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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

INSTITUTO BIOMÉDICO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MICROBIOLOGIA E

PARASITOLOGIA APLICADAS

THAÍS BRASIL SILVEIRA

PERFIL DE CRESCIMENTO DE GENOMOESPÉCIES DE LEPTOSPIRA spp.

EM DIFERENTES MEIOS DE CULTURA

Niterói, RJ

2018

THAÍS BRASIL SILVEIRA

PERFIL DE CRESCIMENTO DE GENOMOESPÉCIES DE LEPTOSPIRA spp.

EM DIFERENTES MEIOS DE CULTURA

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia e Parasitologia Aplicadas do Instituto Biomédico da Universidade Federal Fluminense como requisito parcial à obtenção do título de Mestre. Área de Concentração: Bacteriologia

Orientador: Prof. Dr. Walter Lilenbaum Coorientador: Profa. Dra. Ana Paula Loureiro de Almeida

Niterói, RJ

2018

À memória de meu pai, Nilton.

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a minha mãe, Claudia, por absolutamente tudo.

Por não me deixar desistir em um dos momentos mais difíceis da minha vida.

Por torcer, celebrar, incentivar, apoiar, suportar e se dedicar à mim durante meu

desenvolvimento pessoal e profissional. Essa dissertação é sua mãe. Muito

obrigada!

Agradeço a meu pai, Nilton (in memorian). Tua palavra, tua história. Tua

verdade fazendo escola. Só enquanto eu respirar, vou lembrar de você. Muito

obrigada pai...

Agradeço a minha irmã, Ana Carolina. Você continua sendo meu modelo,

inspiração e eu continuo tentanto fazer você se orgulhar de mim. Obrigada minha

irmã!

Agradeço meu orientador, Walter. Por me conceder essa grande

oportunidade, pelo precioso conhecimento dividido comigo e por esperar sempre

excelência de mim. Minha jornada se inicia agora e eu serei sempre grata.

Agradeço a minha Co-orientadora Ana Paula. Obrigada por toda a

dedicação que teve comigo, pela paciência durante esse processo, por toda

ajuda pessoal e profissional e, principalmente, pela amizade. Muito obrigada!

Agradeço a toda equipe LaBV. Vocês foram essenciais durante toda essa

jornada. Foram meus amigos, meus pais e mães durante as diversas

dificuldades, meus irmãos durante a boêmia, foram meus professores de

Microbiologia, Estatística, Clínica e todas as outras tantas disciplinas... Com

vocês esses dois anos foram leves. Muito obrigada Ana, Gabriel, Lauren, Anahí,

Priscila, Cristina, Ricardo, Bruno R., Hugo, Bruno C. e Lucas.

Agradeço ao professor Rodolpho de Almeida Torres Filho e ao colega

Túlio José de Freitas Goes, pela excelente contribuição quanto as avaliações

estatísticas. Assim como os ensinamentos compartilhados, que permitiram a

finalização do presente estudo.

Agradeço a todos os meus professores da Universidade Federal do Acre,

principalmente aos professores Yuri Karaccas, Luciana Medeiros, Tamyres

Izarelly e Soraia Figueiredo. Entrar na Pós-Graduação e seguir a carreira

acadêmica é um desejo cultivado após o convivio com vocês. Eu me espelho em

cada um durante essa jornada.

Agradeço as minhas amigas. Cultivadas em uma terra longínqua, mas não

desconhecida. Obrigada pela paciência durante todo esse tempo. Por não

desistirem de mim, apesar da distância, da dificuldade de comunicação, pelos

dias sem conversas, pelos finais de semanas preenchidos por ausência, pelos

aniversários em que não estive presente, nos dias em que a tristeza e a

felicidade preencheram e eu não pude compartilhar. Obrigada meninas, Daniela

e Tainá.

RESUMO

Apesar de ser considerado padrão-ouro para o diagnóstico de

leptospirose, o isolamento do agente a partir de amostras clínicas ainda é um

desafio. A construção da curva de crescimento de uma população permite

compreender a dinâmica populacional, seu tempo de geração e o número

máximo de micro-organismos, entretanto poucos são os estudos atuais que

abordam o desenvolvimento de novas técnicas de isolamento de leptospiras e

meios de cultivo. O presente estudo buscou determinar o perfil de crescimento

das espécies Leptospira interrogans (sorogrupos Icterohaemorrhagiae e Sejroe),

L. santarosai, L. borgpetersenii e L. noguchii nos meios de cultura EMHJ,

T80/40LH e Fletcher, com e sem a adição de 10% de Soro de Coelho, 1% de

Albumina Bovina ou 0,1% de Piruvato de Sódio. Foi avaliada ainda a capacidade

dessas estirpes se desenvolverem nestes meios de cultura com a adição dos

coquetéis antimicrobianos STAFF, A5 e CH; a combinação resultou em 32 meios

de cultura a serem avaliados. A avaliação foi feita por contagem manual em

câmara de Neubauer a cada 48 horas. Foi identificado que L. interrogans, L.

noguchii e L. santarosai, apresentam crescimento satisfatório em meio EMJH,

com exceção de L. borgpetersenii a qual desenvolveu-se somente em meio

T80/40LH. A adição de qualquer tipo de composto de enriquecimento não

apresentou aumento significativo no crescimento daquelas espécies. Os

coquetéis STAFF e A5 apresentaram resultados similares e garantiram um

crescimento equivalente ao dos meios-base sem a observação do crescimento

de outros micro-organismos contaminantes. Já o coquetel CHID inibiu o

crescimento de todas as espécies quando adicionado a qualquer um dos meios

avaliados. Conclui-se que o meio de cultura EMJH se mostrou mais eficiente

para o crescimento das espécies L. interrogans, L. noguchii e L. santarosai, mas

não para L. borgpetersenii. Para esta espécie, o meio-base T80/40/LH se

mostrou o mais eficiente.

Palavras-chave: Leptospiras; Curva de crescimento; Meio de cultura.

ABSTRACT

Although it is considered gold standard for diagnosis of leptospirosis,

isolation of the agent from clinical specimens is still a challenge. The construction

of the growth curve of a population allows the understanding of population

dynamics, its generation time and the maximum number of microorganisms.

However there are few recent studies that approach the development of new

isolation techniques for leptospires and culture media. The present study aimed

to determine the growth profile of L. interrogans (serogroup Icterohaemorrhagiae

and Sejroe), L. santarosai, L. borgpetersenii and L. noguchii in the culture media

EMJH, T80/40LH and Fletcher, with and without the addition of 10% Rabbit

Serum, 1% Bovine Albumin or 0.1% Sodium Pyruvate. Ability to grow in these

culture media was also evaluated with addition of antimicrobial cocktails STAFF,

A5 and CH; combination resulted in 32 culture media being evaluated. Evaluation

was done by manual counting in Neubauer chamber every 48 hours. It was

identified that L. interrogans, L. noguchii e L. santarosai presented satisfactory

growth in EMJH medium, except for L. borgpetersenii which was developed only

in T80/40LH media. Addition of any type of enrichment compound did not show

significant increase in growth of these species. STAFF and A5 cocktails

presented similar results and ensured a growth equal to that of the base media

without observing the growth of other contaminating microorganisms. The CHID

cocktail inhibited the growth of all species when added to any of the evaluated

media. We conclude that the EMJH culture medium was more efficient for the

growth of L. interrogans, L. noguchii and L. santarosai, but not for L.

borgpetersenii. For this specie, the T80/40/LH base medium was the most

efficient.

Keywords: Leptospira; Growth curve; Culture medium.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Fig. 1 Esquema representativo dos 32 diferentes meios de cultura

testados, incluindo meios-base (Fletcher, EMJH e T80/40LH);

aditivos de enriquecimento (Soro de Coelho [SORO], Albumina

Bovina [BSA] e Piruvato de Sódio [PIR]) e coquetéis antimicrobianos

(STAFF, A5 e CHID). *SORO e PIR já estão inclusos na composição

base de T80/40LH. **SORO está incluso na composição base de

Fletcher. p.39

Fig. 2 Representação gráfica da curva de crescimento das espécies L.

interrogans sg Icterohaemorrhagiae, L. interrogans sg Sejroe, L.

santarosai, L. borgpetersenii e L. noguchii em meio-base EMJH. p.44

Fig. 3. Representação gráfica da curva de crescimento das espécies L.

interrogans sgs Icterohaemorrhagiae e Sejroe, L. santarosai, L.

borgpetersenii e L. noguchii em meio T80/40/LH. p.46


interrogans sgs Icterohaemorrhagiae e Sejroe, L. santarosai, L.

borgpetersenii e L. noguchii em meio Fletcher. p.48


interrogans sg Icterohaemorrhagiae e L. santarosai em meio EMJH

com a adição dos componentes de enriquecimento Soro de Coelho

(10%) e Piruvato de Sódio (0,1%). p.50


noguchii e L. interrogans sg Sejroe em meio EMJH com a adição dos

componentes de enriquecimento Soro de Coelho (10%) e Piruvato

de Sódio (0,1%). p.62

Fig. 7. Representação gráfica da curva de crescimento de L. borgpetersenii

nos meios EMJH e T80/40LH e nos meio-base EMJH com a adição

dos compostos de enriquecimento Soro de Coelho (10%) e Piruvato

de Sódio (0,1%). p.53


interrogans sg Icterohamenorrhagiae e L. santarosai em meio

Fletcher com a adição dos componentes de enriquecimento

Albumina Bovina (1%) e Piruvato de Sódio (0,1%). p.56


interrogans sg Sejroe e L. noguchii em meio Fletcher com a adição

dos componentes de enriquecimento Albumina Bovina (1%) e

Piruvato de Sódio (0,1%). p.57

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 - Lista dos agentes antimicrobianos e suas concentrações de uso

nos coquetéis para o controle de microrganismos contaminantes.

p.41

TABELA 2 - Valores de tempo de geração (t_gen), ponto de inflexão (t_mid) e

valor de crescimento populacional máximo (k) para as espécies L.

interrogans sgs Icterohaemorrhagiae e Sejroe, L. noguchii, L.

santarosai e L. borgpetersenii em meio-base EMJH. p.45



interrogans sgs Icterohaemorrhagiae e Sejroe, L. noguchii, L.

santarosai e L. borgpetersenii em meio-base T80/40LH. p.47



interrogans sgs Icterohaemorrhagiae e Sejroe, L. noguchii e L.

santarosai em meio-base Fletcher. p.49

TABELA 5 - Relação entre os valores de tempo de geração (t_gen), ponto de

inflexão (t_mid) e pico máximo de crescimento (k) das espécies L.

interrogans sgs Icterohaemorrhagiae e Sejroe, L. noguchii e L.

santarosai, nos meios-base EMJH, Fletcher e T80/40LH. p.50

TABELA 6 - Relação entre os valores de tempo de geração (t_gen), ponto de

inflexão (t_mid) e pico máximo de crescimento (k) da espécie L.

borgpetersenii, nos meios-base EMJH e T80/40LH e nos meios

EMJH+SORO e EMJH+PIR. p.54

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

5-FU 5-Fluorouracil

BSA Bovine Serum Albumin (Albumina Bovina)

CCBVet Coleção de Culturas de Bactérias de Interesse Veterinário

ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay (Ensaios

imunoenzimáticos)

EMJH Ellinghausen e McCullough modificado por Johnson e

Harris

k tamanho populacional máximo

LPS lipopolissacarídeo

PCR Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia da

Polimerase)

PIR Piruvato de Sódio

sg sorogrupo

SORO Soro de Coelho

t_gen tempo de geração

t_mid ponto de inflexão

UFF Universidade Federal Fluminense

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ______________________________________________ 15

2 OBJETIVOS ________________________________________________ 17

2.1 Objetivo geral ____________________________________________ 17

2.2 Objetivos específicos ______________________________________ 17

3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA __________________________________ 18

3.1 Histórico e Classificação Taxonômica __________________________ 18

3.2 Aspectos Morfológicos _____________________________________ 20

3.3 Aspectos Biológicos _______________________________________ 22

3.4 Crescimento bacteriano ____________________________________ 24

3.4.1 Curva de crescimento ___________________________________ 24

3.4.2 Quantificação de leptospiras ______________________________ 25

3.5 Cultivo de Leptospira ______________________________________ 26

3.5.1 Meios de cultura _______________________________________ 27

3.5.2 Compostos de Enriquecimento ____________________________ 30

3.5.3 Estratégias para isolamento primário de leptospiras ___________ 31

3.5.3.1 Uso de coquetéis antimicrobianos ______________________ 31

3.5.3.2 Filtração __________________________________________ 33

3.5.3.3 Diluição Seriada ____________________________________ 33

3.6 Isolamento de Leptospira ___________________________________ 34

4 MATERIAL E MÉTODOS ______________________________________ 36

4.2 Seleção e descongelamento das espécies de Leptospira spp. _______ 36

4.3 Meios de cultura utilizados __________________________________ 36

4.4 Componentes de Enriquecimento _____________________________ 37

4.5 Coquetéis de Antimicrobianos________________________________ 37

4.6 Padronização do inóculo ____________________________________ 39

4.7 Determinação da curva de crescimento ________________________ 40

4.8 Representação gráfica e análise estatística _____________________ 40

5 RESULTADOS ______________________________________________ 42

5.1 Meios-base sem aditivos ____________________________________ 42

5.1.1 Meio-base EMJH ______________________________________ 42

5.1.2 Meio-base T80/40LH ___________________________________ 44

5.1.3 Meio-base Fletcher _____________________________________ 46

5.1.4 Comparação estatística entre os meios-base sem aditivos ______ 48

5.2 Compostos de Enriquecimento _______________________________ 49

5.2.1 Meio EMJH com a adição de compostos de enriquecimento _____ 49

5.2.2 Comportamento da espécie Leptospira borgpetersenii __________ 52

5.2.3 Meio Fletcher com a adição de compostos de enriquecimento ___ 53

5.3 Adição de Coquetéis Antimicrobianos __________________________ 56

6 DISCUSSÃO ________________________________________________ 57

7 CONCLUSÕES ______________________________________________ 64

8 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ______________________________ 65

15

1 INTRODUÇÃO

A leptospirose é uma zoonose causada por espiroquetas do gênero

Leptospira, que ocorre em todo o mundo, principalmente nos países tropicais

(OIE, 2014). Animais suscetíveis adquirem a infecção por contato direto ou

indireto com urina ou tecidos de animais infectados. Animais carreadores

geralmente apresentam doença subclínica com sintomas pouco aparentes, e

eliminam a urina de forma intermitente por longos períodos, tornando-se assim

uma importante fonte de infecção para o ambiente e outros animais, incluindo

humanos (ELLIS, 2015). A compreensão da epidemiologia local com a definição

das espécies circulantes e de seus principais reservatórios se torna essencial

para o sucesso do diagnóstico e programas de controle da leptospirose em

determinadas regiões (SCHNEIDER et al., 2015).

