8/16/2019 Curs Bioseparari4

1/35

Introducere HPLC

1. High pressure liquid cromatpgraph

1. High performance liquid chromatograph

8/16/2019 Curs Bioseparari4

2/35

Introducere  Avantajele utilizarii HPLC

1. timpul mai scurt de analiza

2. rezolutie

3. reproductibilitate

4. precizie

5. automatizare

8/16/2019 Curs Bioseparari4

3/35

Introducere Dezavantajele folosirii HPLC

1. pretul mult mai mare

2. complexitate

3. coelutie

8/16/2019 Curs Bioseparari4

4/35

Introducere

Separare pe o coloana cromatografica

8/16/2019 Curs Bioseparari4

5/35

Notiuni de baza in cromatografia de

lichide

 Volum mort

 Volumul de faza mobila necesar pentruumplerea coloanei cromatografice

8/16/2019 Curs Bioseparari4

6/35

 Volumul mort

2

cM   0.5Ld V 

 VM = volum mort

L = lungime coloana (cm)

dc = diametru coloana (cm)

8/16/2019 Curs Bioseparari4

7/35

 Volumul mort In cazul unei coloane de 250mmx4,6mm,

volumul mort va fi 2,645 mL

Importanta: spalarea coloanelor, echilibrareacoloanelor in cazul lucrului in gradient

8/16/2019 Curs Bioseparari4

8/35

Timpul mort

F

Vt

  M

o 

t0 = timp mort  VM= volum mort

F = debit

8/16/2019 Curs Bioseparari4

9/35

Timpul mort In cazul unei coloane cromatografice de

250mmx4,6mm, daca debitul este de 1

mL/min, timpul mort va fi de 2,645 min

Semnificatie: orice compus care elueaza intr-

un timp mai scurt de 2,645 min nu esteretinut de coloana

8/16/2019 Curs Bioseparari4

10/35

 

Timp/Volum

to 

 A

b

s

o

r 

b

a

n

t

a

 A 

C 

VM  VR  VR 

8/16/2019 Curs Bioseparari4

11/35

 Volum de retentie/timp de retentie  Volum de retentie/Timp de retentie

 Volumul de faza mobila care a trecut princoloana de la momentul injectarii pana la celal detectiei peak-ului (aparitia apexului)

 Volumul de retentie este asociat cu timpul deretentie

 VR = F tR 

8/16/2019 Curs Bioseparari4

12/35

Rezolutie

Scopul cromatografiei – separarea a cat mai multi

compusi dintr-un amestec

12

12S

ww

)t2(tR 

8/16/2019 Curs Bioseparari4

13/35

Rezolutie

8/16/2019 Curs Bioseparari4

14/35

Rezolutie

8/16/2019 Curs Bioseparari4

15/35

Retentie

K = factorul de retentie

 VM = volumul mort

 VR = volumul de retentie t0 = timpul mort

tR = timpul de retentie

o

oR 

M

MR 

t

tt

V

VVk 

 

8/16/2019 Curs Bioseparari4

16/35

Selectivitate Capacitatea fazei stationare de a face

diferenta dintre componentele amestecului

K1 = factorul de retentie al celui mai slabretinut compus

K2 = factorul de retentie al celui mai bineretinut compus

1

2

k 

k  

8/16/2019 Curs Bioseparari4

17/35

Eficienta2

0.5

R 

2

R 

w

t5.54

w

t16= N

 

  

 

 

  

 

tR = timp de retentie

W = laltimea peak-ului la nivelul liniei de baza

W0.5 = latimea peak-ului la jumatate din inaltime

Este definita ca numar de platouri teoretice

8/16/2019 Curs Bioseparari4

18/35

Partile componente ale HPLC

1. POMPA 

2. INJECTOR: AUTOMAT/MANUAL 3. CUPTOR COLOANE

4. DETECTOR 

5. SOFTWARE

8/16/2019 Curs Bioseparari4

19/35

Partile componente ale HPLC

 Amestec la presiune joasa Amestec la presiune inalta

8/16/2019 Curs Bioseparari4

20/35

Conexiuni HPLC Tubulatura, imbinarile – dusmanul ascuns –

Necesar pentru conectarea moduleleor HPLC: pompa, injector coloana detector.

Separarea cromatografica are loc stric la nivelul coloanei.

Zone putin critice: pompa – injector.

Zone critice: injector-coloana.

Zona supra-critica: coloana detector.

 Volumul tubulaturii dintre coloana-detector (ECDV) conduce la scadereadramatica a eficientei unei coloane

Tubulatura ascunsa: Volumul mort al coloanei (CDV), acesta creste pe masura cecolana imbatraneste.

CDV se poate compensa prin sistemul de compresie adaptiva DYNAMAX.

8/16/2019 Curs Bioseparari4

21/35

Imbinari Functia de baza: canal pentru faza

mobila.

Imbinarile critice sunt in zonele: injector,coloana, detector.

O imbinare corecta este reprezentata in

diagrama A. Aici etansarea se face indoua etaje, un etaj intre “patul plat” aletansarii (stop) si tubul metalic si adouaintre garnitura conica (ferrula) si “patulconic” (seal). Aceasta etansare nuconduce la un volum mort suplimentar.

Din cauza dispersiei parametrilortehnologici ai prelucrarilor mecanice dupa

deformarea plastica a ferulei aceasteipiese nu I se va schimba destinatia.

Cazul B implica o disfunctionalitate

Cazul C induce un volum mort de 10-1000 ori volumul fizic al spatiuluiobservabil

8/16/2019 Curs Bioseparari4

22/35

Pompe HPLC Functia de baza: coordonarea fluxului fazei mobile.

