8/2/2019 Benzene Metabolism

1/7

An O v e r v i e w o f B e n z e n e M e t a b o l i s mR o b e r t S n y d e r a n d C h r i s t i n e C . H e d l iE n v i r o n m e n t a l a n d O c c u p a t i o n a l H e a l t h S c i e n c e s I n s t i t u t e , R u t g e r s , T h eS ta te U n i ve r si t y o f New J e r s e y a n d t h e U n i v e r s i t y o f M e d i c i n e a n dD e n t i s t r y o f New J e r s e y - R o b e r t Wood J o h n s o n M e d i c a l S c h o o l ,P i s c a t a w a y , New J e r s e yB e n z e n e t o x i c i t y i n v o l v e s b o t h b o n e marrow d e p r e s s i o n a n d l e u k e m o g e n e s i s c a u s e d b y d a m a g et o m u l t i p l e c l a s s e s o f h e m a t o p o i e t i c c e l l s a n d a v a r i e t y o f h e m a t o p o i e t i c c e l l f u n c t i o n s . S t u d y o ft h e r e l a t i o n s h i p between t h e m e t a b o l i s m a n d t o x i c i t y o f b e n z e n e i n d i c a t e s t h a t s e v e r a lm e t a b o l i t e s o f b e n z e n e p l a y s i g n i f i c a n t r o l e s i n g e n e r a t i n g b e n z e n e t o x i c i t y . B e n z e n e i sm e t a b o l i z e d , p r i m a r i l y i n t h e l i v e r , t o a v a r i e t y o f h y d r o x y l a t e d a n d r i n g - o p e n e d p r o d u c t s t h a t aret r a n s p o r t e d t o t h e b o n e marrow w h e r e s u b s e q u e n t s e c o n d a r y m e t a b o l i s m o c c u r s . Two p o t e n t i a lm e c h a n i s m s b y w h i c h b e n z e n e m e t a b o l i t e s may d a m a g e c e l l u l a r m a c r o m o l e c u l e s t o i n d u c et o x i c i t y i n c l u d e t h e c o v a l e n t b i n d i n g o f r e a c t i v e m e t a b o l i t e s o f b e n z e n e a n d t h e c a p a c i t y o fb e n z e n e m e t a b o l i t e s t o i n d u c e o x i d a t i v e d a m a g e . A l t h o u g h t h e r e l a t i v e c o n t r i b u t i o n s o f e a c h o ft h e s e m e c h a n i s m s t o t o x i c i t y r e m a i n s u n e s t a b l i s h e d , i t i s c l e a r t h a t d i f f e r e n t m e c h a n i s m sc o n t r i b u t e t o t h e t o x i c i t i e s a s s oc i a t ed w i t h d i f f e r e n t m e t a b o l i t e s . A s a c o r o l l a r y , i t i s u n l i k e l y t h a tb e n z e n e t o x i c i t y ca n b e d e s c r i b e d as t h e r e s u l t o f t h e i n t e r a c t i o n o f a s i n g l e m e ta b ol it e w it h as i n g l e b i o l o g i c a l t a r g e t . C o n t i n u e d i n v e s t i g a t i o n o f t h e m e t a b o l i s m o f b e n z e n e a n d i t s m e t a b o l i t e sw i l l a l l o w us t o d e t e r m i n e t h e s p e c i f i c c o m b i n a t i o n o f m e t a b o l i t e s as w e l l as t h e b i o l o g i c a lt a r g e t ( s ) i n v o l v e d i n t o x i c i t y a n d w i l l u l t i m a t e l y l e a d t o our u n d e r s t a n d i n g o f t h e r e l a t i o n s h i pb e t w e e n t h e p r o d u c t i o n o f b e n z e n e m e t a b o l i t e s a n d b o n e marrow t o x i c i t y . E n vi ro n H e a lt hP e r s p e c t 1 0 4 ( S u p p l 6 ) : 1 1 6 5 - 1 1 7 1 ( 1 9 9 6 )K e y w o r d s : b e n z e n e , m e t a b o l i s m , t o x i c i t y , h y d r o q u i n o n e , 1 , 2 , 4 - b e n z e n e t r i o l , b e n z o q u i n o n e ,c o v a l e n t b i n d i n g , o x i d a t i v e s t r e s s , b o n e marrow, l i v e r

I n t r o d u c t i o nT h e i d e n t i f i c a t i o n o f b e n z e n e m e t a b o l i t e sa n d t h e i r q u a n t i f i c a t i o n b e g a n i n t h e 1 9 t hc e n t u r y . H o w e v e r , i t w a s n o t u n t i l c a r b o n -1 4 w a s a v a i l a b l e f o r t h e s y n t h e s i s o f[ 1 4 C ] b e n z e n e t h a t i t w a s p o s s i b l e t o p e r f o r ma c c u r a t e m e a s u r e m e n t s a n d t o b e s u r e t h a ta l l t h e s t a b l e m e t a b o l i t e s c o u l d b e d e t e c t e d .T h u s , i n 1 9 5 3 P a r k e a n d W i l l i a m s ( 1 )r e p o r t e d t h a t u p o n a d m i n i s t e r i n g [ 1 4 C ] b e n -z e n e t o r a b b i t s t h e y c o u l d r e c o v e r 3 2 . 6 % o ft h e d o s e i n u r i n e a s p h e n o l , c a t e c h o l ,h y d r o q u i n o n e , 1 , 2 , 4 - b e n z e n e t r i o l , t r a n s -t r a n s - m u c o n i c a c i d , a n d L - p h e n y l m e r c a p -t u r i c a c i d , 4 4 . 5 % i n t h e e x p i r e d a i r a sT h i s p a p e r was p r e s e n t e d a t B e n z e n e ' 9 5 :An I n t e r n a t i o n a l C o n f e r e n c e o n t h e T o x i c i t y ,C a r c i n o g e n e s i s , a n d E p i d e m i o l o g y o f B e n z e n e h e l d1 7 - 2 0 J u n e 1 9 9 5 i n P i s c a t a w a y , New J e r s e y .M a n u s c r i p t r ec e iv ed 1 6 J a n u a r y 1 9 9 6 ; m a n u s c r i p ta c c e p t e d 1 4 J u n e 1 9 9 6 .A d d r e s s c o r r e s p o n d e n c e t o D r . R . S n y d e r , E O H S I -T o x i c o l o g y D i v i s i o n , 6 8 1 F r e l i n g h u y s e n R o a d ,P i s c a t a w a y , N J 0 8 8 5 5 - 1 1 7 9 . T e l e p h o n e : ( 9 0 8 ) 4 4 5 -3 7 2 0 . F a x : ( 9 0 8 ) 4 4 5 - 0 1 1 9 . E - m a i l : r s n y d e r @e o h s i . r u t g e r s . e d uA b b r e v i a t i o n s u s e d : B T , 1 , 2 , 4 - b e n z e n e t r i o l ; G B S ,g l u t a t h i o n y l 1 , 2 , 4 - b e n z e n e t r i o l s e m i q u i n o n e ; G S H ,g l u t a t h i o n e ; H G B , 5 - O H - g l u t a t h i o n y l - p - b e n z o q u i n o n e ;H O , h y d r o q u i n o n e .

u n c h a n g e d b e n z e n e a n d s m a l l a m o u n t s o fc a r b o n d i o x i d e , a n d 5 t o 1 0 % i n t h e f e c e sa n d t i s s u e s . T h e i r t o t a l r e c o v e r y w a sa p p r o x i m a t e l y 8 4 t o 8 9 % . T h e y w e n t o n t os u g g e s t t h a t b e n z e n e t o x i c i t y , i . e . , b e n z e n e -i n d u c e d b o n e m a r r o w d e p r e s s i o n , m i g h t b ec a u s e d b y s o m e o f t h e s e m e t a b o l i t e s .R e v i e w o f B e n z e n e T o x i c i t yA d i s c u s s i o n o f t h e r o l e o f b e n z e n e m e t a b o -l i t e s i n b e n z e n e t o x i c i t y r e q u i r e s a b r i e fr e v i e w o f b e n z e n e t o x i c i t y ( 2 , 3 ) . B e n z e n et o x i c i t y t o h u m a n s e x p o s e d i n t h e w o r k -p l a c e h a s b e e n c h a r a c t e r i z e d a s e i t h e r e a r l yr e v e r s i b l e h e m a t o t o x i c i t y o r , w i t h p r o -l o n g e d e x p o s u r e t o h i g h d o s e s , i r r e v e r s i b l eb on e m a r r o w d a m a g e . S t u d i e s o f w o r k e rp o p u l a t i o n s i n f a c t o r i e s i n w h i c h b e n z e n ew a s e m p l o y e d a s a s o l v e n t ( 2 ) s h o w e d ar a n g e o f h e m a t o t o x i c e f f e c t s i n c l u d i n g a n e -m i a , l e u k o p e n i a , a n d t h r o m b o c y t o p e n i a .I n s o m e c a s e s , m o r e t h a n o n e c e l l t y p e w a sd e c r e a s e d . A d e c r e a s e i n t h e l e v e l s o f a l l t h ec l a s s e s o f b l o o d c e l l t y p e s i n t h e c i r c u l a t i o ni s t e r m e d p a n c y t o p e n i a a n d i s u s u a l l ya s s o c i a t e d w i t h i r r e v e r s i b l e b on e m a r r o wa p l a s i a . A p l a s t i c a n e m i a i s i n m o s t c a s e sf a t a l . I n t h o s e w h o s u r v i v e a p l a s i a , t h e