Neste contexto, apesar do diagnóstico sorológico definir o sorogrupo a

qual determinada população foi exposta, somente a obtenção de espécies locais

permite: i) incrementar as técnicas sorológicas de diagnóstico, aumentando sua

sensibilidade (PINTO et al., 2015); ii) a criação de novas possibilidades para

estratégias de vacinação (MURRAY, 2013); iii) e a real compreensão do status

epidemiológico da doença (CHAPPEL; SMYTHE, 2012). Apesar disso, o

isolamento de leptospiras a partir de amostras clínicas é um desafio (SAITO et

al., 2014).

O cultivo do agente a partir de amostras clínicas é uma técnica muito

laboriosa com baixa sensibilidade o que demanda grande expertise técnica.

Leptospiras patogênicas tem crescimento fastidioso, são muito exigentes e

susceptíveis aos metabólitos produzidos por microrganismos contaminantes

(CAMERON, 2015). Para obtenção de culturas puras se faz necessário o uso de

meios de cultura especiais, enriquecidos com soro de coelho e/ou albumina

bovina e técnicas de controle de contaminantes, como uso de agentes

antimicrobianos (CAMERON, 2015; LOUREIRO et al., 2015). Apesar da

importância de se ter culturas de espécies locais e da dificuldade da obtenção

destas a partir de amostras clínicas, poucos são os estudos atuais que abordam

o cultivo das diferentes estirpes de leptospiras.

16

São escassos os estudos que compararam os requerimentos nutricionais

de diferentes espécies de Leptospira nos meios de cultura mais frequentemente

utilizados (AL-MAALY; JUDI, 2015; DOS SANTOS PAIXÃO et al., 2014). Além

disso, algumas espécies de leptospiras como L. borgpetersenii se mostraram

menos resistentes às adversidades ambientais e mais difíceis de serem

cultivadas (BULACH et al., 2006) ao passo que outras se mostraram mais

facilmente cultiváveis como L. santarosai (LOUREIRO et al., 2015).

A construção da curva de crescimento de uma população permite o

entendimento da dinâmica do desenvolvimento bacteriano, assim como são

fornecidas importantes informações, como o tempo de geração e o número

populacional máximo (SPROUFFSKE; WAGNER, 2016). Desta forma, o

presente estudo buscou determinar e comparar o perfil de crescimento de

espécies de Leptospira em diferentes meios de cultura por meio da

caracterização e avaliação das curvas de crescimento, objetivando uma maior

compreensão a respeito do desenvolvimento desses microrganismos in vitro.

17

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Avaliar o perfil de crescimento de diferentes genomoespécies de

Leptospira sp. frente à diferentes formulações de meios de cultura.

2.2 Objetivos específicos

1- Avaliar o comportamento de L. interrogans, L. santarosai, L.

borgpetersenii e L. noguchii frente ao cultivo nos meios-base EMJH, T80/40/LH

e Fletcher;

2- Avaliar o comportamento das genomoespécies frente aos

diferentes meios de cultura acima especificados com a adição de componentes

enriquecedores e suas combinações e; determinar quais, dentre estas, são

eficientes em promover o crescimento dessas genomoespécies;

3- Avaliar o comportamento das genomoespécies nos diferentes

meios de cultura acima especificados com a adição de coquetéis antimicrobianos

e suas combinações e; determinar quais, dentre estas, permitem o crescimento

eficiente de cada genomoespécie.

4- Propor o uso de meios de cultura, bem como suas combinações

com componentes enriquecedores e coquetéis antimicrobianos para o

isolamento das diferentes genomoespécies de Leptospira avaliadas.

18

3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

3.1 Histórico e Classificação Taxonômica

Enfermidades que causavam icterícia sempre foram consideradas de

extrema importância para a humanidade (FAINE et al., 1999). Entretanto, foi

somente em 1907 que Stimson descreveu pela primeira vez a presença de

microrganismos espiralados e com a ponta em formato de “gancho” nos tecidos

de um paciente que havia falecido devido a uma “febre amarela” (STIMSON,

1907). Foi sugerido que este paciente de fato havia sucumbido devido à doença

de Weil, ou então que este possuísse tal enfermidade quando contraiu febre

amarela e veio à óbito (SELLARDS, 1940).

Quase uma década depois, uma espiroqueta foi descrita como o agente

etiológico da doença de Weil (INADA et al., 1916), endêmica em regiões do

Japão. Após a comparação da morfologia de diferentes espiroquetas, Noguchi

propôs incluir esse microrganismo como pertencente ao gênero Leptospira

(NOGUCHI, 1918), sendo assim incluídos na Ordem Spirochetales, Família

Leptospiraceae (HOVIND-HOUGEN, 1979). Após a descrição do gênero,

inúmeros autores adotaram essa nomenclatura. Todavia essa classificação era

baseada principalmente nas diferenças morfológicas apresentadas pelas

espécies isoladas (FAINE; STALLMAN, 1982).

Wolff e Broom foram os primeiros a propor uma padronização utilizando

técnicas sorológicas, sugerindo o uso do termo sorovar para a classificação das

leptospiras como unidade taxonômica (WOLFF; BROOM, 1954). Os sorovares

com determinada similaridade são estudados em sorogrupos por conveniência.

Desta forma, as unidades que foram descritas pelas características de

aglutinação foram tratadas como espécies em diversos estudos (CHANG, 1946;

ELLINGHAUSEN, 1960; JOHNSON; GARY, 1962; MARSHALL, 1949; RIDLON,

1931; SANTA-ROSA; PESTANA DE CASTRO; TROISE, 1961; STALHEIM;

WILSON, 1964).

É necessário compreender que a designição em sorogrupos, apesar de

representar um termo muito utilizado, é considerada como uma subclassificação

sem valor taxonômico. Entretanto essa categoria possui grande importância para

a aplicação de técnicas sorológicas para diagnóstico da doença, principalmente

19

para a compreensão da epidemiologia da enfermidade em determinadas regiões

e/ou populações (ELLIS, 2015).

O International Committee on Systematic Bacteriology Subcommittee on

the Taxonomy of Leptospira ao longo dos anos realizou reuniões com os

pesquisadores mais relevantes da área em busca de um consenso sobre a

classificação das leptospiras. Destas, três foram de substancial relevância por

terem apresentado dados que marcaram os estudos que viriam a ser publicados.

Em ordem cronológica, a primeira a ser citada ocorreu em 1962, tendo sido

sugerido que leptospiras saprófitas deveriam ser nomeadas como L. biflexa,

enquanto as patogênicas como L. interrogans (WOLFF; TURNER, 1963).

Em 1982 o mesmo comitê se reuniu novamente e nele os membros

sugeriram que a descrição proposta anteriormente era defasada e inadequada

(FAINE; STALLMAN, 1982), entretanto recomendaram cautela na adoção de

classificações baseadas em diversidade genética (YASUDA et al., 1987). Por

fim, em 1994, foram apresentados estudos que fizeram uso de técnicas

moleculares e que permitiram definir as bases genéticas para a classificação

desses microrganismos. Dentre as recomendações fornecidas por esse comitê,

a principal foi a adoção da homologia entre DNA-DNA igual ou maior a 70% para

a determinação das espécies (MARSHALL, 1995).

Outra importante informação acerca da classificação das leptospiras é a

correlação que existe entre espécies, sorogrupos e sorovares. Como

mencionado anteriormente, alguns sorovares apresentam correlações

antigênicas, sendo incluídos em um mesmo sorogrupo, como é o caso das

estirpes Hardjobovis e Hardjoprajitno do sorovar Hardjo, pertencente ao

sorogrupo Sejroe. Curiosamente, essas estirpes são exemplares de duas

diferentes espécies: L. borgpetersenii e L. interrogans, respectivamente, sendo

indistinguíveis uma da outra em testes sorológicos (FAINE et al., 1999). Sendo

assim, a classificação fenotípica se mantém, mesmo com o advento da biologia

molecular e a nomenclatura passa a ser assumida com a descrição da espécie

genética associada ao sorovar a que se refere. Por exemplo: Leptospira

interrogans sorovar Hardjo (LEVETT; SMYTHE, 2006).

20

Até o momento foram identificados aproximadamente 300 sorovares

distribuídos em 28 sorogrupos e 23 genomoespécies classificadas

filogeneticamente em grupos, sendo nove espécies pertencentes ao grupo I

(patogênicas), sete espécies pertencentes ao grupo II (intermediárias) e sete

pertencentes ao grupo III (não patogênicas) (PICARDEAU, 2017; PUCHE et al.,

2017).

3.2 Aspectos Morfológicos

As leptospiras são espiroquetas finas, de formato helicoidal com diâmetro

de aproximadamente 0,1 a 0,2 µm, medindo entre 10 a 20 µm. Leptospiras recém

isoladas são menores e mais enroladas que aquelas mantidas em laboratório em

sucessivas passagens em meio de cultura (HARTSKEERL; COLLARES-

PEREIRA; ELLIS, 2011). A microscopia de campo escuro em preparações

líquidas é o método de eleição para a visualização destes microrganismos devido

a melhor observação de seu formato delgado e sua rápida motilidade

(CAMERON, 2015; FAINE; STALLMAN, 1982). Quando se encontram em

ambientes inóspitos, com pouca disponibilidade de nutrientes, as leptospiras

entram em estresse. Tais condições induzem alterações morfológicas como a

perda do formato típico espiralado e das pontas em gancho e ocorre a diminuição

da divisão celular, causando uma queda na taxa de crescimento populacional,

podendo levar, posteriormente, a morte desses microrganismos (CAMERON,

2015; CHIDEROLI et al., 2017).

Sua estrutura de parede celular é muito similar à de outras bactérias

Gram-negativas; possui uma membrana externa composta por proteínas,

lipídeos e uma porção do lipopolissacarídeo (LPS). A membrana externa de

Leptospira pode ser facilmente removida durante a manipulação das culturas

(CAMERON, 2015). Essa apresenta um perfil complexo de proteínas em sua

superfície, tendo sido caracterizadas apenas algumas destas, como a porina

OmpL1 (SHANG et al., 1995), as lipoproteínas LipL21, LipL32, LipL36 e LipL41

e as proteínas semelhantes à imunoglobulina A e B - LigA e LigB (CULLEN;

HAAKE; ADLER, 2004; NATARAJASEENIVASAN et al., 2008; NITIPAN et al.,

2013; PINNE; HAAKE, 2009, 2013).

21

Abaixo da membrana externa separado pelo espaço periplasmático

encontra-se o peptidoglicano associado à parede celular da bactéria; entretanto,

diferentemente das demais bactérias Gram-negativas, a localização dessa

estrutura difere uma vez que se apresenta mais próximo à membrana

citoplasmática ao invés da membrana externa (CULLEN; HAAKE; ADLER,

2004). No espaço periplasmático estão inseridos dois endoflagelos que

emergem a partir de inserções no peptidoglicano (CAMERON, 2015). O local de

ancoragem dos endoflagelos difere das demais espiroquetas proporcionando o

formato de gancho característico desses microrganismos. Todavia, o formato

espiral dessas bactérias não está relacionado ao flagelo periplasmático e sim a

união do peptidoglicano e das proteínas do citoesqueleto (SLAMTI et al., 2011).

