UNIVERSIDADE CEUMA - UNICEUMA
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO
PROGRAMA DE MESTRADO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA
ARUANÃ JOAQUIM MATHEUS COSTA RODRIGUES PINHEIRO
INVESTIGAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E ANTI-INFLAMATÓRIA DA
FRAÇÃO ACETATO DE ETILA DE FOLHAS DA ESPÉCIE Punica granatum L.
SÃO LUIS
2015
ARUANÃ JOAQUIM MATHEUS COSTA RODRIGUES PINHEIRO
INVESTIGAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E ANTI-INFLAMATÓRIA DA
FRAÇÃO ACETATO DE ETILA DE FOLHAS DA ESPÉCIE Punica granatum L.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Biologia Parasitária da
Universidade CEUMA, como requisito parcial
para a obtenção do título de Mestre em
Biologia Parasitária.
Orientador: Prof. Dr. Lídio Gonçalves Lima
Neto
Co-orientador: Prof. Dr. Eduardo Martins de
Sousa
SÃO LUIS
2015
ARUANÃ JOAQUIM MATHEUS COSTA RODRIGUES PINHEIRO
INVESTIGAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E ANTI-INFLAMATÓRIA DA
FRAÇÃO ACETATO DE ETILA DE FOLHAS DA ESPECIA Punica granatum L.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Biologia Parasitária da
Universidade CEUMA, como requisito parcial
para a obtenção do título de Mestre em
Biologia Parasitária.
A Comissão julgadora da Defesa do Trabalho Final de Mestrado em
Biologia Parasitária, em sessão pública realizada no dia ___/___/___,
considerou o candidato:
( ) APROVADO ( ) REPROVADO
1) Examinador __________________________________________
2) Examinador __________________________________________
3) Examinador __________________________________________
4) Presidente (Orientador) _________________________________
A minha mãe, mulher de fé e fibra,
pelo seu apoio, incentivo, dedicação
e amor incondicional.
AGRADECIMENTOS
Ao Ser maior e único, a força e o horizonte, o poder e o amor, o Rei eterno e imortal,
invisível aos olhos, mas real ao coração. Só tenho a agradecer a tí, Jesus!
A minha mãe, Flávia Thereza Costa Rodrigues, minha melhor amiga, minha eterna
companheira; pelo apoio, orações, incansável estímulo e amor imensurável. A
mulher que sozinha me ensinou o que é ser homem. Obrigado é insuficiente, mas a
minha admiração, essa sim é de verdade. Te amo muito!
Ao meu pai que mesmo distante, nunca negou quaisquer gestos para com seus
filhos.
Aos meus irmãos Thainara Thereza Costa Rodrigues e Taynã Lucas Costa
Rodrigues, pelo apoio e incentivo em todos os momentos da minha vida. Só tenho a
agradecer.
Ao meu padrasto Raimundo Monteiro Silva (André), por se fazer de figura paterna
desde a minha infância me ensinando o que era preciso, contribuindo ativamente
para a figura que sou hoje.
A minha afilhada Giulia Helena, que mesmo sem saber ainda, move a minha vida de
uma forma inexplicável. Te amo infinito!
A todos os meus familiares pelas orações e força.
Ao meu orientador, Dr. Lídio Gonçalves Lima Neto, pessoa que me ensinou a pensar
cientificamente e me inseriu na pesquisa desde a graduação e sempre me serviu de
exemplo em profissionalismo e amor à ciência. Obrigado por todas as
oportunidades, conselhos, puxadas de orelha e tudo mais. Palavras não descrevem
o tamanho da minha admiração pela sua pessoa. Minha gratidão eterna. E que
venha o doutorado.
Ao meu co-orientador, Dr. Eduardo Martins de Sousa, pela ajuda em todos os
momentos da pesquisa.
As alunas de Iniciação Científica Ádylla Dourado e Jaciara Gonçalves, pela
participação ativa nos experimentos. A ajuda de vocês foi e é indiscutível.
As professoras Iracelle Abreu, Selma do Nascimento, Elizabeth Fernandes, Natilene,
Lanna e Marisa, pela participação em pontos chaves dos testes.
Ao professor Raimundo Antônio e ao Centro de Pesquisa Clínica da UFMA
(CEPEC), pelo auxílio na leitura das lâminas de contagem celular.
A Fundação de Amparo a Pesquisa do Maranhão (FAPEMA) pelo financiamento do
projeto.
A todos os colegas da turma VII do mestrado em Biologia Parasitária, pelo convívio
harmonioso e interativo. Sinto-me no dever de citar cada um: Camilla, Mariana,
Ennio, Enzo, João, Thiago, Domingos, Erika, Cristiane e em especial aos meus
grandes amigos e companheiros de todos os dias Adrielle e Mateus.
A todos os pesquisadores do Laboratório de Imunologia e Microbiologia das
Infecções Respiratórias - LIMIR da UNICEUMA que colaboraram para a realização
desse trabalho.
A todos que direta e indiretamente fizeram parte desse projeto.
“Eis o meu segredo: só se vê bem
com o coração. O essencial é
invisível aos olhos.”
(Antoine de Saint-Exupéry)
RESUMO
O alto índice de resistência bacteriana a antibióticos e os efeitos adversos
exacerbados dos anti-inflamatórios disponíveis justificam a necessidade da busca de
novos medicamentos com essas ações farmacológicas. Dentre as espécies vegetais
utilizadas na medicina popular para tais finalidades, destaca-se a Punica granatum
L.. Nesse contexto, nosso trabalho teve como objetivo avaliar a ação antimicrobiana
e anti-inflamatória da fração acetato de etila (AcOEt) de folhas da Punica granatum
L. Para isso, o extrato hidroalcoólico foi preparado a partir das folhas da espécie
com extração a frio seguida de fracionamento com acetato de etila. Para avaliar a
atividade antimicrobiana realizaram-se testes de difusão em ágar, assim como,
determinação das Concentrações Inibitória Mínima (CIM) e Bactericida Mínima
(CBM) frente a cepas das bactérias relacionadas à infecção respiratória. Além disso,
avaliou-se a atividade anti-inflamatória do extrato in vivo em modelo de dano
pulmonar agudo induzida por LPS (30.000UE/10µg/50µL/animal). Trinta animais
foram divididos em cinco grupos onde receberam tratamento oral com extrato a
30mg/kg, 100mg/kg; Dexametasona 5mg/kg ou PBS e após uma hora foram
induzidos ou não a inflamação por instilação intranasal. Após seis horas da indução,
sangue total e lavado broncoalveolar (LBA) foram coletados para análise. A AcOEt
inibiu o crescimento de S. pyogenes, S. pneumoniae, S. aureus, MRSA, A.
baumannii e P. aeruginosa. Em relação à atividade anti-inflamatória do extrato,
observou-se que a AcOEt reduziu a migração celular, principalmente de neutrófilos,
para os pulmões dos camundongos com dano pulmonar agudo. Da mesma forma, a
AcOEt reduziu concentrações de albumina indiretamente relacionada com o
extravasamento plasmático. Por outro lado, a AcOEt não alterou as concentrações
de TNF-α e IL-10 do LBA em animais com dano pulmonar agudo. Em conclusão, a
AcOEt mostrou ser um potencial agente antimicrobiano e anti-inflamatório.
Palavras-chave: Punica granatum L., Romã, Antimicrobiano; Anti-inflamatório.
ABSTRACT
The high rate of bacterial resistance to antibiotics and the exacerbated side effects of
the anti-inflammatory drugs justify the needed to search for new drugs. The Punica
granatum L is a plant used in folk medicine to treat acute respiratory infectious due to
his potential anti-inflammatory and antimicrobial effects. In this context, our study
evaluated the antimicrobial and anti-inflammatory of ethyl acetate fraction (EtOAc)
prepared from Punica granatum L. leaves. For this, the hydroalcoholic extract was
prepared from leaves of Punica granatum L. using a cold extraction followed by
fractionation with ethyl acetate. To evaluate the antimicrobial activity of EtOAc were
performed agar diffusion tests as well as were determined the Minimum Inhibitory
Concentrations (MIC) and Minimum Bactericidal (MBC) against bacteria related with
respiratory infections. In addition, it was evaluated the anti-inflammatory activity of
the extract in vivo model of acute lung inflammation induced by LPS
(30.000UE/10mg/50µL/animal). Thirty animals were divided into five groups that
received oral treatment with the extract 30mg/kg, 100mg/kg; Dexamethasone 5mg/kg
or PBS and after one hour or they were not induced inflammation by intranasal
instillation. After six hours of induction, whole blood and bronchoalveolar lavage fluid
(BALF) samples were collected for analysis. The EtOAc inhibited the growth of S.
pyogenes, S. pneumoniae, S. aureus, MRSA, A. baumannii and P. aeruginosa. In
relation to the anti-inflammatory activity of EtOAc, it was observed that EtOAc
reduces cell migration, especially neutrophils in BALF, to the lungs. Likewise, the
EtOAc reduced albumin concentrations suggesting a reduction in plasma
extravasation. On the other hand, the EtOAc did not affect the levels of TNF-α and
IL-10 in the BALF. In conclusion, the EtOAc may be a potential antimicrobial and
anti-inflammatory agent.