m a r r o w a p p e a r s t o b e d y s p l a s t i c . M y e l o d y s -p l a s t i c s y n d r o m e , w h i c h h a s b e e n c a l l e d" p r e l e u k e m i a , " i s p r o b a b l y a n e a r l y s t a g e o fa c u t e m y e l o i d l e u k e m i a . T h u s , t h o s e i n t e r -e s t e d i n b e n z e n e m e t a b o l i s m n e e d t o d e t e r -m i n e h o w b e n z e n e m e t a b o l i t e s c o n t r i b u t et o t h e p r o d u c t i o n o f t h i s s e r i e s o f e v e n t sa s s o c i a t e d w i t h t o x i c i t y .B e n z e n e M e t a b o l i s ma n d T o x i c i t yT h e e v i d e n c e i s q u i t e s t r o n g t h a t b e n z e n em e t a b o l i s m p l a y s a c r i t i c a l r o l e i n b e n z e n et o x i c i t y ( 2 , 3 ) . T h u s , i n h i b i t i o n o f b e n z e n em e t a b o l i s m b y t o l u e n e , a c o m p e t i t i v ei n h i b i t o r , r e s u l t s i n a d e c r e a s e i n b e n z e n em e t a b o l i s m a n d a r e d u c t i o n i n b e n z e n et o x i c i t y ( 4 ) . D e c r e a s i n g t h e h e p a t i c m e t a b -o l i s m o f b e n z e n e b y p a r t i a l h e p a t e c t o m ya l s o r e du c e d b e n ze n e t o x i c i t y , s u g g e s t i n gt h a t h e p a t i c m e t a b o l i s m p l a y s a n i m p o r -t a n t r o l e i n t o x i c i t y ( 5 ) . I n a d d i t i o n t oh e p a t i c m e t a b o l i s m , i t a p p e a r s t h a t s e c -o n d a r y m e t a b o l i s m o f b e n z e n e m e t a b o l i t e si n b o n e m a r r o w c o n t r i b u t e s t o t o x i c i t y( 6 - 1 1 ) . T h u s , e l u c i d a t i o n o f t h e m e t a b o l i cp a t h w a y f o r b e n z e n e b i o t r a n s f o r m a t i o n i se s s e n t i a l f o r a f u l l u n d e r s t a n d i n g o f t h em e c h a n i s m o f t o x i c i t y .M e t a b o l i c P a t h w a yf o r B i o t r a n s f o r m a t i o nF i g u r e s 1 a n d 2 s h o w a l t e r n a t i v e r o u t e s b yw h i c h t h e f i r s t s t e p o f b e n z e n e m e t a b o l i s m ,n am el y, p h e no l f o r m a t i o n , c a n o c c u r .C y t o c h r o m e P 4 5 0 2 E 1 , a n d p e r h a p s o t h e rc y t o c h r o m e s P 4 5 0 , c a n g e n e r a t e H202w h e n a c t i n g a s o x i d a s e s o f n i c o t i n a m i d ea d e n i n e d i n u c l e o t i d e p h o s p h a t e ( N A D P H ) .T h e h y d r o x y l r a d i c a l f o r m e d f r o m H202c a n h y d r o x y l a t e b e n z e n e t o y i e l d p h e n o l .An a l t e r n a t i v e m e c h a n i s m f o r p h e n o lf o r m a t i o n i s s e e n i n F i g u r e 2 , w h i c h i sd e s i g n e d t o r e f l e c t o n t h e f a t e o f t h eb e n z e n e o x i d e - o x e p i n s y s t e m . When b e n -z e n e o x i d e i s t h e f i r s t p r o d u c t , i t c a nr e a r r a n g e n o n e n z y m a t i c a l l y t o f o r m p h e -n o l . A l t e r n a t i v e l y , b e n z e n e o x i d e c a n b eh y d r a t e d v i a e p o x i d e h y d r o l a s e t o y i e l d1 , 2 - b e n z e n e d i h y d r o d i o l , w h i c h c a n i n t u r nC Y P 4 5 0 + N A D P H + H+ 0 2 -*Y P 4 5 0 + N A D P + H O O H

H O O H -*- O HB e n z e n e '* O H -*h e n o l

F i g u r e 1 . A n a l t e r n a t i v e r o u t e o f p h e n o l f o r m a t i o nf r o m b e n z e n e : h y d r o x y l a t i o n o f b e n z e n e b y h y d r o x y lr a d i c a l s g e n e r a t e d f r o m H 2 0 2 .

E n v i r o n m e n t a l H e a l t h P e r s p e c t i v e s - V o l 1 0 4 , S u p p l e m e n t 6 * D e c e m b e r 1 99 6

- 1 . l

l 1 1 6 5

8/2/2019 Benzene Metabolism

2/7

SNYDER AND HEDLI

b e o x i d i z e d v i a d i h y d r o d i o l d e h y d r o g e n a s et o f o r m c a t e c h o l . T h e r e a c t i o n o f b e n z e n eo x i d e w i t h g l u t a t h i o n e c a t a l y z e d b y g l u -t a t h i o n e S - t r a n s f e r a s e l e a d s t o t h e f o r m a t i o no f t h e p r e m e r c a p t u r i c a c i d . I t i s l i k e l y t h a tb e n z e n e o x i d e o r i t s o x e p i n a r e p r e c u r s o r s t or i n g o p e n i n g ( 1 2 ) . P h e n o l c a n b e f u r t h e rh y d r o x y l a t e d t o f o r m h y d r o q u i n o n e o r c a t e -c h o l . I n t h e o r y , 1 , 2 , 4 - b e n z e n e t r i o l m a y b ef o r m e d b y t h e h y d r o x y l a t i o n o f e i t h e rh y d r o q u i n o n e o r c a t e c h o l ; b u t I n o u e e t a l .( 1 3 ) s u g g e s t e d t h a t c a t e c h o l i s n o t a p r e c u r -s o r o f 1 , 2 , 4 - b e n z e n e t r i o l i n h u m a n s .U r i n a r y M e t a b o l i t e sT h e m e t a b o l i t e s o f b e n z e n e f o u n d i n u r i n ea r e s h o w n i n F i g u r e 3 . A n y o f t h e p h e n o l i cm e t a b o l i t e s m a y b e c o n j u g a t e d w i t h e i t h e rs u l f a t e o r g l u c u r o n i d e . I n a d d i t i o n t oL - p h e n y l m e r c a p t u r i c a c i d r e p o r t e d b y P a r k ea n d W i l l i a m s ( 1 ) , o t h e r m e r c a p t u r a t e si n c l u d e 6 - N - a c e t y l c y s t e i n y l - S - 2 , 3 - c y c l o -h e x a d i e n o l ( 1 4 , 1 5 ) a n d 2 , 5 - d i O H - p h e n y l -m e r c a p t u r i c a c i d ( 1 6 ) . T h e u r i n e a l s oc o n t a i n s t w o r i n g - o p e n i n g p r o d u c t s , i . e . ,t r a n s - t r a n s - m u c o n i c a c i d ( 1 , 1 7 ) a n d 6 -O H - t , t - 2 , 4 - h e x a d i e n o i c a c i d ( 1 8 ) , a n d t h er e s i d u e o f a c o v a l e n t l y b o u n d DNAa d d u c t , i . e . , N 7 - p h e n y l g u a n i n e ( 1 9 , 2 0 ) .M i c r o s o m a l M e t a b o l i s mT h e m e t a b o l i s m o f b e n z e n e b y p u r i f i e d ,r e c o n s t i t u t e d r a t l i v e r C Y P 4 5 0 2 E 1 i s c h a r -a c t e r i z e d b y t h e r e q u i r e m e n t o f t h e p r e s -e n c e o f c y t o c h r o m e b 5 t o o b t a i n maximumm e t a b o l i s m ( 2 1 ) . A t l o w b e n z e n e c o n c e n -t r a t i o n s ( T a b l e 1 ) , a m u c h l a r g e r p e r c e n t -a g e o f h y d r o q u i n o n e i s f o r m e d t h a n a th i g h e r b e n z e n e c o n c e n t r a t i o n s . T h e a d d i -t i o n o f e p o x i d e h y d r o l a s e a l s o s t i m u l a t e sh y d r o q u i n o n e f o r m a t i o n a t t h e e x p e n s e o fp h e n o l . T h e r o l e o f e p o x i d e h y d r o l a s e i ns t i m u l a t i n g t h e s e c o n d h y d r o x y l a t i o n o fb e n z e n e i s n o t c l e a r . I t m a y a s s i s t i n s t a b i -l i z i n g C Y P 4 5 0 2 E 1 t o c o n t i n u e t o h y d r o x y -l a t e p h e n o l , t h e c o n c e n t r a t i o n o f w h i c hr i s e s a s b e n z e n e m e t a b o l i s m p r o c e e d s .A l t e r n a t i v e l y , i t may r e f l e c t a h i t h e r t ou n r e c o g n i z e d m e t a b o l i c a c t i v i t y l e a d i n g t oh y d r o q u i n o n e f o r m a t i o n . F u r t h e r s t u d y o ft h i s p r o b l e m i s r e q u i r e d .P o t e n t i a l M e c h a n i s m s o f T o x i c i t yT h e p r o d u c t i o n o f b e nz e ne m e t a b o l i t e s ,l a r g e l y i n t h e l i v e r , i s f o l l o w e d b y t h e i rt r a n s p o r t t o t h e b o n e m a r r o w a n d o t h e ro r g a n s . T h e r e a r e m a n y p o s s i b i l i t i e s f o rc a u s i n g b o n e m a r r o w t o x i c i t y . I r o n s a n dc o w o r k e r s ( 2 2 , 2 3 ) s u g g e s t e d t h a t c o v a l e n tb i n d i n g o f h y d r o q u i n o n e t o s p i n d l e f i b e rp r o t e i n c o u l d e x p l a i n i n h i b i t i o n o f c e l l

HOuH - > Q IH S G H 21 - G l u t a t h i o n y l - 2 - O H - 3 , 5 - c y c l o h e x a d i e n e2 - C H -CO -GLY

N H G l u t a t h i o n e S - e p o x i d e> t r a n s f e r a s eG L U B e n z e n ed i h y d r o d i o l0 C t o P 4 5 0 C y t o P 4 5 0B e n z e n e B e n z e n e B e n z e n eo x e p i n o x i d e

N o ne n z y m a t ic R ea rr a ng em en tOH, - n , O H [ O H ]

HOH y d r o q u i n o n e [ O H ]

0

0p - B e n z o q u i n o n e 1 , 2 , '

D i h y d r o d i o ld e h y d r o g e n a s e

, 4 - T r i h y d r o x y b e n z e n e o - B e n z o q u i n o n eF i g u r e 2 . T h e m e t a b o l i c f a t e o f t h e b e n z e n e o x i d e - o x e p i n s y s t e m .

1 . G l u c u r o n i d e a n d s u l f a t e c o n j u g a t e sOS , G ) O S , G )

OH2 . M e r c a p t u r i c a c i d s

CH2 -CH-COOHS NH -COCH3

6 - N - a c e t y l c y s t e i n y l - S -2 , 3 - c y c l o h e x a d i e n o l

O S , G )OH0 g

O S , G ) ?OH

OH

CH 2 -CH-COOHS NH -COCH3

P h e n y l m e r c a p t u r i c a c i d3 . R i n g - o p e n e d m e t a b o l i t e s

H HHOOC-C =C-C =C-COOH

H H

H HHOOC-C = C-C = C-CH 2 0 H

H Ht r a n s - t r a n s - M u c o n i c a c i d 6 - O H - t , t - 2 , 4 - h e x a d i e n o i c a c i d

F i g u r e 3 . T h e u r i n a r y m e t a b o l i t e s o f b e n z e n e .r e p l i c a t i o n b y b e n z e n e . D a m a g e t o DNAc o u l d r e s u l t i n b o n e marrow d e p r e s s i o nl e a d i n g to a p l a s t i c a n e m i a , w h i c h i ns u r v i v o r s l e a d s t o marrow d y s p l a s i a a n d

) HS -C H 2 -CH -COOH

NH -C OC H3HD i O H - p h e n y l m e r c a p t u r i c a c i d

4 . DN A a d d u c t r e s i d u e sOHNN

H2N N NN 7 - p h e n y l g u a n i n e

u l t i m a t e l y t o acute m y e l o i d l e u k e m i a ( 2 4 ) .F i g u r e 4 d i a g r a m s two m e c h a n i s m s b yw h i c h b e n z e n e m e t a b o l i t e s c o u l d caused a m a g e t o DNA. One p a t h w a y f o c u s e s on

E n v i r o n m e n t a l H e a l t h P e r s p e c t i v e s - V o l 1 0 4 , S u p p l e m e n t 6 * December 1996

OH OHrANK ~ ~ ~ [ O H ]