Esses fatores são responsáveis pelo movimento característico de “saca rolha”

desses microrganismos (CHARON; GOLDSTEIN, 2002). Associados, esses

mecanismos garantem rápida motilidade translacional, permitindo um

descolamento de aproximadamente 20 µm em apenas 2 a 3 segundos

(CAMERON, 2015). A morfologia dos endoflagelos e suas estruturas são de uma

forma geral, muito similares e desta forma, assumiu-se que essas observações

pudessem ser extrapoladas para todas as espécies de leptospiras. De fato,

quando são observadas culturas em microscopia de campo escuro é improvável

diferenciar as espécies de leptospiras (FAINE et al., 1999).

Os endoflagelos além de essenciais para a motilidade das leptospiras, são

importantes fatores de virulência, uma vez que subunidades dessa estrutura,

como a proteína FlaA, são essenciais para o estabelecimento da infecção em

modelos animais. Tal fato ocorre principalmente pela necessidade das

leptospiras se disseminarem rapidamente para os tecidos do hospedeiro,

apresentando vigorosa motilidade durante o processo infeccioso (LAMBERT et

al., 2012). Após o sequenciamento de genoma de L. interrogans foi identificado

um conjunto de genes associados a constituição dos endoflagelos

(NASCIMENTO et al., 2004; REN et al., 2003). Quando realizado o nocaute do

gene fliY em L. interrogans sorovar Lai, foi possível observar uma diminuição da

motilidade desses microrganismos e a atenuação da sua virulência (LIAO et al.,

2009). Mais recentemente, foi identificado que o nocaute do gene codificador de

FcpA (proteína expressa abundantemente na superfície endoflagelar) em L.

22

interrogans leva a uma diminuição dos endoflagelos, diminuindo a motilidade

bacteriana e perdendo a capacidade de causar doença em modelos

experimentais (WUNDER et al., 2016).

O LPS das leptospiras é semelhante ao descrito para outras bactérias

Gram-negativas. É formado por três componentes distintos: uma porção

hidrofóbica inserida na membrana externa conhecida como lipídeo A, o antígeno

O, que se estende desde a superfície celular até a parte externa, e o

oligossacarídeo central, que une as duas estruturas citadas anteriormente. Ainda

que a estrutura geral do LPS seja similar a de outras bactérias Gram-negativas,

mesmo sendo o mais comum componente de superfície das leptospiras, pouco

se sabe a respeito de sua real composição e estrutura do LPS leptospírico. Como

já dito anteriormente, a caracterização imunológica do LPS permite a distinção

das leptospiras em sorogrupos devido a correlações antigênicas; todavia,

existem espécies que mesmo diferindo geneticamente como L. interrogans

sorovar Hardjoprajitno e L. borgpetersenii sorovar Hardjobovis, ambas

pertecentes ao sorogrupo Sejroe, são indistinguíveis na sorologia. Desta forma,

foi sugerido que o LPS também possui importante função na determinação da

especificidade de hospedeiros (BULACH et al., 2000; MURRAY et al., 2010;

PATRA et al., 2015). O LPS possui também importante função na virulência

desses microrganismos (PATRA et al., 2015), principalmente na colonização e

disseminação das leptospiras nos organismos (MURRAY et al., 2010; NALLY et

al., 2005).

3.3 Aspectos Biológicos

Os estudos que buscaram elucidar os processos metabólicos envolvidos

na fisiologia das bactérias do gênero Leptospira eram baseados somente em

uma ou duas espécies e as conclusões obtidas eram, então, extrapoladas para

todas as outras espécies (JOHNSON, 1996; JOHNSON; FAINE, 1984). Porém,

mais recentemente foram demonstradas importantes diferenças metabólicas

entre as genomoespécies de leptospiras (FOUTS et al., 2016). Uma das

características mais marcantes desse gênero é o seu desenvolvimento em

ambientes de microaerofilia. Análises por sequenciamento de genoma completo

demonstraram que essas bactérias possuem genes que codificam o ciclo do

23

ácido tricarboxílico e também componentes da cadeia transportadora de elétrons

indicando o uso do oxigênio como aceptor final de elétrons (ZHANG et al., 2011).

As leptospiras não fermentam açúcares; assim sendo, utilizam os ácidos

graxos de cadeia longa (>C15) como única fonte de energia por meio da β-

oxidação (HENNEBERRY; COX, 1970). Entretanto, a não utilização da glicose

como fonte energética não é devido à ausência de enzimas, mas sim devido a

um limitado sistema de transporte desta molécula (JOHNSON; WALBY, 1972;

NASCIMENTO et al., 2004; ZHANG et al., 2011). Compostos como piruvato e

acetato foram estudados como via alternativa para a obtenção de energia, porém

ficou demonstrado que tais bactérias são incapazes de sintetizar ácidos graxos

de cadeia longa a partir destes (JOHNSON et al., 1970; STERN; SHENBERG;

TIETZ, 1969).

Outro produto essencial para o desenvolvimento de Leptospira é o

nitrogênio, comumente fornecido na forma de amônia e obtido principalmente

por meio de sais de amônia ou pelo processo de desaminação da asparagina

pela asparaginase (FAINE et al., 1999). Algumas espécies são capazes de

sintetizar isoleucina por meio de diferentes vias metabólicas, utilizando a via

clássica de treonina, pela via alternativa do piruvato ou ambas simultaneamente

(CHARON; JOHNSON; PETERSON, 1974; REN et al., 2003; WESTFALL;

CHARON; PETERSON, 1983).

Estudos foram realizados a fim de definir se vitaminas poderiam ser

utilizadas como fontes de nitrogênio para esses microrganismos (JOHNSON;

ROGERS, 1964). Foi sugerido que a tiamina (vitamina B1) seria um produto

essencial para o crescimento de leptospiras, já a cianocobalamina (vitamina

B12) só melhoraria o desempenho de crescimento quando associada à primeira

(SCHNEIDERMAN et al., 1953; SHENBERG, 1967; STALHEIM; WILSON,

1964). Tal fato foi confirmado posteriormente, uma vez que o sequenciamento

do genoma completo de algumas espécies evidenciou a presença de genes

responsáveis por vias de síntese de vitamina B12 e também o transporte desses

produtos (RICALDI et al., 2012) demonstrando que a presença de vitamina B12

não é essencial ao crescimento destas bactérias.

24

Por fim, outros micronutrientes comumente adicionados aos meios de

cultura para o crescimento de diversos microrganismos, também foram

estudados para que se soubesse seus efeitos no cultivo e manutenção de

leptospiras. Dentre os minerais mais importantes e necessários para o

desenvolvimento, cita-se cálcio, magnésio, ferro, cobre e manganês (JOHNSON;

GARY, 1963; STALHEIM; WILSON, 1964; STANECK; HENNEBERRY; COX,

1973).

3.4 Crescimento bacteriano

É sabido que as espécies de leptospiras apresentam diferentes padrões

de crescimento quando em meio de cultura devido a diferenças biológicas, o

grau de adaptação ao cultivo em laboratório e também ao inóculo utilizado

inicialmente para repique. Entretanto, de uma forma geral as leptospiras

patogênicas apresentam um crescimento ótimo in vitro em temperaturas entre

28–30 oC, diferenciando-se de leptospiras saprófitas uma vez que não crescem

também em temperaturas baixas (11-13oC). O tempo de geração destas quando

altamente adaptadas ao ambiente in vitro em condições ótimas varia entre 6 e

8h, já quando recém isoladas e inoculadas em meio de cultura o tempo de

geração pode chegar a 14-18h, com uma fase de adaptação durando dias ou até

mesmo semanas (CAMERON, 2015).

3.4.1 Curva de crescimento

Durante muito tempo, as curvas de crescimento têm sido utilizadas como

importantes ferramentas para estudos de regulação da expressão de genes de

virulência, expressão de enzimas, fisiologia do crescimento bacteriano e,

principalmente, requerimentos nutricionais (FERENCI, 1999, 2001;

GYANESHWAR et al., 2005; HALL et al., 2014; OWENS; LEGAN, 1987; SCOTT;

HWA, 2011; SHEHATA; MARR, 1971; SINCLAIR; STOKES, 1962).

Muitos dos estudos que utilizam curvas de crescimento em Leptospira

spp. limitam-se a pesquisa sobre requerimentos nutricionais, características

bioquímicas e observações no padrão de crescimento de L. interrogans dos

sorogrupos Icterohaemorrhagiae e Pomona (CHANG, 1947; ELLINGHAUSEN;

MCCULLOUGH, 1965a, 1965b; ELLINGHAUSEN, 1960; JOHNSON; GARY,

1962, 1963; VANESELTINE; STAPLES, 1961). A curva de crescimento

25

apresentada pelas leptospiras segue o mesmo padrão daquelas apresentadas

por outras bactérias com a diferença de que essa curva é construída em uma

escala de tempo superior à das outras (MICHA; CORRADINI, 2011).

3.4.2 Quantificação de leptospiras

Padrões excelentes de crescimento são atingidos in vitro quando se

obtém 107 a 108 leptospiras/mL (ZUERNER, 2005), sendo sua quantificação

melhor realizada por meio de métodos convencionais (MURRAY et al., 2010).

Isto porque apesar da conveniência na utilização de técnicas como a PCR

quantitativa (AHMED et al., 2009; BOURHY et al., 2011; LOUREIRO et al., 2013),

algumas desvantagens inviabilizam a sua utilização rotineira, como a dificuldade

de padronização, mão de obra e manutenção especializada, alto custo de

aquisição e de manutenção de reagentes e soluções (CLEMENTI, 2000;

LOUREIRO et al., 2013).

A utilização de câmaras de contagem é a técnica disponível mais simples

de ser utilizada nos laboratórios. Não há a necessidade de aparelhagem técnica

dispendiosa, não exige manutenção, é altamente reprodutível e facilmente

padronizável; além disso, existe uma variedade de câmaras no mercado e o seu

uso é amplamente aplicado em laboratórios de pesquisa (CHRISTENSEN;

STRYHN; HANSEN, 2005; COOPER; HELLENKEMPER, 2010). Nos

laboratórios de análises clínicas, a câmera de Neubauer é comumente utilizada

para outros fins, todavia, para contagem de leptospiras se utilizam com

frequência a câmara de Petroff-Hausser (FAINE et al., 1999; HUMBERD et al.,

2005; LARSON, A. D.; TREICK, R. W.; EDWARDS, C. L.; COX, 1958; LARSON;

EDWARDS, 1958; MURRAY et al., 2010) cujo custo de aquisição é muito

superior.

Existem outras técnicas para a contagem de leptospiras, entretanto estas

são métodos indiretos e necessitam de aparelhagens específicas para realizar

essa mensuração pela turbidez. Dentre as disponíveis, uma das mais utilizadas

é a nefelometria, apesar do limite mínimo de detecção da técnica ser de

aproximadamente 106 leptospiras/mL. Há ainda a contagem por

espectrofotometria, menos sensível que a técnica anterior, capaz de realizar

leituras com aproximadamente 108 leptospiras/mL em meio de cultura. Apesar

26

da aplicabilidade dessas metodologias, ainda se faz necessário o uso de

técnicas tradicionais para a construção de um controle a ser utilizado como

padrão (FAINE et al., 1999; KINGSCOTE, 1985; SCHREIER et al., 2009).

3.5 Cultivo de Leptospira

O primeiro cultivo in vitro de uma leptospira patogênica foi obtido a partir

do fígado de uma cobaia após a inoculação do sangue de um paciente com

leptospirose (INADA et al., 1916). Naquela época, os métodos para o isolamento

desse microrganismo eram baseados exclusivamente nas técnicas descritas

para outras espiroquetas, utilizando principalmente a maceração de órgãos de

cobaias, fluidos orgânicos e parafina (NOGUCHII, 1912). Os meios de cultura

buscam mimetizar as condições naturais às quais essas bactérias estão

expostas no organismo dos indivíduos infectados (FAINE et al., 1999).

O cultivo do agente a partir de amostras clínicas é uma técnica muito

laboriosa com baixa sensibilidade o que demanda grande expertise técnica.

Leptospiras patogênicas têm crescimento fastidioso, são muito exigentes e

susceptíveis aos metabólitos produzidos por microrganismos contaminantes

(CAMERON, 2015). Para obtenção de culturas puras, se faz necessário o uso

de meios de cultura especiais enriquecidos e técnicas de controle de

contaminantes, com o uso de agentes antimicrobianos, por exemplo

(LOUREIRO et al., 2015). Apesar da importância de se ter culturas de espécies

locais e da dificuldade da obtenção destas a partir de amostras clínicas, poucos

são os estudos atuais que abordam o desenvolvimento de novas técnicas e

meios de cultivo (CAMERON, 2015; CHIDEROLI et al., 2016; LILENBAUM et al.,

2007; LOUREIRO et al., 2015; MIRAGLIA et al., 2009; ZACARIAS et al., 2008),

as quais serão discutidas no decorrer deste tópico.

