HAL Id: hal-00902556 https://hal.archives-ouvertes.fr/hal-00902556 Submitted on 1 Jan 1999 HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci- entific research documents, whether they are pub- lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers. L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d’enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés. Détection du virus de la septicémie hémorragique virale (SHV) de la truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) par une transcription inverse suivie d’une amplification en chaîne par polymérase. Validations diagnostiques Jean-Pierre Guillou, Ghislaine Merle, Sylvie Hénault, Anne-Marie Hattenberger To cite this version: Jean-Pierre Guillou, Ghislaine Merle, Sylvie Hénault, Anne-Marie Hattenberger. Détection du virus de la septicémie hémorragique virale (SHV) de la truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) par une transcription inverse suivie d’une amplification en chaîne par polymérase. Validations diagnostiques. Veterinary Research, BioMed Central, 1999, 30 (1), pp.49-60. hal-00902556
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HAL Id: hal-00902556https://hal.archives-ouvertes.fr/hal-00902556
Submitted on 1 Jan 1999
HAL is a multi-disciplinary open accessarchive for the deposit and dissemination of sci-entific research documents, whether they are pub-lished or not. The documents may come fromteaching and research institutions in France orabroad, or from public or private research centers.
L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, estdestinée au dépôt et à la diffusion de documentsscientifiques de niveau recherche, publiés ou non,émanant des établissements d’enseignement et derecherche français ou étrangers, des laboratoirespublics ou privés.
Détection du virus de la septicémie hémorragique virale(SHV) de la truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss)
par une transcription inverse suivie d’une amplificationen chaîne par polymérase. Validations diagnostiques
To cite this version:Jean-Pierre Guillou, Ghislaine Merle, Sylvie Hénault, Anne-Marie Hattenberger. Détection du virusde la septicémie hémorragique virale (SHV) de la truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) par unetranscription inverse suivie d’une amplification en chaîne par polymérase. Validations diagnostiques.Veterinary Research, BioMed Central, 1999, 30 (1), pp.49-60. �hal-00902556�
‘’ Unité des zoonoses bactériennes, Cneva Alfort, BP 67, 94703 Maisons-Alfort, Franceh Unité d’ichtyopathologie continentale, Cneva Alfort, BP 67, 94703 Maisons-Alfort, France
(Reçu le 20 août 1997 ; accepté le 22 octobre 1998)
Abstract - Detection of viral haemorrhagic septicaemia virus (VHSV) by reverse transcriptionpolymerase chain reaction: a step towards diagnostic validation. Viral haemorrhagic septicaemiavirus (VHSV) is a fish pathogen that attacks rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) farming. Theonly diagnostic method recognised by the European community for VHS is based on the detection ofthe viral agent in cell culture followed by an immunological identification of thc pathogen. Reversetranscription followed by a double amplification of the polymerase chain reaction (RT-PCR) for thegene encoding the viral glycoprotein G is proposed here as an alternative method to the virus assayin cell culture. The RT-PCR was found to have three advantages over the viral assay method. First.the RT-PCR was found to be more rapid than the virus assay method (24 h compared to 72-120 h).Second, this method was found to be more sensitive than the virus assay (2. 10-2 pfu of virus weredetected per inillilitre of viral suspension compared to 2.10-1 1 pfu.mL-1 by inoculation of the celllines EPC and RTG2). Third, the RT-PCR was shown to be specific towards the VHS virus assay (rep-resented by its four serotypes VHS 1, VHS 11, VHS 23/75 and VHS IV). Moreover no amplificationwas obtained with the other rhabdoviruses used: infectious haematopoictie necrosis virus (Americainstrain Amend 72, WRAC, RB, SRVC) and French reference strain 69/87, eel viruses, spring viracmiaof carp virus and pike fry virus. The validation of this method was perfonned on organs removed fromexperimentally infected rainbow trout and ovarian fluid samples from farmed broodfish from Djj toD150’ By using RT-PCR between D30 and Dt!!t, 13 samples from nine experimcntally infected trout (tenkidney-spleen pools and thrce brains) tested positive, whereas only nine samples (four kidney-spleenpools and five brains) from six fish were positive at D30* The last positive response was obtained byRT-PCR at D!tt for kidney-spleen pools from three fish. At D 150* all the results were negative. From
* Correspondance et tires-a-partT6]. : (33) 01 49 77 13 00 ; fax : (33) 01 43 68 97 62 ; e-mail : am.hattenberger C alfort. cneva. fr+Cet article est particulicrement dedie a J.P. Guillou d6c6d6 le 4 septemhre 1996.