C OH ACO HH~~~~OH,,

1 1 6 6

8/2/2019 Benzene Metabolism

3/7

AN OVERVIEW OF BENZENE METABOLISM

T a b l e 1 . B e n z e n e m e t a b o l i s m b y p u r i f i e d r e c o n s t i t u t e d c y t o c h r o m e P 4 5 0 2 E 1 a n d i t s m o d u l a t i o n b y c y t o c h r o m e b 5a n d m i c r o s o m a l e p o x i d e h y d r o l a s e . 8P h e n o l n m o l / m i n / H y d r o q u i n o n e n m o l /B e n z e n e , mM p m o l P 4 5 0 2 E 1 m i n / p m o l P 4 5 0 2 E 1 T o t a l

W i t h o u t c y t o c h r o m e b 50 . 0 2 0 . 1 6 0 . 0 2 ( 8 4 ) 0 . 0 3 0 . 0 1 ( 1 6 ) 0 . 1 9 0 . 0 10 . 0 8 0 . 4 6 0 . 0 8 ( 9 2 ) 0 . 0 4 0 . 0 2 ( 8 ) 0 . 5 0 0 . 1 10 . 8 0 2 . 4 0 0 . 0 2 ( 9 4 ) 0 . 1 5 0 . 0 3 ( 6 ) 2 . 5 5 0 . 2 34 . 0 5 . 2 8 0 . 1 2 ( 9 5 ) 0 . 2 9 0 . 0 3 ( 5 ) 5 . 5 7 0 . 1 0W i t h c y t o c h r o m e b 50 . 0 2 0 . 7 0 . 0 1 ( 6 0 ) 0 . 4 6 0 . 0 1 ( 4 0 ) 1 . 1 6 0 . 0 10 . 0 8 2 . 0 4 0 . 1 1 ( 7 2 ) 0 . 7 7 0 . 0 7 ( 2 8 ) 2 . 8 5 0 . 1 40 . 8 7 . 4 5 0 . 1 3 ( 9 1 ) 0 . 7 6 0 . 0 4 ( 9 ) 8 . 2 1 0 . 2 04 . 0 9 . 8 4 0 . 2 0 ( 9 5 ) 0 . 5 0 0 . 0 2 ( 5 ) 1 0 . 3 4 0 . 2 3M e t a b o l i s m o f 0 . 8 mM b e n z e n e i n t h e p r e s e n c e o f m i c r o s o m a l e p o x i d e h y d r o l a s eU n i t s E H b P h e n o l H y d r o q u i n o n e T o t a l0 7 . 4 5 0 . 1 3 0 . 7 6 0 . 0 4 8 . 2 1 0 . 0 91 6 7 . 5 4 0 . 1 6 0 . 8 3 0 . 0 5 8 . 3 7 0 . 1 83 2 8 . 4 0 0 . 9 4 1 . 5 4 0 . 1 3 1 0 . 1 2 0 . 8 36 4 8 . 7 4 0 . 3 7 3 . 1 9 0 . 5 0 1 2 . 3 5 0 . 8 2a V a l u e s r e p r e s e n t t h e m e a n s t a n d a r d d e v i a t i o n . P e r c e n t a g e s o f t o t a l m e t a b o l i s m r e s u l t i n g i n e i t h e r p h e n o l o rh y d r o q u i n o n e f o r m a t i o n a r e s h o w n i n p a r e n t h e s e s . b U n i t s E H = a m o u n t o f E H p r o d u c i n g 1 p m o l o f s t y r e n e g l y c o lf r o m s t y r e n e o x i d e p e r m i n u t e ; E H w a s a d d e d s u b s e q u e n t t o b 5 a d d i t i o n a n d p r i o r t o c o m b i n a t i o n w i t h l i p i d .

t h e m e t a b o l i c a c t i v a t i o n o f b e n z e n e t os p e c i e s t h a t c o v a l e n t l y b i n d t o DNA t o p r o -d u c e m u t a g e n i c e v e n t s t h a t a r e e x p r e s s e d a sl e u k e m i a . T h e s e c o n d m e c h a n i s m i n v o l v e st h e p r o d u c t i o n o f m e t a b o l i t e s t h a t c a u s e- . d a t i v e s t r e s s , s u b s e q u e n t o x i d a t i v e d a m -a g e t o DNA, a n d a m u t a g e n i c e f f e c t t h a t h a st h e s a m e c o n s e q u e n c e s .C o v a l e n t B i n d i n g a n d T o x i c i t yWe h a v e k n o w n f o r a l m o s t t w o d e c a d e st h a t b e n z e n e i s m e t a b o l i z e d t o s p e c i e sc a p a b l e o f c o v a l e n t i n t e r a c t i o n w i t h c e l l u -l a r m a c r o m o l e c u l e s . S n y d e r e t a l . ( 2 5 ) f i r s td e m o n s t r a t e d t h a t p r o t e i n s i n t h e b o n em a r r o w a n d o t h e r t i s s u e s o f m i c e t r e a t e dw i t h r a d i o l a b e l e d b e n z e n e i n v i v o c o n -t a i n e d c o v a l e n t l y b o u n d r a d i o l a b e l ( T a b l e2 ) . L u t z a n d S c h l a t t e r s u b s e q u e n t l y d e m o n -s t r a t e d c o v a l e n t b i n d i n g o f b e n z e n e m e t a b o -l i t e s t o DNA i n r a t l i v e r ( 2 6 ) . O u r s t u d i e so f t h e c o v a l e n t i n t e r a c t i o n o f b e n z en em e t a b o l i t e s w i t h c e l l u l a r m a c r o m o l e c u l e ss u g g e s t e d t h a t t h i s p h e n o m e n o n m i g h tp l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e e x p r e s s i o n o ft o x i c i t y . S a m m e t t e t a l . ( 5 ) s h o w e d t h a t i nr a t s p a r t i a l h e p a t e c t o m y c o r r e l a t e d w i t hb o t h p r o t e c t i o n a g a i n s t b e n z e n e t o x i c i t ya n d r e d u c e d l e v e l s o f c o v a l e n t b i n d i n g o fb e n z e n e m e t a b o l i t e s i n b o n e m a r r o w ;L o n g a c r e e t a l . ( 2 7 ) s h o w e d t h a t t h e l e v e l so f c o v a l e n t l y b o u n d m e t a b o l i t e s m e a s u r e di n t h e h e m a t o p o i e t i c t i s s u e s w e r e h i g h e r i nm o u s e s t r a i n s t h a t w e r e m o r e s e n s i t i v e t ob e n z e n e t o x i c i t y t h a n i n t h o s e t h a t w e r e l e s ss e n s i t i v e . R u s h m o r e e t a l . ( 2 8 ) e x t e n s i v e l yi n v e s t i g a t e d c o v a l e n t b i n d i n g i n a n i s o l a t e d

m i t o c h o n d r i a l s y s t e m ; t h e y s h o w e d t h a tt h e b e n z e n e m e t a b o l i t e s a r e c a p a b l e o fc o v a l e n t b i n d i n g t o DNA a n d i n h i b i t i n gp r o t e i n a n d RNA s y n t h e s i s . T o c h e m i c a l l yc h a r a c t e r i z e t h e DNA a d d u c t s f o r m e d ,a d d u c t s w e r e p r e p a r e d i n v i t r o b y r e a c t i n gd e o x y n u c l e o s i d e s o r d e o x y n u c l e o s i d em o n o p h o s p h a t e s w i t h e i t h e r p - b e n z o -q u i n o n e o r h y d r o q u i n o n e i n t h e p r e s e n c eo f a n o x i d i z i n g a g e n t . T h e c o m b i n a t i o n o fU V , f l u o r e s c e n c e , m a s s , a n d n u c l e a r m a g -n e t i c r e s o n a n c e s p e c t r o m e t r y w a s f i r s t u s e db y J o w a e t a l . ( 2 9 ) t o i d e n t i f y 3 ' - O H -1 , N 2 - b e n z e t h e n o - 2 ' - d e o x y g u a n o s i n e a s am a j o r d e ox y g u a n o si n e a d du c t ( F i g u r e 5 ) .P o n g r a c z e t a l . ( 3 0 , 3 1 ) a n d L e v a y e t a l . ( 3 2 )s u b s e q u e n t l y c o m b i n e d t h e s e s p e c t r o s c o p i cm e t h o d s o f s t r u c t u r a l a n a l y s i s w i t h t h e s e n -s i t i v e DNA [ 3 2 P ] p o s t l a b e l i n g m e t h o d o fa d d u c t d e t e c t i o n t o i d e n t i f y ( 3 ' - O H ) - 3 , N 4 -b e n z e t h e n o d e o x y c y t i d i n e - 3 ' - p h o s p h a t e ,( 3 ' - O H ) - 1 , N 6 - b e n z e t h e n o - 2 ' - d e o x y a d e n o -s i n e - 3 ' - p h o s p h a t e a n d ( 3 ' - O H ) - 1 , N 2 - b e n -z e t h e n o - 2 ' d e o x y g u a n o s i n e - 3 ' - p h o s p h a t ef o l l o w i n g t h e i n v i t r o r e a c t i o n o f p - b e n z o -q u i n o n e a n d c a l f t h y m u s DNA. T h e s t r u c -t u r e s o f t h e d e o x y r i b o n u c l e o s i d e f o r m s o ft h e s e a d d u c t s a r e s h o w n i n F i g u r e 5 .A l t h o u g h i n v i t r o s t u d i e s h a v e e s t a b -l i s h e d t h a t r e a c t i v e m e t a b o l i t e s o f b e n z e n ec o v a l e n t l y b i n d t o DNA, i n v i v o e v i d e n c eo f c o v a l e n t b i n d i n g h a s b e e n m o r e d i f f i c u l tt o d e m o n s t r a t e . I n i t i a l s t u d i e s i n v o l v i n ga d m i n i s t r a t i o n o f r a d i o l a b e l e d b e n z e n e t or a t s b y L u t z a n d S c h l a t t e r ( 2 6 ) a s w e l l a sl a t e r s t u d i e s b y A r f e l l i n i e t a l . ( 3 3 ) a n dM a z u l l o e t a l . ( 3 4 ) u s i n g r a t s a n d m i c e ,

B e n z e n e - M e t a b o l i ca c t i v a t i o n

DNA O x i d a t i v ea l k y l a t i o n s t r e s s

1 1M u t a g e n i c e v e n t DNAo r o x i d a t i o nc h r o m o s o m ed a m a g eF i g u r e 4 . P o t e n t i a l p a t h w a y s o f DNA d a m a g e b yb e n z e n e i n b o n e m a r r o w c e l l s .T a b l e 2 . W a t e r - s o l u b l e a n d c o v a l e n t l y b o u n d m e t a b o -l i t e s o f [ 3 H ] b e n z e n e i n o r g a n s o f C D - 1 m i c e g i v e n 2d o s e s p e r d a y ( 8 8 0 m g / k g ) f o r 3 d a y s . aO r g a nB o n e m a r r o wL i v e rK i d n e yL u n gS p l e e nB l o o dM u s c l e

W a t e r - s o l u b l em e t a b o l i t e s b2 6 1 5 1 2 41 3 7 7 2 1 71 3 0 6 2 1 71 1 3 0 1 4 57 7 4 7 61 1 6 1 1 9 91 0 7 6 4 1 1

C o n v a l e n t l y b o u n dm e t a b o l i t e s c6 2 1 86 6 9 1 8 88 7 3 1 0 12 2 3 2 01 7 6 1 21 8 3 3 56 0 1 1

a M i c e w e r e s a c r i f i c e d 1 2 t o 1 6 h r a f t e r t h e l a s t d o s e .b E x p r e s s e d a s n m o l b e n z e n e e q u i v a l e n t s p e r g r a m w e tw e i g h t . c E x p r e s s e d a s n m o l b e n z e n e e q u i v a l e n t s p e rg r a m p r o t e i n .