O cultivo de Leptospira a partir de amostras clínicas é o padrão ouro para

o diagnóstico de leptospirose. Todavia, como já mencionado, essas bactérias

possuem um crescimento fastidioso, requerendo meios de cultura especiais

(HAAKE; LEVETT, 2015) e longos períodos de incubação (ADLER; DE LA

PEÑA-MOCTEZUMA, 2010) que levam até 16 semanas para considerar um

resultado como negativo. Este fato impossibilita o uso desta técnica como

método diagnóstico único para a leptospirose. Outros métodos diretos como a

27

visualização direta de leptospiras a partir de amostras clínicas e métodos

moleculares podem ser utilizados como diagnóstico; todavia, a espessura da

parede das leptospiras impossibilita o uso de colorações tradicionais e desta

forma se faz necessário uso de microscopia de campo escuro e uma

concentração mínima de 104 leptospiras/mL para que seja possível sua

visualização em campo microscópico (AHMAD; SHAH; AHMAD, 2005;

TOYOKAWA; OHNISHI; KOIZUMI, 2011).

Os métodos moleculares têm sido cada vez mais difundidos, uma vez que

estes não exigem a presença de leptospiras viáveis (HAMOND et al., 2014). A

Polymerase Chain Reaction (PCR) é uma técnica que apresenta alta

sensibilidade e especificidade, promovendo a amplificação de quantidades

mínimas de DNA de leptospiras (HERNANDEZ-RODRIGUEZ et al., 2011). O uso

dessa técnica é de grande importância para o diagnóstico rápido de leptospirose,

principalmente em relação a doença aguda. Entretanto, apesar da praticidade,

tal técnica não fornece informações essenciais à epidemiologia como definição

das estirpes circulantes (AHMAD; SHAH; AHMAD, 2005).

Assim sendo, a obtenção de culturas puras de espécies locais se faz

essencial para a compreensão da epidemiologia da leptospirose local já que com

novos isolados é possível: i) incrementar as técnicas sorológicas de diagnóstico,

aumentando sua sensibilidade (SARMENTO et al., 2012); ii) a criação de novas

possibilidades para estratégias de vacinação (MURRAY, 2013); iii) e a real

compreensão do status epidemiológico da doença na região estudada

(CHAPPEL; SMYTHE, 2012).

3.5.1 Meios de cultura

As décadas que se seguiram à descrição do gênero Leptospira

(NOGUCHI, 1918) foram marcadas por inúmeras tentativas de desenvolver

meios de cultura para o crescimento desses microrganismos fastidiosos. Os

pesquisadores buscavam principalmente comparar meios já descritos a fim de

solucionar falhas que afetavam desenvolvimento dessas bactérias (CHANG,

1947; GILLESPIE; RINGEN; KENZY, 1953; JOHNSON; GARY, 1962;

SCHNEIDERMAN et al., 1951; STALHEIM, 1966; STERN; SHENBERG; TIETZ,

1969; STUART, 1946; VOGEL; HUTNER, 1961).

28

Além da utilização de fluidos orgânicos, comumente utilizados para o

cultivo de outras espiroquetas, o cultivo de Leptospira exige a inclusão de ácidos

graxos de cadeia longa (CHANG, 1947; ELLINGHAUSEN; MCCULLOUGH,

1965a; VOGEL; HUTNER, 1961). Porém, a presença de ácidos graxos livres no

meio de cultura inibe a respiração celular das leptospiras sendo assim tóxico

para tais bactérias. Assim sendo, se faz necessário a inclusão de um agente

desintoxicante no meio em que estão inseridos para evitar a inibição do

crescimento (HELPRIN; HIATT, 1957; STALHEIM; WILSON, 1964). As

substâncias desintoxicantes mais comumente utilizadas são a albumina bovina

e os complexos de polissorbato ou “tweens”. A albumina atua adsorvendo

grandes quantidades de ácidos graxos, podendo ligar-se de seis até a nove

moléculas quando em condições favoráveis, liberando-as de forma equilibrada

em concentrações não-tóxicas. Os “tweens” atuam de forma similar à albumina,

todavia diferem no fato de que estes já são produtos associados aos ácidos

graxos na forma não tóxica, atuando como uma fonte limpa dessas substâncias

orgânicas (DAVIS, 1946; ELLINGHAUSEN; MCCULLOUGH, 1965b; JOHNSON;

GARY, 1963).

Diversos meios de cultura foram descritos no decorrer dos anos, como

Stuart (FAINE et al., 1999; STUART, 1946), Korthof (KORTHOF, 1932), Fletcher

(FLETCHER, 1928), BA-P80 (ELLINGHAUSEN; MCCULLOUGH, 1965b) e

T80/40LH (ELLIS; MONTGOMERY; CASSELLS, 1985). A modificação sugerida

por Johnson e Harris (1967) sobre a base de albumina bovina e polisorbato 80

(meio BA-P80) se mostrou eficiente no cultivo de leptospiras do sorogrupo

Pomona. Apesar de exibirem sucesso no cultivo de estirpes de outros

sorogrupos com o mesmo meio, os requerimentos nutricionais destas não foram

analisados extensivamente como foi feito com o sorogrupo Pomona. Mesmo sem

levar em consideração particularidades entre espécies, o meio Ellinghausen-

McCullough/Johnson-Harris modificado, que ficou conhecido como EMJH, foi

consagrado como o padrão para cultivo e isolamento do gênero Leptospira até

o presente momento (BLACKMORE; SCHOLLUM, 1982; BOURHY et al., 2010;

CHAPPEL et al., 1985; LATIFAH et al., 2017; MGODE et al., 2015; MORAIS,

1994).

29

Meios de cultura líquidos, semissólidos e sólidos foram descritos para o

isolamento e cultura de leptospiras. Os meios de cultura líquidos são os mais

comumente utilizados para a manutenção de culturas de leptospiras em

laboratórios de pesquisa e diagnóstico. Entretanto o sucesso no cultivo desses

microrganismos depende diretamente da origem e concentração de bactérias no

inóculo. O crescimento das leptospiras nesses meios cria uma turbidez que pode

ser visualizada a olho nu quando em concentrações de 107 a 108 leptospiras/mL.

Todavia, mesmo quando em crescimento máximo, a densidade obtida nesses

meios não se aproxima a daquelas alcançadas por outras bactérias (CAMERON,

2015; FAINE et al., 1999).

Inicialmente, o ágar era adicionado aos meios de cultura líquidos com

propósitos de demonstrar a fase estacionária de crescimento de leptospiras

(WORATZ, 1952), definir as concentrações de oxigênio necessárias

(LAWRENCE, 1951) e demonstrar a formação de colônias a partir de uma única

unidade formadora (LARSON; EDWARDS, 1958). Atualmente, sabe-se que o

ágar atua também como um agente absortivo ligando-se a partículas prejudiciais

para leptospiras como metabólitos e substâncias inibitórias (CAMERON, 2015;

TURNER, 1970).

Os meios de cultura semissólidos são frequentemente incluídos na rotina

de isolamento e manutenção de leptospiras (BENACER et al., 2013; RIDZLAN

et al., 2010; SAITO et al., 2014, 2015). A adição de 0,2 a 0,5% de ágar em

qualquer meio de cultura líquido leva a solidificação parcial destes (TURNER,

1970). Quando há o crescimento dessas bactérias, forma-se uma zona densa

que pode ser facilmente visualizada a olho nu, conhecida como anel de Dinger

(CAMERON, 2015; CZEKALOWSKI; MCLEOD; RODICAN, 1953; FAINE et al.,

1999; KIRSCHNER; GRAHAM, 1959). O intenso crescimento de leptospiras

concentrado nesta região se dá por esta apresentar ambiente ideal para

crescimento desta bactérias principalmente devido à situação de microaerofilia,

formando assim o anel denso observado (CZEKALOWSKI; MCLEOD;

RODICAN, 1953; LAWRENCE, 1951).

Quando se eleva as concentrações de ágar a valores entre 0,8% e 1,3%,

há a solidificação do meio de cultura (STALHEIM; WILSON, 1964; TURNER,

30

1970). Apesar de existirem diversos meios de cultura sólidos descritos (COX;

LARSON, 1957; FAINE et al., 1999; LARSON, A. D.; TREICK, R. W.;

EDWARDS, C. L.; COX, 1958; STALHEIM; WILSON, 1963; WOOD; JOHNSON;

PALIN, 1981), estes são pouco utilizados principalmente devido à dificuldade na

aplicação da técnica associado a obtenção do crescimento de leptospiras. Foi

descrito um meio sólido (LVW) permissivo ao crescimento de leptospiras

patogênicas após sete dias de inoculação. As principais aplicações dos meios

sólidos são a eliminação de microrganismos contaminantes e obtenção de

culturas puras de leptospiras e também na confecção de testes de

susceptibilidade a antimicrobianos (CAMERON, 2015; WUTHIEKANUN et al.,

2013, 2015).

3.5.2 Compostos de Enriquecimento

Devido a característica fastidiosa de crescimento das leptospiras e em

especial de algumas espécies como L. borgpetersenii (BULACH et al., 2006),

diferentes compostos com o objetivo de enriquecer o meio para leptospiras foram

testados. A necessidade de fatores de crescimento por tais bactérias torna

essencial a inclusão de algum tipo de fluido orgânico, como soro, sangue total

ou até mesmo fluido oriundo de ascite (ELLINGHAUSEN, 1960; LARSON, A. D.;

TREICK, R. W.; EDWARDS, C. L.; COX, 1958; VANESELTINE; STAPLES,

1961).

O soro sanguíneo foi um dos primeiros compostos de enriquecimento

sugeridos para obter sucesso no cultivo de leptospiras (CHANG, 1947;

NOGUCHI, 1918), sendo até mesmo considerado como o mais importante

constituinte dos meios de cultura, uma vez que é uma fonte rica de nutrientes

(ELLINGHAUSEN, 1960; MIFUCHI; HOSOI; YANAGIHARA, 1961). Este possui

fatores de crescimento que são essenciais para a multiplicação desses

microrganismos, como vitamina B12 em altas concentrações, albumina, tiamina

e outros ainda não definidos (ELLINGHAUSEN; PAINTER, 1976; JOHNSON;

GARY, 1962; SHENBERG, 1967; TURNER, 1970; VOGEL; HUTNER, 1961).

A albumina presente no soro é outro importante composto de

enriquecimento comumente utilizado para melhorar o crescimento das

leptospiras. Além de atuar como um agente absortivo, a albumina também

31

fornece aminoácidos e lipídeos ao meio de cultura (JOHNSON; WILSON, 1960).

Todavia, por serem compostos quimicamente indefinidos, devem ser testados

todos os lotes antes de sua utilização, uma vez que estes podem apresentar

lipídios tóxicos contaminantes que inibem o crescimento das leptospiras (FAINE

et al., 1999).

Outro produto comumente utilizado para enriquecer os meios de cultura

utilizados é o piruvato. Inicialmente foi sugerido que este atuaria como fonte de

energia extra para as leptospiras (JOHNSON et al., 1970; STERN; SHENBERG;

TIETZ, 1969). Entretanto, estudos de análise genômica demonstraram que as

leptospiras não apresentam genes que codificam enzimas capazes de sintetizar

ácidos graxos a partir do piruvato (XU et al., 2016). Apesar de não atuar como

fonte energética, o piruvato foi identificado como um produto quimiotático para

Leptospira (LAMBERT et al., 2012) capaz reduzir a fase de adaptação dessas

bactérias em meios de cultura (STANECK; HENNEBERRY; COX, 1973),

sugerindo a importância deste composto para o cultivo de espécies de

crescimento fastidioso (JOHNSON et al., 1973).

3.5.3 Estratégias para isolamento primário de leptospiras

3.5.3.1 Uso de coquetéis antimicrobianos

A presença de outros microrganismos em culturas de Leptospira

provenientes de contaminação ambiental e/ou microbiota normal do hospedeiro

prejudicam o crescimento leptospírico uma vez que o tempo de geração dos

contaminantes é geralmente mais curto. Tais bactérias contaminantes esgotam

os nutrientes e produzem metabólitos que levam a inibição do desenvolvimento

pleno das leptospiras, resultando na morte da cultura de interesse

(SCHONBERG, 1981). Estudos que avaliaram a susceptibilidade de Leptospira

aos antimicrobianos (CHAKRABORTY et al., 2010; HOSPENTHAL; MURRAY,

2003; SCHONBERG, 1981; SUEPAUL et al., 2015; WUTHIEKANUN et al., 2015)

demonstraram que tais bactérias são capazes de resistir à ação toxica de tais

componentes por curto período e em determinadas concentrações (ALT;

ZUERNER; BOLIN, 2001; CHAKRABORTY et al., 2010). Assim sendo, foram

sugeridos a inclusão de antimicrobianos individualmente ou em coquetéis nos

meios de cultura para o controle de crescimento de contaminantes sem que haja

32

prejuízo ao cultivo de Leptospira (CHAKRABORTY et al., 2011; CHIDEROLI et

al., 2016; LOUREIRO et al., 2015; MIRAGLIA et al., 2009; ZACARIAS et al.,

2008).

