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Aspectos Fisiológicos e Bioquímicos de Cistatinas de Vigna vexillata i

ÍNDICE

Lista de abreviaturas iii

Lista de figuras Lista de tabelas Resumo Abstract

iv v vi vii

1- Introdução

1

1.1 - Proteinases cisteínicas

1

1.2 - Inibidores de proteinas em plantas

2

1.3 - Cistatinas: Inibidores de proteinases cisteínicas 1.4 – Vigna vexillata

3 7

2 – Objetivos 3 - Materiais e Métodos

10 10

3.1 - Material Biológico

10

3.1.2- Bactéria Escherichia coli cepa M15 (pREP4) recombinante 3.1.3 - Bactéria Escherichia coli cepa M15 (pREP4) recombinante

10 10

3.2 - Expressão de uma CCPI recombinante em E. coli M15 (pREp4)

10

3.3 - Purificação de uma CCPI recombinante por cromatografia em Ni-NTA agarose

11

3.4- Extração de proteínas extracelulares em sementes de Vigna vexillata

12

3.5-Dosagem de proteínas

12

3.6- Obtenção dos fragmentos de membranas plasmáticas e paredes celulares de cotilédones de V.vexillata

12

3.7 - Visualização eletroforética de proteínas

15

3.8 - Western Blotting

15

3.9 - Ensaio de ELISA para investigação das interações entre cistatina de V. 16

Aspectos Fisiológicos e Bioquímicos de Cistatinas de Vigna vexillata ii

unguiculata fragmentos de parede e membranas celulares de cotilédones de V. vexillata e insulina bovina 3.10- Purificação de uma cistatina a partir de extrato bruto de sementes de V. vexillata por meio de cromatografia de afinidade

17

3.11 - Ensaio de inibição de crescimento do fungo Fusarium solani utilizando a cistatina purificada de V. vexillata 3.12 - Localização tecidual de cistatinas de V. vexillata por imunohistoquímica

18 19

4 - Resultados

19

5 - Discussão 36 6 - Conclusões

41

7 - Referências Bibliográficas

42

Aspectos Fisiológicos e Bioquímicos de Cistatinas de Vigna vexillata iii

LISTA DE ABREVIATURAS

• Amp – Ampicilina • BSA – Albumina Sérica Bovina

• CCPI – “Cowpea Cysteine Proteinase Inhibitor”

• DAB - Diaminobenzidina

• DO – Densidade ótica

• ELISA – Ensaio imunológico de ligação a enzima

• GA - Glutaraldeído

• IgG – Imunoglobulina G

• IPTG – Isopropil β D-galactosídeo

• LB – Meio Luria-Bertani

• Ni-NTA – Níquel ácido nitrilotriacético

• PA - Paraformaldeído

• PAGE – Eletroforese em gel de poliacrilamida

• PBS – Tampão fosfato salino

• PMSF – Fenilmetil-sulfonil fluoreto

• mRNA – RNA mensageiro

• SDS – Sódio dodecil sulfato

• TCA – Ácido tricloroacético

• TEMED – N,N,N’,N’- Tetrametiletilenodiamino

• Tris – Tris (hidroximetil) aminometano

• Tween20 – Polioxietileno (20) sorbitano monolaurato

Aspectos Fisiológicos e Bioquímicos de Cistatinas de Vigna vexillata iv

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Fotografia de exemplar típico da espécie Vigna vexillata (L.) A. Rich, com

destaque para suas folhas, flor e vagem.

9

Figura 2 – Flor da espécie Vigna vexillata (L.) A. Rich.

9

Figura 3- Preparação dos fragmentos de parede celular e membranas celulares. Metodologia de Okorokov e Iehle (1998).

14

Figura 4 – SDS-PAGE (A) e Western-blotting (B) da fração protéica do extrato

bacteriano, retida em cromatografia de afinidade em coluna de Níquel NTA-Agarose.

M - Marcadores de massa molecular; FPR - Fração protéica retida.

22

Figura 5 – SDS PAGE do perfil protéico das frações obtidas no experimento de fluido apoplástico.

25

Figura 6 – Perfil cromatográfico do extrato bruto de Vigna vexillata em Sepharose 4B CM-Papaína.

27

Figura 7 - SDS-PAGE (A) e Western-blotting (B) da fração retida na coluna de afinidade Sepharose 4B CM-Papaína.

29

Figura 8 – Ensaio da atividade antifúngica da cistatina purificada de Vigna vexillata

(200 µg de proteína) contra o fungo F. solani .

31

Figura 8 – Ensaio da atividade antifúngica da cistatina purificada de Vigna vexillata

(200 µg de proteína) contra o fungo F. solani .

31

Figura 9 – Fotomicrografia da análise em microscópio ótico do fungo Fusarium solani

crescido em meio de cultura controle (A) e acrescido de cistatina purificada de Vigna

vexillata (200 µg de proteína) (B)

Figuras 10 e 11 – Análise imunohistoquímica de cistatinas de sementes de V.vexillata

32

Aspectos Fisiológicos e Bioquímicos de Cistatinas de Vigna vexillata v

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Classificação da espécie Vigna vexillata (L.) A. Rich.

8

Tabela 2- Interações entre a cistatina recombinante, fragmentos de membranas e

paredes celulares de cotilédones de V. unguiculata e insulina bovina por ELISA.

23

Tabela 3- Interações entre a cistatina recombinante, fragmentos de membranas e

paredes celulares de cotilédones de V. vexillata e insulina bovina por ELISA.

24

Tabela 4- Ensaio de atividade inibitória contra papaína nas amostras provenientes da

comatografia de afinidade em Sepharose 4B CM Papaína.

28

Aspectos Fisiológicos e Bioquímicos de Cistatinas de Vigna vexillata vi

Resumo

Fitocistatinas têm sido relacionadas a diversos papéis fisiológicos, como

controle de proteólise endógena e defesa contra proteases exógenas de predadores de

plantas. A sugestão de uma característica singular para elas tem sido proposta

envolvendo sua participação em processos de transdução celular de sinais e interação

intertecidual. Nós isolamos uma cistatina de Vigna vexiilata usando uma coluna de

afinidade Seprharose 4B CM-Papaína. A extração ocorreu usando Tris-HCl 0.1M, NaCl

0.5M pH 7.2 (300g de farinha/L), 16h. A suspensão foi centrifugada (5,000xg, 30 minutos

/4ºC) e o sobrenadante (10 mL) foi passado pela coluna Sepharose 4B CM-Papaína. O

tampão de equilíbrio foi fosfato de sódio 0,1M, NaCl 0,5M pH 7,0 e as frações retidas

foram eluídas com o mesmo tampão em pH 11.5. A proteína isolada apresentou um peso

molecular de 13 kDa e reagiu com o anticorpo anti-cistatina através de Western blotting.

Ensaios em microplaca de atividade antifúngica demonstraram que a proteína isolada

completamente inibiu o crescimento de F. solani em uma concentração de 200µg.

Aspectos Fisiológicos e Bioquímicos de Cistatinas de Vigna vexillata vii

Abstract

Phytocystatins have been correlated to several physiological roles, as control of

endogenous proteolysis and defense against exogenous proteases from plant predators. A

suggestion of a singular attribute for them has been proposed involving its participation in

cellular signal transduction and intertissue interaction processes. We isolated a V. vexillata

cystatin by using an affinity Sepharose 4B CM-Papain column. The extraction was

performed using Tris-HCl 0.1M, NaCl 0.5M pH 7.2 (300g of flour/L), overnight. The

suspension was centrifuged (5,000xg, 30 minutes /4ºC) and supernatant (10 mL) was

percolated through the Sepharose 4B CM-Papain column. The equilibration buffer was

sodium phosphate 0,1M, NaCl 0,5M pH 7,0 and retained fractions were eluted by the

same buffer at pH 11.5. The isolated protein had a Mr of 13 kDa and cross-reacted with an

anti-cowpea cystatin antibody by Western blotting. Antifungal activity microplate assays

showed that the isolated protein completely inhibited the growth of F. solani at a

concentration of 200µg. As the V. vexillata cystatin has previously been shown by us to be

located at extracellular space of seed cotyledons, a defense role against predators is

suggested. However, binding of this cystatin to cell wall and cell membrane components

are being tested by ELISA, to investigate its potential participation in the above mentioned

role of involvement in signal transduction and intertissue interaction processes.

Aspectos Fisiológicos e Bioquímicos de Cistatinas de Vigna vexillata 1

1- INTRODUÇÃO

1.1 - Proteinases cisteínicas

O termo protease é usado para se referir tanto a endopeptidases como a

exopeptidades. O termo proteinase é usualmente empregado para se referir a

endopeptidases. Estas se classificam de acordo com o aminoácido envolvido em seu sítio

catalítico e com seu mecanismo de ação em: serínicas, cisteínicas, aspárticas ou

metaloproteinases (Barrett, 1986).

As proteinases cisteínicas são amplamente distribuídas em animais, plantas e

microorganismos, onde participam de variados processos intra e extracelulares de

importância fisiológica. Estas podem ser induzidas em resposta a diferentes fatores

ambientais como calor e frio (Schaffer e Fisher, 1990), seca (Koizumi et al., 1993).

