Biotecnologie in Ortopedia e Traumatologia : dalle attuali evidenze

cliniche alle nuove frontiere

Basi biologiche dell’uso delle MSCs

Dr Eugenio Boux Dr Alberto SiclariP.O. Di Biella ASLBI

Mesenchymal stem cell MSC

CELLULE STAMINALICELLULE STAMINALI

• Indifferenziate• Capaci di autorigenerarsi ( self-

renewal)• Capaci di differenziarsi in tipi

cellulari specifici• Capaci di ripopolare un dato

tessuto in vivo

EMBRIONALI ADULTE

CELLULE STAMINALI

• TOTIPOTENTI: capaci di dar luogo a tipi cellulari embrionali e non.

• PLURIPOTENTI: capaci di dar luogo a tutti i tipi cellulari derivati dai tre foglietti embrionali (cellule isolate da un embrione a sei settimane, cellule isolate da feto a termine, da placenta, da sangue cordonale e da tessuti adulti).

• MULTIPOTENTI: capaci di dar luogo a cellule appartenenti a diversi lineages (cellule staminali dei tessuti adulti, hematopoietic stem cells).

• OLIGOPOTENTI: capaci di dar luogo a un ristretto subset di lineage cellulari (neural stem cells, hair bulge stem cells).

• UNIPOTENTI: capaci di differenziarsi in un unico tipo cellulare (spermatogonial stem cells).

CELLULE STAMINALI ADULTECELLULE STAMINALI ADULTE

Cellule NON DIFFERENZIATE di organi o

tessuti adulti, capaci di AUTORIGENERARSI e di DIFFERENZIARSI nei tipi cellulari

del tessuto o organo preso in

considerazione

Le cellule mesenchimali staminali

• Sono conosciute anche come:

• colony forming fibroblastic cells

• stromal fibroblasts• marrow stromal stem cells• mesenchymal progenitor

cells

• Le cellule mesenchimali sono cellule non-emopoietiche stromali che hanno la capacità di differenziarsi in diverse linee

.• Condroblasti• Osteoblasti • Adipociti • Cellule neurali • Miociti

• E’ possibile guidare le MSCs in uno specifico tipo anche in laboratorio usando adatti fattori di crescita o specifiche sostanze

• ( ad esempio il blu di toluidina le differenzia in condroblasti )

MF Pittinger et al.Multilineage potential of adult human MSCs Science 1999; 284 :143-7

Dennis J.E. Origin and differentiation of human and murine stroma. (2002) Stem Cells; 20:205-214

CARATTERIZZAZIONE CARATTERIZZAZIONE IMMUNOFENOTIPICA DELLE MSCIMMUNOFENOTIPICA DELLE MSC

Nome marcatore Tipo cellulare Funzione

CD45 Leucociti Non espresso sulle MSC.Proteina di superficie dei progenitori dei leucociti.

Glicoforina Eritrociti Non espresso sulle MSC.

CD14 Monociti e macrofagi Non espresso sulle MSC.Recettore del lipopolisaccaride

CD50 Cellule staminali ematopoietiche (HSC)

Non espresso sulle MSC.ICAM 3

CD34 HSC, cellule satelliti, progenitori endoteliali

Non espresso sulle MSC.Sialomucina

CD44 Cellule mesenchimali Molecola di adesione e recettore dell’acido ialuronico e dell’osteopontina

ScaI HSC, MSC Stem cell antigen

CD29 MSC VLA-β chain

Sono cellule mobili?

Le MSCs hanno la capacità di muoversi e rispondono alla chemiotassi .

WR Otto Tomorrow’s skeleton staff MSC and the repair of bone and cartilage Cell Prolif 2004 ; 37: 97-110

Dopo le microfratture si ritrovano nell’articolazione

J. Kramer et al. “In vivo matrix-guided human mesenchymal stem cells” Cellular and molecular life sciences 2006,vol 63 n°5 pp. 616-626

Le funzioni delle MSCs

• Supportare l’ematopoiesi• Attrarre le HSC (hematopoietic

stem cells) circolanti nel midollo (homing)

• Immunosoppressione• Riserva di cellule • Produzione di sostanze bioattive

( magazzino!)

supportare l’ematopoiesisupportare l’ematopoiesi

Le MSC supportano l’ematopoiesiattraverso interazioni cellula- cellula.

attrarre le HSC nel midollo attrarre le HSC nel midollo (homing)(homing)

effetto effetto immunosoppressivoimmunosoppressivo

Le MSC hanno un ruolo importante nella

maturazione dei linfociti T, B e NK e delle cellule dendritiche.

Riserva di cellule

• Costituiscono una popolazione residente nel midollo osseo capace di differenziare in cellule del tessuto adiposo, del tessuto cartilagineo, del tessuto osseo e nello stroma che supporta l’ematopoiesi.

Differenziamento Differenziamento osteogenicoosteogenico

Acido ascorbicoDesametasoneΒ Glicerofosfato

MSCsOsteoblasti

Differenziamento Differenziamento condrogenicocondrogenico

Acido ascorbicoInsulinahTGFβ1Poli- lisina

MSCsCondrociti

Sostenze bio-attive

• Sostanze anti-apoptosi / citoprotettive

• Antifibrotiche• Angiogenetiche

• Mitotiche• ?????

Dove sono le MSCs ?