Após a avaliação da susceptibilidade de 46 estirpes de Leptospira a

diferentes antimicrobianos (CHAKRABORTY et al., 2010), sugeriu-se a utilização

de um coquetel antimicrobiano para o isolamento de leptospiras a partir de

amostras ambientais, composto por Sulfametoxazol (400µg/mL), Trimetoprima

(200 µg/mL), Anfotericina B (50 µg/mL), Fosfomicina (4000 µg/mL) e 5-

Fluorouracil (1000 µg/mL), posteriormente identificado como STAFF

(CHAKRABORTY et al., 2011). Espécies patogênicas de L. interrogans, L.

noguchii e L. santarosai foram isoladas a partir de urina e fluido vaginal de

bovinos utilizando meios de cultura com a adição do coquetel antimicrobiano

STAFF (LOUREIRO et al., 2015; MARTINS et al., 2015). Mais recentemente, foi

descrito o primeiro isolamento de L. borgpetersenii no Brasil (CHIDEROLI et al.,

2016) após a utilização de outro coquetel antimicrobiano composto por 5-

Fluorouracil (400mg/L), Cloranfenicol (5mg/L), Ácido Nalidíxico (50mg/L),

Neomicina (10mg/L) e Vancomicina (10mg/L), descrito anteriormente

(ZACARIAS et al., 2008).

Além dos antimicrobianos, o componente químico 5-Fluorouracil (5-FU) é

um dos mais utilizados no controle de microrganismos. Seu mecanismo de ação

consiste em inibir a biossíntese do DNA e RNA atribuído principalmente à

incorporação errônea de fluoronucleotídeos no DNA e RNA durante a síntese

destes (LONGLEY, HARKIN, JOHNSTON, 2003). Nos estudos que buscavam

elucidar o papel do nitrogênio no metabolismo de estirpes do sorogrupo Pomona,

foi demonstrado que pirimidinas não podem ser incorporadas aos ácidos

nucléicos de leptospiras (JOHNSON; ROGERS, 1964). Desta forma, por ser um

análogo da pirimidina, o 5-FU não influencia no metabolismo das leptospiras

podendo ser utilizado como controle de outros microrganismos contaminantes

sem prejudicar o crescimento de leptospiras.

Ainda assim, estudos que utilizaram somente o 5-FU para o controle de

microrganismos apresentaram altas taxas de isolamento a partir de amostras

clínicas ou ambientais (BENACER et al., 2013; DOS SANTOS PAIXÃO et al.,

33

2014; GONÇALVES et al., 2010; LALL et al., 2016; MGODE et al., 2015; TAN et

al., 2014), mostrando que o uso de 5-FU como agente único ou associado a

outros antimicrobianos pode ser uma alternativa viável para o cultivo de

Leptospira e para o controle de microrganismos contaminantes.

3.5.3.2 Filtração

Filtros com poros de 0,22 µm de diâmetro são utilizados frequentemente

para esterilizar líquidos que não podem ser submetidos a técnicas que utilizam

o calor como agente esterilizante (CAMERON, 2015). Leptospiras são capazes

de passar através de filtros de microporos quando determinada força é aplicada

(manualmente pela pressão de uma seringa) ou por centrifugação já que

apresentam formato helicoidal com diâmetro de aproximadamente 0,1 µm,

enquanto que outras bactérias permanecem retidas (TURNER, 1970).

Estudando a eficiência da técnica de filtração para o isolamento de Leptospira,

foi possível demonstrar que os microporos dos filtros devem possuir um diâmetro

menor que 0,45 µm para que se alcance resultados ótimos no isolamento desses

microrganismos (KABOOSI; RAZAVI; AL SADAT NOOHI, 2010), o melhor filtro

para a aplicação da técnica é o de 0,22 µm de diâmetro (CAMERON, 2015).

3.5.3.3 Diluição Seriada

O objetivo da diluição seriada é diminuir a carga de microrganismos

contaminantes presentes na amostra original. Tal técnica também é preconizada

quando se faz cultura a partir de tecidos, como renal ou aborto, já que a presença

de tecido macerado no meio apresenta alguns fatores inibitórios ao crescimento

de leptospiras ainda não bem definidos (MIRAGLIA et al., 2009; TURNER, 1970).

Diluições seriadas devem ser realizadas com soluções salina estéreis

(pH 7.4) ou mesmo em meios de cultura, variando de 10-1 até 10-4 e devendo ser

mantidas em estufa a 28º a 30º C (MIRAGLIA et al., 2009). Os tubos contendo

as diluições seriadas devem ser mantidos em estufa durante 24h e

posteriormente ressemeados em outro meio de cultura, devendo ser examinados

por microscopia de campo escuro durante seis semanas (LILENBAUM et al.,

2007). Outra metodologia sugerida é a inoculação de 0,1 mL de cada diluição

em meios de cultura sólidos, sendo estes selados e mantidos invertidos em

34

estufa. Quando houver crescimento de leptospiras, essa deve ser transferida

para um meio líquido (TURNER, 1970).

3.6 Isolamento de Leptospira

Apesar do isolamento de Leptospira ser imprescindível para que sejam

conhecidas as espécies circulantes em determinadas regiões (LILENBAUM;

MARTINS, 2014), grande parte dos estudos que alcançam esse objetivo não

apresentam altas taxas de isolamento a partir de amostras clínicas.

Investigando as características genéticas e sorológicas de estirpes de

Leptospira isoladas a apartir de amostras de sangue de 388 pacientes humanos

utilizando o meio de cultura EMJH, pesquisadores puderam recuperar 6,1% de

espécies de L. borgpetersenii, L. kirschneri e L. interrogans a partir de amostras

(BOURHY et al., 2010). Já em Portugal, estudando 68 pacientes de um hospital,

obteve-se uma taxa de isolamento de 14,7% com a detecção de L. interrogans

e L. borgpetersenii, quando associada a técnica de diluição seriada em meio

EMJH. Os pesquisadores também fizeram uso de repiques consecutivos para

manutenção das culturas em EMJH semissólido com a adição de 5% de soro de

coelho e 5-FU (GONÇALVES et al., 2010).

Em animais, as taxas de isolamento não são diferentes daquelas obtidas

em estudos com seres humanos. Amostras de urina de 167 bovinos foram

inoculadas em meio de cultura EMJH e Fletcher e, caso identificada

contaminação por outros microrganismos, a adição de 5-FU e a filtração das

culturas eram realizadas. Com esse protocolo os autores foram capazes de isolar

a partir dessas amostras clínicas de bovinos no Brasil 6% de L. noguchii

(MARTINS et al., 2015). Em outro estudo, a metodologia utilizada permitiu o

isolamento de 10,4% a partir dos rins de 480 bovinos do Zimbábue. Entretanto,

os isolados só foram caracterizados por sorogrupagem por meio de

soroaglutinação microscópica (FERESU, 1992). Na Malásia, foram recuperados

6,7% de isolados de Leptospira a partir de amostras de 300 ratos urbanos

utilizando EMJH e EMJH semissólido, com a adição de 0,13% de Bacto agar,

1% de soro e coelho, 1% de albumina bovina e 5-FU (BENACER et al., 2013).

As taxas de isolamento mais baixas observadas em amostras de animais frente

àquelas em que o isolamento foi realizado a partir de amostras clínicas de

35

humanos provavelmente se dá em decorrência da dificuldade de se ter um

ambiente com baixo nível de contaminação e boa antissepsia na coleta de

amostras em animais. Isto predispõe um maior risco de contaminação por outros

microrganismos nestas amostras, fator crucial para sucesso no isolamento de

leptospiras (LOUREIRO et al., 2015).

Observando outros relatos de isolamento de Leptospira já descritos em

literatura, tanto a partir de animais e humanos como também a partir de amostras

ambientais, fica evidente que não há um padrão para o protocolo de isolamento

de leptospiras (CHAKRABORTY et al., 2011; CHIANI et al., 2016; CHIDEROLI

et al., 2016; GRUNE LOFFLER et al., 2015; SALGADO et al., 2015; ZACARIAS

et al., 2008). Os pesquisadores fazem uso de técnicas já descritas obtendo

sucesso relativo no isolamento de determinadas espécies de Leptospira.

Todavia, fica evidente que o sucesso não é dependente exclusivamente do

protocolo aplicado e desta forma o estudo do crescimento de leptospiras ainda

se faz necessário.

36

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.2 Seleção e descongelamento das espécies de Leptospira spp.

Foram selecionadas para o estudo quatro espécies de leptospiras

patogênicas, mais frequentemente associadas à leptospirose (CAMERON, 2015;

DIRECTOR et al., 2014; LOUREIRO et al., 2015; MARTINS et al., 2015; OTAKA

et al., 2012), sendo estas: L. santarosai, sorogrupo (sg) Shermani, sorovar (sv)

Shermani, cepa 1342K; L. borgpetersenii, sg Sejroe, sv Hardjobovis, cepa

Sponselee; L. noguchii, sg Panama, sv Panama, cepa CZ 214K; L. interrogans,

sg Icterohameorrhagiae, sv Copenhageni, cepa M20; L. interrogans, sg Sejroe,

sv Hardjoprajitno, cepa Hardjoprajitno. Todas as espécies estudadas estavam

congeladas em meio EMJH à -196 ºC na Coleção de Culturas de Bactérias de

Interesse Veterinário (CCBVet) localizado no Laboratório de Bacteriologia

Veterinária da Universidade Federal Fluminense (UFF). Uma alíquota em

criotubo das espécies selecionadas foi descongelada à temperatura ambiente e

todo o conteúdo foi transferido para um tubo de ensaio contendo 5 mL de meio

de cultura EMJH para o crescimento inicial (NARDUCHE et al., 2016).

As espécies descongeladas foram mantidas em estufa a 28 ºC em meio

EMJH durante 10 dias e avaliadas em microscopia de campo escuro. Para

garantir a qualidade do experimento, as culturas eram avaliadas quanto: i) ao

crescimento eficiente da população bacteriana, atingindo concentrações

próximas de 108 leptospiras/mL de meio de cultura; ii) à motilidade ativa das

leptospiras, caracterizada por vigorosa rotação com a presença de uma ou

ambas as extremidades da célula dobradas (em formato de “gancho”); iii) à

presença ou ausência de auto-aglutinação das células e; iv) a ausência de

crescimento concomitante de microrganismos contaminantes. Após a análise,

quando considerado necessário, foram realizados subcultivos a 1:50 em novo

meio EMJH para manutenção das culturas vivas in vitro.

4.3 Meios de cultura utilizados

Os meios selecionados para a avaliação da curva de crescimento foram

o EMJH líquido, o Fletcher semissólido e o T80/40/LH líquido sem a adição de

antimicrobianos que estavam incluídos na formulação original. Para o preparo

dos meios EMJH e Fletcher foram seguidas as indicações fornecidas pelo

37

fabricante (Difco, Detroit, MI, EUA). Já o preparo do meio T80/40LH seguiu as

recomendações dos autores (ELLIS; MONTGOMERY; CASSELLS, 1985).

4.4 Componentes de Enriquecimento

Foram selecionados três componentes de enriquecimento, utilizados

separadamente. Estes foram: a) 10% de Soro de Coelho – SORO, b) 1% de

Albumina Bovina – BSA ou c) 0,1% de Piruvato de Sódio – PIR, em

concentrações recomendadas (NATARAJASEENIVASAN et al., 2010;

ZUERNER, 2005). O preparo das soluções estoques de BSA (40 mg/mL;

Millipore Sigma, São Paulo, BR) e PIR (100 mg/mL; Millipore Sigma, São Paulo,

BR) foi feito de acordo com as informações fornecidas pelos fabricantes, sendo

em seguida armazenados e mantidos congelados até seu uso. O soro de coelho

(Cíprion, São Paulo, BR) teve seu sistema complemento inativado a 56 ºC por

30 minutos em banho maria, sendo mantido em seu recipiente original e após

resfriamento armazenado à -20 oC até seu uso. Para a adição dos componentes

de enriquecimento, as soluções estoques de BSA e PIR e o soro de coelho foram

completamente descongeladas e homogeneizadas antes de serem adicionadas

ao meio de cultura.

4.5 Coquetéis de Antimicrobianos

Para controle de microrganismos contaminantes foram selecionados os

coquetéis de agentes antimicrobianos descritos na Tabela 1. Foi primeiramente

realizada a solubilização dos agentes antimicrobianos em seus diluentes

próprios de acordo com o indicado pelo fabricante (Sigma-Aldrich, Missouri,

EUA). Após a diluição dos agentes, foram preparadas soluções-estoque dos

coquetéis STAFF (CHAKRABORTY et al., 2011) e A5 (ELLIS; LITTLE, 1984).

Após o preparo, as soluções foram homogeneizadas e filtradas duas vezes em

filtros de membrana com poros de tamanho 0,22 µm (Kasvi, Guangzhou, CH),

sendo em seguida armazenados e mantidos congelados à -20 oC até seu uso.

Para o preparo do meio, as soluções-estoque foram completamente

descongeladas e preparados os meios nas concentrações de 10% para o

coquetel STAFF e 0,15% para o coquetel A5, de acordo com as recomendações

dos autores.

38

Para o coquetel CHID, não foi descrito o preparo de solução estoque,

apenas foi indicado a concentração final dos antimicrobianos em meio de cultura.

Desta forma, a diluição dos agentes foi realizada diretamente nos meios de

cultura. Após a adição dos produtos de forma asséptica no meio de cultura já

estéril, estes eram mantidos sob refrigeração (4 a 8o C) até o seu uso.

Tabela 1. Lista dos agentes antimicrobianos e suas concentrações de uso nos

coquetéis para o controle de microrganismos contaminantes.