A B0OH! N

NH~KN N 'd R

OH

dR

COH / N

N \aNdR

F i g u r e 5 . S t r u c t u r e s o f t h e m a j o r d e o x y r i b o n u c l e o s i d ea d d u c t s o f p - b e n z o q u i n o n e ( A ) 3 ' - O H - 1 , N 2 - b e n z e t h e n o -2 ' - d e o x y g u a n o s i n e ; ( B ) 3 ' - O H - 3 , N 4 - b e n z e t h e n o - 2 ' -d e o x y c y t i d i n e ; ( C ) 3 ' - O H - 1 , N 6 - b e n z e t h e n o - 2 ' -d e o x y a d e n o s i n e I d R = 2 - d e o x y r i b o s e ) .d e m o n s t r a t e d c o v a l e n t b i n d i n g t o DNA o fs e v e r a l a n i m a l t i s s u e s i n c l u d i n g l i v e r , b o n em a r r o w , s p l e e n , k i d n e y , s t o m a c h , a n d l u n g .A t t e m p t s t o i d e n t i f y a d d u c t f o r m a t i o n i nv i v o u s i n g t h e [ 3 2 P ] p o s t l a b e l i n g m e t h o dh a v e n o t , h o w e v e r , b e e n h i g h l y s u c c e s s f u l .

E n v i r o n m e n t a l H e a l t h P e r s p e c t i v e s * V o l 1 0 4 , S u p p l e m e n t 6 * D e c e m b e r 1 9 9 6 1 1 6 7

8/2/2019 Benzene Metabolism

4/7

SNYDER AND H E D L I

T h e s e p r o b l e m s m a y b e r e l a t e d t o t h e l o wc o v a l e n t b i n d i n g i n d e x o f b e n z e n e , t h e c o m -p l e x n a t u r e o f t h e b o n e m a r r o w , a n dd i f f i c u l t i e s i n e s t a b l i s h i n g b o t h a n o p t i m a lt r e a t m e n t r e g i m e n a n d a n a ni ma l m o d e ls y s t e m t h a t a c c u r a t e l y r e f l e c t s a l l t h e t o x i cr e s p o n s e s t o b e n z e n e o b s e r v e d i n h u m a n s .T h e m o s t c o n s i s t e n t d e m o n s t r a t i o n s o fb e n z e n e m e t a b o l i t e - i n d u c e d DNA a d d u c tf o r m a t i o n i n a c e l l u l a r m o d e l h a v e b e e nm a d e u s i n g h u m a n p r o m y e l o c y t i c ( H L - 6 0 )c e l l s i n c u l t u r e , a l i n e o f m y e l o i d c e l l s t h a th a s t h e c a p a c i t y t o d i f f e r e n t i a t e i n r e s p o n s et o s p e c i f i c c h e m i c a l s t i m u l a n t s i n t o a n y o ft h e f o u r c l a s s e s o f h e m a t o p o i e t i c c e l l s o f t h em y e l o m o n o c y t i c l i n e a g e , i . e . , g r a n u l o c y t e s ,m o n o c y t e s , e o s i n o p h i l s , o r m a c r o p h a g e s( 3 5 ) . S t u d i e s u s i n g t h i s m o d e l a n d t h e[ 3 2 P ] p o s t l a b e l i n g m e t h o d o f a d d u c t d e t e c -t i o n b y L e v a y e t a l . h a v e l e d t o t h e d e t e c t i o no f DNA a d d u c t s i n b e n z e n e m e t a b o l i t e -t r e a t e d c e l l s t h a t a r e n o t c h r o m a t o g r a p h i -c a l l y i d e n t i c a l w i t h t h o s e f o r m e d f o l l o w i n gt h e i n v i t r o r e a c t i o n o f p - b e n z o q u i n o n e a n dDNA ( 3 2 ) . A l t h o u g h t h e s e i n v e s t i g a t i o n ss h o w e d t h a t b e n z e n e m e t a b o l i t e s i n t e r a c ts y n e r g i s t i c a l l y t o p r o d u c e DNA a d d u c t s( 3 6 ) a n d t h a t p e r o x i d a s e a c t i v a t i o n o fh y d r o q u i n o n e i s r e q u i r e d f o r a d d u c t f o r m a -t i o n ( 3 7 ) , n o a t t e m p t s w e r e m a d e t o l i n ka d d u c t f o r m a t i o n w i t h a n y e n d p o i n t o f t o x -i c i t y o t h e r t h a n c y t o t o x i c i t y . We r e c e n t l ye v a l u a t e d t h e s i g n i f i c a n c e o f DNA a d d u c tf o r m a t i o n i n t o x i c i t y b y s t u d y i n g t h e e f f e c t so f b e n z e n e m e t a b o l i t e s o n DNA a d d u c t f o r -m a t i o n a n d r e t i n o i c a c i d - i n d u c e d g r a n u l o -c y t i c d i f f e r e n t i a t i o n i n t h i s m o d e l ( 3 8 ) .T a b l e 3 s h o w s t h a t w h i l e t r e a t m e n t o f H L -6 0 c e l l s w i t h 5 0 , u M h y d r o q u i n o n e f o r 1 t o4 h r i n d u c e d t h e f o r m a t i o n o f a s i n g l e DNAa d d u c t t h a t i n c r e a s e d w i t h i n c r e a s i n g t i m eo f e x p o s u r e , n o a d d u c t s w e r e d e t e c t e d i nc e l l s t r e a t e d w i t h 5 0 t o 5 0 0 pM 1 , 2 , 4 - b e n -z e n e t r i o l f o r u p t o 4 h r . U s i n g t h e s a m ei n c u b a t i o n c o n d i t i o n s , t r e a t m e n t o f t h e c e l l sw i t h e i t h e r h y d r o q u i n o n e o r 1 , 2 , 4 - b e n z e n -e t r i o l p r i o r t o i n d u c i n g d i f f e r e n t i a t i o n w i t hr e t i n o i c a c i d s i g n i f i c a n t l y i n h i b i t e d t h e i r

c a p a c i t y t o d i f f e r e n t i a t e , a s a s s e s s e d b y e v a l -u a t i n g c e l l m o r p h o l o g y , u s i n g l i g h t a n de l e c t r o n m i c r o s c o p y , a n d t w o i n d i c a t o r s o fc e l l f u n c t i o n a l c a p a c i t y - p h a g o c y t o s i s a n dn i t r o b l u e t e t r a z o l i u m r e d u c t i o n . T h e s e d a t ai n d i c a t e t h a t DNA a d d u c t f o r m a t i o n m a yp l a y a r o l e i n i n h i b i t i n g c e l l d i f f e r e n t i a t i o ni n h y d r o q u i n o n e b u t n o t i n 1 , 2 , 4 - b e n z e n -e t r i o l - t r e a t e d c e l l s , a n d s u p p o r t t h e c o n -t e n t i o n t h a t v a r i o u s m e t a b o l i t e s c o n t r i b u t et o d i f f e r e n t c o m p o n e n t s o f t h e m e c h a n i s mo f t o x i c i t y .O x i d a t i v e S t r e s s a n d T o x i c i t yT h e p o t e n t i a l f o r o x i d a t i v e s t r e s s t oc o n t r i b u t e t o b e n z e n e t o x i c i t y i s c l o s e l y t i e dt o s p e c i f i c b e n z e n e m e t a b o l i t e s . H y d r o -q u i n o n e may b e o x id iz ed t o p - b e n z o -q u i n o n e , w h i c h i s h i g h l y r e a c t i v e a n d c a nc o v a l e n t l y b i n d t o c e l l u l a r m a c r o m o l e c u l e s( a b o v e ) o r t o g l u t a t h i o n e . A l t e r n a t i v e l y ,

S t e p 1 S t e

b e n z e n e m e t a b o l i t e s m a y e n g a g e i n r e d o xc y c l i n g , w h i c h i n v o l v e s a u t o o x i d a t i o n o f ar e d u c e d f o r m o f t h e m e t a b o l i t e t o y i e l d a no x i d i z e d s p e c i e s p l u s r e a c t i v e o x y g e n . T h eb o n e m a r r o w , w h i c h i s a r i c h l y o x y g e n a t e do r g a n , h a s t h e c a p a b i l i t y t o g e n e r a t e r e a c t i v eo x y g e n s p e c i e s . T h e f o u r - e l e c t r o n r e d u c t i o no f o x yg e n ( 3 9 ) m a y g e n e r a t e s u p e r o x i d ea n i o n r a d i c a l , h y d r o g e n p e r o x i d e , a n dh y d r o x y l r a d i c a l . T h e o x i d i z e d m e t a b o l i t em a y u n d e r g o f l a v o p r o t e i n r e d u c t i o n t o y i e l dt h e s t a r t i n g m a t e r i a l t h a t m a y r e e n t e r t h er e d o x c y c l e .I t m i g h t b e p o s t u l a t e d t h a t h y d r o -q u i n o n e - p - b e n z o q u i n o n e w o u l d b e l i k e l y t ou n d e r g o r e d o x c y c l i n g . R e c e n t s t u d i e s b yB o e r s m a e t a l . ( 4 0 ) a r g u e t o t h e c o n t r a r y .F i g u r e 6 s h o w s t h a t t h e r e d u c t i o n o f p - b e n -z o q u i n o n e m a y p r o c e e d v i a a r e d u c t a s e s u c ha s C Y P 4 5 0 r e d u c t a s e i n t w o s t e p s . T h e f i r s tp r o d u c t w o u l d b e t h e s e m i q u i n o n e a n i o n

. p 2Ao 0 o -K : o F P H 2 - FPH2 Xo 0 2 2 o - O ~ 2 02o

p - B e n z o q u i n o n e - H + + H + - H + +H+p K a = 4 . 1

o * S t e p 2B O - OHC ~ FPH2 X -+OH2 + H

OH0 02 OH pKa=9.85 OHS e m i q u i n o n e r a d i c a l H y d r o q u i n o n e

F i g u r e 6 . T w o - s t e p r e d u c t i o n o f p - b e n z o q u i n o n e b y r e d u c t a s e ( F P H 2 ) : e v i d e n c e t h a t p - b e n z o q u i n o n e d o e s n o t s u p -p o r t r e d o x c y c l i n g a t p h y s i o l o g i c a l p H . S t e p s 1 , 2 A , a n d 2 B a r e s i t e s a t w h i c h r e a c t i o n s w i t h o x y g e n t o y i e l d s u p e r -o x i d e w o u l d o c c u r i n r e d o x c y c l i n g . H o w e v e r , p - b e n z o q u i n o n e i s s t o i c h i o m e t r i c a l l y r e d u c e d t o h y d r o q u i n o n e a t p H7 . 5 , t h e p H o f t h e c e l l ( 4 0 ) .