 Aplicatiile cromatografice actuale necesita debite in intervalul 0.01-10mL/min sila presiuni de pana la 500atm.

Factorii de merit ai unei pompe:

 Acuratetea si reproductibilitatea debitului;

 Acuratetea si reproductibilitatea gradientului;

Timpul de schimbare efectiva al gradientului;

Lipsa pulsatiilor;

Compensarea dinamica a compresibilitatii solventilor;

Conservarea starii de agregare a solventilor si a impuritatilor dizolvate inacestea;

8/16/2019 Curs Bioseparari4

23/35

 Admisia probei in sistemul LC

8/16/2019 Curs Bioseparari4

24/35

Utilizarea Autosamplerelor Automatizarea admisiei de probe

Moduri diferite de injectie (partial loop

fiil…)

Conditionarea probei.

 Adaugarea de reactivi.

Stabilizarea factorilor de mediu.

Stabilizarea coloanei.

8/16/2019 Curs Bioseparari4

25/35

Secventa de injectie cu

autosampler

8/16/2019 Curs Bioseparari4

26/35

Secventa de injectie cu

autosampler

8/16/2019 Curs Bioseparari4

27/35

Detectori folositi in HPLC Detector UV-VIS/Diode array

Detector fluorescenta

Detector RI

Detector de conductivitate

Detector electrochimic Detector LSD/ELSD

Spectrometru de masa

8/16/2019 Curs Bioseparari4

28/35

Moduri de separare HPLC Separare in faza normala

Separare in faza inversata

Separare prin schimb de ioni

Separare dimensionala

8/16/2019 Curs Bioseparari4

29/35

Separarea in faza normala

Este caracterizata de folosirea de faze stationare polare si de faza mobilaslab polara sau nepolara

Faza stationara este uzual silicagelul. Gruparile polare sunt silanol, sau altegrupari functionale CN, -NH2

Moleculele polare sunt retinute mai mult sau mai putin in functie de tariainteractiunii lor cu gruparile polare din faza stationara.

Uzual compusii nepolari elueaza primii urmati de cei polari in ordineapolaritatii acestora.

8/16/2019 Curs Bioseparari4

30/35

Separarea in faza inversata Este caracterizata de folosirea de

faze stationare nepolare si fazamobila polara.

Cea mai des intalnita tehnica HPLC.

Majoritatea aplicatiilorutilizeza fazastationara tip C18 cu gruparioctadecyl (C18H37) legate lasuprafata. Exista si variante cu octylsau phenyl.

Substantele ionice se pot separa cuaceasta metoda prin adaugarea desubstante organice cu ioni depolaritate opusa cu analitul (ionpairing). Nota: aceste substante trebuie sa fie

volatile, ex: TFA, HFBA, TEA 

8/16/2019 Curs Bioseparari4

31/35

Separarea prin schimb de ioni Se utilizeza pentru separarea substantelor ionice

Faza stationara a coloanelor destinate acestei tehnici se obtine prin legarea desuportul mecanic (silcagel sau polimer poros) a unor centri ionici activi.

Centrii ionici cu exces de sarcina negativa –cation exchange –

Centrii ionici cu exces de sarcina pozitiva –anion exchange –

8/16/2019 Curs Bioseparari4

32/35

Separarea dimensionala Difera de celelalte tehnici de separare prin lipsa interactiilor de natura fizico-chimica.

Interactiunile utilizate sunt de natura mecanica.

Separarea se bazeaza pe porozitatea fazei stationare.

Moleculele mari care nu pot patrunde in pori sunt antrenate de faza mobila foarte usorsi elueaza primele.

Moleculele mici patrund in porozitati, si sunt antrenate lent de faza mobila.

Ordinea de elutie este de la molecule mari la mici

Faza mobila are o importanta secundara si se alege nu din punct de vedere al timpilorde retentie ci din punct de vedere al caracteristicilor de solubilitate sau alte propietatifizica chimice.

8/16/2019 Curs Bioseparari4

33/35

 Aplicatii Des utilizata in procesul

de pregatire al probei(extractie, curatare)

In exemplul alaturatacest tip de separare afost utilizat pentruextractia sarurilor dintr-

o proba ce urmeaza astabili continutul deproteine si peptide.

8/16/2019 Curs Bioseparari4

34/35

Gradientul fazei mobile Functie: Asigurarea unor conditii

bune de separare pentru toticompusii, mentinand timpul de lucrula valori uzuale. Focalizarea benzilor

de injectie. In exemplul din figura:

FM tip A: ST 1,2 nu suntrezolvate

FM tip B: ST 1,2 sunt rezolvate,ST3 are un timp de elutie foarte

mare FM trece de la A la B (gradient).

Toate ST sunt rezolvate

8/16/2019 Curs Bioseparari4

35/35

Coloana comatografica Realizeza secventa principala de separare.

Clasificare:

Preparative

Garda (precoloane)

 Analitice Clasice

Cu diametru redus (micro bore, capillary)

Dupa dimensiunile fizice

Dupa tipul umpluturii

Debitul optim este functie de diametrul coloanei (proportional cu D2 )

Deoarece solventul se elimina inainte de analiza in spectrometrul de masa coloanele de

diametru mic sunt preferate in fata celor clasice.

Deaorece imbinarile nu se pot scala in aceeasi proportie cu debitul eluentului coloanele cudiametru redus sunt puternic afectate de ECDV

Ingustarea picurilor cromatografice cu diametrul coloanei conduce la probleme in alegereaparametrilor spectrali si la folosirea unui detector secundar.