Coquetel Antimicrobiano Agentes

STAFF

Sulfametoxazol 400 mg/L

Trimetoprima 200 mg/L

Anfotericina B 50 mg/L

Fosfomicina 4000 mg/L

5-Fluorouracil 1000 mg/L

CHID

5-Fluorouracil 400 mg/L

Cloranfenicol 5 mg/L

Ácido Nalidixico 50 mg/L

Neomicina 10 mg/L

Vancomicina 10 mg/L

A5 5-Fluorouracil 200 mg/L

Ácido Nalidixico 20 mg/L

39

A combinação entre os meios-base, bem como os componentes de

enriquecimento e os coquetéis antimicrobianos avaliados, permitiram a avaliação

de 32 diferentes formulações a serem estudadas (Fig 1).

Figura 1. Esquema representativo dos 32 diferentes meios de cultura

testados, incluindo meios-base (Fletcher, EMJH e T80/40LH); aditivos de

enriquecimento (Soro de Coelho [SORO], Albumina Bovina [BSA] e Piruvato de

Sódio [PIR]) e coquetéis antimicrobianos (STAFF, A5 e CHID). *SORO e PIR já

estão inclusos na composição base de T80/40LH. **SORO está incluso na

composição base de Fletcher.

4.6 Padronização do inóculo

O inóculo inicial para todas as espécies foi definido como 106

leptospiras/mL (FAINE et al., 1999). Para a contagem de leptospiras foram

realizadas diluições das culturas crescidas em solução tampão de Sorensen

(Fosfato Dissódico Na2HPO4 e Fosfato Monopotássico KH2PO4; pH 6.8). A

proporção das diluições dependia da confluência de crescimento inicial

observado nas culturas de leptospiras a fim de facilitar a contagem na câmara

de Neubauer. Para determinar a concentração de leptospiras presentes em 1 mL

de meio de cultura, os dados foram tratados na seguinte fórmula:

40

4.7 Determinação da curva de crescimento

O inóculo de 106 leptospiras/mL foi semeado em tubos contendo 5 mL de

cada um dos 32 meios de cultura avaliados, sempre em duplicata. Todos os

tubos inoculados foram incubados em estufa a 28º C por 16 dias. Os tubos eram

submetidos à avaliação por contagem manual em câmara de Neubauer a cada

48 horas, sendo a última no dia 16 após incubação.

4.8 Representação gráfica e análise estatística

Os dados obtidos com a realização das contagens foram primeiramente

trabalhados no programa GraphPad Prism 5 (GraphPad Software Inc., Califórnia,

EUA) para a construção gráfica das curvas de crescimento. Com esses dados,

foi possível realizar uma análise qualitativa das curvas de crescimento

apresentadas pelas genomoespécies nos 32 diferentes meios de cultura

avaliados.

Posteriormente, para uma avaliação quantitativa, os dados obtidos com a

realização das contagens foram trabalhados no programa RStudio (R. RStudio

Inc., Massachussets, EUA) com o pacote GrowthCurver (SPROUFFSKE;

WAGNER, 2016) para a obtenção das variáveis: a) tamanho populacional

máximo (k; em milhões), b) tempo de geração (t_gen; em horas) e c) ponto de

inflexão, momento em que inicia-se o crescimento exponencial da população

(t_mid; em horas).

As variáveis k, t_gen e t_mid foram tratadas por ANOVA com o teste de

Tukey (p<0,05) e utilizadas para comparar as curvas de crescimento das

diferentes estirpes em cada meio de cultura. Nesta análise foi observada que

apenas a estirpe L. borgpetersenii apresentava comportamento distinto das

demais e os resultados desta estirpe foram analisados individualmente. Com a

41

exclusão dos resultados para L. borgpetersenii, os dados obtidos das demais

estirpes foram agrupadas como repetições para a análise da combinação de

meios de cultura/enriquecimento/antimicrobianos mais satisfatório no

crescimento de leptospiras. Para tais análises foi utilizado o programa IBM SPSS

Statistics 20 (IBM Inc., Nova York, EUA).

42

5 RESULTADOS

5.1 Meios-base sem aditivos

5.1.1 Meio-base EMJH

Com os dados obtidos a partir da contagem das leptospiras em meio de

cultura base EMJH, foi possível construir a curva de crescimento para as cinco

estirpes estudadas (Fig.2). A espécie L. interrogans sg Icterohaemorrhagiae

exibiu uma breve fase lag de dois dias, seguida de uma fase log com duração de

seis dias, passando a fase estacionária a qual teve quatro dias de duração,

culminando na fase de declínio a partir do 12º dia de incubação. As espécies L.

interrogans sg Sejroe e L. noguchii exibiram um padrão de crescimento similar,

com fase lag de dois dias, seguida de fase log de longa duração (10 dias),

entretanto não foi possível identificar uma fase estacionária. Nestes casos, a fase

de declínio iniciou logo após o pico, ao 12º dia de incubação. Já a espécie de L.

santarosai também apresentou fase lag breve de dois dias, entretanto as fases

seguintes diferiram das espécies anteriores, sendo a fase log breve, com quatro

dias de duração e a estacionária mais prolongada, durante seis dias, culminando

no declínio da curva. Com os 16 dias de experimento não foi possível desenhar

uma curva de crescimento completa para L. borgpetersenii neste meio, tendo

sido identificada somente uma fase lag extensa, a qual durou até o 12º dia,

quando se deu o início do crescimento exponencial da população.

43

Figura 2. Representação gráfica da curva de crescimento das espécies L.

interrogans sg Icterohaemorrhagiae, L. interrogans sg Sejroe, L. santarosai, L.

borgpetersenii e L. noguchii em meio-base EMJH.

Com relação às variáveis geradas pelo pacote GrowthCurver (Tabela 2),

identificou-se que o t_gen diferiu significativamente entre as espécies (p<0,05),

sendo que L. santarosai apresentou o menor valor para esse parâmetro

(t_gen=10h) e L. borgpetersenii o maior valor (t_gen=61h). O t_mid das espécies

L. santarosai e L. interrogans sg Icterohaemorrhagiae mostraram-se similares

(t_mid=115h e 116h), já os valores de L. noguchii (t_mid=126h) e L. interrogans

sg Sejroe (t_mid=135h) diferiram em relação às demais espécies. O k de todas

as espécies, com exceção de L. borgpetersenii, foi similar entre si (p>0,05),

sendo que L. noguchii apresentou o maior valor para esta variável (k=358

milhões) e L. santarosai o menor valor (k=203 milhões). Devido a grande

diferença apresentada para o padrão de crescimento da espécie L.

borgpetesenii, as análises para tais valores foram realizadas separadamente e

apresentada em um tópico a parte.

44

Tabela 2. Valores de tempo de geração (t_gen), ponto de inflexão (t_mid) e valor

de crescimento populacional máximo (k) para as espécies L. interrogans sgs

Icterohaemorrhagiae e Sejroe, L. noguchii, L. santarosai e L. borgpetersenii em

meio-base EMJH.

Espécie Sorogrupo t_gen

(horas) t_mid

(horas) K (em

milhão)

L. santarosai Shermani 10a 115a 203a

L. interrogans Icterohaemorrhagiae 21b 116a 341a

L. noguchii Panama 24c 126b 358a

L. interrogans Sejroe 25d 135c 322a

L. borgpetersenii Sejroe 61 1868 -

Obs.: Valores que compartilham verticalmente uma mesma letra não diferem entre si; Leptospira

borgpetersenii não foi incluída na avaliação estatística

5.1.2 Meio-base T80/40LH

Para o meio-base T80/40/LH, as curvas de crescimento das estirpes

estudadas estão demonstradas na Figura 3. Para a espécie de L. interrogans sg

Icterohaemorrhagiae, a fase lag teve duração de quatro dias, seguindo para a

fase log com duração de seis dias, entrando gradualmente na fase estacionária

(10º ao 14º dia), culminando no declínio. Para L. interrogans sg Sejroe, a fase

lag teve a mesma duração da anterior, com fase log do 4º ao 12º dia, passando

diretamente para a fase de declínio. A espécie de L. santarosai apresentou fase

lag breve (0 ao 2º dia), fase log com seis dias de duração, entrando na fase

estacionária, sendo esta breve (dois dias de duração) culminando em uma longa

fase de declínio do 10º até o último dia de avaliação. L. noguchii exibiu fase lag

com duração de quatro dias, fase log com seis dias de duração, passando de

forma gradual pela fase estacionária (10º ao 12º dia), entrando em declínio. Por

fim, a espécie de L. borgpetersenii apresentou fase lag com quatro dias de

duração, uma longa fase log (oito dias), não sendo possível identificar uma fase

estacionária, passando diretamente a fase de declínio, a partir do 12º dia.

45


interrogans sgs Icterohaemorrhagiae e Sejroe, L. santarosai, L. borgpetersenii

e L. noguchii em meio T80/40/LH.

Comparando os valores de t_gen para as cinco espécies em meio

T80/40LH (Tabela 3), observa-se que L. interrogans sg Icterohaemorrhagiae

(t_gen=13h) não difere das espécies L. santarosai, L. borgpetersenii e L.

noguchii (t_gen=12h, 15h e 15h, respectivamente); as espécies L. borgpetersenii

e L. noguchii também são similares entre si e, por fim, a espécie L. interrogans

sg Sejroe não se assemelha a nenhuma outra avaliada. Já os valores de t_mid

diferem entre si para todas as espécies estudadas. As análises dos valores de k

seguiram o mesmo padrão para as demais variáveis, tendo a espécie L.

interrogans sg Sejroe apresentado o maior valor (k=289 milhões) e L.

borgpetersenii o menor valor (k=122 milhões).

46



Icterohaemorrhagiae e Sejroe, L. noguchii, L. santarosai e L. borgpetersenii em

meio-base T80/40LH.

Espécie Sorogrupo t_gen

(horas) t_mid

(horas) k (em

milhão)

L. santarosai Shermani 12a 98a 212c

L. interrogans Icterohaemorrhagiae 13ab 143b 242d

L. noguchii Panama 15b 161d 122a

L. interrogans Sejroe 15b 150c 187b

L. borgpetersenii Sejroe 20c 167e 289e

Valores que compartilham verticalmente uma mesma letra não diferem entre si

5.1.3 Meio-base Fletcher

No meio Fletcher (Fig. 4) a espécie de L. borgpetersenii não apresentou

crescimento, o que impossibilitou a avaliação logo após o 2º dia de

experimento. Não foi possível identificar a fase lag das demais estirpes

avaliadas, o crescimento exponencial da população (fase log) iniciou a partir do

dia 0 durando entre o 6º e o 8º dia. Além disso, também não foi possível

identificar o período estacionário, iniciando a fase de declínio logo após atingir

o pico máximo de crescimento no 12º dia.

47


interrogans sgs Icterohaemorrhagiae e Sejroe, L. santarosai, L. borgpetersenii e

L. noguchii em meio Fletcher.

O t_gen das quatro espécies que conseguiram crescer em meio Fletcher

não diferiu significativamente (Tabela 4), tendo L. interrogans sg Sejroe

apresentado o menor valor para esta variável (t_gen=3h) e L. interrogans sg

Icterohaemorrhagiae o maior valor (t_gen=11h). O t_mid de L. noguchii e L.

interrogans sg Icterohaemorrhagiae se mostraram similares, enquanto que L.

santarosai e L. interrogans sg Sejroe também não apresentaram diferença

entre si.

48



Icterohaemorrhagiae e Sejroe, L. noguchii e L. santarosai em meio-base

Fletcher.

Espécie Sorogrupos t_gen

(horas) t_mid

(horas) k

(horas)

L. interrogans Sejroe 3a 97b 68c

L. noguchii Panama 6a 41a 59b

L. santarosai Shermani 6a 84b 45a

L. interrogans Icterohaemorrhagiae 11a 56a 72c


5.1.4 Comparação estatística entre os meios-base sem aditivos

Para avaliar o meio que possibilitou o alcance de maior k, foi realizada

uma comparação entre os meios-base EMJH, T80/40LH e Fletcher utilizando os

dados das estirpes L. interrogans sgs Icterohaemorrhagiae e Sejroe, L.

santarosai e L. noguchii como repetições (Tabela 5). Foi observada diferença

(p<0,05) entre os meios de cultura avaliados, sendo o EMJH o meio que

apresentou maior valor de k, excluindo-se os valores para a espécie L.

borgpetersenii devido à impossibilidade de se definir o valor de k. Com relação

à média para a variável t_gen, o meio Fletcher apresentou valores inferiores aos

demais meios (t_gen=6h), enquanto que o meio EMJH apresentou o maior valor

para esta variável (t_gen=20h); já em relação ao t_mid, os três meios de cultura

avaliados não diferiram entre si (Fletcher=61h; T80/40LH=107h; EMJH=97h).

Tabela 5. Relação entre os valores de tempo de geração (t_gen), ponto de

inflexão (t_mid) e pico máximo de crescimento (k) das espécies L. interrogans

sgs Icterohaemorrhagiae e Sejroe, L. noguchii e L. santarosai, nos meios-base

EMJH, Fletcher e T80/40LH.