As proteinases cisteínicas não são secretadas como enzimas digestivas em

animais superiores, mas são encontradas nos intestinos médios de algumas espécies das

famílias Hemipterae (Houseman, 1978; Houseman et al., 1980) e Coleopterae (Murdock

et al., 1987). Alguns membros da família Coleopterae são importantes pestes de

sementes e folhas (Murdock et al., 1987); estes utilizam principalmente proteinases

cisteínicas para a sua digestão protéica, não necessitando de proteinases serínicas para

tal propósito. Desta maneira a larva de Callosobruchus maculatus (inseto predador de

sementes de feijão-de-corda), por exemplo, consegue ingerir tecidos com níveis

relativamente altos de inibidores de proteinases serínicas sem sofrer maiores efeitos

(Xavier Filho e Campos, 1984).

Dentre as proteinases de órgãos de reserva em plantas que estão envolvidas

em processos bioquímicos durante a germinação, as principais são as proteinases

cisteínicas (Ryan e Walker-Simmons, 1981). Estas enzimas foram primeiramente

estudadas em sementes germinantes de leguminosas (Tully e Beevers, 1978).

As proteinases cisteínicas estão envolvidas na degradação de proteínas de

reserva durante a germinação de sementes como mostram estudos pioneiros sobre a

degradação protéica de vicilinas por uma peptideohidrolase cisteínica em sementes

germinantes de Vigna radiata (Baumgartner e Chrispeels,1976).

A ação das proteinases cisteínicas na hidrólise de proteínas de reserva

também é relatada em trabalhos sobre a germinação de sementes de feijão comum


(Phaseolus vulgaris) (Csoma e Polgar, 1984) e sobre a ação de duas endopeptidases

cisteínicas na degradação protéica em cotilédones de sementes de Vigna mungo

(Mitsuhashi et al., 1986).

Durante o desenvolvimento de sementes, as proteinases cisteínicas catalizam

os processos pós-transcricionais da maioria dos precursores protéicos, como é mostrado

no trabalho de Abe et al. (1993), onde é estudada uma asparaginil endopeptidase de

sementes de Canavalia ensiformis. Estudos que revelam uma expressão coordenada de

proteinases cisteínicas e inibidores de papaína durante o desenvolvimento de sementes

de feijão-de-corda foram realizados por Fernandes et al. (1991).

As proteinases cisteínicas também estão envolvidas na degradação protéica

durante os processos de senescência, como mostra o trabalho no qual é caracterizada e

purificada uma tiol protease induzida durante a senescência em ovários não polinizados

de Pisum sativum (Cercos e Carbonell,1993).

1.2 - Inibidores de proteinases em plantas

Existem, em plantas, algumas famílias de inibidores de proteinases já

descritas, dentre as quais temos a família de inibidores de tripsina de soja do tipo Kunitz,

família de inibidores de batata I, família de inibidores de batata II, família de inibidores de

proteinases aspárticas e a família de inibidores de proteinases cisteínicas (cistatinas), por

exemplo (De Leo, 2002).

Devido ao fato de que inibidores de proteinases inibem enzimas digestivas de

animais, estes foram e são objetos de inúmeros estudos.

A importância de alguns inibidores de proteinases no controle de pragas fez

com que muitos esforços fossem dirigidos a estudar a expressão, em plantas, de

diferentes genes de inibidores de proteinases. Assim, plantas transgênicas de tabaco

foram utilizadas para avaliar os efeitos inseticidas de vários genes (Hilder et al., 1987)

dentre eles: os de inibidores de proteinases I e II de plantas de tabaco (Johnson et al.,

1989); o gene que codifica para inibidor tríptico de feijão-de-corda (CpTI) (Boulter et al.,

1989); o gene de um inibidor de proteinase cisteínica de sementes de arroz (Masoud et

al., 1993); e o gene que codifica o inibidor bifuncional de proteinases serínicas e de α-

amilases de insetos de milho (Masoud et al., 1993), dentre outros. Outras plantas

transgências, tais como batata, algodão, alfafa, soja, Arabidopsis, batata-doce, morango,

repolho, arroz, apresentaram melhores “performances” em bioensaios utilizando uma


diversa gama de insetos predadores, que plantas controle (não transformadas)

(Mochizuki et al., 1999; Hilder e Boulter, 1999; Lara et al., 2000; Vila et al., 2005; Bu et al.,

2006; Álvarez-Alfageme et al., 2007).

1.3 - Cistatinas: inibidores de proteinases cisteínicas

O termo cistatina foi atribuído pela primeira vez por Barrett et al (1986) a uma

proteína de clara de ovo de galinha, que tinha propriedade de inibir proteinases

cisteínicas.

As cistatinas são, portanto, inibidores competitivos e reversíveis de

proteinases cisteínicas, compondo uma superfamília de proteínas evolutivamente

relacionadas. Esta superfamília, denominada superfamília das cistatinas, está dividida em

três famílias (Barret et al., 1987): a das estefinas, a família das cistatinas e a família dos

cininogênios.

As cistatinas de plantas estão classificadas em grupo à parte, tido com o

grupo das fitocistatinas. Estas proteínas não possuem pontes de enxofre e contêm uma

seqüência conservada L-A-R-[FY]-A-[VI]-X3-N na região N-terminal (Margis et al., 1998).

As evidências que sugerem que as cistatinas supracitadas constituem uma

nova família diferente das estefinas, cistatinas e cininogênios baseiam-se no fato de que

muitas destas possuem características de duas famílias diferentes como estefinas e

cistatinas ,simultaneamente, como citado por Flores (1997) .

Outra característica marcante, diferente, encontrada em algumas cistatinas de

origem vegetal, como a orizacistatina II (Kondo et al., 1991) e a cistatina de milho (Abe et

al., 1992), é a organização genômica evidentemente diferente das cistatinas animais

(Margis et al., 1998 ; Kondo et al., 1991; Abe et al., 1992).

As fitocistatinas têm sido relacionadas com a regulação de proteinases

cisteínicas endógenas envolvidas na mobilização de proteínas de reserva durante a

germinação de sementes ou em outros processos fisiológicos de tecidos vegetais (Abe et

al., 1991; Watanabe et al., 1991; Fernandes et al., 1991; Lim et al., 1996; Ojima et al.,

1997).

Estudos sobre a presença de cistatinas em plantas iniciaram-se apenas na

década de 80. Exemplos de tais registros foram as descobertas das cistatinas I e II de

arroz, conhecidas como orizacistatinas (Abe et al., 1987;1989; Kondo et al., 1991), das


cistatinas I e II de milho (Abe e Whitaker, 1988; Abe e Arai, 1991; Abe et al., , 1996; Irie et

al., 1996), cistatina de Wisteria floribunda (Hirashiki et al., 1990), cistatina de tubérculos

de batata (Rowan et al., 1990; Waldron et al., 1993; Orr et al., 1994; Walsh e Strickland,

1993), cistatina de sementes de feijão–de-corda (Fernandes et al., 1993), cistatinas de

frutos de abacate (Kimura et al., 1995), cistatinas de botões florais de Brassica campetris

(Lim et al., 1996), cistatina de sementes de soja (Hines et al., 1991; Misaka et al., 1996),

cistatinas de sementes de mamão (Song et al., 1995), cistatinas de sementes de

Phaseolus vulgaris (Santino et al., 1998; Brzin et al., 1998), cistatinas de Chelidonium

majus ( Rogelj et al., 1998), cistatinas de sementes de girassóis (Kouzuma et al., 1996,

2000 e 2001) cistatinas de sementes de trigo (Corre-Menguy et al., 2002), cistatinas de

sementes de sésamo (Shyu et al., 2004a), cistatinas de frutos de abacaxi (Shyu et al.,

2004b), cistatina de sementes de cevada (Martinez et al., 2005a), cistatina do tubérculo

Colocasia esculenta (Yang et al., 2005), cistatina de morango (Martinez et al., 2005b),

cistatinas de cana-de-açúcar (Gianotti et al., 2006), cistatina de Celosia cristata

(Gholizadeh et al., 2005), cistatinas de sementes de Phaseolus mungo (Sharma et al.,

2006).

O papel de defesa vegetal destas proteínas contra diversos predadores tem

sido demonstrado por testes de atividades biológicas de cistatinas contra insetos, como

os trabalhos de Hines et al. (1991), Chen et al. (1992), Michaud et al. (1994), Irie et al.

(1996), Kuroda et al. (1996) e Lim et al. (1996), contra nematódios (Urwin et al., 1995,

1997), moluscos (Walker et al., 1999) e fungos (Pernas et al., 1999; Siqueira-Júnior et al.,

2002., Martinez et al, 2005., Christoya et al., 2006).

Paralelamente, também foi demonstrado que em sementes de feijão-de-corda

não há relação entre os níveis de cistatinas encontrados e a resistência destas ao

bruquídeo peste, Callosobruchus maculatus (Xavier-Filho et al.,1989; Fernandes et al.,

1993) e um papel destas fitocistatinas na regulação de proteinases cisteínicas endógenas

durante a maturação das sementes foi ainda sugerido (Fernandes et al., 1991).

No caso específico de feijão-de-corda foram observados padrões complexos e

coordenados de atividades de proteinases cisteínicas e de cistatinas durante o

desenvolvimento de sementes (Fernandes et al., 1991), bem como variada localização em

células e tecidos (Flores et al., 2001). Neste último trabalho observa-se uma distribuição

uniforme de cistatinas em células de cotilédones e eixos embrionários de feijão-de-corda,

exceto por uma maior concentração em células epidérmicas da zona de abscisão entre os

cotilédones. De forma semelhante, Misaka et al. (1996) demonstraram que a cistatina de


soja concentrava-se em uma camada periférica de células cotiledonárias. Entretanto, os

autores não atribuem nenhuma importância especial a tal localização, ao contrário dos

primeiros que sugerem que tal concentração elevada em uma camada celular periférica

seria compatível com um papel de defesa do tecido vegetal. A seqüência de aminoácidos

deduzida de uma cistatina de feijão-de-corda clonada por Fernandes et al. (1993) foi vista

como deficiente em um peptídeo sinal N-terminal, significando que esta isoforma não

deve ser transportada através de um sistema secretório.