T a b l e 3 . E f f e c t o f b e n z e n e m e t a b o l i t e t r e a t m e n t o n g r a n l o c y t i c d i f f e r e n t i a t i o n a n d D N A a d d u c t f o r m a t i o n i n H L - 6 0 c e l l s .E f f e c t o f i n d i c a t e d t r e a t m e n t s o n r e t i n o i c a c i d - i n d u c e d c e l l d i f f e r e n t i a t i o nD N A b i n d i n g b y M o r p h o l o g i c a l e v a l u a t i o n b y F u n c t i o n a l e v a l u a t i o nT r e a t m e n t [ 3 2 P ] p o s t l a b e l i n g l i g h t a n d e l e c t r o n m i c r o s c o p y P h a g o c y t o s i s o f s h e e p r e d b l o o d c e l l s N B T r e d u c t i o n

N e g a t i v e - c o n t r o l u n t r e a t e d c e l l s N o n e I m m a t u r e u n d i f f e r e n t i a t e dP o s i t i v e - c o n t r o l u n t r e a t e d - R A i n d u c e d N o t a n a l y z e d M a t u r e u n d i f f e r e n t i a t e d + +5 0 p M H Q / 0 . 5 t o 4 h r S i n g l e a d d u c t / t i m e - L e s s m a t u r e c e l l s , d i f f e r e n t i a t i o n 4 .d e p e n d e n t i n c r e a s e i n h i b i t e d5 0 p M B T / 2 h r N o t d e t e c t a b l e D i f f e r e n t i a t i o n i n h i b i t e d J I I -2 5 0 p M B T / 2 h r , 4 h r N o t d e t e c t a b l e D i f f e n t i a t i o n i n h i b i t e d 1 15 0 0 p M B T / 4 h r N o t d e t e c t a b l e N o t a n a l y z e d N o t a n a l y z e d N o t a n a l y z e d

E n v i r o n m e n t a l H e a l t h P e r s p e c t i v e s * V o l 1 0 4 , S u p p l e m e n t 6 * D e c e m b e r 1 9 9 61 6 8

8/2/2019 Benzene Metabolism

5/7

AN OVERVIEW OF BENZENE METABOLISM

r a d i c a l ( S t e p 1 ) , w h i c h c o u l d e i t h e r b er e d u c e d a g a i n ( S t e p 2 A ) , o r may-morel i k e l y - b e p r o t o n a t e d b e f o r e t h e s e c o n dr e d u c t i o n ( S t e p 2 B ) . T h e p K a o f t h e p r o t o -n a t i o n s t e p i s 4 . 1 , s u g g e s t i n g t h a t a t t h e pHo f t h e c e l l , i . e . , a p p r o x i m a t e l y 7 . 5 , t h e a n -i o n i c f o r m w o u l d p r e d o m i n a t e . F o l l o w i n gt h e s e c o n d r e d u c t i o n , t h e m o n o a n i o n o fh y d r o q u i n o n e w o u l d b e f o r m e d , b u t t h eP K a f o r i t s p r o t o n a t i o n i s 9 . 8 5 , i n d i c a t i n gt h a t i t w o u l d e x i s t m a i n l y i n t h e d i p r o t o -n a t e d f o r m . R e o x i d a t i o n t o p - b e n z o -q u i n o n e , t h e n e x t s t e p i n r e d o x c y c l i n g ,w o u l d b e i n h i b i t e d b e c a u s e i t i s t h e m o n a n -i o n t h a t i s t h e s u b s t r a t e f o r a u t o o x i d a t i o nl e a d i n g t o s u p e r o x i d e a n i o n f o r m a t i o n .T h u s , i t i s u n l i k e l y t h a t h y d r o q u i n o n e - p -b e n z o q u i n o n e u n d e r g o e s r e d o x c y c l i n g a tp h y s i o l o g i c a l p H .T h e m e t a b o l i c f a t e o f p - b e n z o q u i n o n e ,i f i t i s n o t r e d u c e d , m a y b e t o r e a c t w i t hg l u t a t h i o n e ( G S H ) t o f o r m t h e p r e m e r c a p -t u r i c a c i d o f h y d r o q u i n o n e , w h i c h m a y g oo n t o f o r m t h e m e r c a p t u r i c a c i d , o r m a yu n d e r g o s l o w a u t o o x i d a t i o n l e a d i n g t o t h ep r o d u c t i o n o f r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s ( 4 1 )( F i g u r e 7 ) . A l t e r n a t i v e l y , p - b e n z o q u i n o n em a y b e c o n v e r t e d t o i t s e p o x i d e e i t h e r v i aC Y P 4 5 0 o r HOOH ( F i g u r e 8 , S t e p 1 ) , l e a d -i n g t o p - b e n z o q u i n o n e 2 , 3 - o x i d e a n d u l t i -m a t e l y t o 1 , 2 , 4 - b e n z e n e t r i o l ( S t e p 2 A )f o l l o w i n g e i t h e r a t w o - e l e c t r o n r e d u c t i o nb y d i a p h o r a s e o r t w o o n e - e l e c t r o n r e d u c -t i o n s b y C Y P 4 5 0 r e d u c t a s e . R e a c t i o n o fp - b e n z o q u i n o n e 2 , 3 - o x i d e w i t h GSH l e a d st o t h e f o r m a t i o n o f g l u t a t h i o n y l 1 , 2 , 4 - b e n -z e n e t r i o l ( F i g u r e 8 , S t e p 2 B ) .T h e u n i q u e f e a t u r e o f g l u t a t h i o n y l1 , 2 , 4 - b e n z e n e t r i o l i s i t s a b i l i t y t o s p o n t a -n e o u s l y u n d e r g o a u t o o x i d a t i o n a n d r e d o xc y c l i n g ( F i g u r e 9 ) . B r u n m a r k a n d C a d e n a s( 4 1 ) s h o w e d t h a t g l u t a t h i o n y l b e n z e n e t r i o lc o u l d b e s e q u e n t i a l l y o x i d i z e d t o g l u -t a t h i o n y l - 1 , 2 , 4 - b e n z e n e t r i o l s e m i q u i n o n e

1 . A n a e r o b i c03 + GS H -

0

OH

GS OH

a n d t h e n t o 5 - O H - g l u t a t h i o n y l - p - b e n z o -q u i n o n e ( H G B ) . H GB i s a l s o t h e p r o d u c to f t h e r e a c t i o n b e t w e e n p - b e n z o q u i n o n e2 , 3 - o x i d e a n d g l u t a t h i o n y l - 1 , 2 , 4 - b e n z e n e -t r i o l s e m i q u i n o n e ( G B S ) , w h i c h a l s o y i e l d s5 - O H - b e n z o s e m i q u i n o n e . A l t e r n a t i v e l y ,GBS c a n u n d e r g o d i s p r o p o r t i o n a t i o n t of o r m g l u t a t h i o n y l - 1 , 2 , 4 - b e n z e n e t r i o l , w h i c hc a n i n i t i a t e t h e r e d o x c y c l e a g a i n . I f r e d o xc y c l i n g i s a n i m p o r t a n t p h e n o m e n o n i n t h em e c h a n i s m o f b e n z e n e t o x i c i t y , i t i s l i k e l yt h a t 1 , 2 , 4 - b e n z e n e t r i o l p l a y s a s i g n i f i c a n tr o l e i n t h e p r o c e s s .I n a s e r i e s o f s t u d i e s i n H L - 6 0 c e l l s ,h y d r o q u i n o n e , p - b e n z o q u i n o n e a n d 1 , 2 , 4 -b e n z e n e t r i o l w e r e a d d e d s o t h a t r e s e a r c h e r sc o u l d s t u d y t h e i r i m p a c t s o n o x i d a t i v es t r e s s a n d a n t i o x i d a n t f a c t o r s ( 4 2 ) . T a b l e 4s h o w s t h a t h y d r o q u i n o n e a n d p - b e n z o -q u i n o n e i n c r e a s e d s u p e r o x i d e , n i t r i c o x i d e ,a n d HOOH p r o d u c t i o n , b u t t h a t 1 , 2 , 4 -b e n z e n e t r i o l , w h i l e i n c r e a s i n g s u p e r o x i d ea n d HOOH, h a d n o e f f e c t o n n i t r i c o x i d ep r o d u c t i o n . H y d r o q u i n o n e a n d p - b e n z o -q u i n o n e b u t n o t 1 , 2 , 4 - b e n z e n e t r i o ld e c r e a s e d c a t a l a s e a c t i v i t y . H y d r o q u i n o n ea n d 1 , 2 , 4 - b e n z e n e t r i o l b u t n o t p - b e n z o -q u i n o n e d e c r e a s e d s u p e r o x i d e d i s m u t a s ea n d h y d r o q u i n o n e a n d b e n z e n e t r i o ld e c r e a s e d s u l f h y d r y l l e v e l s . T h u s , a l t h o u g ha l l o f t h e m e t a b o l i t e s i n d u c e o x i d a t i v e

1 . F o r m a t i o n o f p - b e n z o q u i n o n e 2 , 3 - o x i d eo a

+ HOOH > jjo + HOHo o

2 . F a t e o f p - b e n z o q u i n o n e 2 , 3 - o x i d eA . R e d u c t i o n( 1 ) O n e - e l e c t r o n r e d u c t i o n ( C Y P 4 5 0 r e d u c t a s e l

O 0 OH1o + F P H 2 - + F Po o -

( 2 ) T w o - e l e c t r o n r e d u c t i o n ( d i a p h o r a s e lO OHi - f . ~ ~ ~ ~ ~ O HI o + F P H 2 > + F PO OH

B . R e a c t i o n w i t h G S HO OH OH[ + GSH-Thf ~ ~ ~ ~ G SO OHF i g u r e 8 . T h e f o r m a t i o n o f p - b e n z o q u i n o n e 2 , 3 - o x i d ef r o m p - b e n z o q u i n o n e a n d i t s m e t a b o l i c f a t e . S t e p 1 . pB e n z o q u i n o n e i s c o n v e r t e d t o i t s e p o x i d e b y t h e a d d i -t i o n o f H O O H . S t e p 2 A . p - B e n z o q u i n o n e i s r e d u c e d t o1 , 2 , 4 - b e n z e n e t r i o l b y e i t h e r o n e - e l e c t r o n r e d u c t i o n ( 1 )c a t a l y z e d b y P 4 5 0 r e d u c t a s e o r t w o - e l e c t r o n r e d u c t i o n( 2 ) c a t a l y z e d b y D T d i a p h o r a s e . S t e p 2 B . R e a c t i o n o f1 , 2 , 4 - b e n z e n e t r i o l w i t h g l u t a t h i o n e t o y i e l d g l u -t a t h i o n y l 1 , 2 , 4 - b e n z e n e t r i o l .

