobre las variablescuantificadas para ambas leguminosas (L. corniculatus y alfalfa).



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