Outros resultados demonstraram que, além de uma localização citoplasmática

principal, as cistatinas de sementes de Vigna vexillata também eram encontradas em

depósitos extracelulares nos cotilédones destas sementes e que, portanto, um processo

de translocação, neste caso, deveria ser admitido (Ávila et al., 1999).

O estudo de uma cistatina também extracelular, insolúvel, caracterizada por

Ojima et al. (1997), de tecidos cultivados in vitro de sementes de cenoura, sugeriu seu

envolvimento em processos de transdução de sinais celulares e de interação tecidual

entre células. Esta cistatina foi vista como capaz de interagir com glicoproteínas solúveis

de 57 kDa, que por sua vez, também possuíam a capacidade de ligarem-se a peptídeos

homólogos à insulina (Satoh ,1998).

Após a descoberta da insulina em animais, trabalhos realizados por Collip

(1923), apresentaram resultados que sugeriam a presença de substâncias similares à

insulina em extratos vegetais (folhas de cebola, cevada, alface, trigo e feijão verde; raízes

de cebola e cevada e caules de feijão verde). Nestes trabalhos, observou-se que todos os

extratos promoviam a redução dos níveis de glicose do sangue de coelhos normais e

cães pancreatectomizados. Os níveis de glicose no sangue de cães pancreatectomizados

também retornavam aos níveis normais após o tratamento com extratos de beterraba

(Best, 1924).

No trabalho realizado por Khanna et al. (1976) com sementes de Momordica

charantia, foi isolada uma proteína com massa molecular de aproximadamente 6 kDa que

reagia com anticorpos contra insulina humana. Trabalho realizado por Collier et al. (1987)

relatou o isolamento de proteínas de folhas de espinafre e plantas de Lemna gibba G3,

com massas moleculares semelhantes à insulina, que reagiam com anticorpos anti-

insulina suína e ligavam-se ao receptor de insulina humana. Mas nenhum desses

trabalhos determinou a estrutura primária dessas proteínas. Foi isolada, do tegumento de

sementes de C. ensiformis, uma proteína de massa molecular de 6 kDa que apresentou

100% de homologia com a insulina bovina. Essa mesma fração mostrou um fragmento


polipeptídico de 11 aminoácidos, homólogo a um receptor do tipo proteína quinase

humana (Oliveira et al.,1999). Trabalhos realizados posteriormente pelo mesmo grupo

mostraram a presença de proteínas homólogas à insulina em vagens verdes do feijão de

corda Vigna unguiculata (Venâncio et al., 2003), e em folhas de Bauhinia variegata

(Azevedo et al., 2006). Outros resultados mostraram que antígenos do tipo insulina estão

presentes na torta de filtro, subproduto residual da clarificação de açúcar extraído da

cana-de-açúcar (Lopes, 2001), em folhas de Phaseolus vulgaris, nas gimnospermas

Cupressus sempervirens, Pinus ponderosa, Cycas revoluta, Eycadaceae zamia e

Selaginell sp, na parte aérea das pteridófitas Psilotaceae sp e Equisetoceae sp, na

levedura Saccharomyces cerevisiae, na alga Rodofta sp, no caldo de cana de Saccharum

officinarum, (Silva et al., 2002; Xavier-Filho et al., 2003).

Posteriormente, trabalhos realizados por Oliveira et al. (2004) mostraram que

proteínas imunorrelacionadas à insulina, ao receptor de insulina e a proteínas do tipo

fosfoserina estão localizados na camada interna do tegumento de sementes de C.

ensiformis.

Em 1989, Kagawa e Hirano mostraram a presença de proteínas do tipo

globulinas 7S, em soja, que eram capazes de se ligarem à insulina suína, sugerindo para

essas proteínas uma possível função de receptor para o hormônio insulina. Essa proteína

foi denominada Bg e consiste de duas cadeias polipeptídicas de 16 e 26 kDa, unidas

entre si por pontes dissulfetos. Trabalhos posteriores demonstraram que essas proteínas

apresentavam atividade de proteína quinase semelhante à atividade tirosina quinase,

típica do receptor de insulina animal.

Proteínas do tipo globulinas 7S básicas, imunorrelacionadas à Bg (globulina

7S básica de soja), já foram detectadas em uma grande variedade de sementes, dentre

elas, Vigna radiata, Vigna angularis e Lupinus alobus (Komatsu e Hirano, 1991).

Satoh, em 1998, encontrou em sementes de cenoura uma proteína de 57 kDa,

a qual denominou de EDGP. Tal proteína apresentou homologia de seqüência de

aminoácidos com a Bg e também era capaz de se ligar à insulina e também foi capaz de

ligar-se a cistatina extracelular de sementes de cenoura. Posteriormente, foi isolada uma

proteína de radículas de soja que era capaz de estimular a fosforilação da Bg in vitro, a

qual foi denominada leginsulina (Ilgoutz et al., 1997).

Existe uma complexidade de papéis fisiológicos pensados hoje para as

fitocistatinas, dentre esses, há indícios de que as fitocistatinas estariam participando de

processos de sinalização celular e transdução de sinais. Esta função é particularmente de


interesse em nosso grupo de estudo, já que recentemente isolou-se e caracterizou-se

pela primeira vez, na literatura, uma insulina de origem vegetal, em tegumentos de

sementes de Canavalia ensiformis, em nosso laboratório (Oliveira et al., 1999). Além

disso, como relatado anteriormente, também foi detectada a presença de cistatina

extracelular em Vigna vexillata (Ávila et al., 1999), sendo este o segundo registro de tal

localização para fitocistatinas, de nosso conhecimento.

Além disso, já existem evidências da ligação de uma cistatina recombinante

de Vigna unguiculata com porções de paredes e membranas celulares de células

cotiledonárias de Vigna vexillata e também existem indícios da presença de uma cistatina

endógena em frações de parede celular de Vigna vexillata (Da Cunha, 2004), o que é de

grande interesse, uma vez que não se conhece na literatura nenhuma cistatina localizada

em paredes celulares de sementes.

1.4 - Vigna vexillata

Vigna vexillata é uma das mais importantes espécies pertencentes ao

subgênero Plectotropis. Este subgênero é um dos sete reconhecidos por Maréchal no

gênero Vigna (Maréchal et al., 1978). O subgênero Plectotropis ocupa uma posição

intermediária entre os subgêneros Vigna e Ceratrotopis, os quais englobam espécies

endêmicas da África e Ásia, respectivamente (Maréchal et al., 1978). A classificação da

espécie Vigna vexillata está descrita na Tabela 1.

Espécies não cultivadas do gênero Vigna despertam interesse de

pesquisadores envolvidos com pesquisas visando diferentes objetivos, tais como a

utilização destas espécies como fontes de genes para a manipulação genética de feijões

cultivados, como, por exemplo, o feijão-de-corda (Vigna unguiculata (L.) Walp.) e o feijão

mungo (Vigna radiata (L.) Wilczeck) (Rao e Kammannanauar, 1990; James e Lawan,

1991; Oghiakhe et al., 1993; Thottappilly et al., 1994). Tais projetos de manipulação

teriam como principais metas a melhoria da capacidade defensiva contra pestes e pragas,

e a elevação do valor nutritivo de suas sementes e folhagens (Siddhuraju et al., 1994;

Vanderborght, 1989). Além disso, muitas destas espécies apresentam propriedades

medicinais (Kokwaro, 1976) e são também utilizadas como forragens em cultivos

(Vanderborght, 1989).

A espécie Vigna vexillata é caracterizada por enormes variações morfológicas

principalmente no que diz respeito à forma dos folíolos. Esta variabilidade resultou em


múltiplas nomenclaturas no passado, as quais foram drasticamente reduzidas por

Verdcourt (1971) e depois por Marechal et al. (1978), que identificaram várias variedades

botânicas como sendo Vigna vexillata.

A espécie Vigna vexillata não é cultivada para propósito de consumo e não

passou por nenhum processo de cultivo agrícola (Marechal et al., 1978).

As Figuras 1 e 2 mostram as características físicas da espécie Vigna vexillata

(L.) A. Rich.

Tabela 1 – Classificação da espécie Vigna vexillata (L.) A. Rich.

Classificação: Vigna vexillata (L.) A. Rich.

Reino Plantae – Plantas Sub-reino Tracheobionta – Plantas Vasculares

Super-divisão Spermatophyta – Plantas com sementes Divisão Magnoliophyta – Plantas com flores

Classe Magnoliopsida – Dicotiledôneas Subclasse Rosidae

Ordem Fabales Família Fabaceae

Subfamília Faboideae Gênero Vigna

Espécie Nome vulgar

Vigna vexillata (L.) A. Rich. Feijão-miúdo, violeta do campo (“zombi pea”)

Adaptado de Albuquerque, V.M. (1987).


Figura 1 - Fotografia de exemplar típico da espécie Vigna vexillata (L.) A.

Rich, com destaque para suas folhas, flor e vagem.

Fonte: http://www.nfc.co.kr/nat/flora/flora&04/ros/legu/legu&23/

Figura 2 – Flor da espécie Vigna vexillata (L.) A. Rich.