1 . A u t o o x i d a t i o n o f 2 - O H - 5 - g l u t a t h i o n y l h y d r o q u i n o n e t o y i e l d 2 - O H - 5 - g l u t a t h i o n y l - p - b e n z o q u i n o n eOH

OH

GSOH

2 2\ , " + l e ,F P H 2

0 0OH

GS0 -

0 2 2+e

F P H 200o-

GS '0

2 . A l t e r n a t i v e m e c h a n i s m f o r 2 - O H - 5 - g l u t a t h i o n y l - p - b e n z o q u i n o n e p r o d u c t i o n v i a r e d o x t r a n s i t i o n0

0

0

0 *OH+ KH

GS0 -

0 O OH

O-

o-* 0 3 GS 0

3 . D i s p r o p o r t i o n a t i o n o f t h e h y d r o x y s e m i q u i n o n e2 . A e r o b i c

OHOH 0

1121+ H202 GSOH 0 F i g u r e 9 . T h e r e d o xF i g u r e 7 . P o t e n t i a l i n t e r a c t i o n o f p - b e n z o q u i n o n e w i t h 2 - O H - g l u t a t h i o n y l hg l u t a t h i o n e ( 1 ) a n a e r o b i c ( 1 : 1 s t o i c h i o m e t r y ; r a p i d ) ; ( 2 ) t r a n s i t i o n o f t h e h y da e r o b i c ( s l o w a u t o o x i d a t i o n ) . q u i n o n e v i a d i s p r o p c

OHOH

GSOH

+0

o-

GS0

K c y c l i n g o f g l u t a t h i o n y l b e n z e n e t r i o l . 1 . F o r m a t i o n o f 2 - O H - 5 - g l u t a t h i o n y l p - b e n z o q u i n o n e f r o mi y d r o q u i n o n e b y a u t o o x i d a t i o n . 2 . F o r m a t i o n o f 2 - O H - 5 - g l u t a t h i o n y l p - b e n z o q u i n o n e v i a r e d o xd r o x y s e m i q u i n o n e a n d p - b e n z o q u i n o n e 2 , 3 - o x i d e . 3 . F o r m a t i o n o f 2 - O H - 5 - g l u t a t h i o n y l p - b e n z o -o r t i o n a t i o n o f t h e h y d r o x y s e m i q u i n o n e .

E n v i ro n m e n ta l H e a l th P e r s p e c t i v e s * V o l 1 0 4 , S u p p l e m e n t 6 * December 1 9 9 6 1 1 6 9

8/2/2019 Benzene Metabolism

6/7

SNYDER AND HEDLI

T a b l e 4 . I m p a c t o f h y d r o q u i n o n e , p - b e n z o q u i n o n e , a n d 1 , 2 , 4 - b e n z e n e t r i o l o n o x i d a t i v e s t r e s s a n d a n t i o x i d a n t f a c -t o r s i n H L - 6 0 c e l l s a c t i v a t e d b y 1 2 - O - t e t r a d e c a n o y l p h o r b o l - 1 3 - a c e t a t e .F a c t o r H Q B O B T M e t h o dS u p e r o x i d e I n c r e a s e I n c r e a s e I n c r e a s e R e i d a n d L o e b ( 4 5 )N i t r i c o x i d e I n c r e a s e I n c r e a s e N o c h a n g e G r e e n e t a l . ( 4 6 )H y d r o g e n p e r o x i d e I n c r e a s e I n c r e a s e I n c r e a s e B a s s e t a l . ( 4 7 )M y e l o p e r o x i d a s e N o c h a n g e N o c h a n g e N o c h a n g e H i m m e l h o c h e t a l . ( 4 8 )C a t a l a s e D e c r e a s e D e c r e a s e N o c h a n g e A e b i ( 4 9 )S O D D e c r e a s e N o c h a n g e D e c r e a s e M a r k l u n d a n d M a r k l u n d ( 5 0 )V i t a m i n C N o c h a n g e N o c h a n g e N o c h a n g e A t t w o o d e t a l . ( 5 1 )T h i o l s ( G S H ) D e c r e a s e N o c h a n g e D e c r e a s e B e u t l e r e t a l . ( 5 2 )

m o d i f i c a t i o n s i n t h e s e c e l l s , t h e i r i n d i v i d -u a l i m p a c t s o n o x i d a t i v e s t r e s s a n d a n t i o x i -d a n t f a c t o r s i n t h e s e c e l l s a r e d i f f e r e n t .P o t e n c y o f B e n z e n ea n d I t s M e t a b o l i t e si n P r o d u c i n g T o x i c i t yI n a t t e m p t i n g t o s o r t o u t t h e r o l e p l a y e d b yt h e v a r i o u s b e n z e n e m e t a b o l i t e s i n t h ep r o d u c t i o n o f b e n z e n e t o x i c i t y , i t i s h e l p f u lt o e x a m i n e t h e p o t e n c y w i t h w h i c h e a c h o ft h e m e t a b o l i t e s , a l o n e o r i n c o m b i n a t i o n ,c a u s e s t o x i c e f f e c t s . T h e r e a r e m a n y s t a g e si n b o n e m a r r o w c e l l m a t u r a t i o n a n d a m p l i -f i c a t i o n a n d t h e r e a r e a n u m b e r o f f u n c -t i o n s p e c u l i a r t o t h e s t r o m a l c e l l s t h a tp r o v i d e t a r g e t s f o r a t t a c k b y b e n z e n e a n di t s m e t a b o l i t e s . I t w o u l d b e h e l p f u l t or e v i e w a r a n g e o f p o t e n c i e s o f e a c h . T a b l e5 s h o w s t h e r e l a t i v e p o t e n c y w i t h w h i c hb e n z e n e a n d i t s m e t a b o l i t e s i n h i b i t e r y -t h r o p o i e s i s , a s m e a s u r e d b y t h e m e t h o d o fL e e e t a l . ( 4 3 ) u s i n g t h e [ 5 9 F e ] u p t a k et e c h n i q u e . T h e n u m b e r s a r e n o t a b s o l u t ev a l u e s b u t a r e r o u n d e d o f f t o d e m o n s t r a t et h e r a n g e o f d o s e s a t w h i c h s i g n i f i c a n t

d e p r e s s i o n s i n r e d c e l l p r o d u c t i o n w e r eo b s e r v e d . T h e d a t a d e m o n s t r a t e t h a t w h e na d m i n i s t e r e d t o m i c e i n a d e f i n e d d o s i n gr e g i m e n , b e n z e n e i s t h e l e a s t p o t e n t m e m b e ro f t h e s e r i e s a n d t h e c o m b i n a t i o n o f h y d r o -q u i n o n e p l u s m u c o n a l d e h y d e p r o v i d e s t h eg r e a t e s t p o t e n c y . T h e d o s e s o f e a c h c h e m i -c a l u s e d i n t h e l a t t e r c a s e w e r e t o o l o w f o re i t h e r m u c o n a l d e h y d e o r h y d r o q u i n o n e t op r o d u c e b o n e m a r r o w d e p r e s s i o n g i v e ni n d e p e n d e n t l y , b u t t h e y w e r e h i g h l y e f f e c -t i v e w h e n g i v e n i n c o m b i n a t i o n . M a n y o ft h e o t h e r b e n z e n e m e t a b o l i t e s w e r e e f f e c t i v ea t d e c r e a s i n g i r o n u p t a k e , a l b e i t w i t h d i f -f e r e n t p o t e n c i e s , e x c e p t f o r p h e n o l , w h i c hw a s c l e a r l y i n e f f e c t i v e . 1 , 2 , 4 - B e n z e n e t r i o lw a s i n e f f e c t i v e i n p r e l i m i n a r y s t u d i e s , b u tf u r t h e r w o r k i s n e e d e d t o e s t a b l i s h t h es i g n i f i c a n c e o f t h e s e o b s e r v a t i o n s , s i n c e ad e c r e a s e i n l y m p h o c y t e s h a s b e e n o b s e r v e di n t h e b o n e m a r r o w o f a n i m a l s t r e a t e d w i t h1 , 2 , 4 - b e n z e n e t r i o l (CC H e d l i a n d RS n y d e r , u n p u b l i s h e d o b s e r v a t i o n s ) . I n a d d i -t i o n , t h e r e c e n t d e m o n s t r a t i o n o f 1 , 2 , 4 -b e n z e n e t r i o l a s a m i c r o s o m a l m e t a b o l i t e o fb e n z e n e i n i s o l a t e d m o u s e b u t n o t r a t h e p a -t o c y t e s ( 4 4 ) s u g g e s t s t h a t t h e p r o d u c t i o n o f

T a b l e 5 . R e l a t i v e p o t e n c i e s o f b e n z e n e a n d b e n z e n em e t a b o l i t e s i n s h o r t - t e r m t e s t s o f e r y t h r o p o i e s i s . aD o s e , m g / k gC o m p o u n d ( 3 d o s e s , 2 d a y s )

B e n z e n e 1 0 0 0P h e n o lH y d r o q u i n o n e s u l f a t e 3 0 0H y d r o q u i n o n e 1 0 0C a t e c h o l 1 0 06 - O H - t , t - 2 , 4 - h e x a d i e n a l ( C H O - M - O H ) 2 0H y d r o q u i n o n e + p h e n o l 1 0C a t e c h o l + p h e n o l 1 01 , 2 , 3 - B e n z e n e t r i o lp - B e n z o q u i n o n e 1M u c o n a l d e h y d e 1M u c o n a l d e h y d e + h y d r o q u i n o n e 0 . 0 5 - 0 . 0 1 ( e s t ) ba M e a s u r e d u s i n g t h e 1 5 9 F e ] u p ta k e a ss ay ( 4 3 ) .b E s t i m a t e d v a l u e .t h i s m e t a b o l i t e m i g h t c o r r e l a t e w i t h s u s c e p -t i b i l i t y t o t o x i c i t y . F u r t h e r e x p e r i m e n t s a r ei n p r o g r e s s t o d e t e r m i n e t h e e f f e c t o f 1 , 2 , 4 -b e n z e n e t r i o l t r e a t m e n t o n c i r c u l a t i n g b l o o dc e l l s a n d o t h e r h e m a t o p o i e t i c t i s s u e .Summary a n d C o n c l u s i o n sB e n z e n e t o x i c i t y , w h i c h i n v o l v e s b o t h b o n em a r r o w d e p r e s s i o n a n d l e u k e m o g e n e s i s ,a p p e a r s t o r e q u i r e m e t a b o l i t e s o f b e n z e n et h a t i m p i n g e o n s e v e r a l c e l l t y p e s a n d o n av a r i e t y o f f u n c t i o n s . We m u s t c o n t i n u e t os t u d y t h e m e t a b o l i s m o f b e n z e n e w i t h t h ei n t e n t o f u n d e r s t a n d i n g w h ic h b on e m a r -r o w c e l l s m e t a b o l i z e b e n z e n e a n d i t sm e t a b o l i t e s , i d e n t i f y i n g t h e s p e c i f i c a r r a yo f m e t a b o l i t e s r e s p o n s i b l e f o r t h e d i s e a s ep r o c e s s e s , a n d u l t i m a t e l y u n d e r s t a n d i n gt h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e e v e n t s i n b o n em a r r o w t o x i c i t y a n d t h e g e n e r a t i o n o fs p e c i f i c m e t a b o l i t e s .