Keywords: Punica granatum L., Pomegranate, Antimicrobial, Anti-inflammatory.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Árvore da espécie Punica granatum L........................................................ 30
Figura 2: Análise da celularidade do sangue periférico de camundongos. (A)
Leucócitos Totais; (B) Células Mononucleares; (C) Polimorfonucleares................... 53
Figura 3: Análise da celularidade do lavado broncoalveolar de camundongos. (A)
Leucócitos Totais; (B) Células Mononucleares; (C) Polimorfonucleares................... 55
Figura 4: Dosagem de citocinas do sobrenadante do lavado broncoalveolar. (A) TNF-
α; (B) IL-10................................................................................................................. 57
Figura 5: Dosagem de albumina no lavado broncoalveolar....................................... 58
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Constituintes e meio para identificação de antocianidinas e
flavoóides................................................................................................................... 38
Tabela 2: Constituintes e meio para identificação de leucoantocianidinas, catequinas
e flavanonas............................................................................................................... 39
Tabela 3: Metabólitos secundários encontrados em extrato e frações obtidas das
folhas da Punica granatum L..................................................................................... 48
Tabela 4: Avaliação da atividade antimicrobiana da AcOEt por teste de difusão em
ágar............................................................................................................................ 50
Tabela 5: Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração
Bactericida Mínima (CBM) da AcOEt......................................................................... 51
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AcOEt Fração acetato de etila
AINE Anti-inflamatório não-esteroidal
ATCC Coleção americana de tipo celular
BHI Caldo de infusão de cérebro e coração
C.N. Controle negativo
CBM Concentração bactericida mínima
CEUA Comissão de ética no uso de animal
CIM Concentração inibitória mínima
CLSI Instituto de padrões clínicos e laboratoriais
COX Cicloxigenase
DAMP Padrões moleculares associados ao perigo
DEXA Dexametasona
E100 Fração acetato de etila 100mg/kg
E30 Fração acetato de etila 30mg/kg
ELISA Ensaio imunoenzimático
EU Unidades de Endotoxina
EUA Estados Unidos da América
FCl Fração clorofórmica
FHe Fração hexânica
HIV Vírus da imunodeficiência humana
IL-10 Interleucina 10
LPS Lipopolissacarídeo
MRSA Staphylococcus aureus resistente a meticilina
MyD88 Diferenciação mielóide 88
PAMP Padrões moleculares associados a patógenos
PBS Tampão fosfato salino
pH Potencial de hidrogênio
PMN Polimorfonucleares
PRR Receptores de reconhecimento padrão
TLR Receptores do tipo toll
TNF-α Fator de necrose tumoral alpha
UFMA Universidade Federal do Maranhão
UniCEUMA Universidade CEUMA
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO....................................................................................................... 17
1.1 Infecções e resistência bacteriana.................................................................. 17
1.2 Aspectos gerais da inflamação........................................................................ 20
1.3 Medicina complementar, produtos naturais e fitoterapia............................. 26
1.4 Punica granatum L............................................................................................ 29
2 OBJETIVOS............................................................................................................ 34
2.1 OBJETIVO GERAL..............................................................................................34
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS................................................................................34
3. MATERIAL E MÉTODOS...................................................................................... 35
3.1 Obtenção e preparo das folhas de Punica granatum L.................................. 35
3.2 Extrato hidroalcoólico....................................................................................... 35
3.3 Fração acetato de etila...................................................................................... 36
3.4 Análise fitoquímica dos extratos...................................................................... 36
3.4.1 Teste para fenóis e taninos............................................................................... 37
3.4.2 Teste para antocianidinas e flavonóides........................................................... 37
3.4.3 Teste para leucoantocianidinas, catequinas e flavonas.................................... 38
3.4.4 Teste para esteroides e triterpenóides.............................................................. 39
3.4.5 Teste para saponina......................................................................................... 39
3.4.6 Teste para cumarina......................................................................................... 40
3.5 Atividade antimicrobiana in vitro......................................................................40
3.5.1 Microorganismos utilizados............................................................................... 40
3.5.2 Preparo das suspensões bacterianas............................................................... 41
3.5.3 Avaliação da sensibilidade bacteriana.............................................................. 41
3.5.4 Determinação das Concentrações Inibitória Mínima (CIM) e Bactericida Mínima
(CBM)......................................................................................................................... 42
3.6 Atividade anti-inflamatória in vivo.................................................................... 43
3.6.1 Animais..............................................................................................................43
3.6.2 Modelo experimental de inflamação respiratória.............................................. 43
3.6.3 Obtenção do sangue total e lavado broncoalveolar dos animais...................... 44
3.6.4 Contagem total e diferencial de leucócitos....................................................... 44
3.6.5 Quantificação das citocinas por ELISA............................................................. 45
3.6.6 Dosagem de Albumina...................................................................................... 45
3.7 Análise estatística.............................................................................................. 46
4 RESULTADOS........................................................................................................ 47
4.1 Análise fitoquímica do extrato hidroalcoólico da Punica granatum L. e
frações...................................................................................................................... 47
4.2 Atividade antimicrobiana...................................................................................48
4.2.1 Ágar de difusão................................................................................................. 48
4.2.2 Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima
(CBM)......................................................................................................................... 50
4.3 Atividade anti-inflamatória................................................................................ 51
4.3.1 Contagem total e diferencial de leucócitos no sangue periférico...................... 51
4.3.2 Contagem total e diferencial de leucócitos no lavado broncoalveolar.............. 54
4.3.3 Dosagem de citocinas do lavado broncoalveolar.............................................. 56
4.3.4 Dosagem de Albumina...................................................................................... 58
5 DISCUSSÃO........................................................................................................... 59
6 CONCLUSÃO......................................................................................................... 69
REFERÊNCIAS.......................................................................................................... 70
17
1 INTRODUÇÃO
1.1 Infecções e resistência bacteriana
As infecções por micro-organismos no ser humano já se tornaram uma
problemática mundial, pois a quantidade de admissões hospitalares seguidas de
morte vem aumentando a cada dia e esse problema não ocorre somente em
hospitais. As infecções adquiridas na comunidade podem ser incluídas nesses
índices, podendo até evoluir a quadros mais graves antes mesmo de uma
intervenção médica. A grande causa disso é a capacidade das bactérias de
adquirirem resistência aos antibióticos, mesmo com os avanços da tecnologia no
desenvolvimento de novas drogas. Um grande agravante dessa situação é que não
existe apenas um único mecanismo de resistência bacteriana, mas cada gênero
desenvolve sua própria resistência e dificulta os tratamentos convencionais
(TENOVER, 2006).
Dentre as doenças bacterianas, as infecções do trato respiratório se
destacam por serem uma das maiores causas de internação ao redor do mundo,
sendo a pneumonia responsável por 1,3 milhões de mortes de crianças por ano. A
maioria dos patógenos causadores dessas infecções são oportunistas e a
transmissão é bem mais susceptível pelo fato de ocorrer pela via respiratória e a
consequente colonização até o local da inflamação podendo evoluir a uma doença
sistêmica (SIEGEL; WEISER, 2015).
Os patógenos responsáveis por essas infecções variam de acordo com a
região do globo, mas o gênero Streptococcus se destaca como o maior causador da
pneumonia adquirida na comunidade. Levando em consideração que
18
aproximadamente 20-50% dos indivíduos saudáveis são colonizados por
Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae e Staphylococcus aureus nas
vias aérias superiores, essas espécies são grande alvo de estudos relacionados a
esse tipo de infecção (CILLONIZ et al., 2015).
Streptococcus pyogenes é uma espécie gram positiva que também se
destaca por causar desde uma faringite a doenças infecciosas graves, como um
choque séptico. Além disso, essa bactéria também vem apresentando altos índices
de resistência a antibióticos o que pode ser explicado por sua capacidade de
desenvolver fatores de virulência complexos relacionados a diversos tipos de
proteínas de parede celular codificados por esse gênero (POURHAJIBAGHER;
BAHADOR, 2015).
A espécie Staphylococcus aureus é um problema muito comum devido ao
fato dessa espécie ser parte da microbiota normal da pele. Essa espécie se torna
um maior problema nas internações hospitalares, onde possui uma alta incidência
de septicemia devido aos pacientes usarem por muito tempo acessos venosos por
cateter. Quando isso ocorre, é muito comum o isolamento de Staphylococcus aureus
resistente a Meticilina (MRSA) que é uma forma mais agressiva, resistente e
virulenta da espécie (CUERVO et al., 2015). Além disso, sabe-se que a espécie é
comumente causadora de infecções hospitalares e adquiridas na comunidade,
porém a espécie MRSA é preocupante não só pela sua resistência à meticilina, mas
também por vir apresentando resistência a outros agentes quimioterápicos, como as
quinolonas, assim a vancomicina permanece como antibiótico de escolha para o
tratamento de infecções por MRSA, no entanto há um número crescente de relatos
de isolamento de cepas VMSA (Staphylococcus aureus resistente a Vancomicina)
(BHATTACHARYA; BIR; MAJUMDAR, 2015).
19
Outros grupos de bactérias destacam-se pelo aumento da resistência a
antibióticos, como por exemplo, Acinetobacter baumannii e Klebsiella pneumoniae,
que são bactérias gram negativas responsáveis por muitos casos de infecções
hospitalares em UTI’s e com altas taxas de mortalidade (AGODI et al., 2015). Além
dessas, Pseudomonas aeruginosa, também gram negativa, é muito citada quando
se diz respeito a aumento de resistência a antimicrobianos (PAULEN et al., 2015).
A taxa no aumento de resistência bacteriana cresce a cada dia, o que é
uma consequência da evolução e adaptação microbiana que foi induzida pelo
consumo descontrolado de antibióticos. Mesmo os esforços de incentivo para a
produção de novos fármacos sejam grandes, está cada vez menor a descoberta de
novas substâncias. A maior medida para diminuir a incidência dessa resistência é o
uso racional desses medicamentos (OBOLSKI; STEIN; HADANY, 2015).
Na infecção bacteriana, o patógeno em si não é o único problema, mas
também devemos destacar os efeitos no organismo do hospedeiro, como uma
resposta imunológica exacerbada. O controle de uma infecção bacteriana aguda
envolve mecanismos de proteção imune com uma cascata de reações, desde a
migração de células para o local do dano, como a produção de citocinas e
marcadores com a finalidade de eliminar o patógeno, o que causa no organismo
reações que por vezes agravam ainda mais a sintomatologia no hospedeiro
(GRGURIC-SMITH et al., 2015). Assim, se torna comum o uso de tratamento
combinado nas infecções bacterianas utilizando drogas antimicrobianas para a
eliminação do patógeno e drogas anti-inflamatórias para amenizar os sintomas
gerados pela resposta do sistema imunológico à invasão do micro-organismo
(SUNDARARAJ et al., 2013).
20
1.2 Aspectos gerais da inflamação
A inflamação é um processo complexo e natural do organismo
imunológico contra um dano tecidual ou uma resposta biológica contra uma invasão
de patógenos. Pode ser caracterizado por uma série de eventos sequenciais, dos
quais podemos destacar vasodilatação; recrutamento, migração e infiltração celular;
aumento da permeabilidade vascular; secreção de mediadores inflamatórios, entre
outros (GONZALEZ et al., 2015).
Na resposta imune contra a invasão de patógenos, três linhas de defesas
são bem desenvolvidas pelo organismo: a primeira são as barreiras anatômicas e
naturais do corpo humano, tais como as mucosas; epitélios; suco gástrico; reflexos
como espirros e tosses; pH vaginal e estomacal. O segundo mecanismo de defesa
já é voltado à identificação e eliminação inespecífica do agente invasor que é
mediada pela imunidade inata. Essa é realizada por meio de componentes
humorais, tais como, complementos proteicos; e algumas citocinas; além de
componentes celulares, como é o caso dos monócitos, eosinófilos e das células
fagocíticas, como neutrófilos, células dendríticas e macrófagos. Finalmente, a
terceira linha de defesa do organismo é a chamada imunidade adquirida ou
adaptativa que já é específica e envolve a proliferação de linfócitos e a produção de
anticorpos (AGIER; EFENBERGER; BRZEZINSKA-BLASZCZYK, 2015).
As células fagocíticas do sistema imune inato expressam receptores de
reconhecimento de patógeno (PRRs), dentre eles os da família do TLR que são
ligados à membrana plasmática dessas células. Tais receptores reconhecem
padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) e padrões moleculares
associados ao perigo (DAMPs) o que alerta as células do hospedeiro da presença
21
do material resultante da inflamação ou do dano gerado, desencadeando assim a
produção dos consequentes padrões de resposta imune eficaz no combate do
agressor (SIMON; HILBI, 2015).
O LPS (lipopolissacarídeo) de parede celular de bactérias gram-negativas
é um forte antígeno, capaz de ativar uma resposta inflamatória tão logo quanto em
uma hora e é reconhecido pelo sistema imune através de receptores específicos
expressados na parede celular de células do sistema imunológico (DHARIWAL et
al., 2015). Os receptores do tipo Toll (Toll-like-receptors - TLR) reconhecem uma
grande variedade de substâncias e moléculas provenientes de patógenos (fungos,
bactérias, vírus) como antígenos e coordenam uma série de eventos de sinalização
desencadeando uma resposta inflamatória coordenada. Esses receptores são
expressos em várias células do sistema imune, mas principalmente e classicamente
naquelas do sistema imune inato que são mais comumente ativados por
macrófagos. O reconhecimento do LPS pelos receptores do tipo Toll inicia uma
cascata de reações que parte da produção de mediadores inflamatórios que vão
definir o tipo de resposta imune, como é o caso das citocinas (CALDWELL et al.,
2014).
As citocinas são importantes moduladoras da resposta imunológica e são
produzidas pelo estímulo das células imunes. Quando ligadas aos seus receptores
específicos, essas citocinas regulam de forma positiva ou negativa a proliferação,
ativação e diferenciação celular; mediam as reações do sistema imunológico;
induzem ou inibem a produção de outras citocinas; entre outras funções. Essas
citocinas são divididas em dois grupos de acordo com sua função e padrão da
resposta imunológica: citocinas pró-inflamatórias e anti-inflamatórias. Existe um
22
equilíbrio entre esses grupos de citocinas, o que leva a uma função adequada do
sistema imunológico (TRIFUNOVIC et al., 2015).
O fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) é uma citocina inflamatória
fundamental produzida por macrófagos expostos a patógenos. Quando liberado no
tecido, o TNF age sobre os neutrófilos aumentando a sua atividade fagocítica e a
citotoxicidade, além de estimular a degranulação e a aderência dessas células no
endotélio. Além disso, induz a febre, aumenta a produção de proteínas de fase
aguda da inflamação, estimula a produção de moléculas de adesão e aumenta o
metabolismo oxidativo de fagócitos, o que resulta na ativação da sinalização para a
expressão de moléculas e sequentemente promover a migração subendotelial de
leucócitos (PROBERT, 2015). Um pico sistêmico de TNF-α pode causar
vasodilatação e aumento da permeabilidade vascular conduzindo um
extravasamento plasmático, podendo gerar um edema local, além de estimular a
migração de leucócitos para o local do dano e estimular os macrófagos a produzirem
outras citocinas pró-inflamatórias resultando na liberação de vários mediadores
imunorreguladores. Essas respostas vasculares e celulares geram os sinais e
sintomas clássicos da inflamação como dor, calor, vermelhidão e edema
(MACHADO et al., 2014).
Os neutrófilos são polimorfonucleares granulócitos fagocíticos
considerados como primeira linha de defesa celular contra microorganismos,
neutralizando bactérias (CAO et al., 2015). Uma neutrofilia (migração excessiva de
neutrófilos) devido a uma infecção bacteriana pode resultar em uma formação de
edema, produto gerado da morte celular, causando dor e ardor no local do dano e
caso não controlado, perda da função tecidual (SCHILTER et al., 2015). Essas
células que fazem parte da imunidade inata podem matar microorganismos de
23
diversas formas, tanto os ingerindo diretamente, como liberando produtos
microbicidas como, por exemplo, as espécies reativas de oxigênio, nas imediações
(SINGH et al., 2014). Na migração celular, os neutrófilos respondem a um amplo
número de eventos quimiotáxicos por ativação de integrinas e produção de citocinas
inflamatórias (NIYONSABA et al., 2013). As moléculas de adesão (selectinas e
integrinas) promovem a fixação e rolamento dos leucócitos pelo epitélio dos vasos
sanguíneos promovendo seu rolamento até o local do dano por um gradiente
quimiotáxico (MA et al., 2013).
O processo de quimiotaxia dos leucócitos é dependente da liberação de
compostos quimiotáxicos no local da lesão, tais como produtos liberados pelo
próprio agente infeccioso, ou até mesmo substâncias que foram previamente
liberadas pelas células imunes residentes, como partes do sistema complemento,
quimiocinas e citocinas e até mesmo mediadores lipídicos como os leucotrienos.
Assim, as células que migraram podem liberar mais mediadores o que resulta na
amplificação da resposta inflamatória (COLLINS et al., 2015).
A migração celular, assim como a liberação de citocinas e quimiocinas
fazem com que forme um excesso de material intersticial, o que provoca o inchaço,
vermelhidão e edema no local do dano. O extravasamento de proteínas para
cavidades se torna frequente e no caso das infecções pulmonares, é comum
encontrar altas concentrações no líquido broncoalveolar que provavelmente é
secretado pelo epitélio do trato respiratório (PROHL et al., 2015).
Quando o padrão pró-inflamatório exacerba a sua resposta ao dano, o
sistema imunológico inicia a mudança do padrão de resposta para anti-inflamatório.
A interleucina 10 (IL-10) é uma citocina anti-inflamatória vital que é responsável por
defender o hospedeiro de uma resposta inflamatória exacerbada (UDDIN et al.,
24
2015). Os macrófagos alveolares são altamente regulados para evitar uma resposta
imunológica indesejada, isso é conseguido por ação da IL-10 (KAUR et al., 2015).
No início, a IL-10 era descrita apenas como uma citocina pró-inflamatória, mas agora
sabe-se que ela também está envolvida no padrão anti-inflamatório sendo
expressada por diversos tipos de células imunes, incluindo macrófagos, linfócitos e
células dendríticas (SZIKSZ et al., 2015).
Dentre os modelos de inflamação, podemos destacar o dano pulmonar
agudo que é caracterizada por hipoxemia, insuficiência respiratória, edema
pulmonar, extravasamento capilar e infiltração alveolar; comumente utilizada em
animais por instilação nasal de LPS, causando um acúmulo agudo de células
imunes no tecido pulmonar gerando edema (MOURATIS et al., 2015).
Na saúde pública, as infecções pulmonares são consideradas doenças
mais agravantes do que outras mais reconhecidas, como o HIV, câncer,
complicações cardíacas e derrames cerebrais. O LPS causa uma ativação potente e
rápida do sistema imune inato através do reconhecimento dos receptores TLR, que
após a ligação com o lipopolissacarídeo geram uma via de sinalização por meio de
moléculas de adaptação, como o MyD88 que é necessário para uma resposta
inflamatória pulmonar e posterior limpeza das bactérias dos pulmões (TANINO et al.,
2012).
As infecções pulmonares agudas são mais comumente causadas por
bactérias, onde as células imunes residentes, como os macrófagos alveolares, não
são capazes de inibir a invasão sozinha, assim ocorre a sinalização de marcadores
e expressão de citocinas para o recrutamento das células do sistema imune inato,
inicialmente de neutrófilos. O sistema imune mantém um equilíbrio na defesa contra
25
microorganismos, mas no caso esse equilíbrio é perturbado resultando em uma
lesão pulmonar persistente (XU, W. et al., 2015).
Na medicina tradicional o tratamento das reações inflamatórias é feito
com os anti-inflamatórios não-esteroidais ou glicocorticoides. (JUSTO et al., 2015). A
grande problemática desses medicamentos são os efeitos colaterais quando usados
por períodos mais prolongados, como por exemplo, danos gastrointestinais e a
supressão do sistema imune (ADEBAYO et al., 2015).
Os anti-inflamatórios não-esteroidais (AINE’s) são uma classe de
fármacos que agem sobre a glicoproteína cicloxigenase (COX), que por sua vez
pode ser classificada em duas isoformas: COX-1 (enzima produzida de forma
constitutiva) e COX-2 (enzima regulada de forma positiva durante uma resposta
inflamatória); assim, os AINE’s são classificados de acordo com a sua seletividade
sobre a isoforma da COX: podem ser inibidores não seletivos da COX, como por
exemplo o diclofenaco; ou podem ser inibidores seletivos, como é o caso do
celecoxib que é inibidor seletivo da COX-2 (MURRELL et al., 2015).
Já os glicocorticoides são hormônios essenciais na homeostase do
organismo humano e na resposta ao estresse. Além de sintetizados, podem ser
encontrados de forma endógena, produzidos no córtex supra-renal (cortisol, em
seres humanos) e sua ação é regulada da ligação específica aos seus receptores
que são amplamente presentes em órgãos alvo em todo o corpo (SPIGA et al.,
2015). Essa classe de fármaco ativa a transcrição de vários genes anti-inflamatórios
e reprimem muitos genes pró-inflamatórios (LEE, 2015). Apesar dos glicocorticoides
serem indispensáveis como drogas anti-inflamatórias pelo seu alto efeito
imunossupressor, os efeitos adversos do tratamento com essa classe de fármaco
são amplos e variam de acordo com o tempo de tratamento, a via de administração,
26
o organismo do indivíduo, entre outros fatores, variando desde problemas com a
fertilidade (LEROY et al., 2015) e até a indução da osteoporose (BRIOT; ROUX,
2015).
1.3 Medicina complementar, produtos naturais e fitoterapia
A medicina complementar e alternativa vem se destacando entre países
desenvolvidos como Canadá, Austrália, Japão e Estados Unidos, demostrando que
seus habitantes fazem uso de algum dos tratamentos como, acupuntura, dietas
especiais, homeopatia, massagens e uso de ervas medicinais, pelo menos uma vez
ao ano. As explicações para o aumento do uso de tais terapias são inúmeras, dentre
elas, a descrença com as medicações convencionais, a existência de efeitos
colaterais significativos dos mesmos, dentre outras (KOK et al., 2015).
A humanidade sempre teve que desenvolver métodos alternativos para a
manutenção da saúde e dessa forma, a flora tem sido constantemente explorada
para esta finalidade. O uso de plantas medicinais pelo homem tem sido registrado
em todas as épocas e culturas, a qual tem aprendido a tirar proveito desses recursos
naturais para aumentar assim sua chance de sobrevivência; melhorando a saúde
(CRAGG; NEWMAN, 2013).
Fitoterapia pode ser definida como a utilização de produtos derivados de
plantas como agente promotor de saúde ou medicamento. Um fitoterápico se difere
farmacologicamente de um medicamento de origem vegetal, pois esse último se
trata de uma substância isolada a partir de uma dada espécie, diferente de um
fitoterápico ou fitocomplexo que se trata de um conjunto de substâncias originadas
do metabolismo primário ou secundário de uma espécie vegetal em conjunto,
27
objetivando preservar a complexidade dessas com menos processamento, mas com
concentração determinada. Vários fatores interferem na qualidade desses
complexos, tais como, a espécie utilizada, o método de plantio e colheita, o tipo de
extração dos compostos, entre outros (PASSALI et al., 2015).
As espécies vegetais são uma importante fonte de substâncias
biologicamente ativas, ou seja, substâncias que apresentam alguma atividade sobre
o metabolismo de um organismo vivo. As plantas são produtoras de metabolitos
químicos primários e secundários, sendo o primeiro geralmente comum para a
maioria das espécies, e como o próprio nome diz, são básicos e necessários à
sobrevivência das mesmas. Já os metabólitos secundários são produzidos de forma,
quantidade e de tipos diferentes, ou seja, variam de espécie para espécie e é o que
as diferencia, pois cada espécie produz esses metabólitos como forma de destaque
entre as demais e para facilitar sua sobrevida (ASHU AGBOR; NAIDOO, 2015).
O metabolismo secundário das espécies vegetais evolui através da ação
de enzimas específicas que catabolizam precursores a fim de produzirem os
metabólitos secundários necessários, além de regularem a pressão de seleção,
otimizando a regulação, controle e localização com as condições ambientais para a
produção desses compostos (MUKHERJEE; MUKHERJEE; GHOSH, 2015).
O uso de plantas medicinais já foi reportado por aproximadamente 80%
da população mundial para cuidados primários como, tosse, inchaços, vermelhidão e
resfriado. São utilizadas cerca de 50.000 espécies diferentes, mas o número de
espécies fitoquimicamente estudadas é muito baixo (GULER; KUMUSTEKIN;
UGURLU, 2015).
A flora brasileira é constituída por uma ampla variedade de espécies que
são utilizadas na medicina popular para o tratamento de doenças e para a busca na
28
melhoria da saúde, entretanto a grande maioria não possui comprovação científica
de sua ação terapêutica. O estudo e confirmação destes produtos fundamentam a
utilização e continuidade dos estudos de diversas espécies (TRIBESS et al., 2015).
Desde as últimas décadas, quando começaram os estudos com plantas
medicinais, foi descoberto o poder dos fitocomplexos como antimicrobianos, assim
cada vez mais os estudos com diversas espécies vegetais vêm crescendo em todo o
mundo, procurando quais perfis de microorganismos cada gênero tem melhor ação
de inibição (NABAVI et al., 2015).
Em um estudo realizado por AHOUA et al. (2015) onde foi testado o
potencial antibacteriano e antifúngico de vinte e sete espécies de plantas, concluiu-
se que 18% dos extratos testados foram efetivos contra bactérias e 5% contra
fungos. Em outro estudo, MAHBOUBI et al. (2015) testaram o extrato das flores da
romã contra bactérias gram negativas e gram positivas causadoras de infecções
transmitidas por alimentos. Eles concluíram que o extrato tinha alta concentrações
de fenóis e flavonóides, o que resultou numa ação inibitória de todas as espécies
testadas.