• Tessuto adiposo Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, Huang J, Futrell JW, Katz AJ, Benhaim P, Lorenz HP, Hedrick MH: Multilineage

cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng 2001, 7:211-228. • Periostio• De Bari C, Dell'Accio F, Luyten FP: Human periosteum-derived cells maintain phenotypic

stability and chondrogenic potential throughout expansion regardless of donor age. Arthritis Rheum 2001, 44:85-95.

• Membrana sinoviale • De Bari C, Dell'Accio F, Tylzanowski P, Luyten FP: Multipotent mesenchymal stem cells

from adult human synovial membrane. Arthritis Rheum 2001, 44:1928-1942. • Muscoli• Bosch P, Musgrave DS, Lee JY, Cummins J, Shuler T, Ghivizzani TC, Evans T, Robbins TD,

Huard J: Osteoprogenitor cells within skeletal muscle. J Orthop Res 2000, 18:933-944. ,• Derma • Young HE, Steele TA, Bray RA, Hudson J, Floyd JA, Hawkins K, Thomas K, Austin T, Edwards C, Cuzzourt

J, Duenzl M, Lucas PA, Black AC: Human reserve pluripotent mesenchymal stem cells are present in the connective tissues of skeletal muscle and dermis derived from fetal, adult, and geriatric donors. Anat Rec 2001, 264:51-62.

• Midollo osseo • Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, Douglas R, Mosca JD, Moorman MA, Simonetti DW, Craig

S, Marshak DR: Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 1999, 284:143-147.

• Le prime evidenze validanti l’esistenza di una popolazione staminale mesenchimale nel midollo risalgono al 1970. Friedstein mise in coltura campioni di midollo osseo umano e dopo 4 ore allontanò le cellule non aderenti.

• Si erano formati piccoli foci di cellule aderenti composti da 3-4 cellule; queste cellule erano dormienti per circa 4 giorni e poi cominciavano a proliferare. Dopo alcuni passaggi in coltura queste cellule tendevano a diventare più omogenee e dalla forma affusolata.

MSC dal sangue periferico

• La possibilità di isolare MSC dal sangue periferico (PB-MSC) è ancora molto dibattuta.

• La frequenza delle MSCs nel sangue è molto bassa, tuttavia, sotto la stimolazione di citochine, ormoni e fattori di crescita, che vengono secreti nel sangue in diverse condizioni patologiche, il numero di queste cellule aumenta.

• • Non è chiaro la loro origine né la loro funzione

in vivo; è noto che le MSC possono ritornare dagli organi periferici al midollo ma non è chiaro se possano persistere nel sangue e costituire una popolazione staminale residente.

Aspirato midollare

• Il midollo osseo contiene tre tipi principali di cellule : endoteliali 0,1 %ematopoietiche 99,5% MSC 0,4%.

Concentrazione dell’aspirato midollare

• centrifugazione • filtrazione selettiva

• concentrare la componente cellulare e portare il volume a 6-10 cc con un numero di cellule fino a 9 volte superiore rispetto all’aspirato midollare

• ......ma da dove partiamo prima della concentrazione ?

Il numero delle cellule

• Il fattore piu’ importante !

• Quante sono le MSC presenti nel bacino del

nostro paziente?

Variabili

• 1) Variabilità individuale Evento valutabile solo a

posteriori dopo il prelievo• 2) Sede del prelievo in uno stesso

individuo Bacino

Variabili • 3) Traumi recenti nella sede del prelievo • “ consumo “ delle cellule 4) Malattie endocrine carenza estrogeni 5) Tabacco L’uso di tabacco influenza sicuramente la vitalità

delle cellule mesenchimali e quindi il rischio di ottenere meno cellule deve essere tenuto

presente . Non esistono al momento studi che mettano in rapporto il numero di sigarette fumate e il numero di MSCs

Variabili • 6) Farmaci che influiscono sulla fisiologia del midollo

osseo. Chemioterapici 7) Tumori in fase attiva In particolari per le neoplasie che elettivamente

metastatizzano alle ossa. E´ noto come le cellule stromali mesenchimali tumorali (TDMC) che crescono accanto e frammiste alle CT in molte neoplasie possano essere parzialmente responsabili del loro sviluppo. L´interazione reciproca tra CT e lo stroma mesenchimale circostante è stata dimostrata nei tumori primari e nelle loro sedi metastatiche ed in particolare nelle ossa. Le TDMC forniscono un ambiente ottimale per la proliferazione delle TC grazie al reciproco scambio di molecole solubili e della matrice extracellulare, anche coinvolgendo cellule endoteliali e cellule della risposta immune. Il rischio di reclutare TDMC controindica questa procedura

Variabili

• 8) Abuso di alcool• 9) Età e sesso • Sono le variabili piu’ studiate .• E’ stata analizzata la popolazione di

cellule mononucleate e dei progenitori degli osteoblasti presenti nel midollo osseo di individui di età differenti, suddivisi in maschi e femmine per studiare se il sesso e l’età possano influenzare la concentrazione cellulare.

Variabili

Numero delle MSC s

maschi : decresce da 38 106

(30 aa) a 25.5 106 cells/ ml ( 70 aa)

femmine : decresce da 56 106 (30 aa) a 19.5 106 cells/ml (70 aa).

Muschler GF, Nitto H, Boehm C, Easley K. Age- and gender-related changes in the cellularity of human bone marrow and the prevalence of osteoblastic progenitors. J Orthop Res. 2001 Jan;19(1):117-25

E la funzione varia?

La partita è finita ........ Grazie a tutti !!