Meio de Cultura / Variáveis t_gen (horas) t_mid (horas) k (em milhões)

Fletcher 6a 61a 61a

T80/40LH 15b 107a 232b

EMJH 20b 97a 306c


49

5.2 Compostos de Enriquecimento

5.2.1 Meio EMJH com a adição de compostos de enriquecimento

A adição de BSA no EMJH inibiu o crescimento de todas as espécies de

Leptospira. As curvas de crescimento nos meios com adição de SORO e PIR

das estirpes L. interrogans sg Icterohaemorrhagiae e L. santarosai mostraram

um padrão semelhante em ambas estirpes, diferindo somente na fase

estacionária, a qual estava presente no meio EMJH+PIR e ausente no meio

EMJH+SORO (Figura 5). A curva de crescimento da espécie L. noguchii frente

ao meio EMJH+SORO foi semelhante à curva apresentada no meio EMJH+PIR

(Figura 6). Da mesma forma, as curvas para a espécie L. interrogans sg Sejroe

nos meios EMJH+SORO e EMJH+PIR não diferiram. Comparando-se o meio-

base EMJH e a adição dos componentes de enriquecimento SORO e PIR não

houve diferença nos valores de k, t_gen e t_mid (p<0,05) para as quatro estirpes

avaliadas. Quando inoculada nos meios EMJH+PIR e EMJH+SORO, L.

borgpetersenii apresentou curva incompleta aos 16 dias, semelhante ao ocorrido

no EMJH base.

50

Figura 5. Representação gráfica da curva de crescimento das espécies L. interrogans sg Icterohaemorrhagiae e L. santarosai em

meio EMJH com a adição dos componentes de enriquecimento Soro de Coelho (10%) e Piruvato de Sódio (0,1%).

51

Figura 6. Representação gráfica da curva de crescimento das espécies L. interrogans sg Sejroe e L. noguchii em meio EMJH com a

adição dos componentes de enriquecimento Soro de Coelho (10%) e Piruvato de Sódio (0,1%).

52

5.2.2 Comportamento da espécie Leptospira borgpetersenii

Assim como no meio-base EMJH, com os 16 dias de contagem não foi possível

desenhar uma curva de crescimento completa para L. borgpetersenii, nos meios

EMJH+PIR e EMJH+SORO, foi observado somente uma longa fase lag (Fig.7),

quando se deu o início do crescimento exponencial da população. O meio T80/40LH

foi o único meio de cultura que permitiu um desenvolvimento completo de L.

borgpetersenii, como pode ser visto anteriormente. Neste meio de cultura, o pico

máximo alcançado pela população foi k=122 milhões.

Figura 7. Representação gráfica da curva de crescimento de L. borgpetersenii nos

meios EMJH e T80/40LH e nos meio-base EMJH com a adição dos compostos de

enriquecimento Soro de Coelho (10%) e Piruvato de Sódio (0,1%).

A variável t_mid não apresentou diferença (p>0,05) para os meios T80/40LH

(161h) e EMJH+PIR (280h). Da mesma forma, não houve diferença para os valores

de t_mid na comparação entre os meios EMJH+PIR e EMJH+SORO (371h) (Tabela

53

6). Os valores de t_gen para L. borgpetersenii nos meios T80/40LH (15h) e EMJH+PIR

(27h) são similares entre si, porém diferem dos valores observados para os meios

EMJH+SORO (65h) e EMJH (61h) que também não apresentam diferenças

significativas entre si.

Tabela 6. Relação entre os valores de tempo de geração (t_gen), ponto de inflexão

(t_mid) e pico máximo de crescimento (k) da espécie L. borgpetersenii, nos meios-

base EMJH e T80/40LH e nos meios EMJH+SORO e EMJH+PIR.


5.2.3 Meio Fletcher com a adição de compostos de enriquecimento

As curvas para L. interrogans sg Icterohaemorrhagiae nos meios Fletcher+BSA

e Fletcher+PIR foram similares à do meio-base Fletcher, com uma fase lag pouco

definida, não apresentando fase estacionária (Fig. 8). O mesmo comportamento foi

observado para a espécie L. santarosai. A espécie L. interrogans sg Sejroe não foi

capaz de se desenvolver quando houve a adição de BSA ao meio, enquanto L.

noguchii apresentou fase lag com duração de quatro dias, entrando em crescimento

exponencial até atingir o pico de crescimento no 6º dia, não sendo possível identificar

a fase estacionária, com declínio logo em seguida (Fig 9). Quando adicionado PIR ao

meio-base Fletcher, as espécies L. interrogans sg Sejroe e L. noguchii apresentaram

curva de crescimento com fase lag pouco definida, atingindo seu pico de crescimento

no 10º dia e entrando em declínio em seguida. A espécie de L. borgpetersenii não

apresentou crescimento no meio Fletcher mesmo quando suplementado com BSA ou

PIR. Os valores de k, t_gen e t_mid para os meios Fletcher+BSA Fletcher+PIR não

diferiram em relação ao meio-base Fletcher (p<0,05) tanto na análise geral dos meios

(usando espécies com repetição) quanto na comparação entre as espécies.

Meio de Cultura / Variáveis

t_mid (horas)

t_gen (horas)

k (em milhão)

T80/40LH 161a 15a 122

EMJH+PIR 280ab 27a -

EMJH+SORO 371b 65b -

EMJH - 61b -

54

Figura 8. Representação gráfica da curva de crescimento das espécies L. interrogans sg Icterohamenorrhagiae e L. santarosai em

meio Fletcher com a adição dos componentes de enriquecimento Albumina Bovina (1%) e Piruvato de Sódio (0,1%).

55

Figura 9. Representação gráfica da curva de crescimento das espécies L. interrogans sg Sejroe e L. noguchii em meio Fletcher com

a adição dos componentes de enriquecimento Albumina Bovina (1%) e Piruvato de Sódio (0,1%).

56

5.3 Adição de Coquetéis Antimicrobianos

Os coquetéis STAFF e A5 não inibiram o crescimento das espécies L.

interrogans sgs Icterohaemorrhagiae e Sejroe, L. noguchii e L. santarosai. A espécie

L. borgpetersenii não foi capaz de se desenvolver em meio EMJH+STAFF, crescendo

somente quando da adição do coquetel A5 em meio-base EMJH. Em todos os outros

meios avaliados o coquetel STAFF não produziu este mesmo efeito. Já o coquetel

CHID inibiu o crescimento de todas as espécies avaliadas quando adicionado a

qualquer um dos meios-base e dos meios com a adição de componentes de

enriquecimento.

Na análise geral dos meios, a adição dos coquetéis antimicrobianos STAFF e

A5, não alterou os valores de k, t_gen e t_mid em relação aos meios-base e suas

combinações com componentes de enriquecimento (p>0,05). Quando comparados

entre si, os coquetéis STAFF e A5 mostram-se similares (p>0,05) para o meio EMJH-

base, assim como quando houve a adição de componentes de enriquecimento; e para

o meio T80/40LH-base. Entretanto, quando os resultados em meio Fletcher-base, L.

interrogans sgs Icterohaemorrhagiae e Sejroe, L. noguchii e L. santarosai

apresentaram t_gen para o meio Fletcher+A5 menor que o t_gen para o meio

Fletcher+STAFF. O oposto foi observado na análise da combinação Fletcher+PIR, em

que, quando adicionado o coquetel A5, o t_gen se mostrou maior para este do que o

apresentado no meio Fletcher+PIR+STAFF para as mesmas espécies anteriores.

57

6 DISCUSSÃO

Durante muito tempo, os estudos em Leptospira utilizaram a construção da

curva de crescimento como ferramenta para o entendimento dos requerimentos

nutricionais e características bioquímicas de algumas espécies, fazendo observações

pontuais a respeito do padrão de crescimento desses microrganismos (CHANG, 1947;

ELLINGHAUSEN; MCCULLOUGH, 1965a, 1965b; ELLINGHAUSEN, 1960;

JOHNSON; GARY, 1962, 1963; VANESELTINE; STAPLES, 1961). Entretanto, até o

presente momento, não foi realizada uma avaliação da curva de crescimento

comparando diferentes espécies de Leptospira, pré-definindo assim que todas as

espécies do gênero se comportariam de forma idêntica. Pouco se sabe a respeito da

forma mais eficiente de se obter o isolamento dessas bactérias, principalmente

aquelas mais exigentes e de crescimento mais fastidioso, como L. borgpetersenii. A

construção da curva de crescimento permite o entendimento da dinâmica do

desenvolvimento bacteriano (SPROUFFSKE; WAGNER, 2016) e, assim sendo, sua

interpretação contribui substancialmente para um melhor entendimento do cultivo

desses microrganismos.

A respeito das curvas de crescimento apresentadas pelas espécies de

Leptospira, a estruturação não diferiu, de forma geral, daquela apresentada por outras

espécies bacterianas (MICHA; CORRADINI, 2011). Entretanto, a avaliação qualitativa

das curvas de crescimento apresentadas em meio EMJH mostrou diferenças no

comportamento das espécies estudadas, assim como observado em outros estudos

descritivos (SHENBERG, 1967). No presente estudo, não nos remetemos apenas a

análise qualitativa para a avaliação do meio de cultura mais eficiente no crescimento

de espécies de leptospiras, mas utilizamos também os parâmetros k, t_gen e t_mid

como referências, já que estes predizem, respectivamente, a população máxima a ser

alcançada em tal meio de cultura, o tempo de geração desses microrganismos e o

momento em que se inicia o crescimento exponencial da população (SPROUFFSKE;

WAGNER, 2016).

É sabido que a fase lag das bactérias nos meios de cultura corresponde a um

período de adaptação ao meio em que estão inseridos (TJØRVE; TJØRVE, 2017).

Quando inoculadas no meio de cultura de mesma formulação ao qual a bactéria vinha

sendo mantida, a tendência é que se encurte esse período adaptativo. O meio EMJH

é o mais frequentemente aplicado na manutenção de leptospiras em cultura (LATIFAH

58

et al., 2017; LOUREIRO et al., 2015; MOHD ALI et al., 2017; SCIALFA et al., 2017);

desta forma é de se esperar que espécies provenientes de uma coleção de culturas

estejam mais adaptadas a este meio, apresentando fase lag breve para todas as

espécies avaliadas. Porém, na análise geral dos meios, os valores de t_mid para

EMJH, T80/40/LH e Fletcher não diferiram indicando que a adaptação das espécies

de leptospira utilizadas em meios diferentes é tão eficiente quanto em seu meio

original de manutenção (EMJH).

Um meio de cultura eficiente no crescimento de leptospiras é aquele que

alcança alta densidade populacional no menor prazo possível para detecção precoce

do microrganismo por microscopia de campo escuro. Foi relatado que as densidades

populacionais que leptospiras já adaptadas ao meio podem alcançar in vitro variam

entre 107-108 leptospiras/mL com tempo de geração estimado em 6-8h (CAMERON,

2015). No presente estudo, as espécies apresentaram picos máximos de crescimento

(k) com valores de 108 leptospiras/mL em concordância com o descrito em literatura.

Porém em relação aos tempos de geração (t_gen), somente em meio Fletcher as

espécies adaptadas ao ambiente in vitro apresentaram t_gen semelhante ao

anteriormente descrito. Quando inoculadas nos meios líquidos T80/40LH e EMJH as

leptospiras apresentaram t_gen bastante superiores ao descrito para leptospiras

previamente adaptadas às condições in vitro. Comparando tais parâmetros entre os

meios de cultura (EMJH-base, T80/40LH-base e Fletcher-base), o meio Fletcher

apresentou o menor valor de t_gen; porém a sugestão deste como meio mais eficiente

para o isolamento e manutenção de leptospiras não se justifica pelo fato da população

máxima de leptospiras para este ser bastante inferior a observada nos demais.

Apesar de serem microrganismos capazes de se desenvolverem em

ambientes de microaerofilia (ZHANG et al., 2011), a pouca aeração do meio Fletcher

causada pela presença do ágar pode influenciar negativamente na obtenção de

oxigênio por essas bactérias, em comparação com meios líquidos. Durante muito

tempo o meio Fletcher foi indicado como meio de manutenção a longo prazo de

leptospiras (FAINE et al., 1999; TURNER, 1970). Entretanto, os resultados

apresentados nesse estudo contraindicam o uso deste meio de cultura para este fim,

visto que o ambiente de cultivo fornecido pelo Fletcher não permite que leptospiras

adaptadas perdurem por mais de oito dias. Adicionalmente, um meio semissólido

dificulta a manipulação da cultura em laboratório já que com este não é possível

59

proceder filtragem por membranas de 0,22um para descontaminação e/ ou

congelamento de espécies para preservação de virulência (NARDUCHE et al. 2016).

Assim sendo, em uma análise geral, o meio líquido EMJH-base se mostrou o

mais eficiente para manutenção e isolamento de leptospiras visto que o k para este

meio se mostrou mais alto. Tal achado reforça e justifica o uso do EMJH base na

manutenção e isolamento primário de leptospiras quando não se objetiva o isolamento

de L. borgpetersenii.