Recentemente, vários produtos naturais vêm sido estudados com o intuito
de descobrir novas terapêuticas com ações anti-inflamatórias, mas com reduzidos
efeitos colaterais. A atividade farmacológica no processo inflamatório, assim como
em outras doenças depende de várias vias de sinalização celular e molecular,
podendo ser modulado não só para prevenir, mas também para tratar. Muitas
plantas, ervas e correlatos têm mostrado grande potencial anti-inflamatório, fazendo
as pesquisas por dados científicos que comprovem essa ação, constante no meio
acadêmico (WANG et al., 2013).
29
Dentre as espécies utilizadas comumente na medicina popular, destaca-
se a Punica granatum L., que vem sendo reportada como uma espécie de diversas
ações farmacológicas (BOROUSHAKI et al., 2014).
1.4 Punica granatum L.
A Punica granatum L., popularmente conhecida como romã, é uma planta
lenhosa e ramificada, pertencente à família Punicaceae originária do nordeste da
Índia, mas que tem sido cultivada em várias partes do mundo, como na região
mediterrânea, sul da Ásia, Arizona, entre outras. No Brasil, a espécie chegou através
dos portugueses se adaptando a climas tropicais, subtropicais, e até no semi-árido.
É pertencente a uma família pequena, tendo apenas um único gênero e duas
espécies: Punica granatum L. e Punica protopunica. Possui folhas simples e
espessas, podendo atingir de 1,5 a 5 metros de altura e seus frutos são de sabor
agradável (SHAYGANNIA et al., 2015) como pode-se observar na figura 1.
Preparações a partir da romã vêm sendo utilizadas com fins medicinais,
incluindo contra infecções bacterianas e complicações respiratórias, porém a relação
dos compostos químicos presentes na espécie com a sua respectiva ação
terapêutica ainda não é totalmente estabelecida. No entanto, nos últimos anos
houve um grande avanço no estabelecimento e identificação de metabólitos
responsáveis por certas ações farmacológicas (VILADOMIU et al., 2013).
Dentre as classes de metabólitos secundários encontrados na romã,
destacam-se os flavonóides que são uma subclasse de polifenóis e que
desempenham um importante papel na biologia dos vegetais e na saúde humana.
São conhecidos devido a fortes evidências experimentais da sua capacidade anti-
30
inflamatória e antimicrobiana, entre outras. São caracterizados por possuir dois ou
mais anéis aromáticos, um grupo hidroxila ligados por uma ponte de carbono.
Podem ser subdivididos nas seguintes subclasses: Flavonas; Flavonóis, Isoflavonas;
Flavanonas; Flavonóis; e Antocianidinas (MANSURI et al., 2014).
Figura 1. Árvore da espécie Punica granatum L.
Fonte: http://fradeonline.blogspot.com.br/2014/02/conheca-os-beneficios-da-roma-roma.html.
Existem diversas maneiras de utilização farmacológica dessa planta,
desde métodos diferentes de preparo, quanto utilização de partes diferentes, tais
como suco, óleo essencial, apenas o fruto e apenas as folhas. Dependendo do
modo a ser utilizado e até mesmo da época de colheita, pode-se encontrar
diferentes constituintes e metabólitos, dentre eles: ácido ascórbico, ácido gálico e
caféico, punicalaginas, esteroides, taninos, alcaloides, flavonóides, entre diversos
outros. Os diferentes usos da romã em fins medicinais podem ser justificados pela
vasta quantidade de metabólitos secundários produzidos pela espécie. Dentre seus
usos destacam-se a ação antitumoral e antioxidante, antidiabética e anti-
31
hipertensiva, anti-obesidade, antimicrobiana, anti-inflamatória, dentre outras
(JURENKA, 2008).
Vários estudos vêm descrevendo a ação antioxidante da romã, resultando
em uma ação antitumoral. MODAEINAMA et al. (2015) mostraram que a casca da
fruta possui altos níveis de fenóis e flavonóides, responsável pela ação antioxidante
em diversas linhagens de células tumorais. Já ASMAA et al. (2015) identificaram a
presença de saponinas, flavonóides e taninos polifenóis também na casca da fruta, o
que mostrou ser eficaz na inibição do ciclo proliferativo de células cancerígenas.
Numa revisão bibliográfica realizada por TURRINI; FERRUZZI; FIMOGNARI (2015),
foi destacada a eficácia da romã no tratamento de diversos tipos de câncer, dentre
eles, de mama, próstata, cólon, fígado, pele, pulmão, bexiga, cérebro; além de
leucemia.
No que diz respeito a ação antidiabética da romã, SALWE et al. (2015)
induziram a diabetes em ratos a partir da administração de steptozotocina e viram
que o extrato da casca do fruto e das folhas da romã foi capaz de reduzir em até
42,75% os níveis de glicose quando comparados aos animais sem tratamento. Em
outro estudo, DORSEY; GREENSPAN (2014) pesquisaram a capacidade de
diversos sucos na inibição da glicação de células mediada por albumina e frutose e
viram que de todas as frutas, a romã foi a que obteve maior concentração de
compostos fenólicos e consequentemente teve a maior porcentagem na redução da
glicação da proteína podendo chegar a 98%.
O uso da Romã como agente anti-hipertensivo vem sendo reportado em
diversos estudos. SHEMA-DIDI et al. (2014) concluíram que após a ingestão do
suco da romã três vezes por semana durante um ano, pacientes hemodinâmicos
reduziram significativamente a pressão sanguínea sistólica, o que não foi observado
32
no grupo placebo. ASGARY et al. (2013) descobriram que a ingestão diária do suco
natural da romã por homens adultos hipertensos foi capaz de produzir uma ação
hipotensiva tanto na pressão sanguínea sistólica como na diastólica.
Ainda, ZOU et al. (2014) analisaram o efeito positivo da romã na
esteatose hepática (doença do fígado gorduroso), assim como interferiu no depósito
de gordura quando se há uma dieta de alta ingestão. Já AHMED et al. (2015)
induziram a obesidade em ratos com a ingestão de uma dieta rica em gordura e
após, trataram com o suco da romã. Os resultados obtidos foram a redução
significativa dos níveis séricos de lipídeos e glicose, além da diminuição do ganho de
peso corporal.
A ação antimicrobiana da Punica granatum L. já é reportada em vários
estudos com diversas cepas bacterianas, como frente a Clostridium difficile
(FINEGOLD et al., 2014); ação do extrato fresco do fruto frente a Staphylococcus
epidermidis (BETANZOS-CABRERA et al., 2015); atividade antibacteriana do extrato
frente a Streptococcus mutans e Porphyromonas gingivalis (ROSAS-PINON et al.,
2012); entre outros estudos.
Estudos prévios com a romã evidenciaram a sua ação anti-inflamatória
em diversos modelos de indução. COSTANTINI et al. (2014) estudaram a atividade
anti-inflamatória de substâncias obtidas a partir do extrato das sementes da espécie
em cultura celular e concluíram que houve uma diminuição da dosagem de diversas
citocinas pró-inflamatórias, como TNF-α, IL-12, IL,-7, entre outras, quando foi
adicionado o extrato à cultura. Outro estudo in vitro foi o realizado por
(HOLLEBEECK et al., 2012), onde foi adicionado LPS à cultura de células do epitélio
intestinal tratadas previamente com o extrato das cascas da romã e foi observado
que após 24 horas de incubação o extrato foi capaz de reduzir a dosagem de
33
citocinas pró-inflamatórias, como IL-6 e IL-8. MINAIYAN et al. (2014) estudaram o
efeito da administração intraperitoneal do extrato das sementes da romã em
camundongos com pancreatite aguda induzida por ceruleína e observaram que o
extrato foi capaz de reduzir a dosagem de lipase sérica, além de diminuir o dano
pancreático a nível histológico. Além desses, existem estudos que evidenciam a
ação anti-inflamatória e analgésica do extrato das cascas da romã em modelo de
edema de pata em ratos com tratamento tópico (MO et al., 2013).
Portanto, devido ao aumento da taxa de resistência bacteriana de várias
espécies patogênicas, citado anteriormente; os diversos efeitos colaterais causados
pelo uso prolongado das drogas anti-inflamatórias disponíveis no mercado; e o uso
popular da Punica granatum L. (romã) na medicina popular, na sua grande maioria
para o tratamento de infecções e complicações respiratórias; se faz necessário o
estudo para a comprovação científica da utilização desta espécie com tais fins
terapêuticos.
34
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar a ação antimicrobiana e anti-inflamatória da fração acetato de etila
(AcOEt) das folhas da Punica granatum L.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Caracterizar os metabólitos secundários presentes no extrato
hidroalcoólico e suas frações;
Determinar a sensibilidade, assim como a Concentração Inibitória Mínima
(CIM) e a Concentração Bactericida Mínima (CBM) do extrato, frente a bactérias
patogênicas;
Avaliar a atividade do extrato na quimiotaxia de leucócitos em
camundongos com dano pulmonar agudo;
Avaliar a atividade do extrato nas concentrações de IL-10 e TNF-α no
lavado broncoalveolar obtido de camundongos com dano pulmonar agudo;
Avaliar a ação do extrato no extravasamento plasmático de camundongos
com dano pulmonar agudo.
35
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Obtenção e preparo das folhas de Punica granatum L.
As folhas de Punica granatum L. foram coletadas no Herbário Ático
Seabra da Universidade Federal do Maranhão - UFMA às 06:00 após estiagem de
24 horas. As folhas foram limpas com papel toalha e selecionadas, descartou-se as
folhas já secas ou com fungos para posterior processo de secagem in natura das
mesmas. Após 72 horas, as folhas foram trituradas em moinho elétrico e o pó obtido
foi medido em proveta graduada para posterior extração dos metabólitos presentes.
3.2 Extrato hidroalcoólico
O processo de extração de metabólitos das folhas foi realizado por
maceração, utilizando-se uma mistura de álcool etílico e água destilada (solução
hidroalcoólica 70%) como solvente. O volume de solvente utilizado foi três vezes
superior ao volume do soluto (pó das folhas). A mistura foi feita em frasco âmbar
fechado e mantido em constante agitação. Após 72 horas foi realizada a primeira
filtragem do extrato, com auxílio de um funil e papel filtro. O volume filtrado foi
medido em proveta graduada e o obtido foi então reposto com mais solvente para a
mistura inicial. O mesmo processo foi repetido mais duas vezes sempre a cada três
dias, sendo que na terceira vez foi obtido o filtrado final da maceração e a solução
obtida das três filtragens foi misturada e medida. Após esse processo de extração, o
volume obtido foi submetido à rotaevaporação para a eliminação da fração alcoólica
36
do extrato. O resultado final foi então liofilizado e estocado à -20ºC para posterior
fracionamento.
3.3 Fração acetato de etila
Para o fracionamento do extrato hidroalcoólico, 10g do pó liofilizado foram
pesados e dissolvidos em 200ml de uma solução hidrometanólica (9 partes de
metanol e 1 parte de água destilada) para fracionamento em funil de separação.
Para isso, foram utilizados solventes com um gradiente de polaridade crescente e de
forma sequencial: Hexano (a fim de extrair esteroides); Clorofórmio (com finalidade
de extrair os esteroides restantes) e por fim, Acetato de Etila (a fim de extrair
principalmente os flavonóides, mas também compostos fenólicos). A separação das
fases se deu pela diferença de densidade dos solventes e os compostos separavam-
se pela afinidade com o determinado solvente. No final do processo, foram obtidos
três frações: Fração Hexânica (FHe); Fração Clorofórmica (FCl); Fração Acetato de
Etila (AcOEt) e Resíduo Metanol/Água. Todas as frações foram armazenadas em
frascos âmbar e estocadas à temperatura ambiente no abrigo da luz. Para os testes
in vitro e in vivo foi utilizado a AcOEt.