REFERENCES1 . P a r k e DV, W i l l i a m s R T . S t u d i e s i n d e t o x i c a t i o n 4 9 . T h em e t a b o l i s m o f b e n z e n e c o n t a i n i n g ( 1 4 C ) b e n z e n e . B i o c h e m J5 4 : 2 3 1 - 2 3 8 ( 1 9 5 3 ) .2 . S n y d e r R , K o c s i s J J . C u r r e n t c o n c e p t s o f c h r o n i c b e n z e n e t o x i -c i t y . C r i t R e v T o x i c o l 3 : 2 6 5 - 2 8 8 ( 1 9 7 5 ) .3 . S n y d e r R , W i t z G , G o l d s t e i n B D . T h e t o x i c o l o g y o f b e n z e n e .E n v ir o n H e a lt h P e r s p e c t 1 0 0 : 2 9 3 - 3 0 6 ( 1 9 9 3 ) .4 . S a m m e t t D , L e e EW, K o c s i s J J , S n y d e r R . P a r t i a l h e p a t e c t o m yr e d u c e s b o t h m e t a b o l i s m a n d t o x i c i t y o f b e n z e n e . J T o x i c o lE n v i r o n H e a l t h 5 : 7 8 5 - 7 9 2 ( 1 9 7 9 ) .5 . A n d r e w s L S , L e e EW, W i t m e r CM, K o c s i s J J , S n y d e r R .E f f e c t s o f t o l u e n e o n t h e m e t a b o l i s m , d i s p o s i t i o n , a n d h e m o -p o i e t i c t o x i c i t y o f 3H b e n z e n e . B i o c h e m P h a r m a c o l2 6 : 2 9 3 - 3 0 0 ( 1 9 7 7 ) .6 . A n d r e w s L S , S a s a m e H A , G i l l e t e J R . 3 H B e n z e n e m e t a b o l i s mi n r a b b i t b o n e m a r r o w . L i f e S c i 2 5 : 5 6 7 - 5 7 2 ( 1 9 7 9 ) .7 . I r o n s R , D e n t J , B a k e r T , R i c k e r t D . B en ze ne i s m e t a b o l i z e da n d c o v a l e n t l y b o u n d i n b o n e m a r r o w i n s i t u . Chem B i o lI n t e r a c t 3 0 : 2 4 1 - 2 4 5 ( 1 9 8 0 ) .

8 . P o s t G , S ny de r R , K a l f G F . M e t a b o l i s m o f b e n ze n e a n d p h e n o li n m a c r o p h a g e s i n v i t r o a n d i n h i b i t i o n o f RNA s y n t h e s i s b yb e n z e n e m e t a b o l i t e s . C e l l B i o l T o x i c o l 2 : 2 3 1 - 2 4 6 ( 1 9 8 6 ) .9 . S c h l o s s e r M J , K a l f G F . M e t a b o l i c a c t i v a t i o n o f h y d r o q u i n o n eb y m a c r o p h a g e p e r o x i d a s e . Chem B i o l I n t e r a c 7 2 : 1 9 1 - 2 0 7( 1 9 8 9 ) .1 0 . S u b r a h m a n y a m V V , D o a n e - S e t z e r P , S t e i n m e t z K L , R o s s D ,S m i t h MT. P h e n o l - i n d u c e d s t i m u l a t i o n o f h y d r o q u i n o n e b i o a c -t i v a t i o n i n m o u s e b o n e m a r r o w i n v i v o : p o s s i b l e i m p l i c a t i o n s i nb e n z e n e m y e l o t o x i c i t y . T o x i c o l o g y 6 2 : 1 0 7 - 1 1 6 ( 1 9 9 0 ) .1 1 . S u b r a h m a n y a m V V , K o l a n c h a n a P , S m i t h MT . H y d r o x y l a t i o no f p h e n o l t o h y d r o q u i n o n e c a t a l y z e d b y a h u m a n m y e l o p e r o x i -d a s e - s u p e r o x i d e c o m p l e x : p o s s i b l e i m p l i c a t i o n s i n b e n z e n em y e l o t o x i c i t y . F r e e R a d i c R e s Comm 1 5 : 2 8 5 - 2 9 6 ( 1 9 9 1 ) .1 2 . W i t z G , Z h a n g Z , G o l d s t e i n B D . R e a c t i v e r i n g - o p e n e d a l d e -h y d e m e t a b o l i t e s i n b e n e z e h e m a t o t o x i c i t y . E n v i r o n H e a l t hP e r s p e c t 1 0 4 ( S u p p l 6 ) : 1 1 9 5 - 1 1 9 9 ( 1 9 9 6 ) .1 3 . I n o u e 0 , S e i j i K , N a k a t s u k a H , W a t a n a b e T , Y in S - N, L i G - L ,C a i S - X , J i n C , I k e d a M . E x c r e t i o n o f 1 , 2 , 4 - b e n z e n e t r i o l i n t h e

1 1 1 7 0 E n v i r o n m e n t a l H e a l t h P e r s p e c t i v e s * V o l 1 0 4 , S u p p l e m e n t 6 * December 1 9 9 6

8/2/2019 Benzene Metabolism

7/7

AN OVERVIEW OF BENZENE METABOLISM

u r i n e o f w o r k e r s e x p o s e d t o b e n z e n e . B r J I n d Med4 6 : 5 5 9 - 5 6 5 ( 1 9 8 9 ) .1 4 . S a b o u r i n P J , B e c h t o l d WE, B i r n b a u m L S , L u c i e r G ,H e n d e r s o n R F . D i f f e r e n c e s i n t h e m e t a b o l i s m a n d d i s p o s i t i o no f i n h a l e d [ 3 H ] b e n z e n e b y F 3 4 4 / N r a t s a n d B 6 C 3 F j m i c e .T o x i c o l A p p l P h a r m a c o l 9 4 : 1 2 8 - 1 4 0 ( 1 9 8 8 ) .1 5 . S a b o u r i n P J , B e c h t o l d WE, H e n d e r s o n R F . A h i g h p r e s s u r el i q u i d c h r o m a t o g r a p h i c m e t h o d f o r t h e s e p a r a t i o n a n d q u a n t i -t a t i o n o f w a t e r - s o l u b l e r a d i o l a b e l e d b e n z e n e m e t a b o l i t e s . A n a lB i oc h e m 1 7 0: 3 1 6- 3 2 7 ( 1 9 8 8 ) .1 6 . N e r l a n d D E , P i e r c e WM. I d e n t i f i c a t i o n o f N - a c e t y l - S - ( 2 , 5 -d i h y d r o x y p h e n y l ) - l - c y s t e i n e a s a u r i n a r y m e t a b o l i t e o f b e n z e n e ,p h e n o l a n d h y d r o q u i n o n e . D r u g M e t a b D i s p o s 1 8 ( 6 ) : 9 5 8 - 9 6 1( 1 9 9 0 ) .1 7 . Drummond J C , F i n a r I L . M u c o n i c a c i d a s a m e t a b o l i c p r o d u c to f b e n z e n e . B i o c h e m i s t r y 3 2 : 7 9 - 8 4 ( 1 9 3 8 ) .1 8 . K l i n e S A , R o b e r t s o n J F , G r o t z V L , G o l d s t e i n B D , W i t z G .I d e n t i f i c a t i o n o f 6 - h y d r o x y - t r a n s , t r a n s - 2 , 4 - h e x a d i e n o i c a c i d , an o v e l r i n g - o p e n e d u r i n a r y m e t a b o l i t e o f b e n z e n e . E n v i r o nH e a l t h P e r s p e c t 1 0 1 : 3 1 0 - 3 1 2 ( 1 9 9 3 ) .1 9 . M u l l e r G , K o e l b l M , H e g a r M , N o r p o t h K . U r i n a r y S - p h e n y lm e r c a p t u r i c a c i d a n d p h e n y l g u a n i n e a s i n d i c a t o r s o f b e n z e n ee x p o s u r e . I n : B i o l o g i c a l M o n i t o r i n g o f E x p o s u r e t o C h e m i c a l s ,O r g a n i c C o m p o u n d s ( H o MH, D i l l i o n H K , e d s ) , New Y o r k :J o h n W i l ey & S o n s , 1 9 8 7 ; 9 1 - 9 8 .

2 0 . N o r p o t h K , S t u c k e r W, K r e w e t E , M u l l e r G . B i o m o n i t o r i n g o fb e n z e n e e x p o s u r e b y t r a c e a n a l y s i s o f p h e n y l g u a n i n e . I n t A r c hO c c u p E n v i r o n H e a l t h 6 0 : 1 6 3 - 1 6 8 ( 1 9 8 8 ) .2 1 . S n y d e r R , C h e p i g a T , Y a n g C S , T h o m a s H , P l a t t K , O e s c h F .B e n z e n e m e t a b o [ i s m b y r e c o n s t i t u t e d c y t o c h r o m e s P 4 5 0 2 B 1a n d 2 E 1 a n d i t s m o d u l a t i o n b y c y to c h ro m e b 5 , m i c r o s o m a le p o x i d e h y d r o l a s e , a n d g l u t a t h i o n e t r a n s f e r a s e s : e v i d e n c e f o r a ni m p o r t a n t r o l e o f m i c r o s o m a l e p o x i d e h y d r o l a s e i n t h e f o r m a t i o no f h y d r o q u i n o n e . T o x i c o l A p p l P h a r ma c ol 1 2 2 : 1 72 - 1 8 1 ( 1 9 9 3 ) .2 2 . I r o n s R D , N e p t u n D A . E f f e c t s o f p r i n c i p l e h y d r o x y - m e t a b o -l i t e s o f b e n z e n e o n m i c r o t u b u l e p o l y m e r i z a t i o n . A r c h T o x i c o l4 5 : 2 9 7 - 3 0 5 ( 1 9 8 0 ) .2 3 . P f e i f f e r RW, I r o n s R D . A l t e r a t i o n o f l y m p h o c y t e f u n c t i o n b yq u i n o n e s t h r o u g h s u l f h y d r y l - d e p e n d e n t d i s r u p t i o n o f m i c r o -t u b u l e a s s e m b l y . I n t J I m m u n o p h a r m a c o l 5 : 4 6 3 - 4 7 0 ( 1 9 8 3 ) .2 4 . S n y d e r R , K a l f G F . A p e r s p e c t i v e o n b e n z e n e l e u k e m o g e n e s i s .C r i t R e v T o x i c o l 2 4 ( 3 ) : 1 7 7 - 2 0 9 ( 1 9 9 4 ) .2 5 . S n y d e r R , L e e EW, K o c s i s J J . B i n d i n g o f l a b e l e d b e n z e n em e t a b o l i t e s i n m o u s e l i v e r a nd b on e m a r r o w . R e s CommunChem P a t h o l P h a r m a c o l 2 0 : 1 9 1 - 1 9 4 ( 1 9 7 8 ) .2 6 . L u t z WK, S c h l a t t e r C H . M e c h a n i s m o f t h e c a r c i n o g e n i c a c t i o no f b e n z e n e : i r r e v e r s i b l e b i n d i n g t o r a t l i v e r DNA. Chem B i o lI n t e r a c t 1 8 : 2 4 1 - 2 4 5 ( 1 9 7 9 ) .2 7 . L o n g a c r e S , K o c s i s J J , S n y d e r R . I n f l u e n c e o f s t r a i n d i f f e r e n c e si n m i c e i n t h e m e t a b o l i s m a n d t o x i c i t y o f b e n z e n e . T o x i c o lA p p l P h a r m a c o l 6 0 : 3 9 8 - 4 0 9 ( 1 9 8 1 ) .2 8 . R u s h m o r e T , K a l f G , S n y d e r R . C o v a l e n t b i n d i n g o f b e n z e n ea n d i t s m e t a b o l i t e s t o DNA i n r a b b i t b o n e m a r r o w m i t o c h o n -d r i a i n v i t r o . Chem B i o l I n t e r a c t 4 9 : 1 3 3 - 1 5 4 ( 1 9 8 4 ) .2 9 . J o w a L , W i t z G , S n y d e r R , W i n k l e S , K a l f G F . S y n t h e s i s a n dc h a r a c t e r i z a t i o n o f d e o x y g u a n o s i n e - b e n z o q u i n o n e a d d u c t s .J A p p l T o x i c o l 1 0 : 4 7 - 5 4 ( 1 9 9 0 ) .3 0 . P o n g r a c z K , K a u r S , B u r l i n g a u m e A L , B o d e l l W J . D e t e c t i o n o f3 ' - h y d r o x y - 3 , N 4 - b e n z e t h e n o d e o x y c y t i d i n e 3 ' - p h o s p h a t e b y