Fonte: http://www.nfc.co.kr/nat/flora/flora&04/ros/legu/legu&23/

2 – OBJETIVOS


2.1- Purificar e caracterizar uma cistatina extracelular de V.vexillata.

2.2– Determinar o potencial fungicida da cistatina purificada contra fungos

fitopatogênicos de relevância agronômica.

2.3 - Avaliar as interações entre a cistatina recombinante de V.unguiculata com

preparações de paredes e membranas celulares de células cotiledonárias das

mesmas sementes.

2.4 - Imunolocalização de cistatina de Vigna vexillata.

3- MATERIAIS E MÉTODOS

3.1- Materiais Biológicos

3.1.2- Material Botânico

A espécie Vigna vexillata não é cultivada para propósito de consumo e não passou

por nenhum processo de cultivo agrícola (Marechal et al., 1978).

Para o presente trabalho os frutos já maduros de Vigna vexillata são constantemente

coletados nas dependências do campus da UENF, onde tal espécie cresce, como erva

daninha, em determinadas épocas do ano.

3.1.3 - Bactéria Escherichia coli cepa M15 (pREP4) recombinante

Os clones bacterianos de E.coli (cepa M15[pREP4]) transformados com o plasmídeo

pQ30 contendo um cDNA codificante de uma cistatina de feijão-de-corda (CCPI)

(Fernandes et al., 1993) foram cedidos pelo Dr. Peter Urwin, da Universidade de Leeds –

UK.

3.2 - Expressão de uma CCPI recombinante em E. coli M15 (pREp4)

O gene codificador de uma cistatina de sementes de V. unguiculata foi clonado

(Fernandes et al., 1993) e expresso em células de E. coli (Urwin et al., 1997).

A proteína recombinante foi obtida pela transferência, segundo metodologia descrita

por Flores (1997), de uma alíquota da bactéria crescida em meio sólido onde foram

mantidas colônias bacterianas transformadas com o gene codificador de cistatina, para 3

mL de meio LB (10g de bactotriptona; 10g de NaCl; 5g de extrato de levedura; pH 7,0). A

este foram previamente adicionados 7µL de ampicilina (retirados de uma solução estoque


de concentração de 50 mg de ampicilina por mL de água) e 15µL de kanamicina (retirados

de uma solução estoque de 100 mg de kanamicina por mL de água) . A suspensão foi

mantida em estufa incubadora a 37oC, por 16 h e o crescimento foi avaliado por leitura a

600nm em espectrofotômetro (OD = 0,6).

O próximo passo foi preparar as placas de Petri para efetivar o crescimento das

colônias em meio sólido. Foram utilizadas duas placas autoclavadas, 30mL de meio LB,

7µL de ampicilina (50mg/mL), 12,87µL de kanamicina (100mg/mL) e 0,45g de bacto-agar.

15mL dessa preparação foram distribuídos em cada uma das placas que foram então

vedadas e deixadas em estufa a 37oC, por 16 h.

As bactérias foram transferidas para o meio sólido e deixadas em estufa a 37ºC, por

16h. Após o crescimento das colônias nas placas contendo o meio sólido, foi realizada

mais uma transferência para o meio líquido, desta vez para multiplicação das células

bacterianas.

As bactérias nessa cultura foram então induzidas a expressar a proteína

recombinante, pela adição de 0,5 mM de IPTG. Novamente houve uma incubação sob

agitação por 3h, até o alcance de uma OD600 = 0,8. A suspensão foi centrifugada a 3000 x

g, por 15 min, tendo-se descartado o sobrenadante e ressuspendido o precipitado em 20

mL de Tris-HCl 10 mM, fosfato de sódio dibásico 0,1M, uréia 8M, pH 8,0.

A cultura foi então sonicada em intensidade máxima (30 burst) por três vezes, por 1

min cada, dando um espaço de 1 min de intervalo entre cada sonicação. As células

lisadas foram sedimentadas por centrifugação a 12000 x g por 5 min e o extrato contendo

os produtos induzidos foi congelado até ser utilizado.

A metodologia descrita baseou-se na utilização por Flores et al. (2002).

3.3 - Purificação da CCPI recombinante por cromatografia em Ni-NTA agarose

A cromatografia foi realizada em tubos de microcentrufugação em sistema de

“batching” utilizando 500 µL de matriz em cada tubo. A matriz foi equilibrada com 1 mL de

tampão imidazol 10mM sob agitação leve, em temperatura ambiente, durante 5 minutos.

Após este tempo a solução foi centrifugada a 7000 x g por 30 s. Estas etapas de equilíbrio

e centrifugação foram repetidas por mais duas vezes.

Em seguida adicionou-se 780 µL do extrato bacteriano em cada tubo, os quais

foram mantidos, sob leve agitação, durante 45 min. Após este tempo as suspensões


foram centrifugadas a 7000 x g por 30 s. O sobrenadante foi reservado e denominado não

retido. Após estas etapas foram realizadas 4 lavagens com 1 mL de tampão imidazol 20

mM, sob agitação, por 10 min, e as suspensões foram centrifugadas a 7000 x g por 30 s.

As lavagens foram reunidas e denominadas de fração de lavagem.

Outras 5 eluições foram realizadas com 200 µL de tampão imidazol 250 mM sob

agitação por 5 min. Depois de centrifugação por 30 s, a 7000 x g, os sobrenadantes foram

reunidos e denominados de fração retida.

3.4- Obtenção do fluido apoplástico em sementes de Vigna vexillata

As proteínas exudadas e/ou extracelulares de sementes de Vigna vexillata foram

extraídas segundo a metodologia descritas por Wälti et al (1995). As sementes foram

embebidas em tampão de extração de fluido apoplástico (0,14 M de carbonato de sódio,

NaCl 0,5 M, 0,33% Tween 20 e 0,2% β-mercaptoetanol, pH 5,5) por 1h e após este tempo

foram submetidas a um tratamento de baixa pressão, através de uma bomba à vácuo.

Elas, então, foram transferidas cuidadosamente para seringas e estas para tubos de

microcentrífuga e, então, foram submetidas à centrifugação (700 x g, 5 min, 4ºC). O fluido

apoplástico foi então coletado no fundo do tubo de microcentrífuga.

3.5-Dosagem de proteínas

As determinações das quantidades totais de proteínas foram feitas pelo

método descrito por Bradford (1976), usando-se albumina sérica bovina como proteína de

referência.

3.6- Obtenção dos fragmentos de membranas plasmáticas e paredes celulares de

sementes de Vigna unguiculata e vexillata.

De acordo com a metodologia de Okorokov e Iehle (1998) as sementes foram

embebidas em água para a preparação do homogenato que sofreu, então, um processo

de centrifugação e conseqüentemente de filtração para a obtenção do primeiro sedimento

que foi continha porções de paredes celulares. O sobrenadante desta primeira

centrifugação foi novamente centrifugado e o sedimento proveniente foi considerado

como porções de membranas celulares maiores. Realizou-se então mais um processo de

centrifugação e este último sedimento foi considerado com porções de membranas

menores. O sobrenadante foi então descartado.


Os procedimentos empregados para a obtenção de fragmentos de

membranas plasmáticas e paredes celulares estão mostrados esquematicamente na

figura 3.


Figura 3- Preparação dos fragmentos de parede celular e membranas celulares.

Metodologia de Okorokov e Iehle (1998).

Sobrenadante

Sedimento (Porções de membranas celulares menores)

Sedimento (Porções de membranas celulares maiores)

3g de sementes sem os tegumentos

Preparação, em água, do homogenato

1/3 (β−β−β−β−mercaptoetanol 25mM e PMSF 2mM) 15min. 4ºC.

F i l tr aç ã o do h omo g e na t o e m 9 c a ma d as de g a ze e m u m f u n i l p lá s t i c o .

Centrifugação a 2470 x g / 15 min.

S e di me nt o ( Po rç õe s d e par e de ce l u l ar )

Sobrenadante – Centrifugação a 11000 x g/ 45min.

S o b r e na d a n te – C e n t r i f ug a çã o a

2 5 00 xg / 30 mi n


3.7- Visualização eletroforética de proteínas

Amostras da fração protéica do extrato bacteriano retida em cromatografia de

afinidade, das frações obtidas do experimento do fluido apoplástico e da fração retida na

coluna de afinidade Sepharose 4B CM-Papaína; todas em uma concentração de 20 µg de

proteína por poço, foram visualizadas por eletroforese em gel de poliacrilamida (12%) na

presença de SDS, segundo método descrito por Laemmli (1970). A eletroforese foi

realizada em um sistema vertical Mini Protean II da BIORAD. A separação protéica

ocorreu sob uma corrente constante de 15 mA nos primeiros 30 minutos e 30 mA no

tempo restante.

O gel foi corado em solução corante de Azul Brilhante de Coomassie G a 2%

em água, metanol e ácido acético (6:3:1, v/v/v), por 6 horas e descorado em solução

descorante composta de água destilada, metanol e ácido acético na mesma relação de

proporcionalidade usada na preparação da solução corante.

3.8- Western blotting

As proteínas separadas por eletroforese em gel de poliacrilmida-SDS foram

transferidas para uma membrana de nitrocelulose, de acordo com Towbin et al. (1979). O

sistema utilizado foi o de transferência semi-seca Trans-blot Sigma.

A membrana e o gel foram equilibrados em tampão de transferência (Tris

25mM, glicina 192mM e metanol 20%) para equlíbrio durante 20 minutos. Em seguida

foram mergulhadas 9 folhas de papel filtro no mesmo tampão.