3.4 Análise fitoquímica dos extratos
Foram realizados testes colorimétricos semi-quantitativos de acordo com
Matos, 2009 para a determinação dos compostos secundários presentes no extrato
hidroalcoólico e nas frações. Os testes realizados avaliaram a presença dos
seguintes metabólitos secundários: fenóis e taninos; antocianidinas e flavonóides;
37
leucoantocianidinas, catequinas e flavonas; esteroides e triterpenóides; saponina; e
cumarina. Para isso, inicialmente, separou-se três porções de 4ml em tubos de
ensaio e uma porção de 10ml em béqueres de cada extrato devidamente
identificados; este último foi secado pela metade (resíduo seco) e completado para
20ml com álcool 70%, em seguida com clarificado com carvão ativado e filtrado. As
preparações citadas foram utilizadas para a realização dos testes para identificação
dos compostos metabólitos.
3.4.1 Teste para fenóis e taninos
Para determinar a presença de fenóis e taninos foram adicionados três
gotas de solução de cloreto férrico. Após agitação, observou-se se houve variação
de sua cor ou formação de preciptado forte e escuro. A comparação foi feita com um
teste branco (água destilada + cloreto férrico). Coloração variável entre azul e o
vermelho é indicativo da presença de fenóis e a presença de um preciptado escuro
de tonalidade azul indica a presença de taninos hidrolisáveis, e verde a presença de
taninos condensados ou catéquicos.
3.4.2 Teste para antocianidinas e flavonóides
A determinação da presença de antocianidinas e flavonóides se deu
utilizando os três tubos de ensaio, sendo que, um destes foi acidificado com ácido
clorídrico 0,1M e o pH foi ajustado para 3 e os outros dois foram alcalinizados com
hidróxido de sódio 0,1M ajustando o pH para 8,5 e 11, respectivamente. O
38
surgimento de cores diversas indica a presença dos metabólitos secundários, de
acordo com a tabela 1 a seguir:
Tabela 1. Constituintes e meio para identificação de antocianidinas e flavonóides
Constituinte Cor em meio
Ácido (pH=3) Alcalino (pH=8,5) Alcalino (pH=11)
Antocianinas e
antocianidinas Vermelho Lilás Azul-púrpura
Flavona, flanonóis
e xantonas ----------------- ----------------- Amarelo
Chalconas e
auronas Vermelho ----------------- Vermelho-púrpura
Flavononóis ----------------- ----------------- Vermelho-laranja
Fonte: MATOS, 2009
3.4.3 Teste para leucoantocianidinas, catequinas e flavonas
Para a determinação de leucoantocianidinas, catequinas e flavonas foram
utilizados os tubos do teste já devidamente acidificados ou alcanizados com pH
igual a 3 e 11, respectivamente. Os tubos foram aquecidos por dois minutos e a
modificação da cor da amostra foi avaliada conforme a tabela 2:
39
Tabela 2. Constituintes e meio para identificação de leucoantocianidinas, catequinas
e flavanonas
Constituinte Cor em meio
Ácido (pH=3) Alcalino (pH=11)
Leucoantocianidinas Vermelho -----------------
Catequinas Pardo-amarelado -----------------
Flavanonas ----------------- Vermelho-laranja
Fonte: MATOS, 2009
3.4.4 Teste para esteroides e triterpenóides
Para a determinação de esteroides e triterpenóides foi adicionado 2ml de
clorofórmio ao resíduo seco presente no béquer preparado previamente.
Posteriormente, a solução foi filtrada utilizando um funil fechado com algodão e
coberto com alguns decigramas de sulfato de sódio anidro para um tubo de ensaio
bem seco. Após adicionar 1ml de andrido acético e três gotas de ácido sulfúrico
concentrado. A alteração da cor para azul evanescente ou verde permanente é
indicativo da presença de esteroides livres; e parda ou vermelha é indicativo da
presença de triterpenóides. O resíduo insolúvel foi aproveitado para a realização do
teste para a determinação de saponina.
3.4.5 Teste para saponina
Para a determinação da presença de saponina, resíduo insolúvel em
clorofórmio foi redissolvido em 10ml de água destilada e, em seguida filtrou-se a
40
solução para assim, a mesma ser fortemente agitada durante três minutos. A
formação de espuma persistente é indicativa da presença de saponina.
3.4.6 Teste para cumarina
A determinação da presença de cumarina doi realizada com o auxílio de
um capilar, onde foram colocados dois pontos do extrato de aproximadamente
1,5cm de diâmetro em um pedaço de papel filtro e deixado para secar.
Posteriormente foi adicionado sobre um dos pontos uma gota de solução aquosa de
hidróxido de potássio e o papel filtro foi levado à luz ultravioleta por três minutos. A
observação de uma fluorescência azulada, forte e bem visível na mancha é
indicativo da presença de cumarina.
3.5 Atividade antimicrobiana in vitro
3.5.1 Microorganismos utilizados
Foram utilizadas cepas de bactérias relacionadas à infecção respiratória
aguda: Streptococcus pyogenes (ATCC 19615); Streptococcus pneumoniae (ATCC
55143); Staphylococcus aureus (ATCC 25923); Haemophilus influenzae (ATCC
53876); e cepas de bactérias relacionadas à infecção hospitalar: Acinetobacter
baumannii (ATCC 19606); Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27283);
Staphylococcus aureus resistente a meticilina - MRSA (ATCC 343602) e Klebsiela
pneumoniae (ATCC 10031).
41
3.5.2 Preparo das suspenções bacterianas
Os microrganismos foram inicialmente reativados a partir das suas
culturas originais e mantidos em meio líquido BHI (Brain Heart Infusion) a 37°C por
24hs. Posteriormente as amostras foram cultivadas em placas de Ágar Nutriente a
37°C por 18-24 horas. Colônias isoladas foram então ressuspendidas em 5mL de
salina estéril até atingir uma turbidez equivalente à escala 0,5 de Mc Farland (1,5 x
108 bactérias/mL).
3.5.3 Avaliação da sensibilidade bacteriana
As bactérias foram testadas inicialmente através do método de difusão
em ágar Mueller-Hinton, onde cada placa foi semeada com 100μL do inóculo de
cada bactéria, e em seguida, foram perfurados sete poços, onde foram adicionados
30µl do extrato em cada um dos poços, nas concentrações 32mg/ml, 16 mg/ml, 8
mg/ml, 4 mg/ml e 2 mg/ml, além do Controle Negativo (Salina 0,9%) e Controle
Positivo (Cloranfenicol 1μg/ml, exceto para P. aeruginosa que foi utilizado
Ciprofloxacino 10 μg/ml) e incubadas a 37°C por 24 horas. Após incubação, foi
medido o diâmetro do halo de inibição do crescimento com o auxílio de uma régua
milimétrica. Os ensaios foram realizados em triplicata.
42
3.5.4 Determinação das Concentrações Inibitória Mínima (CIM) e Bactericida Mínima
(CBM)
A determinação da CIM foi realizada através da técnica de microdiluição
em placa. Para isso, cada suspensão microbiana foi reativada e ajustada à
quantidade de 1,5 x 108 bactérias/mL e diluídas 1:10. Após, foram transferidos para
uma placa de 96 poços distribuídos da seguinte forma: A coluna 1 foi feito o Controle
Negativo (Meio + Inóculo); a coluna 2 foi feito o Controle Positivo (Meio + Antibiótico
+ Inóculo); a coluna 3 foi feito o controle da pureza do meio (Meio puro) e as colunas
“4-12” foi realizado uma diluição seriada do extrato iniciando na concentração de 32
mg/ml, além da adição de meio e do inóculo bacteriano. O volume final foi de 200μL
por poço e os ensaios foram realizados em quadruplicatas. Após a preparação do
ensaio, a placa foi incubada a 37°C por 24 horas. A revelação da placa foi feita pela
adição de 30µL de Resazurina 0,03% por poço e incubado novamente por 30
minutos. A CIM (em mg/mL) foi a menor concentração da fração AcOEt onde não
houve mudança de coloração.
Para a determinação da CBM foi utilizada a placa do teste de CIM. Uma
alíquota de 10µL de cada poço foi inoculada em placas de Mueller Hinton e
posteriormente as placas foram incubadas a 37°C por 18-24h. A CBM foi a menor
concentração do extrato no qual não houve crescimento celular significativo sobre a
superfície do agar inoculado (90% de morte microbiana).
43
3.6 Atividade anti-inflamatória in vivo
3.6.1 Animais
Foram utilizados camundongos swiss, machos, com idade variando entre
seis a oito semanas, todos provenientes do biotério da UNICEUMA, mantidos em
condições higiênicas e em ciclo circadiano de 12 horas claro/escuro, com livre
acesso a água e alimentação ad libitum. O projeto teve aprovação na Comissão de
Ética no Uso de Animal (CEUA) sob o número 107/14 e os pesquisadores
envolvidos possuíam certificado de aprovação em curso de Bioética em
Experimentação Animal.
3.6.2 Modelo experimental de dano pulmonar agudo
Trinta animais foram utilizados nos testes, sendo que estes foram
divididos em seis grupos: Veículo+PBS (Controle Negativo - CN / N=6); Veículo+LPS
(LPS / N=6); AcOEt 30mg/kg+LPS (E30 / N=5); AcOEt 100mg/kg+LPS (E100 / N=7);
e Dexametasona+LPS (DEXA / N=6). Foi administrado, por via oral (v.o.), uma
solução de PBS como veículo (10ml/kg) nos grupos CN e CP; uma solução da
AcOEt 30mg/kg no grupo E30; uma solução da AcOEt 100mg/kg no grupo E100; e
uma solução de Dexametasona (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA) 5mg/kg no
grupo DEXA. Após uma hora, os animais foram levemente sedados com uma
mistura de Quetamina (40mg/kg) e Xilazina (5mg/kg) e a inflamação respiratória foi
induzida nos animais dos grupos LPS, E30, E100, e DEXA, através da instilação de
30.000EU/10µg/50µL/animal (25µL/narina) de lipopolissacarídeo (LPS) obtido de
44
Pseudomonas aeruginosa (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA); e no grupo CN
foi administrado 50μL (25μL/narina) de PBS. Os sinais clínicos dos animais, como
hipotermia e respiração, foram monitorados até o final do efeito sedativo.
3.6.3 Obtenção do sangue total e lavado broncoalveolar dos animais
Após seis horas da indução do dano pulmonar, os animais foram
anestesiados com uma mistura de Ketamina (80mg/kg) e Xilazina (10mg/kg) e o
sangue total foi coletado por punção cardíaca. O lavado broncoalveolar foi coletado
por punção traqueal com o auxílio de um cateter, injetando-se um volume de 1ml de
PBS estéril gelado dividido em duas vezes de 500μL, observando a inflação do
pulmão e fazendo-se a aspiração imediata. O sangue e o lavado foram utilizados
para determinação do número de leucócitos total e diferencial e o sobrenadante do
lavado para a quantificação das citocinas TNF-α e IL-10 por ELISA (Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay), além da dosagem de proteínas plasmáticas.
3.6.4 Contagem total e diferencial de leucócitos
A contagem dos leucócitos presentes no sangue total foi realizada no
mesmo dia da coleta. Em microtubos foram pipetados 400μL de solução de Turk e
adicionado 20μL da amostra (diluição 1:20); após homogeneização, a contagem foi
feita em câmara de Neubauer. A contagem dos leucócitos presentes no lavado
broncoalveolar também foi realizada no mesmo dia da coleta. Foi feita uma diluição
de 1:2 de 10μL da amostra com 10µL de solução de Turk; após homogeneização, a
contagem foi feita em Câmara de Fuchs Rosenthal. A contagem diferencial dos
45
leucócitos presentes no sangue foi realizada por esfregaço sanguíneo de uma
alíquota de 10µL da amostra em lâmina. A contagem diferencial dos leucócitos
presentes no lavado broncoalveolar foi realizada por gota espessa de uma alíquota
de 100µL da amostra em citocentrífuga (TEKLAB). A leitura das lâminas foi realizada
por microscopia ótica em objetiva de 100X com imersão a óleo através da contagem
de 100 células.