3 2 P - p o s t l a b e l i n g o f DNA r e a c t e d w i t h p - b e n z o q u i n o n e .C a r c i n o g e n e s i s 1 1 : 1 4 6 9 - 1 4 7 2 ( 1 9 9 0 ) .3 1 . P o n g r a c z K , B o d e l l W J . D e t e c t i o n o f 3 ' - h y d r o x y - 1 , N 6 - b e n -z e t h e n o 2 ' - d e o x y a d e n o s i n e 3 ' - p h o s p h a t e b y 2 P - p o s t l a b e l i n g o fDNA r e a c t e d w i t h p - b e n z o q u i n o n e . Chem R e s T o x i c o l 4 : 1 9 9 -2 0 2 ( 1 9 9 1 ) .3 2 . L e v a y G , P o n g r a z K , B o d e l l W J . D e t e c t i o n o f DNA a d d u c t s i nH L - 6 0 c e l l s t r e a t e d w i t h h y d r o q u i n o n e a n d p - b e n z o q u i n o n e b y3 2 P - p o s t l a b e l i n g . C a r c i n o g e n e s i s 1 2 : 1 1 8 1 - 1 1 8 6 ( 1 9 9 1 ) .3 3 . A r f e l l i n i G , G r i l l i S , C o l a c i A , M a z z u l l o M , P a r o d i G . I n v i v o

a n d i n v i t r o b i n d i n g o f b e n z e n e t o n u c l e i c a c i d s a n d p r o t e i n s o fv a r i o u s r a t a n d m o u s e o r g a n s . C a n c e r L e t t 2 8 : 1 5 9 - 1 6 8 ( 1 9 8 5 ) .3 4 . M a z z u l l o M , B a r t o l i S , B o n o r a B , C o l a c c i A , G r i l l i S , L a t t a n z iG , N ie ro A , T u r i n a M P . B e n z e n e a d d u c t s w i t h r a t n u c l e i c a c i d sa n d p r o t e i n s : d o s e - r e s p o n s e r e l a t i o n s h i p a f t e r t r e a t m e n t i n v i v o .E n v ir o n H e a lt h P e r s p e c t 8 2 : 2 5 9 - 2 6 6 ( 1 9 8 9 ) .3 5 . C o l l i n s S J . T h e H L - 6 0 p r o m y e l o c y t i c l e u k e m i a c e l l l i n e : p r o l i f -e r a t i o n , d i f f e r e n t i a t i o n a n d c e l l u l a r o n c o g e n e e x p r e s s i o n .B l o o d 7 0 : 1 2 3 3 - 1 2 4 4 ( 1 9 8 7 ) .3 6 . L e v a y G , B o d e l l W J . P o t e n t i a t i o n o f DNA a d d u c t f o r m a t i o n i nH L - 6 0 c e l l s b y c o m b i n a t i o n s o f b e n z e n e m e t a b o l i t e s . P r o c N a t lA c a d S c i USA 8 9 : 7 1 0 5 - 7 1 0 9 ( 1 9 9 2 ) .3 7 . L e v a y G , R o s s D , B o d e l l W J . P e r o x i d a s e a c t i v a t i o n o f h y d r o -q u i n o n e r e s u l t s i n t h e f o rm at i on o f DNA a d d u c t s i n H L - 6 0c e l l s , m o u s e b o n e m a r r o w m a c r o p h a g e s a n d h u m a n b o n e m a r -r o w . C a r c i n o g e n e s i s 1 4 : 2 3 2 9 - 2 3 3 4 ( 1 9 9 3 ) .3 8 . H e d l i C C , R a o N R , R e u h l K R , W i t m e r CM, S n y d e r R . E f f e c t so f b e n z e n e m e t a b o l i t e t r e a t m e n t o n DNA a d d u c t f o r m a t i o na n d g r a n u l o c y t i c d i f f e r e n t i a t i o n i n H L - 6 0 c e l l s . A r c h T o x i c o l7 0 : 1 3 5 - 1 4 5 ( 1 9 9 6 ) .3 9 . W i l l i a m s R J P . An i n t r o d u c t i o n t o t h e b i o l o g i c a l c h e m i s t r y o fo x y g e n . I n : T h e B i o l o g y a n d C h e m i s t r y o f O x y g e n ( B a n i s t e rJ V , B a n n i s t e r W I H , e d s ) . New Y o r k : E l s e v i e r , 1 9 8 4 .4 0 . B o e r s m a GM, B a l v e r s WG, B o e r e n S , V e r v o o r t J , R i e t j e n sIMCM. NADPH-cytochrome r e d u c t a s e c a t a l y z e d r e d o xc y c l i n g o f 1 , 4 - b e n z o q u i n o n e ; h a m p e r e d a t p h y s i o l o g i c a l c o n d i -t i o n s , i n i t i a t e d a t i n c r e a s e d pH v a l u e s . B i o c h e m P h a r m a c o l4 7 : 1 9 9 4 - 1 9 5 5 ( 1 9 9 4 ) .4 1 . B r u n m a r k A , C a d e n a s E . R e d u c t i v e a d d i t i o n o f g l u t a t h i o n e t op - b e n z o q u i n o n e , 2 - h y d r o x y - p - b e n z o q u i n o n e , a n d p - b e n z o -q u i n o n e e p o x i d e s . E f f e c t o f h y d r o x y - a n d g l u t a t h i o n y l s u b -s t i t u e n t s o n p - b e n z o q u i n o n e a u t o o x i d a t i o n . Chem B i o lI n t e r a c t 8 6 : 2 7 3 - 2 9 8 ( 1 9 8 8 ) .4 2 . R a o N R , S n y d e r R . O x i d a t i v e m o d i f i c a t i o n s p r o d u c e d i n H L -6 0 c e l l s o n e x p o s u r e t o b e n z e n e m e t a b o l i t e s . J A p p l T o x i c o l1 5 : 4 0 3 - 4 0 9 ( 1 9 9 5 )4 3 . L e e EW, K o c s i s J J , S n y d e r R . T h e u s e o f f e r r o k i n e t i c s i n t h es t u d y o f e x p e r i m e n t a l a n e m i a . E n v i r o n H e a l t h P e r s p e c t3 9 : 2 9 - 3 7 ( 1 9 8 1 ) .4 4 . O r z e c h o w s k i A , S c h w a r z L R , S c h w e g l e r U , B o c k KW, S n y d e rR , S c h r e n k D . B en ze ne m e t a b o l i s m i n r o d e n t h e p a t o c y t e s : r o l eo f s u l p h a t e c o n j u g a t i o n . X e n o b i o t i c a 2 5 ( 1 0 ) : 1 0 9 3 - 1 1 0 2( 1 9 9 5 ) .4 5 . R e i d TM, L o e b A L . M u t a g e n i c s p e c i f i c i t y o f o x y g e n r a d i c a l sp r o d u c e d b y h u m a n l e u k e m i a c e l l s . C a n c e r R e s 5 2 : 1 0 8 2 - 1 0 8 6( 1 9 9 2 ) .4 6 . G r e e n L C , W a g ne r D A , G l o g o w s k i J , S k i p p e r P L , W i s h n o k J S ,T a n n e n b a u m S R . A n a l y s i s o f n i t r a t e , n i t r i t e a n d ( 1 5 N ) n i t r a t ei n b i o l o g i c a l f l u i d s . A n a l B i o c h e m 1 2 6 : 1 3 1 - 1 3 8 ( 1 9 8 2 ) .4 7 . B a s s D A , P a r c e J W , D e c h a t l e t L R , S z e j d a P , S e e d s MC,T h o m a s M . F l o w c y t o m e t r i c s t u d i e s o f o x i d a t i v e p r o d u c t f o r -m a t i o n b y n e u t r o p h i l l s : a g r a d e d r e s p o n s e t o m e m b r a n e s t i m u -l a t i o n . J I m m u n o l 1 3 0 : 1 9 1 0 - 1 9 1 7 ( 1 9 8 3 ) .4 8 . H i m m e l h o c h HR, E v a n s WH , Mage MG, P e t e r s o n E A .P u r i f i c a t i o n o f m y e l o p e r o x i d a s e f r o m t h e b o n e m a r r o w o f t h eg u i n e a p i g . B i o c h e m i s t r y 8 : 9 1 9 4 - 9 1 9 7 ( 1 9 6 9 ) .4 9 . A eb i H . C a t a l a s e i n v i t r o . M e t h o d s E n z y m o l 1 0 5 : 1 2 1 - 1 2 6( 1 9 8 4 ) .5 0 . M a r k l u n d S , M a r k l u n d G . I n v o l v e m e n t o f s u p e r o x i d e a n i o nr a d i c a l i n t h e a u t o o x i d a t i o n o f p y r o g a l l o l a n d a c o n v e n i e n ta s s a y f o r s u p e r o x i d e d i s m u t a s e . E u r J B i o c h e m 4 7 : 4 6 9 - 4 7 4( 1 9 7 4 ) .5 1 . A t t w o o d K C , R o l e y E E , R o s s J , B r a d l e y F , Kramer J J .D e t e r m i n a t i o n o f p l a t e l e t a n d l e u k o c y t e v i t a m i n C a n d t h e l e v -e l s f o u n d i n n o r m a l s u b j e c t s . C l i n Chim A c t a 5 4 : 9 5 - 1 0 5( 1 9 7 4 ) .5 2 . B e u t l e r E , Duron D , K e l l y BM. I m p r o v e d m e t h o d f o r t h ed e t e r m i n a t i o n o f b l o o d g l u t a t h i o n e . J L a b C l i n Med6 1 : 8 8 2 - 8 8 6 ( 1 9 6 3 ) .

E n v i r o n m e n t a l H e a l t h P e r s p e c t i v e s - V o l 1 0 4 , S u p p l e m e n t 6 * December 1 9 9 6 1 1 7 1