Na busca pelo aprimoramento da técnica de cultivo de Leptospira, muito foi

estudado a respeito do uso de soro de animais como um aditivo que levasse a melhora

nas taxas de crescimento, de tal forma que muitos autores passaram a adicionar esse

produto como enriquecimento para os meios de cultura (DELANEY et al., 2014; DOS

SANTOS PAIXÃO et al., 2014; ELLINGHAUSEN, 1960; JOHNSON; GARY, 1962;

KUTSUNA et al., 2015; SCHNEIDERMAN et al., 1951). Quando feita a avaliação

estatística entre o meio-base EMJH com e sem a adição de soro de coelho, esses

valores não se mostraram significativamente diferentes. Apesar da formulação exata

do meio EMJH comercial não ser conhecida, em algumas publicações é

disponibilizada a composição para fabricação in house deste meio, a qual inclui Soro

de Coelho e Albumina Bovina (CAMERON, 2015; JOHNSON; HARRIS, 1967). Já foi

demonstrado anteriormente que a adição de 8-12% de soro de coelho no meio de

cultura configura melhora no crescimento de leptospiras; entretanto, quando a

concentração supera 12%, há diminuição deste potencial (ELLINGHAUSEN, 1960).

Especula-se que os fatores de crescimento indicados na bula do EMJH comercial

contenham em sua formulação algum percentual de soro de coelho e, no presente

estudo a inclusão adicional deste composto tenha elevado além do recomendado as

concentrações desse produto, diminuindo sua performance como promotor de

crescimento.

A albumina bovina atua como um agente absortivo, desintoxicante, além de

transportar aminoácidos e lipídeos (FAINE et al., 1999; JOHNSON; WILSON, 1960).

Como mencionado anteriormente, sugere-se que há BSA na composição original do

meio comercial EMJH e, assim como ocorreu quando adicionado soro de coelho a

este meio, a adição de BSA como componente de enriquecimento no presente estudo

elevou suas concentrações. Entretanto, diferente do que aconteceu com o

EMJH+SORO, a supersaturação de BSA em EMJH não foi permissiva ao crescimento

60

de nenhuma das espécies avaliadas. Já quando adicionado ao meio Fletcher,

somente as espécies L. interrogans sg Icterohaemorrhagiae, L. santarosai e L.

noguchii apresentaram crescimento. Em um estudo da curva de crescimento do

sorogrupo Icterohaemorrhagiae identificou-se que o soro era essencial para o

crescimento da espécie e que este não poderia ser substituído por albumina em sua

totalidade (CHANG, 1947). Quando feita a separação do soro em três porções

(albumina, globulina e ultrafiltrado) a porção única de albumina permitia o crescimento

de leptospiras do sorogrupo Pomona, porém as três porções eram necessárias para

um crescimento ótimo (JOHNSON; WILSON, 1960).

O último componente de enriquecimento avaliado foi o piruvato de sódio, o qual

foi utilizado por alguns autores para o cultivo de leptospiras (MYERS; JELAMBI, 1975;

NATARAJASEENIVASAN et al., 2010; SKILBECK; FORSYTH; DOHNT, 1988). O

piruvato de sódio se mostrou eficiente na estimulação do crescimento de espécies

fastidiosas (JOHNSON et al., 1973). Entretanto, as análises do presente estudo não

justificam a adição de piruvato de sódio em meio EMJH, visto que a adição deste não

melhorou os parâmetros do meio de cultura.

A espécie L. borgpetersenii não apresentou curva completa ao final dos 16

dias de experimento quando inoculadas tanto em EMJH-base quanto nas suas

combinações. Isto ocorreu devido ao fato de que esta espécie apresentou um t_gen e

t_mid muito longos nestes meios. Assim sendo, o uso de EMJH para o isolamento

primário destas espécies não seria indicado. A fase lag mais prolongada permite o

estabelecimento de outros microrganismos contaminantes com consumo de

nutrientes e produção de metabólitos no meio muito antes do estabelecimento da

população de leptospiras, dificultando, assim, a obtenção de uma cultura pura de

leptospiras (LOUREIRO et al., 2015).

Recentemente foi sugerido um novo protocolo para o isolamento de L.

borgpetersenii sorovar Hardjo a partir de amostras clínicas de bovinos. Neste, utilizou-

se EMJH adicionado de piruvato de sódio e soro fetal bovino para o isolamento

primário da espécie. De acordo com os autores, a adição de superóxido dismutase

em EMJH se fez necessária para a manutenção in vitro de L. borgpetersenii

(CHIDEROLI et al., 2017). Em 1985, um estudo objetivando o isolamento de espécies

do tipo Hardjo a partir de amostras clínicas de bovinos obteve maior sucesso no

isolamento em meio T80/40LH do que em EMJH. O meio T80/40LH possui em sua

61

formulação soro de coelho, piruvato de sódio, albumina bovina e superóxido

dismutase (ELLIS; MONTGOMERY; CASSELLS, 1985). Ainda que Chideroli e

colaboradores tenham obtido o isolamento de L. borgpetersenii e L. interrogans,

espécies até o momento inéditas no país (CHIDEROLI et al., 2017), o custo da adição

de piruvato de sódio, soro fetal bovino e superóxido dismutase no meio EMJH é maior

do que a fabricação in house de T80/40LH. Desta forma, considerando os valores de

k, t_mid e t_gen desse microrganismo, o meio T80/40/LH se mostrou o mais eficiente

no cultivo de L. borgpetersenii.

Além do desenvolvimento mais lento de L. borgpetersenii em EMJH, esta

espécie também não foi capaz de crescer em meio Fletcher. O sequenciamento de

genoma completo de L. borgpetersenii indicou uma redução de genoma frente às

demais espécies de leptospiras. Assim sendo, essa espécie possui menos

mecanismos de adaptação à diferentes ambientes, o que dificulta seu isolamento

(BULACH et al., 2006). Dentre as estirpes pertencentes à espécie L. borgpetersenii, a

Hardjobovis do sorogrupo Sejroe é a de maior relevância por estar mais

frequentemente associada às perdas reprodutivas por leptospirose em bovinos (LAU

et al., 2015). No Brasil, estudos sorológicos demonstraram alta prevalência para o

sorogrupo Sejroe (COSATE et al., 2012; PINTO; LIBONATI; LILENBAUM, 2017).

Entretanto são raros os relatos de isolamento de L. borgpetersenii no país

(CHIDEROLI et al., 2016) em comparação com outras espécies como L. santarosai e

L. noguchii (LOUREIRO et al., 2015; MARTINS et al., 2015). Devido a sua dificuldade

de isolamento e a predominância do uso do EMJH como meio preferencial para o

isolamento de leptospiras nos estudos reportados (CHIDEROLI et al., 2016; HAMOND

et al., 2015; LOUREIRO et al., 2015; MARTINS et al., 2015), questiona-se se estirpes

L. borgpetersenii são de fato relevantes no Brasil como no restante do mundo, ou se

a falta de isolamentos destas espécies representaria um viés dada por suas

exigências particulares de cultivo.

Um relato recente com o uso de sequenciamento direto de amostras clínicas

de 77 bovinos no Brasil apontou que 41,7% das amostras tinham DNA correspondente

a L. borgpetersenii frente à 25,0% identificadas como L. santarosai, 25,0% como L.

interrogans e apenas 8,3% como L. noguchii (HAMOND et al., 2016). O indício de

prevalência considerável para L. borgpetersenii nos bovinos do Brasil, associado aos

resultados do presente estudo que indicam que as metodologias mais frequentemente

62

aplicadas são pouco eficientes para o isolamento de L. borgpetersenii, sugerem que

esta dificuldade de obtenção de espécies realmente vem impactando na compreensão

da epidemiologia da leptospirose bovina no Brasil.

Por fim, no que se refere ao controle do crescimento de microrganismos

contaminantes, os coquetéis STAFF e A5 se mostraram eficazes no controle de

contaminantes assim como em outros estudos (ELLIS; MONTGOMERY; CASSELLS,

1985; HAAKE et al., 1991; LOUREIRO et al., 2015; MIRAGLIA et al., 2009).

Adicionalmente, quando comparado os valores de k, t_gen e t_mid dos meios com e

sem a adição destes coquetéis antimicrobianos, não diferiram, demonstrando que seu

uso não interfere no crescimento das espécies de Leptospira, com exceção de

espécies de L. borgpetersenii.

A eficiência do STAFF na obtenção de culturas puras de leptospiras já foi

demonstrada anteriormente em amostras de solo (CHAKRABORTY et al., 2010) e

amostras clínicas de bovinos (LOUREIRO et al., 2015). Porém neste último estudo

feito a campo foi observada a predominância de isolamento de espécies L. noguchii e

L. santarosai levando a acreditar em certa seletividade do coquetel STAFF para tais

espécies. Tal observação se confirmou parcialmente no presente estudo uma vez que

a espécie L. borgpetersenii teve seu crescimento inibido frente a este coquetel de

antibióticos. Já as espécies de L. interrogans sgs Icterohaemorrhagiae e Sejroe não

foram inibidas, o que sugere que este não foi o principal fator para a não obtenção

destas espécies em estudos anteriores.

A composição dos coquetéis antimicrobianos e a escolha do protocolo para o

isolamento de leptospiras influenciam diretamente no sucesso da técnica. Alguns

coquetéis como STAFF e A5 não afetam o desenvolvimento desses microrganismos

a longo prazo, como pode ser visto no presente estudo, podendo ser utilizados em

meios de cultura de manutenção. Muitos autores utilizam coquetéis antimicrobianos

nas primeiras 24 ou 48h após a inoculação inicial, realizando um novo repique após o

tempo decorrido em meios de cultura que não contém esses coquetéis (BHATIA;

UMAPATHY; NAVANEETH, 2015; CHIDEROLI et al., 2017; HIGINO S.S.S. et al.,

2010; SAITO et al., 2015; ZACARIAS et al., 2008). Tal técnica é baseada no fato de

que o tempo de geração mais longo da Leptospira faria com que não houvesse

assimilação das drogas nas primeiras 48 horas após inoculação (SCHONBERG,

1981). O contrário ocorreria nos microrganismos contaminantes que sucumbiriam logo

63

nas primeiras horas após a semeadura. No presente estudo o coquetel CHID inibiu o

crescimento de todas as espécies avaliadas tanto quando adicionados aos meios-

base como àqueles que possuíam componentes de enriquecimento. Recentemente,

foi descrito sucesso utilizando um protocolo especifico em que o material clínico era

inoculado no meio contendo o coquetel CHID apenas nas primeiras 24h pós-

inoculação, quando então era realizado um repique em novo meio de cultura sem a

presença de antibióticos (CHIDEROLI et al., 2017). Esta estratégia reforça os achados

do presente estudo, em que este coquetel é contraindicado para o uso contínuo em

manutenção ou isolamento de culturas.

64

7 CONCLUSÕES

1. O meio de cultura EMJH se mostrou mais eficiente no crescimento geral para as

espécies L. interrogans, L. noguchii e L. santarosai. Alcançando populações de

até 108 leptospiras/mL, a qual ocorreu, em média, no 12º dia de cultivo para

espécies já adaptadas ao ambiente in vitro.

2. A adição de 1% de Albumina Bovina no meio EMJH comercial não permitiu o

crescimento de nenhuma das espécies avaliadas, entretanto o mesmo não foi

observado no meio Fletcher, sugerindo que esta, quando não acompanhada de

um fluido orgânico, leva à inibição do crescimento das leptospiras.

3. A adição de 10% de Soro de Coelho ou de 0,1% de Piruvato de Sódio não

produziu alterações significativas no crescimento de L. interrogans, L. noguchii,

ou L. santarosai. Sugere-se que o uso desses produtos como compostos de

enriquecimento não melhore o desempenho dessas espécies em meio EMJH e

Fletcher.

4. Não foi possível caracterizar a curva de crescimento de L. borgpetersenii no meio-

base EMJH com 16 dias de avaliação. Além disso, L. borgpetersenii não foi capaz

de se desenvolver nos meios de cultura semissólidos. Para o cultivo de L.

borgpetersenii o meio-base T80/40/LH se mostrou mais eficiente já que a espécie

apresentou melhores taxas de crescimento e menor tempo de geração.

5. Quanto a adição de antimicrobianos aos meios de cultura, os coquetéis A5 e

STAFF se mostraram similares e garantiram um crescimento igual ao dos meios-

base para as espécies L. interrogans sgs Icterohaemorrhagiae e Sejroe, L.

santarosai e L. noguchii sem a observação do crescimento de outros

microrganismos contaminantes. Já o coquetel CHID não permitiu o crescimento

de nenhuma das espécies avaliadas quando adicionado a qualquer um dos meios-

base avaliados e também aqueles com a adição de compostos de enriquecimento.

6. O meio T80/40LH-base se mostrou o mais eficiente para o cultivo das espécies L.

interrogans, L. noguchii e L. santarosai e L. borgpetersenii; o coquetel

antimicrobiano STAFF mostrou ser o método de controle de contaminantes menos

influente no crescimento das três primeiras, enquanto que, para L. borgpetersenii,

recomenda-se o uso do coquetel antimicrobiano A5 como método de controle de

contaminantes que menos compromete o crescimento desta espécie.

65

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