3.6.5 Quantificação das citocinas por ELISA
O sobrenadante do lavado broncoalveolar foi obtido através da
centrifugação das amostras a 2.500rpm por 5 minutos. As amostras do
sobrenadante do lavado broncoalveolar foram utilizadas para a determinação das
concentrações de IL-10 e TNF-α de acordo com as instruções do fabricante (Life
Technologies, Carlsbad, Califórnia, EUA). A quantificação das dosagens foi feita
través de uma curva padrão de cada citocina: Para IL-10, a curva variou de 2000 a
31,2pg/ml; e para TNF-α, a curva padrão variou de 1000 a 15,6pg/ml. Os resultados
foram obtidos, expressos em pg/ml e apresentados em forma de gráfico.
3.6.6 Dosagem de Albumina (proteínas plasmáticas)
A dosagem de albumina foi realizada no sobrenadante do lavado
broncoalveolar. Para isso, 25µL de amostra foram incubadas com 200µL do
Reagente de Bradford (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA) diluído 1:4 por poço.
Para comparação, foi feito uma curva padrão de Albumina (Sigma-Aldrich, St. Louis,
46
Missouri, EUA) de 1000 a 15,6µg/ml para calcular a concentração das amostras. Os
resultados foram obtidos, expressos em µg/ml e apresentados em forma de gráfico.
3.7 Análise estatística
Os resultados obtidos foram analisados utilizando o programa GraphPad
Prism 6 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) e apresentados na forma
gráfica.
Para determinação do tipo de simetria das variáveis quantitativas
contínuas foi realizado o teste de simetria de Kolmogorov-Simirnov. Par as variáveis
com distribuição assimétrica foi utilizado testes paramétricos, o teste ANOVA de uma
via seguindo por pós-teste de Newman-Keuls para comparar mais de duas
populações quanto à tendência central dos dados. Para as variáveis categóricas
foram calculadas as frequências absolutas e relativas e foram comparadas por Qui-
Quadrado ou Teste Exato de Fisher. O nível de significância estabelecido foi de
p<0,05.
47
4 RESULTADOS
4.1 Análise fitoquímica do extrato hidroalcoólico da Punica granatum L. e
frações
Após os ensaios colorimétricos específicos para avaliação da presença
dos metabólitos secundários nas folhas da Romã, pode-se observar a presença de
fenóis; taninos hidrolisáveis; flavonóides, flavonas, flavononóis e xantonas;
esteroides; saponinas; e chauconas e auronas no extrato hidroalcoólico variando
entre fracamente positivo (+), moderadamente positivo (++) e fortemente positivo
(+++). Esses metabólitos foram separados por fracionamento, sendo que na Fração
Hexânica (FHe) e na Fração Clorofórmica (FCl) foi observado a presença de
esteroides (+); por sua vez, a Fração Acetato de Etila (AcOEt) apresentou fenóis
(+++), flavonóides, flavonas, flavononóis e xantonas (+++) e saponina (+). Por fim,
no Resíduo Metanol/Água os testes mostraram a presença de fenóis (+++), taninos
hidrolisáveis (+++), saponinas (++) e chauconas e auronas (++) (tabela 3).
48
Tabela 3. Metabólitos secundários encontrados em extrato e frações obtidas das
folhas da Punica granatum L.
Metabólitos
Secundários
EXTRATO / FRAÇÕES
Extrato
hidro-
alcoólico
Fração
Hexânica
Fração
Clorofórmica
Fração
Acetato de
Etila
Resíduo
Metanol /
Água
Fenóis +++ +++ +++
Taninos
Hidrolisáveis
+++ +++
Flavonóides,
Flavonas,
Flavononóis e
Xantonas
+++ +++
Esteróides ++ + +
Saponinas ++ + ++
Chauconas e
Auronas
++ ++
Critérios adotados: +++ fortemente positivo; ++ moderadamente positivo; + fracamente
positivo.
4.2 Atividade antimicrobiana
4.2.1 Ágar de difusão
Para avaliar a capacidade antibacteriana foi utilizado o método de ágar
difusão conduzido de acordo com as normas da CLSI (Clinical and Laboratory
Standards Institute). Nos controles negativos (Salina 0,9%) não houve formação de
halo; e o extrato, assim como o controle positivo (antibiótico) inibiu, formando halo
nas cepas de S. pyogenes nas concentrações de 32mg/ml (28,0 ± 0,6mm), 16mg/ml
49
(21,6 ± 0,4mm), 8mg/ml (19,6 ± 0,4mm), 4mg/ml (17,3 ± 0,4mm) e 2mg/ml (14,6 ±
0,4mm); S. pneumoniae nas mesmas concentrações com halos de inibição de 28,3 ±
0,6mm, 24,0 ± 1,0mm, 19,7 ± 0,6mm, 14,3 ± 0,6mm e 11,0 ± 1,0mm,
respectivamente. Na cepa de S. aureus, o extrato inibiu o crescimento bacteriano
nas concentrações de 32mg/ml (18,0 ± 0mm), 16mg/ml (14,0 ± 2,0mm) e 8mg/ml
(12,0 ± 0mm); já para A. baumannii, a inibição do crescimento bacteriano se deu nas
concentrações de 32mg/ml (11,0 ± 0mm) e 16mg/ml (9,5 ± 0,7mm). Em P.
aeruginosa, o extrato inibiu o crescimento bacteriano nas concentrações de 32mg/ml
(21,0 ± 1,4mm), 16mg/ml (17,5 ± 0,7mm), 8mg/ml (13,0 ± 0mm) e 4mg/ml (9,5 ±
0,7mm) e para MRSA, a formação de halo ocorreu nas concentrações de 32mg/ml
(18,5 ± 0,7mm), 16mg/ml (15,0 ± 0mm) e 8mg/ml (12,0 ± 0mm). O extrato não inibiu
o crescimento bacteriano de H. influenzae e K. pneumoniae. O controle positivo
utilizado foi Cloranfenicol 1μg/ml, exceto para P. aeruginosa que foi utilizado
Ciprofloxacino 10 μg/ml (Tabela 4).
50
Tabela 4. Avaliação da atividade antimicrobiana da AcOEt por teste de difusão em
agar
Espécie
Halo de Inibição em mm (média ± DP)
C.P. AcOEt
32mg/ ml 16mg/ ml 8mg/ml 4mg/ml 2mg/ml
Streptococcus
pyogenes
35,6 ±
0,4
28,0 ±
0,6 21,6 ± 0,4
19,6 ±
0,4
17,3 ±
0,4
14,6 ±
0,4
Streptococcus
pneumoniae
38,0 ±
1,0
28,3 ±
0,6 24,0 ± 1,0
19,7 ±
0,6
14,3 ±
0,6
11,0 ±
1,0
Staphylococcus
aureus
26,0 ±
5,3 18,0 ± 0 14,0 ± 2,0 12,0 ± 0 0 0
Haemophilus
influenzae
45,0 ±
1,4 0 0 0 0 0
Acinetobacter
baumannii
15,5 ±
0,7 11,0 ± 0 9,5 ± 0,7 0 0 0
Pseudomonas
aeruginosa 47,0 ± 0
21,0 ±
1,4 17,5 ± 0,7 13,0 ± 0 9,5 ± 0,7 0
MRSA 27,0 ±
1,4
18,5 ±
0,7 15,0 ± 0 12,0 ± 0 0 0
Klebsiela
pneumoniae
39,0 ±
5,7 0 0 0 0 0
Controle Positivo: Cloranfenicol 1μg/ml, exceto para P. aeruginosa que foi utilizado
Ciprofloxacino 10 μg/ml | Controle Negativo: Salina 0,9%
4.2.2 Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima
(CBM)
Os testes de microdiluição em placa de 96 poços com revelação por
Resazurina 0,03%, seguido da semeadura em placas de Mueller-Hinton mostraram
a concentração mínima do extrato capaz de inibir o crescimento bacteriano e
51
também a menor concentração capaz de matar as bactérias. Para S. pyogenes tanto
a CIM quanto a CBM foi de 2mg/ml; enquanto que para S. pneumoniae o valor da
CIM e CBM foi de 0,5mg/ml. S. aureus apresentou uma CIM de 1,25mg/ml e uma
CBM de 2,5mg/ml; já para A. baumannii tanto a CIM quanto a CBM foi de 2mg/ml.
Para P. aeruginosa, a CIM apresentou um valor de 8mg/ml e a CBM de 16mg/ml;
enquanto para MRSA, a CIM foi de 0,256mg/ml e a CBM de 1,024mg/ml (Tabela 5).
.
Tabela 5. Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração
Bactericida Mínima (CBM) da AcOEt
Espécie CIM (mg/ml) CBM (mg/ml)
Streptococcus pyogenes 2 2
Streptococcus pneumoniae 0,5 0,5
Staphylococcus aureus 1,25 2,5
Acinetobacter baumannii 2 2
Pseudomonas aeruginosa 8 16
MRSA 0,256 1,024
4.3 Atividade anti-inflamatória
4.3.1 Contagem total e diferencial de leucócitos no sangue periférico
Como observado na figura 2A, a contagem total de leucócitos do sangue
revelou que o grupo LPS (32.500 ± 23.729) apresenta um aumento no número
destas células em relação ao grupo C. N. (22.833 ± 10.759). Os dois grupos tratados
com o extrato, E30 (30.800 ± 16.679) e E100 (20,571 ± 7.913) não reduziram a
contagem de leucócitos, assim como o grupo DEXA (17.333 ± 6.918). Na figura 2B,
52
onde é ilustrada a quantidade de células mononucleares, o grupo LPS (21.870 ±
16.195) mostrou um aumento na contagem dessas células em relação ao grupo C.N.
(21.008 ± 9.951). Por outro lado, os grupos testes mostraram uma redução em
relação grupo LPS, tanto o grupo E30 (18.724 ± 11.472); o grupo E100 (14.230 ±
5.379); e o grupo DEXA (11.915 ± 4.806), porém não houve diferença
estatisticamente significativa. Na contagem de polimorfonucleares (Figura 2C), o
grupo LPS (10.890 ± 7.423) apresentou um aumento significativo (p<0,05) na
contagem celular quando comparado ao grupo C.N. (1.825 ± 1.037). Quando os
grupos testes foram comparados ao grupo LPS, nenhum deles apresentou redução
significativa (E30 - 9.946 ± 6.232), (E100 - 6.295 ± 2.625); e (DEXA - 5.418 ± 2.116).
53
Figura 2. Análise da celularidade do sangue periférico de camundongos. Os grupos foram
identificados como: veículo+veículo (C.N. - Controle Negativo); veículo+LPS (LPS); AcOEt
30mg/kg+LPS (E30); AcOEt 100mg/kg+LPS (E100); e Dexametasona 5mg/kg+LPS (DEXA).
(A) Leucócitos Totais; (B) Células Mononucleares; (C) Polimorfonucleares - PMN. * p<0,05
quando comparados com o grupo controle negativo.