O sanduíche de transferência foi montado da seguinte maneira: três pedaços

de papel de filtro, seguidos da membrana de nitrocelulose, do gel e outros três pedaços

de papel de filtro umedecidos no tampão de transferência. Após 1h de transferência em

amperagem de 1mA/cm2 do gel, o que correspondeu a uma amperagem constante de

38mA, a membrana foi corada com Ponceau S (Sigma) para verificação da transferência.

Após confirmar-se que as proteínas tinham sido transferidas para a membrana

de nitrocelulose, esta foi submersa em solução bloqueadora (tampão fosfato de sódio 0,1

M, NaCl 0,5 M pH 7,2 [PBS], com 2% de leite em pó desnatado), por 2 horas.

Posteriormente foram feitas quatro lavagens em tampão PBS e a membrana foi colocada

em contato com solução bloqueadora contendo anticorpo contra cistatina de feijão-de-


corda produzido em coelho e cedido pelo Dr. Robert Thornburg, da Iowa State University,

na diluição de 1:2000, e mantida nesta solução durante a noite (16 horas, 4ºC).

No dia seguinte a solução bloqueadora foi descartada e quatro lavagens por 5

min cada com PBS foram efetuadas. Nova solução bloqueadora, desta vez contendo

anticorpo anti-IgG de coelho conjugado com peroxidase na diluição de 1: 2000, foi

despejada sobre a membrana e deixada sob agitação leve, por duas horas.

Para a revelação da reação imunoquímica utilizou-se o método de revelação

por diaminobenzidina (DAB), onde foram utilizados 100 µL do tampão Tris-HCl 2mM pH

7,5, 5 mg do corante DAB, 0,3 mL de imidazol 0,1M, 4,9 mL de água destilada e 5 �L de

água oxigenada 30%. Esta solução (10 mL) foi vertida sobre a membrana e mantida por

aproximadamente 10 minutos. A reação foi parada com substituição da solução

reveladora por água destilada.

3.9- Ensaio de ELISA para investigação das interações entre cistatina recombinante

de V. unguiculata, fragmentos de paredes e membranas celulares de V. vexillata,

unguiculata e insulina bovina

Foram realizados ensaios de ELISA modificados para investigação de

possíveis ligações entre a cistatina de V. unguiculata e insulina bovina comercialmente

adquirida, antes e após a ligação da cistatina a fragmentos de paredes e membranas

celulares de V. vexillata e unguiculata.

Para o ensaio de ELISA propriamente dito, poços de micro placas (NUNC

Maxi-Sorb) foram sensibilizados com 20 µg de proteína /100 µL de tampão carbonato

bicarbonato 0,05M pH 9,6 dos diversos antígenos utilizados (cistatina; cistatina retida em

parede; cistatina retida em membrana e insulina bovina comercial).

A sensibilização procedeu-se por 16 horas a 4ºC. Após a sensibilização os

poços foram lavados com PBS (fosfato 0,1M/ NaCl 0,5M/ pH 7,6) contendo Tween 0,05%

(280 µL) por 60 min. Após este período foram adicionados 300 µL do tampão bloqueador

(gelatina 1% no mesmo tampão PBS/Tween citado acima) As reações foram mantidas por

60 min, a temperatura ambiente, e uma nova lavagem com PBS/Tween (280 µL). por 60

min, foi realizada. Após esta etapa, foram adicionados, quando previsto na estratégia do

ensaio experimental, os ligantes (20 µg de insulina bovina ou cistatina). A reação de


ligação foi aguardada durante 2 h, a temperatura ambiente. Os poços foram então

lavados com PBS-Tween 0,05% (280 µL) por 2 h.

Em casos específicos, quando tratando-se de cistatina como antígeno, as

preparações de paredes e membranas celulares foram adicionadas após o período de

bloqueio com PBS-Tween-gelatina, quando previsto na estratégia experimental mostrada

na Tabela 3 (Poços 9 e 10). Nestes ensaios, especificamente, pretendeu-se investigar se

a ligação de insulina bovina dava-se ao nível de cistatinas isoladas ou associadas a tais

preparações de paredes e membranas.

Em seguida, adicionou-se os anticorpos anti-cistatina ou anti-insulina humana

diluídos (1:2000) em tampão bloqueador (50 µL) durante 2 h, a 37ºC. Depois de expostas

aos anticorpos, as placas foram lavadas 6 x com PBS/Tween (280 µl) a cada 5 min, e

incubadas com uma solução contendo o complexo anti-IgG de coelho + peroxidase

(quando o 1º anticorpo for anti-cistatina) ou anti-IgG de guinea pig + peroxidase (quando o

1º anticorpo for anti-insulina), diluído em tampão bloqueador (1:2000), a 37ºC, por 2 h.

Lavagens posteriores (6 x) com PBS/Tween (280 µL) foram novamente

realizadas a cada 5 min. A revelação foi feita usando-se 50 µL de uma solução de OPD

(orto fenil diamina) (5 mg de OPD/ 12,5 mL de tampão ácido [3,25 mL de ácido cítrico 0,1

M; 3,5 mL de fosfato de sódio 0,2 M; 5 µL de H2O2 30%; 5,75 mL de H2O pH 5,0]).

A revelação durou aproximadamente 10 minutos, em uma reação mantida em

ausência de luz. Esta reação foi parada com 50 µL de H2SO4 3 N e os produtos foram

avaliados por sua absorbância a 492 nm, lidos em um leitor de microplaca.

3.10- Purificação de uma cistatina a partir do extrato bruto de sementes de Vigna

vexillata por meio de cromatografia de afinidade.

Para a obtenção do material a ser aplicado na coluna, retirou-se o tegumento

das sementes de Vigna vexillata para a preparação da farinha. Foi realizada uma primeira

extração com metanol 80%, 1:5 (m/v), para a remoção da clorofila. Essa extração foi

repetida três vezes. Em seguida foi realizada uma segunda extração, na proporção de

300g de farinha para 1L de tampão de extração (Tris-HCl 0,1M, NaCl 0,5M pH 7,2), sob

agitação, em geladeira, por 16 horas. Após essa extração, esse material foi centrifugado

a 5.000xg por 30 minutos a 4ºC. O precipitado foi descartado e o sobrenadante fervido

durante 5 minutos. Fez-se uma nova centrifugação nas mesmas condições citadas acima.


O precipitado foi descartado e o sobrenadante foi então liofilizado. Esse material foi

submetido à dosagem de proteínas e ensaio de atividade inibitória contra papaína.

A coluna de afinidade Sepharose 4B – CM-Papaína, previamente preparada e

disponível em nosso laboratório, foi equilibrada com tampão fosfato de sódio 0,1M, NaCl

0,5M pH 7,0. Foram aplicados na coluna 10 mL do material obtido como descrito acima. A

coluna foi então novamente lavada com tampão pH 7,0, para assim haver a liberação do

material que não ficou retido na coluna. Quando esse material parou de ser liberado, foi

aplicado o tampão de eluição da coluna (tampão fosfato de sódio 50 mM, NaCl 0,5 M pH

11,5), que liberou as proteínas retidas na matriz, mais especificamente cistatinas presas à

papaína carboximetilada imobilizada na Sepharose. A coleta foi realizada em sistema de

coletor automático com um volume coletado de 1 mL. Todo o material liberado da coluna

foi analisado em espectrofotômetro a 280 nm para assim medir as devidas absorbâncias,

bem como em sua atividade inibitória sobre papaína por ensaios in vitro.

3.11- Ensaio de inibição de crescimento do fungo F. solani utilizando a cistatina

purificada de Vigna vexillata.

3.11.1 - Obtenção de esporos filamentosos

O fungo F. solani foi crescido em uma placa de Petri contendo ágar

sabouraud por 10 dias a 30 ºC. Após esse período 10 mL de salina 0,15 M foram vertidos

sobre essa placa e os esporos foram liberados com o auxílio de uma alça de Drigalski.

Essa suspensão com os esporos foi devidamente filtrada em gases para a purificação de

restos miceliais que pudessem estar vindo junto com os esporos. Esses esporos foram

contados em câmara de Newbauer.

3.11.2 - Ensaio de inibição

Em placas de cultura de células (96 poços), contendo 200 µL de meio de

cultura específico para o crescimento do fungo utilizado, foi adicionada uma amostra

contendo a cistatina purificada de Vigna vexillata em uma concentração de 200 µg de

proteína/mL e 1 x 104 esporos/mL de F. solani. Para a observação da inibição do

crescimento dos fungos, foi determinada a densidade ótica calculadas a partir de leituras

em “um leitor de ELISA” a 670 nm a cada 6 horas, por um período de 60 horas. Todo o

procedimento, desde a obtenção dos esporos até a montagem do experimento na placa

foi feito sobre condições assépticas em capela de fluxo laminar.Controles foram feitos

sem a adição da cistatina.


As amostras obtidas foram também gotejadas sobre lâminas microscópicas

para visualização em microscópio ótico e análise morfológica dos prováveis efeitos da

cistatina sobre o crescimento do fungo.

