carrier screening, which involves identifying unaffected individuals who
carry one copy of a gene for a disease
preimplantation genetic diagnosis
prenatal diagnostic testing
newborn screening
presymptomatic testing for predicting adult-onset disorders such as
Huntington's disease
presymptomatic testing for estimating the risk of developing adult-onset
cancers and Alzheimer's disease
confirmational diagnosis of a symptomatic individual
forensic/identity testing
Identificare nuovi farmaci per la cure di specifiche malattie
Farmacogenomica
Terapia Genica
Terapia
Identificazione di mutazioni di
tumor suppressor genes
che predispongono all’insorgenza di
neoplasie
Prevenzione
Metodologie citogenetiche
Metodologie molecolari
In base al potere di risoluzione della
tecnica
• Formulare la domanda
• Utilizzare la metodica appropriata
Analisi Southern (DNA)
Analisi Northern (RNA)
Analisi Western (Proteine)
PCR (DNA)
RT-PCR (RNA)
Microarray (DNA – RNA – Proteine)
Metodologie molecolari
Estrazione DNA
• Cellule (sangue periferico – colture
cellulari)
• Tessuti (biopsie – prelievi autoptici)
• Una cellula umana diploide contiene circa 3,3x2 pg di DNA.
• 1 mL di sangue periferico umano contiene ÷6-7 x 106 globuli bianchi.
• Massimo recupero teorico di DNA: 40-50 g/mL di sangue.
• Quantità di DNA impiegata per il Southern blot: 5-10 g.
• Quantità di DNA impiegata per la PCR: 0.1 g.
Lisi della membrana plasmatica - della membrana nucleare
Purificazione della cromatina -denaturazione delle proteine
Estrazione DNA
Degradazione meccanicaUsare pipette e puntali a punta larga
Degradazione chimicaLavorare in ghiaccio
Usare i guanti
Estrazione DNA
Ottenere del DNA non degradato - di alto peso molecolare
Ottenere del DNA “puro” non contaminato da proteine o da RNA
Estrazione DNA
Controllo:
Lettura allo spettrofotometro
260 OD – quantificazione
Rapporto 260/280 – purezza
Rapporto ottimale
1,5 – 1,7
Estrazione DNA
Precipitazione e Risospensone
Precipitazione con 2.5 volumi di etanolo 75%
Risospensione in H2O o TE (Tris EDTA)
Estrazione RNA
• Cellule (sangue periferico – colture
cellulari)
• Tessuti (biopsie – prelievi autoptici)
Controllo:
Lettura allo spettrofotometro
260 OD – quantificazione
Rapporto 260/280 – purezza
Rapporto ottimale
1,8 – 2.0
Estrazione RNA
Sonde Molecolari
Sequenze nucleotidiche marcate a
singolo filamento in grado di
riconoscere sequenze
complementari
• Denaturazione di una molecola di acido
nucleico a doppia elica
• Rinaturazione o ibridazione di
polinucleotidi a filamento singolo in una
molecola a doppia elica
Marcatura
• Radioisotopi (32P, 3H, 35S)
• Fluorescenti (biotina-avidina)
• Chemiluminescenti (fosfatasi alcanica)
• Notevole quantità di DNA - RNA – Proteine (numero elevato di cellule da analizzare)
• Uso di sostanze radioattive
• Tempo impiegato
Limiti
Questa tecnica, utilizzando i principi della
duplicazione del DNA,
permette di ottenere in poco tempo
notevoli quantità di materiale specifico
ideata nel 1983 da Kary B. Mullis il quale ottenne, per questo, il
premio Nobel per la chimica (1993).
PCR - Polymerase Chain Reaction
CampioneDNA bersaglio
Oligonucleotidi sintetici complementari
a sequenze fiancheggianti il tratto di
DNA da studiare 20 – 25 bpPrimers
Nucleotidi trifosfati
DNA polimerasiEnzima
Denaturazione del DNA (94°C)
Ibridazione dei primers al bersaglio(40°C – 60°C)
Sintesi del DNA(72°C)
Termociclatori
• Si può evitare l’uso di tecniche più
laboriose. Velocità di esecuzione
• Si possono analizzare campioni di
poche cellule (anche 1 cellula). Elevata
sensibilità
Vantaggi