A
B
C
54
4.3.2 Contagem total e diferencial de leucócitos no lavado broncoalveolar
Na contagem total de leucócitos do lavado broncoalveolar demostrado na
figura 3A, o grupo LPS (58.733 ± 13.629) mostrou um aumento de doze vezes na
quantidade de células quando comparado ao grupo C.N. (4.883 ± 957) e essa
diferença foi estatisticamente significante (p<0,05). Além disso, os grupos E30
(49.540 ± 10.968); E100 (35.814 ± 12.004); e DEXA (20.200 ± 6.099) tiveram uma
redução na contagem dessas células; e quando comparados ao grupo C. P., os
grupos E100 e DEXA apresentaram significância estatística. A figura 3B ilustra os
resultados da contagem de mononucleares, onde não houve diferença entre os
grupos controle negativo - C.N. (4.814,8 ± 922,8) e LPS (4.028,2 ± 1.499,4). Os
animais com inflamação pulmonar e tratados com uma dose de 30mg/kg do extrato
(grupo E30) não mostrou redução na contagem de mononucleares (3.245,0 ± 798,0),
por outro lado o grupo E100 (2.936,1 ± 1.104,9) reduziu significativamente a
contagem quando comparado ao grupo C.N.; e o grupo DEXA (1.096,7 ± 543,5) teve
redução significativa tanto comparado ao grupo C.N., quanto ao grupo LPS. Na
contagem de polimorfonucleares (Figura 3C), o grupo LPS (54.813,0 ± 12.677,7)
mostrou um aumento significativo quando comparado ao grupo C.N. (59,3 ± 33,3).
Além disso, os grupos E30 (46.291,8 ± 10,377,7); E100 (32.878,1 ± 11.115,6); e
DEXA (19.101,3 ± 5.587,9) apresentaram uma redução na contagem dessas células
e, quando comparados ao grupo LPS, os grupos E100 e DEXA tiveram redução
estatisticamente significativa.
55
Figura 3. Análise da celularidade do lavado broncoalveolar de camundongos. Os grupos
foram identificados como: veículo+veículo (C.N. - Controle Negativo); veículo+LPS (LPS);
AcOEt 30mg/kg+LPS (E30); AcOEt 100mg/kg+LPS (E100); e Dexametasona 5mg/kg+LPS
(DEXA). (A) Leucócitos Totais; (B) Células Mononucleares; (C) Polimorfonucleares - PMN. *
p<0,05 quando comparados com o grupo controle negativo; # p<0,05 quando comparados
com o grupo LPS.
A
B
C
56
4.3.3 Dosagem de citocinas do lavado broncoalveolar
A figura 4 mostra as dosagens de citocinas realizadas no sobrenadante
do lavado broncoalveolar coletado dos animais. A dosagem de TNF-α (Figura 4A)
mostrou que o grupo LPS (3.574,0 ± 1.636,9) teve um aumento estatisticamente
significativo comparado ao grupo C.N. (87,7 ± 35,5). Os grupos tratados com a
AcOEt tiveram uma redução nessa dosagem, porém não apresentaram diferença
significativa; tanto o grupo E30 (2.198,8 ± 63,9), quanto o grupo E100 (2.772,0 ±
680,4). Por outro lado o grupo tratado com dexametasona - DEXA (985,1 ± 747,1)
apresentou uma redução significativa quando comparado ao grupo LPS. Na
dosagem de IL-10 (Figura 4B), o grupo LPS (21,3 ± 9,4) teve uma redução
significativa estatisticamente quando comparado ao grupo C.N. (36,6 ± 6,6). Todos
os grupos tratados (E30 - 31,6 ± 6,6 | E100 - 24,2 ± 7,4 | DEXA - 34,4 ± 6,9)
apresentaram um aumento na dosagem quando comparados ao grupo LPS, apesar
de não ter sido estatisticamente significativo.
57
Figura 4. Dosagem de citocinas do sobrenadante do lavado broncoalveolar. Os grupos
foram identificados como: veículo+veículo (C.N. - Controle Negativo); veículo+LPS (LPS);
AcOEt 30mg/kg+LPS (E30); AcOEt 100mg/kg+LPS (E100); e Dexametasona 5mg/kg+LPS
(DEXA). (A) TNF-α; (B) IL-10. * p<0,05 quando comparados com o grupo controle negativo;
# p<0,05 quando comparados com o grupo LPS.
A
B
58
4.3.4 Dosagem de Albumina
A figura 5 demonstra a dosagem de albumina no lavado broncoalveolar.
Os resultados obtidos mostram que o grupo LPS (228,5 ± 41,5) apresentou um
aumento significativo na dosagem quando comparado ao grupo C.N. (39,8 ± 30,6).
Além disso, todos os grupos tratados apresentaram redução nas dosagens em
relação ao grupo LPS, sendo que o grupo E30 (138,8 ± 40,2) não apresentou
diferença significativa, diferente dos grupos E100 (120,5 ± 42,8) e DEXA (76,1 ±
38,8) onde a redução foi estatisticamente significante quando comparado ao grupo
LPS.
Figura 5. Dosagem de albumina no lavado broncoalveolar. Os grupos foram identificados
como: veículo+veículo (C.N. - Controle Negativo); veículo+LPS (LPS); AcOEt 30mg/kg+LPS
(E30); AcOEt 100mg/kg+LPS (E100); e Dexametasona 5mg/kg+LPS (DEXA). * p<0,05
quando comparados com o grupo controle negativo; # p<0,05 quando comparados com o
grupo LPS.
59
5 DISCUSSÃO
A Punica granatum L. (Romã), assim como muitas outras plantas usadas
com fins medicinais, possui várias classes de metabólitos químicos secundários em
diversas estruturas, como folha, fruto, semente, flores, casca, entre outros; com
diferentes atividades biológicas (SYED et al., 2013).
Os resultados encontrados na análise fitoquímica do extrato hidroalcoólico
da romã mostraram a presença de fenóis; taninos hidrolisáveis; flavonóides,
flavonas, flavononóis e xantonas; esteroides; saponinas; e chauconas e auronas.
Em um estudo realizado por PHATTHALUNG; CHUSRI; VORAVUTHIKUNCHAI
(2012) na Tailândia, foi estudado a ação de vários extratos frente à Acinetobacter
baummannii e, na análise fitoquímica do pericarpo da Punica granatum L.,
concluíram que a presença de taninos hidrolisáveis e flavonóides, tais compostos
também achados em nosso estudo, foram alguns dos metabólitos secundários
responsáveis por tal ação. MENA et al. (2012) realizaram um estudo onde
objetivaram identificar os compostos presentes no suco da romã por métodos
cromatográficos e detectaram quantidades significativas de flavonóides, taninos,
compostos fenólicos, resultados também semelhantes aos achados em nosso
estudo e comprova por uma metodologia mais sensível que há a presença desses
compostos. Além desses, NAYAK et al. (2013) avaliaram a ação cicatrizante do
extrato da casca do fruto da romã em modelo de indução de ferida em murinos e
viram na análise fitoquímica a presença de saponinas, taninos e flavonóides,
resultados também encontrados na nossa pesquisa, só que nas folhas da espécie, o
que mostra que os metabólitos coincidem em partes diferentes, mas dentro da
mesma espécie. Outro trabalho que também corrobora com os nossos resultados foi
60
realizado por PANICHAYUPAKARANANTA et al. (2010), no qual testou-se o extrato
da casca do fruto da romã obtido por extração metanólica e logo após fracionado
com acetato de etila para avaliar o seu efeito antioxidante. Por métodos
cromatográficos, foram detectadas grandes quantidades de flavonóides, mesmo
resultado encontrado em nossa fração acetato de etila utilizado em todos os nossos
testes e que pode justificar as ações terapêuticas encontradas. A classe de
metabólitos secundários dos flavonóides tem grande afinidade com o Acetato de
Etila, o que fez com que toda a carga desse composto presente no extrato
hidroalcoólico da romã fosse transferido para a fração AcOEt quando foi realizado o
fracionamento com tal solvente. Da mesma forma, SENGUTTUVAN; PAULSAMY;
KARTHIKA (2014) realizaram o fracionamento do extrato alcoólico das raízes da
espécie Hypochaeris radicata L. e na análise fitoquímica, viram que a fração Acetato
de Etila tinha uma forte presença de flavonóides. Diante do descrito, pode-se
observar que o perfil de metabólitos secundários é semelhante em diversas partes
da Punica granatum L., e mesmo havendo poucos estudos acerca das folhas da
espécie, se torna pertinente a sua utilização, devido ao fato da disponibilidade dos
frutos, casca e sementes ser sazonal, diferente das folhas.
No que diz respeito aos resultados obtidos na avaliação da ação
antimicrobiana da Punica granatum L. (Romã), são poucos os artigos que relatam
sobre o assunto. Os resultados encontrados foram positivos para a inibição de S.
aureus e P. aeruginosa, onde a fração Acetato de Etila da romã foi capaz de inibir o
crescimento dessas espécies, além de apresentar uma boa CIM e CBM para ambas.
Este é um dos primeiros trabalhos a relatar a atividade antibacteriana das folhas da
romã, por outro lado, existem estudos com outras partes da espécie. Em um estudo
realizado por MCCARRELL et al. (2008), eles avaliaram a atividade antimicrobiana
61
do extrato das cascas da romã e mostraram uma atividade sobre S. aureus e P.
aeruginosa em 12 e 24h de incubação, corroborando com os nossos dados. Outro
estudo com o mesmo resultado foi o realizado por DUMAN et al. (2009), onde eles
também viram que dentre várias bactérias e fungos, a romã foi capaz de inibir o
crescimento de S. aureus e P. aeruginosa nos ensaios de ágar difusão e
concentração inibitória mínima. Além da cepa sensível de S. aureus, a AcOEt teve
ação inibitória também sobre a cepa resistente da espécie (MRSA), algo que foi
descrito por VORAVUTHIKUNCHAI; KITPIPIT (2005), mas com o extrato etanólico
da romã. Segundo LEE, J. K. et al. (2015) Acinetobacter baumannii é uma das
bactérias que mais causam internações em UTI’s em quadro de pneumonia. O que
agrava mais esse quadro é o fato de que essa cepa vem desenvolvendo fortes
genes relacionados à resistência bacteriana, como mostra o estudo de HOU; YANG
(2015). A cepa de A. baumannii testada em nosso estudo foi sensível ao extrato da
Punica granatum L., o que prova mais uma vez o poder antibacteriano da espécie.
Interessantemente, esse é o primeiro trabalho que descreve a ação antimicrobiana
da Romã frente a S. pyogenes, que segundo COTS et al. (2015) é a maior
causadora de faringite bacteriana em adultos. De acordo com um trabalho realizado
por SIRIWONG et al. (2015), a quercetina e a luteolina, compostos que pertencem a
família dos flavonóides, possui forte atividade antibacteriana frente a essa bactéria.
Outras cepas relacionadas à infecções do trato respiratório são Streptococcus
pneumoniae, que seguida por Klebsiella pneumoniae que são as maiores
causadoras da pneumonia adquirida na comunidade, segundo IROEZINDU et al.
(2014). O extrato testado teve uma ótima ação antibacteriana contra S. pneumoniae,
inibindo o crescimento em todas as concentrações testadas, além de ter tido o
melhor resultado de Concentração Inibitória Mínima (CIM) dentre todas as cepas
62
testadas (0,5mg/ml). Da mesma forma, HAYOUNI et al. (2011) testaram a ação
bactericida e fungicida do extrato metanólico da casca da romã e obtiveram
resultados positivos para a inibição de S. pneumoniae, entre outras bactérias e
fungos.