3.12 – Localização tecidual de cistatinas de V. vexillata por imunohistoquímica

As sementes de V. vexillata foram analisadas no que se refere à localização

tecidual de cistatinas. Para tal, as sementes foram embebidas em água destilada por 8h e

posteriormente fixadas por 3h em tampão cacodilato 0,01M pH 7,2 ; glutaraldeído 0,01%

e paraformaldeído 4%. Após a fixação, as sementes foram submetidas a três lavagens

(30 min cada) em tampão cacodilato 0,05M para posteriormente serem desidratadas

seqüencialmente com metanol a 50% (30min), 70%(60min), 90%(60min) e tratadas com

50% de metanol + 50% de resina LR Gold (18h), 30% de metanol + 70% de resina LR

Gold (16h), 100% de resina LR Gold (2 a 3 dias) e 100% resina + catalizador (10h). Todos

os passos foram feitos a -20°C. Cortes semifinos são preparados e incubados com PBS-

BSA (tampão fosfato-salino com albumina sérica bovina) por 40min, e então incubados

com anticorpo anti-cistatina (1:200) por 2h. Os cortes são então incubados em cloreto de

amônio por 30 min, incubados com PBS-BSA por 20 min, incubados com anticorpo

primário anticistatina por 2h (1:100), lavados 10 vezes com PBS-BSA por 10 min cada,

incubados com anticorpo secundário conjugado a ouro 5nm (1:300), repete-se a lavagem

com PBS-BSA por 10 min cada, lava-se com PBS (tampão fosfato salino) 10min cada

lavagem e lava-se com água milli Q por 10 min cada. As incubações que envolvem

anticorpos, são realizadas em câmara úmida (um recipiente contendo algodão

embebecido em água). Ao término das etapas de preparação, acrescenta-se um a gota

de 0,2 M de N-propilgalato e cobrem-se as lâminas com lâminulas. O material deve ser

guardado em geladeira (4ºC) até a visualização, após coloração por prata. Os resultados

foram observados por microscopia óptica.

4 – RESULTADOS 4.1 - Análise da expressão da cistatina recombinante de Vigna unguiculata em E.

coli, por SDS-PAGE

A Figura 4A mostra a eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida

demonstrando a purificação da cistatina recombinante de Vigna unguiculata por


cromatografia de afinidade, em resina de Ni-NTA agarose. O poço 2, referente a amostra

proveniente do pico retido na resina apresenta a banda protéica de 13 kDa,

aproximadamente (seta).

A natureza da banda protéica apontada pela seta, como uma cistatina, foi

confirmada por experimento de Western blotting, após transferência de proteína do gel

para uma membrana de nitrocelulose. O reconhecimento imunológico positivo por um

anticorpo específico anti-cistatina (1:2000) é observado na Figura 4B. A banda referente a

cistatina recombinante, reconhecida pelo anticorpo, é apontada na região de massa

molecular próxima a 13 kDa (seta).

4.2 –Verificação das ligações estabelecidas entre cistatinae de Vigna unguiculata,

fragmentos de paredes e membranas celulares de V. vexillata, unguiculata e

insulina bovina

As Tabelas 2 e 3 apresentam os valores obtidos com o ensaio de ELISA.

Os ensaios mostram a existência de uma ligação da cistatina a preparações

de membranas e paredes de células cotiledonárias de V. vexillata e unguiculata indicados

a partir dos resultados dos ensaios anteriores. Nota-se também que não há ligação direta

da cistatina com insulina bovina, nem vice-versa (Poços 6 e 14, respectivamente). Porém

observa-se a ligação da insulina diretamente às preparações de membranas e paredes

(Poços 12 e 13). Tal interação é confirmada quando analisamos a ligação da insulina com

os complexos cistatina-parede e cistatina-membrana (Poços 7 e 8) e percebemos que ela

é bem menor do que quando a insulina liga-se diretamente, sem a presença de cistatina,

às preparações de paredes e membranas (Poços 12 e 13). Isto indicaria que a cistatina

estaria competindo com a insulina por sítios de ligação nestas frações subcelulares, o que

também reforça, outra vez, a ligação da cistatina a paredes e membranas. Um

interessante dado é o apresentado no experimento do Poço 3, cujo valor elevado de

detecção pelo anticorpo anti-cistatina sugere a presença de uma cistatina endógena

ligada à preparação de parede em V. vexillata, uma vez que comparando-se os valores de

absorbância da ligação da cistatina recombinante com o anticorpo anti-cistatina (Poço 1:

0,960) e os valores da absorbância da ligação do complexo cistatina-parede com o

mesmo anticorpo (Poço 3: 1,312), observa-se um valor muito mais alto para a segunda

situação experimental.


Quando incubamos primeiramente a insulina nas preparações de paredes e

membranas celulares e depois incubamos a cistatina (Poços 9 e 10) observamos também

valores de ligação que estariam indicando a formação de um complexo supra-molecular

entre as estruturas celulares estudadas, a cistatina e a insulina bovina.

4.3 - Eletroforese das frações provenientes dos ensaios de fluido apoplástico

realizados em sementes de Vigna vexillata.

A figura 5 mostra a eletroforese em gel de poliacrilamida das frações

provenientes dos ensaios de fluido apoplástico, extraído de sementes de Vigna vexillata.

A visualização de tais frações por SDS-PAGE mostra o perfil protéico destas amostras e

sugere a presença de moléculas do tipo cistatina, uma vez que bandas com massas

moleculares características destas, de aproximadamente 14kDa (seta), aparecem nos

poços referentes às frações dos fluidos. Tal proteína foi detectada nos três diferentes

fluidos, exsudatos quando as sementes foram embebidas em diferentes soluções, como

especificado no item 3.4. O resultado precisa ser confirmado com a realização de Western

blotting, assim que tivermos posse do anticorpo anti-cistatina.


A B M FPR FPR

Figura 4 – SDS-PAGE (A) e Western-blotting (B) da fração protéica do extrato

bacteriano, retida em cromatografia de afinidade em coluna de Níquel NTA-Agarose. M -

Marcadores de massa molecular; FPR - Fração protéica retida.

Obs: Os marcadores de massa molecular encontram-se na seguinte ordem de cima para

baixo: 66kDa: Albumina sérica bovina, 45kDa: Ovoalbumina, 29kDa: Anidrase carbônica,

24kDa: Tripsinogênio, 18kDa: Inibidor de tripsina e 14kDa: Lactoalbumina.


Tabela 2 - Interações entre a cistatina recombinante, fragmentos de

membranas e paredes celulares de cotilédones de V. unguiculata e insulina bovina por

ELISA.

Poços Antígeno Incubação Anticorpo Absorbância *

1

Cistatina

-

Anti-cistatina

0,921

2

Insulina

-

Anti-cistatina

0

3

Cistatina + Parede

-

Anti-cistatina

0,917

4

Cistatina + Membrana

-

Anti-cistatina

0,812

5

Cistatina

-

Anti-insulina

0

6

Cistatina

Insulina

Anti-insulina

0

7

Cistatina + Parede

Insulina Anti-insulina

0,299

8



0,323

9

Cistatina

Membrana +Insulina

Anti-insulina

0,378

10

Cistatina

Parede + Insulina

Anti-insulina

0,387

11

Insulina

-

Anti-insulina

0,598

12

Membrana

Insulina

Anti-insulina

0,465

13

Parede

Insulina

Anti-insulina

0,478

14

Insulina

Cistatina

Anti- insulina

0,520


Tabela 3 - Interações entre a cistatina recombinante, fragmentos de

membranas e paredes celulares de cotilédones de V. vexillata e insulina bovina por

ELISA.

Poços Antígeno Incubação Anticorpo Absorbância *

1

Cistatina

-

Anti-cistatina

0,960

2

Insulina

-

Anti-cistatina

0

3

Cistatina + Parede

-

Anti-cistatina

1,312

4


-

Anti-cistatina

0,848

5

Cistatina

-

Anti-insulina

0

6

Cistatina

Insulina

Anti-insulina

0

7

Cistatina + Parede


0,340

8



0,341

9

Cistatina

Membrana +Insulina

Anti-insulina

0,390

10

Cistatina

Parede + Insulina

Anti-insulina

0,370

11

Insulina

-

Anti-insulina

0,595

12

Membrana

Insulina

Anti-insulina

0,450

13

Parede

Insulina

Anti-insulina

0,421

14

Insulina

Cistatina

Anti- insulina

0,590


M F1 F2 F3

Figura 5 – SDS PAGE do perfil protéico das frações obtidas no experimento de fluido

apoplástico. (M – marcador de peso molecular [66kDa: Albumina sérica bovina, 45kDa:

Ovoalbumina, 29kDa: Anidrase carbônica, 24kDa: Tripsinogênio, 18kDa: Inibidor de

tripsina, 14kDa: Lactoalbumina); F1: fluido apoplástico 1; F2: fluido apoplástico 2; F3:

fluido apoplástico 3.

66

45

29

24 14


4.4 – Purificação da cistatina de Vigna vexillata

4.4.1 – Cromatografia de afinidade em CnBr Sepharose 4B – CM Papaína.

A figura 6 mostra o perfil cromatográfico de extrato bruto de Vigna vexillata (10 mL)

submetido à cromatografia de afinidade em coluna Sepharose 4B CM-Papaína ativada

com CnBr. O gráfico representa a leitura, em absorbância, dos tubos coletados durante o

curso da cromatografia, evidenciando-se, após a seta vertical, os materiais eluídos pela

adição do tampão de eluição da coluna (tampão fosfato de sódio 50mM, NaCl 0,5M, pH

11,5). Observa-se um pico proeminente em torno dos tubos 149, 150, 151 e 152. Esse

material foi recolhido e utilizado em teste enzimático que mede a atividade inibitória contra

papaína (Tabela 4). Os ensaios confirmam a atividade inibitória de papaína, típica de

cistatinas, nos tubos 155, 156 e 157. Em seguida o pico referente a estes tubos contendo

a atividade inibitória foi dialisado e submetido a eletroforese e Western Blotting.

4.4.2 - Eletroforese proveniente da fração retida nos ensaio de cromatografia de afinidade para cistatina em extrato de sementes de Vigna vexillata.

A figura 7A mostra a eletroforese em gel de poliacrilamida das frações obtidas

na coluna de afinidade Sepharose 4B CM-Papaína.

A visualização das frações por SDS-PAGE mostra o perfil protéico destas

amostras e mostra a presença da cistatina, uma vez que uma banda com a massa

molecular característica desta cistatina, entre 14 e 18 kDa, aparece no poço referente à

fração. A natureza da banda protéica apontada pela seta (Figura 7B), como sendo uma

cistatina, foi confirmada por experimento de Western blotting, após transferência de

proteína do gel para uma membrana de nitrocelulose. O reconhecimento imunológico

positivo por um anticorpo específico anti-cistatina (1:2000) é observado na Figura 7B.

Uma segunda banda de massa molecular aproximada de 30 kDa, vista na

fração retida na figura 7A, pode representar a formação de um dímero, o que já foi

previamente demonstrado para a cistatina recombinante de Vigna unguiculata por Flores

et al. (2001) e Aguiar et al. (2006).


0

0,5

1

1,5

2

2,5

1 13 25 37 49 61 73 85 97 109 121 133 145 157 169 181 193 205

Tubos

Ab

s 28

0nm

Figura 6 – Perfil cromatográfico do extrato bruto de Vigna vexillata em cromatografia

de afinidade em Sepharose 4B CM-Papaína.

pH 11,5


Tabela 4 – Ensaio de atividade inibitória contra papaína nas amostras provenientes da

cromatografia de afinidade em Sepharose 4B CM-Papaína. UAI (Unidade de Atividade

Inibitória).

TUBOS UAI 1-154 0 155 224,5 156 321 157 325,8

158-205 0


M ET FR M ET FR

Figura 7 - SDS-PAGE (A) e Western-blotting (B) da fração retida na coluna de

afinidade Sepharose 4B CM-Papaína. M - Marcadores de massa molecular; ET – Extrato

Total; FR - Fração protéica retida.

66

45

29 24 18 14

A B


4.5 – Ensaio de atividade antifúngica da cistatina purificada de Vigna vexillata

contra o fungo Fusarium solani.

A figura 8 mostra a atividade antifúngica da cistatina purificada de Vigna

vexillata contra o fungo Fusarium solani. Pode-se observar, que nas mesmas condições

de tempo e temperatura, a fração da cistatina purificada foi capaz de inibir praticamente

100% o crescimento do fungo quando comparado com o controle.

As figuras 9A e 9B mostram através da análise microscópica o perfil do ensaio

antifúngico, comprovando novamente a ação inibitória da cistatina de Vigna vexillata

sobre o crescimento do fungo Fusarium solani. Na figura 9B, podemos notar nitidamente a

total inibição de formação de hifas do fungo em estudo, quando o meio de crescimento foi

acrescido da fração purificada da cistatina de Vigna vexillata.


0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 10 20 30 40 50 60

Tempo, h

Abso

rbân

cia,

670

nm

Controle

Cistatina

Figura 8 – Ensaio da atividade antifúngica da cistatina purificada de Vigna

vexillata (200 µg de proteína) contra o fungo F. solani .


Figura 9 A – Fotomicrografia da análise em microscópio ótico do fungo

Fusarium solani crescido em meio de cultura controle.

Figura 9B - Fotomicrografia da análise em microscópio ótico do fungo

Fusarium solani crescido em meio de cultura controle, acrescido de cistatina

purificada de Vigna vexillata (200 µg de proteína)


4.6 – Localização tecidual de cistatinas de V. vexillata

Nos estudos ultraestruturais, uma marcação positiva foi vista em citoplasma e

espaço extracelular cotiledonário de sementes de V. vexillata ao utilizar-se um anticorpo

anti-cistatina de V. unguiculata. As Figuras 10 e 11 mostram a análise imunohistoquímica

de cistatinas de sementes de V. vexillata, inicialmente mostradas por fotos em preto e

branco, reveladas por prata (Figura 10) e em seguida por fotos coloridas (Figura 11),

mostrando a marcação por setas e cabeças de setas.


Figura 10 - Análise imunohistoquímica de cistatinas de sementes de V. vexillata.

Fotos em preto e branco, reveladas por prata mostrando: 1 - Controle sem anticorpo

primário; 2 - Marcação positiva no citoplasma e em camada circundante das células

cotiledonárias (setas).


Figura 11 - Análise imunohistoquímica de cistatinas de sementes de V. vexillata.

Fotos coloridas reveladas por prata mostrando: 1 - controle como na Figura 10; 2 -

Marcação positiva de cistatinas em uma região extracelular (setas). Cabeça de seta:

traço foliar de vaso condutor.


5 - DISCUSSÃO

Cistatinas são proteínas com elevados potenciais defensivos contra pestes e

patógenos que vêm sendo empregadas em programas de transformação genética de

plantas visando a melhoria de suas habilidades defensivas contra predadores (Hines et al,

1981). Uma das principais forças motrizes de tal aplicação biotecnológica é o fato de

considerarem-se os genes de cistatinas como os, talvez, melhores candidatos aos

programas de transformação de plantas visando o incremento de suas habilidades

defensivas (Urwin et al., 1997).

Existe uma grande diversidade de papéis fisiológicos propostos para tal classe

de proteína. Um desses papéis foi proposto em trabalho de Satoh (1998). Este autor

verificou uma capacidade de ligação entre uma cistatina de culturas de células de

sementes de cenoura com glicoproteínas solúveis extracelulares, que por sua vez, ligava-

se a proteínas homólogas à insulina. É de nosso grande interesse confirmar esta

capacidade de ligação uma vez que nosso estudo demonstrou que, além de uma

localização citoplasmática principal, as cistatinas de sementes de Vigna vexillata também

são encontradas em depósitos extra-celulares nos cotilédones destas sementes e que,

portanto, um processo de translocação deve ser admitido (Figuras 10 e 11). Nosso grupo

também isolou e caracterizou pela primeira vez, na literatura, uma insulina de origem

vegetal, em tegumentos de sementes de Canavalia ensiformis (Oliveira et al., 1999). Tais

resultados serão bastante úteis para a avaliação de mais uma possível função para a

classe das cistatinas, que é a de estas proteínas serem participantes de processos de

interação tecidual e transdução de sinais.

Em virtude das sementes de V. vexillata apresentarem dimensões diminutas e

as cistatinas serem encontradas em concentrações muito baixas em sementes

(Fernandes et al., 1991), para este trabalho foi preciso, inicialmente, expressarmos uma

cistatina recombinante de V. unguiculata através da utilização de células bacterianas de

E. coli, que já haviam sido previamente transformadas, para expressarem a proteína de

interesse (gentilmente cedidas pelo Dr. Peter Urwin - UK). A expressão de proteínas em

bactérias é estratégia freqüentemente adotada diante da necessidade de obtenção de

quantidades suficientes de uma dada proteína. Neste sentido podemos mencionar as

expressões em bactérias da cistatina de milho (Abe et al., 1994), cistatina de folha de

mamão (Song et al., 1995), orizacistatina I e II de arroz (Michaud et al., 1994), cistatinas


de folhas de repolho (Lim et al.,1996), de sementes de soja (Misaka et al., 1996) e de

sementes de feijão-de-corda (Urwin et al., 1995).

O isolamento da cistatina recombinante expressa por tais células foi alcançado

pela percolação do extrato bacteriano, cujas células haviam sido lisadas por sonicação,

através de uma coluna de níquel NTA-agarose. Tal isolamento pode ser verificado por

SDS-PAGE e por Western-blotting (Figura 4) onde verificou-se a presença de uma banda

de aproximadamente 13 kDa, responsiva ao anticorpo anti-cistatina de Vigana vexillata.

É importante ressaltar que a cistatina que está sendo empregada neste projeto

é uma cistatina recombinante de Vigna unguiculata que já havia sido clonada por

Fernandes et al. (1993), que demonstraram ser, esta, uma proteína que não possuía um

peptídeo sinal, portanto não podendo ser extracelular. Tal fato é de extrema relevância

uma vez que estamos detectando ligação desta cistatina a elementos constituintes de

paredes e membranas em uma tentativa de investigar uma proposição da função para

cistatinas descrita por trabalho de Satoh (1998). A diferença fundamental é que a cistatina

estudada por Satoh (1998) é uma cistatina extracelular obtida a partir de tais culturas de

células de cenoura.

Nossos ensaios de ligação sugeriram potencialidades de ligação da cistatina

recombinante de Vigna unguiculata tanto às paredes como às membranas celulares de

ambas as sementes, V. unguiculata e V. vexillata (Tabelas 2 e 3). Os dados também

apontam claramente para a ligação tanto da cistatina recombinante, quanto da insulina

bovina, às preparações de paredes e membranas celulares de cotilédones de V. vexillata

e unguiculata. Deve-se assumir, portanto, a presença de ligantes para tais proteínas nas

diferentes frações subcelulares. Nota-se, ainda, que o valor de absorbância-controle da

reação da cistatina recombinante com o anticorpo anti-cistatina é mais baixo que aquela

referente à reação da cistatina incubada às preparações de paredes e o mesmo anticorpo

na espécie V. vexillata, sugerindo que o anticorpo estaria reconhecendo uma outra

cistatina, que provavelmente é a cistatina endógena, sugerida como presente em

preparações de paredes celulares de cotilédones de V. vexillata. Também é possível que

esta cistatina seja externalizada, como suspeitado pela presença de bandas de massa

molecular em torno de 13 kDa, visualizada no fluido apoplástico de sementes de V.

vexillata (Figura 5)

Tal consideração é de grande interesse para estudos futuros, uma vez que

não se conhece na literatura nenhuma cistatina localizada em paredes celulares de

sementes.