Por outro lado, nosso extrato não apresentou atividade antimicrobiana
contra K. pneumoniae e H. influenzae, da mesma forma que DURAIPANDIYAN;
AYYANAR; IGNACIMUTHU (2006) testaram a atividade antimicrobiana de 18
extratos de plantas medicinais e viram que a Punica granatum L. não apresentou
inibição frente a K. pneumoniae. Já no estudo de QABAHA (2013) onde foi avaliada
a ação de cinco plantas indígenas da Palestina contra bactérias no combate de
radicais livres, o autor concluiu que K. pneumoniae foi sensível ao extrato da casca
da romã. Não foi encontrada nenhuma referência sobre o teste da Punica granatum
L. ou dos compostos encontrados por nosso trabalho frente à cepa H. influenzae.
Os testes que avaliaram a atividade anti-inflamatória da romã em modelo
de dano pulmonar agudo em camundongos, os resultados da contagem total de
leucócitos no sangue mostraram que o grupo de animais com dano pulmonar agudo
e sem tratamento tiveram alterações significativas. Isso sugere que o tempo de seis
horas de indução da inflamação não foi é suficiente para estimular a liberação de
células para o sangue periférico provenientes da medula óssea. Em um trabalho
realizado por AULAKH; SURI; SINGH (2014) onde eles avaliaram o poder de
inibição do dano pulmonar agudo da angiostatina, foi realizado a instilação de LPS e
após 9 horas o sangue periférico foi coletado e eles observaram que não houve
diferença estatística entre os grupos controles positivo, negativo e de tratamento.
Para a contagem diferencial dos leucócitos séricos, não houve diferença nos grupos
em relação às células mononucleares, já que os linfócitos, principais e mais
63
numerosos representantes, estão relacionados a uma resposta imune adaptativa,
estando mais presente na fase tardia da inflamação, quando o organismo inicia uma
resposta imune específica ao invasor (DINGENOUTS; GOUMANS; BAKKER, 2015).
Já os polimorfonucleares, mostraram uma grande diferenciação no grupo C.P. em
relação ao grupo C.N., evidenciando a ativação da imunidade inata. Os grupos de
animais que receberam tratamento também tiveram uma modulação, mas reduzindo
a diferenciação celular sérica, porém essa diferença não foi estatisticamente
significativa.
Na contagem de leucócitos totais do lavado broncoalveolar pode se
observar um aumento significante no número de leucócitos nos animais do grupo
que recebeu a instilação de LPS sem tratamento (LPS) em relação ao controle
negativo (C.N.). De fato, essa endotoxina tem a capacidade de induzir a resposta
imunológica rápida a nível local ativando fatores de transcrição de vários genes
necessários à síntese de citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias, o que
desencadeia uma migração celular para o local do dano iniciando assim, a resposta
imunológica inflamatória aguda (LU, Y. C.; YEH; OHASHI, 2008). Os animais dos
grupos onde foi induzida o dano pulmonar agudo e tratados tiveram uma redução na
contagem dos leucócitos na cavidade alveolar, porém o grupo que recebeu a dose
de 30mg/kg do extrato não foi o suficiente para obter uma redução significativa,
diferente do grupo que recebeu uma dose de 100mg/kg que foi o necessário para
reduzir significativamente a migração celular para o local do dano. Esse é o primeiro
trabalho a relatar a atividade anti-inflamatória das folhas da romã em modelo de
inflamação respiratória aguda induzida por LPS, porém um trabalho prévio realizado
por DE OLIVEIRA et al. (2013), onde foram trataram camundongos asmáticos com o
extrato das folhas da romã, foi observada a redução da migração celular no lavado
64
broncoalveolar coletado após 24 horas da indução inflamatória com ovalbumina.
Além dos grupos tratados com a AcOEt, utilizamos a dexametasona como anti-
inflamatório convencional, para validar a técnica de tratamento por via oral dos
animais. Os animais pertencentes a tal grupo foram os que apresentaram a maior
redução da migração celular local, reduzindo para menos da metade quando
comparado ao grupo LPS. LI et al. (2015) testaram o efeito imunomodulador de um
flavonóide em modelo de dano pulmonar agudo e também usaram a dexametasona
como controle de tratamento; e após seis horas da instilação com LPS, coletaram o
lavado broncoalveolar dos animais para realizar a contagem total de leucócitos e
viram que o grupo tratado com o anti-inflamatório convencional teve uma redução de
mais de 50% na migração comparado ao grupo LPS; resultados que corroboram
com os obtidos em nosso teste. Vale lembrar que a classe de metabólitos
secundários flavonóides foi a que apresentou maior presença no extrato utilizado
neste estudo.
Na contagem diferencial do lavado broncoalveolar, foi observado
basicamente dois tipos celulares: macrófagos, que são monócitos teciduais, e
neutrófilos, que são polimorfonucleares. O grupo controle negativo, onde não foi
induzida nenhuma inflamação, apresentou baixa celularidade e essas poucas
células observadas, em média 99% eram macrófagos teciduais sem apresentar
quantidades representativas de polimorfonucleares. Já no grupo LPS, onde os
animais foram induzidos a inflamação pulmonar e não tiveram quaisquer
tratamentos, observou-se uma grande migração de neutrófilos para os pulmões. Em
um trabalho realizado por XU, M. et al. (2015), também houve uma migração
significativa de neutrófilos no lavado broncoalveolar dos animais do grupo LPS
depois de sete horas da administração de LPS quando comparado ao grupo controle
65
negativo. No modelo de tratamento com a AcOEt utilizado neste trabalho pode-se
observar a redução da migração neutrofílica, sendo significativo no grupo que foi
administrado a concentração de 100mg/kg do extrato (E100). PENG et al. (2015)
estudaram a ação anti-inflamatória da punicalagina isolada do fruto da Punica
granatum L. na síndrome da insuficiência respiratória aguda induzida pela instilação
intranasal de LPS em camundongos e observaram a redução da migração de
neutrófilos e macrófagos no lavado broncoalveolar e histologicamente no tecido
pulmonar, caracterizando a redução de infiltração pulmonar.
HUANG; ZHONG; WU (2015) utilizaram o mesmo protocolo animal usado
em nosso trabalho, administrando uma dose única de quercitina via oral uma hora
antes da instilação com LPS e a coleta do lavado broncoalveolar foi realizado 6
horas após a indução; e viram que o grupo tratado foi capaz de reduzir
significativamente a migração de neutrófilos para os pulmões. É importante
relembrar que a quercitina é uma substância pertencente à família dos flavonóides,
metabólito secundário mais presente no extrato testado do nosso trabalho.
Na quantificação proteica de citocinas no lavado broncoalveolar, pode-se
observar que houve um aumento significativo na produção de TNF-α no grupo onde
foi administrado LPS e sem tratamento quando comparado ao grupo controle
negativo, o que de fato acontece, já que essa endotoxina é capaz de ativar genes
que transcrevem citocinas pró-inflamatórias como é o caso do TNF-α (LIU et al.,
2015), podendo estar relacionado com a migração celular de polimorfonucleares
observada no mesmo grupo. Em um estudo realizado por HECKER et al. (2015), foi
realizada uma instilação de LPS em camundongos e após oito horas foi observado
um aumento significativo na dosagem de TNF-α, corroborando com os nossos
dados. Os dois grupos tratados com o AcOEt, causaram uma redução na
66
quantificação dessa mesma citocina, porém este efeito não foi significativo quando
comparado ao grupo LPS, isso pode ser justificado pelo tempo de tratamento com
os extratos que pode ter sido insuficiente para ocorrer uma maior redução dessa
citocinas. Já o anti-inflamatório, dexametasona, utilizado como controle de
tratamento do trabalho, apresentou uma redução significativa de TNF-α, justificando
o fato de esse grupo ter sido o que mais reduziu a migração celular para os
pulmões. LEE, H. S. et al. (2015) induziram o dano pulmonar agudo com instilação
de LPS e utilizaram a dexametasona como controle de tratamento e; após quatro
horas, observaram que o anti-inflamatório foi o que mais inibiu a dosagem de TNF-α
no lavado broncoalveolar.
Em relação à dosagem de IL-10, o único grupo de apresentou diferença
estatística foi o LPS, que teve uma redução na dosagem proteica quando
comparado ao grupo controle negativo. Podemos observar que o mesmo grupo foi o
que maior expressou TNF-α no lavado broncoalveolar, deixando evidente a
modulação que a interleucina 10 tem na produção de citocinas pró-inflamatórias
(AGBANOMA et al., 2012). Nenhum dos grupos tratados (E30, E100 e DEXA)
tiveram os níveis de IL-10 alterados comparando com os controles. HACKSTEIN et
al. (2015) induziram uma pneumonia em camundongos e trataram com células
tronco mesenquimais e viram que em até 48 horas da indução, o nível proteico de
IL-10 no lavado broncoalveolar não diferenciou em nenhum dos grupos (controle
negativo, LPS e tratamento).
A dosagem de albumina no sobrenadante do lavado broncoalveolar
mostrou que a instilação intranasal por LPS foi responsável pelo extravasamento de
proteínas séricas para a cavidade alveolar, uma vez que o mesmo não foi observado
no grupo controle negativo, onde não houve a indução da inflamação. O mesmo foi
67
observado no trabalho de LU, H. et al. (2015), onde a dosagem de proteínas totais e
albumina no lavado broncoalveolar foram maiores no grupo onde foi administrado
LPS quando comparado ao controle negativo. Por outro lado, todos os grupos de
tratamento do nosso estudo foram capazes de reduzir o extravasamento proteico, e
os grupos E100 e DEXA foram estatisticamente menores que o LPS. DE OLIVEIRA
et al. (2013) observaram que micropartículas contendo o extrato das folhas da
Punica granatum L. encapsulado foi capaz de reduzir o extravasamento proteico
para o lavado broncoalveolar de camundongos asmáticos induzido por ovalbumina.
Podemos afirmar que o extrato testado, assim como a dexametasona foram capazes
de reduzir a formação do edema pulmonar, uma vez que é conhecido que o
extravasamento de proteínas para os alvéolos pulmonares é fundamental para a
formação do edema no processo inflamatório, evidenciando mais uma vez a
atividade anti-inflamatória.
Apesar do extrato estudado não ter reduzido a dosagem da citocina pró-
inflamatória, a diminuição do extravasamento plasmático, avaliado indiretamente
pela dosagem de albumina pode justificar a redução da migração de neutrófilos e
consequentemente a migração de leucócitos totais. Em outro estudo, (HUSARI et
al., 2014) induziram um dano pulmonar agudo em camundongos por hiperóxia
durante cinco dias e observaram que o tratamento com o suco da romã reduziu no
lavado broncoalveolar a migração leucocitária, principalmente de neutrófilos
justificado pela redução na dosagem de albumina e de citocinas pró-inflamatórias,
como o TNF-α.
Estudos complementares são necessários para avaliar a ação do extrato
estudado na virulência de algumas cepas bacterianas e também para determinar o
perfil de sensibilidade ao extrato de cepas obtidas de amostras clínicas, além de
68
outras cepas multirresistentes. Porém, este estudo é de grande impacto por mostrar
pela primeira vez, a ação antimicrobiana das folhas da romã frente a bactérias
causadoras de infecções respiratórias agudas e infecções hospitalares. Além disso,
para reforçar a ação anti-inflamatória das folhas da romã são necessários outros
estudos com protocolo de tratamento mais prolongado, como por exemplo, de 24
horas e até mesmo tratamentos múltiplos com o extrato para a avaliação da síntese
proteica e da migração celular a nível sistêmico diferente deste estudo onde o
modelo utilizado foi de tratamento único e tempo de indução de seis horas. Por outro
lado, este estudo é de grande impacto por mostrar a importância do uso de outras
partes da Punica granatum L. diferentes dos trabalhos disponíveis na literatura, além
de evidenciar a atividade do extrato na migração de neutrófilos, provavelmente
justificada pela diminuição do extravasamento plasmático.
69
6 CONCLUSÃO
O presente estudo foi capaz de comprovar as ações antimicrobiana e anti-
inflamatória da Romã de acordo com a sua utilização na medicina popular.
Com os resultados obtidos, podemos concluir que a AcOEt de folhas da
espécie Punica granatum L. pode ser um potencial agente antimicrobiano frente a
bactérias associadas à infecções respiratórias agudas infecções hospitalares.
Ainda, a AcOEt pode ser utilizada para tratar doenças inflamatórias
considerando que o extrato afetou a quimiotaxia de neutrófilos e o extravasamento
plasmático.
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