Em 1989, Kagawa & Hirano mostraram a presença de proteínas do tipo

globulinas 7S, em soja, que eram capazes de se ligarem à insulina suína, sugerindo para

essas proteínas uma possível função de receptor para o hormônio insulina. Essa proteína

foi denominada Bg e consiste de duas cadeias polipeptídicas de 16 e 26 kDa, unidas

entre si por pontes dissulfetos. Trabalhos posteriores demonstraram que essas proteínas

apresentavam atividade de proteína quinase semelhante à atividade tirosina quinase,

típica do receptor de insulina animal.

Proteínas do tipo globulinas 7S básicas, imunorrelacionadas a Bg (globulina

7S básica de soja), já foram detectadas em uma grande variedade de sementes, dentre

elas, Vigna radiata, Vigna angularis e Lupinus alobus (Komatsu & Hirano, 1991).

Satoh, em 1998, encontrou em sementes de cenoura uma proteína de 57 kDa,

a qual denominou de EDGP. Tal proteína apresentou homologia de seqüência de

aminoácidos com a Bg e também era capaz de se ligar à insulina. Posteriormente, foi

isolada uma proteína de radículas de soja que era capaz de estimular a fosforilação da Bg

in vitro, a qual foi denominada leginsulina (Ilgoutz et al., 1997).

Acreditamos, com isso, que também existam, em nossas preparações de

paredes e membranas, proteínas similares que estejam sendo ponte de ligação para a

insulina e também exista a presença de um ligante, nestas frações subcelulares, para a

cistatina.

A formação de um complexo supra-molecular observada entre as frações

subcelulares analisadas, a cistatina e a insulina bovina, evidenciada principalmente pelos

nossos ensaios de ELISA, vem reforçar a proposta de Satoh (1998) que sugere que

cistatinas extracelulares de células de cenoura estariam envolvidas em processos de

transdução de sinais celulares e de interação tecidual entre células.

A utilização da cromatografia de afinidade em Sepaharose CM-papaína foi bem

sucedida no que se refere à purificação da cistatina de Vigna vexillata. A proteína

purificada apresentou massa molecular em torno de 15kDa, e a formação de um dímero

de cerca de 30 kDa foi visualizada por experimentos de eletroforese sob condições

desnaturantes, a exemplo do já observado para a cistatina de Vigna unguiculata por

Flores et al. (2001) e Aguiar et al. (2006). A proteína eluída desta cromatografia de

afinidade foi imunoreativa com o anticorpo anti-cistatina de Vigna unguiculata, quando

submetida a experimento de Western blotting.

A cistatina de V. vexillata foi vista como capaz de inibir em 100% o crescimento

do fungo fitopatogênico F. solani, causando também um drástico efeito sobre a formação


de hifas, em concentração de 200 µg/mL. Os ensaios de atividade inibitória de

crescimento deste fungo reforçam uma das funções já descritas para as fitocistatinas, que

é o papel de defesa vegetal contra diversos predadores, como os fungos e ácaros

(Pernas et al., 1999; Siqueira-Junior et al., 2002; Soares-Costa et al., 2002; Martinez et al.,

2003; Yang & Yeh, 2005; Christova et al., 2006; Abraham et al., 2006). Martinez et al.

(2005) mostraram que a cistatina recombinante de morango, FaCPI-1, inibiu quase

completamente o crescimento dos fungos Botritis cinérea, a uma concentração de 3 µM, e

Fusarium oxysporum, em concentrações mais elevadas, de 6 µM. A exemplo do

observado neste trabalho, com a cistatina de V. vexillata, o efeito inibitório observado deu-

se sobre ambos os processos de germinação de esporos e desenvolvimento micelial. É

de extrema importância comparar o potencial inibitório da cistatina de V. vexillata com

outras cistatinas já estudadas, tais como a cistatina de tomate, como descrito por

Siqueira-Júnior et al. (2002), uma vez que com 200 µg de cistatina de V. vexillata o

crescimento do fungo foi quase 100% inhibido enquanto que a cistatina de tomate, nas

mesmas concentrações não inibe nem 50% do crescimento dos fungos Trichoderma

viride (non-phytopathogenic) and Fusarium solani (phytopathogenic). A cistatina de tomate

(TC), como visto por tais autores, causa uma redução de cerca de 18% no crescimento de

T. viride e de 45% no crescimento de F. solani quando testada em concentrações de

150 µg ml–1. Abraham et al. (2006) demonstraram que seis de sete cistatinas de cevada

foram capazes de inibir o crescimento dos fungos B. cinerea e F. oxysporum, sendo as

cistatinas HvCPI-2 e HvCPI-6 as duas mais eficazes quando calculadas as Concentrações

Efetivas para inibição de 50% do crescimento (EC50), as quais foram <1.5 µM para ambos

os fungos. Os experimentos realizados por Yang & Yeh (2005), com cistatinas de

tubérculos de inhame (Colocasia esculenta) mostraram que em concentrações de 150

µg/ml ou 200 µg/ ml, o crescimento micelial de Sclerotium rolfsii Sacc. era fortemente

inibido. A morfologia das hifas, observada por microscopia óptica microscope, revelou

filamentos mais curtos e delgados.

Embora o mecanismo de atividade antifúngica destas fitocistatinas ainda não

esteja completamente estabelecido, Martinez et al. (2003) demonstraram por mutagênese

sítio-dirigida que a inibição de Botrytis cinerea pela cistatina de cevada não está

associada com a propriedade inibitória de proteinases cisteínicas desta proteína.

Especula-se que alterações na permeabilidade de membranes fúngicas possam ser a

origem dos problemas causados pelas fitocistatinas nestes organismos. O inibidor de


tripsina conhecido como SAP16 de Helianthus annuus modifica a permeabilidade da

membrana celular de Sclerotinia scleroticum e reprime a germinação de ascósporos

(Giudici et al., 2000). Alterações de permeabilidade de membrana foram também

detectadas quando a orizacistatina OC-I foi expressa no compartimento citossólico de

células de folhas de tabaco (van de Vyver et al., 2003). No entanto, Yang and Yeh (2005)

sugeriram recentemente que a inibição de crescimento do fungo fitopatogênico Sclerotium

rolfsii causada por uma cistatina de tubérculos de Colocasia esculenta relacionava-se

diretamente a inibição de uma proteinase cisteínica do fungo. Conclui-se, portanto, que

trabalhos adicionais serão necessários para o estabelecimento dos mecanismos de ação

antifúngica de cada fitocistatina sobre diferentes patógenos.

Também faz-se importante ressaltar que, a localização da cistatina de V.

vexillata nos espaços extracelulares (Figuras 10 e 11), por experimentos preliminares,

condiz muito bem com uma função de defesa contra tais organismos patogênicos.

Trabalhos de imunolocalização de cistatinas em plantas, em geral, apontam para

localizações citoplasmáticas, tais como o de Boulter and Harvey (1985), acerca de uma

multicistatina de batata e o de Madureira et al. (2006), acerca de uma cistatina de folhas

de tomate de 87 kDa. Tais localizações citoplasmáticas também indicam correlações com

potenciais papéis defensivos, ao contrário das sugestões de papéis fisiológicos propostos

para cistatinas de sementes de soja (Misaka et al., 1996) e de Vigna unguiculata (Flores

et al., 2001), as quais sugerem-se estar envolvidas na regulação de proteinases

cisteínicas endógenas, importantes para os processos de desenvolvimento e germinação

de sementes. A localização em espaços extra-celulares e cotiledonários das cistatinas de

V. vexillata, aqui apresentadas, bem como as de cistatinas de tomate (Madureira et al.,

2006) e batata (Boulter and Harvey, 1985), diferem significativamente de trabalhos

anteriores investigativos da compartimentalização de outros inibidores de proteases.

Diversos destes inibidores, tais como os inibidores de proteases serínicas induzidos por

lesão ou metil-jasmonato de folhas de tomate, foram encontrados em vacúolos centrais,

inclusive associados a corpos protéicos (Walker-Simmons and Ryan, 1977; Narváez-

Vásquez et al., 1993; Villanueva et al., 1998) Um inibidor de proteinases cisteínicas de

batata, mas que no entanto não apresenta homologia com cistatinas de plantas, foi

também principalemente localizado em vacúolos de plantas tratadas com metil jasmonato

(Gruden et al., 1997).


6 – Conclusões

1. A ligação de uma cistatina recombinante de V. unguiculata com porções de

paredes e membranas celulares de células cotiledonárias de V. vexillata é

fortemente sugerida pelas diferentes estratégias metodológicas apresentadas no

trabalho.

2. Diferentes componentes de paredes e membranas celulares devem estar

envolvidos em tais interações.

3. Não observou-se ligação direta da insulina com a cistatina recombinante de V.

unguiculata, ou vice-versa, por ensaio de ELISA modificado.

4. Ligações entre insulina bovina e preparações de paredes e membranas celulares

de células cotiledonárias de Vigna vexillata foram mostradas por ensaio de ELISA

modificado.

5. Há indícios de uma cistatina endógena ligada às preparações de paredes celulares

de sementes de Vigna vexillata.

6. Foi verificado através de ensaios imunohistoquímicos que a cistatina se localiza

principalmente no citoplasma das sementes de Vigna vexillata.


6 -REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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