La septicémie hémorragique virale(SHV) est une rhabdovirose qui atteint enélevage intensif de salmonidés, différentesclasses d’âge de la truite arc-en-ciel (Onco-rhynchus mykiss), du stade de la truitellejusqu’au stade sub-adulte ou adulte.
Cette maladie se développe préférentiel-lement à des températures inférieures à14 °C, c’est-à-dire en deçà de l’optimum
physiologique des poissons. L’infection cli-nique souvent mortelle, se manifeste toutd’abord par des troubles oedèmateux-hémor-
ragiques, assortis souvent d’exophtalmieuni- ou bi-latérale et de mélanose, jusqu’àl’établissement d’une phase nerveuse ter-minale.
En France, la SHV est une maladie répu-tée contagieuse soumise à déclaration obli-gatoire depuis 1985, confirmé en 1995 [5, 6].Comme les symptômes et lésions ne four-
nissent aucune certitude étiologique, l’inter-vention sanitaire exige un diagnostic delaboratoire rapide et fiable.
Le virus de la SHV, parfaitement mis enévidence sur cultures cellulaires sensibles,nécessite un délai minimal de culture etd’identification par immunofluorescence ouneutralisation de 72 à 120 h. Ces techniques,encore trop longues dans certains cas, sontles seules reconnues à l’heure actuelle au
plan de la réglementation de la communautéeuropéenne [4].
La réaction d’amplification en chaîne parpolymérase, (polymerase chain reac-tion : PCR) [15], peut constituer une alter-native plus rapide et plus sensible auxméthodes classiquement employées [17].En effet la technique PCR a déjà été appli-quée à des fins d’études et de recherchespour le diagnostic différentiel entre la SHVet la nécrose pancréatique infectieuse (NHI)[2, 8] et aussi en vue d’une utilisation dia-gnostique pour la SHV [2] et pour la NHI [ 1,18].
L’objet de cette étude est de comparer lasensibilité, la spécificité et la rapidité dudiagnostic de la SHV par PCR après rétro-transcription (RT PCR) à celles obtenuespar la technique virologique de référence[11] et de valider ces potentialités sur deséchantillons pathologiques en vue d’utili-sations diagnostiques plus performantes.
2. MATÉRIEL ET MÉTHODES
2.1. Échantillons
2.1.1. Organes issus de poissons infectésexpérimentalement
Soixante truitelles arc-en-ciel provenant d’unepisciculture indemne ont été éprouvées au temps10 de manière à garantir leur statut sanitaire depoisson témoin négatif avant d’être infectées parvoie balnéatoire avec 5.104 ufp-mL-1 de virusde la SHV pendant 3 h à une température de+10 °C. À chaque étape (J+7, J+30, J+60, J+150),
15 poissons ont été sacrifiés. Les organes (rein -rate ensemble et cerveau) ont été prélevés, broyésdans un mortier stérile. Une partie des broyats aété conservée à une température <_ -70 °C pour larecherche du virus par RT PCR et l’autre partiea été diluée au 1/10 dans du milieu de Eagle,supplémenté en antibiotiques et centrifugée. Lessurnageants ont été conservés entre +2 °C et+8 °C en attente de réalisation du protocole derecherche virale par inoculation aux cultures cel-lulaires sensibles [10, 11].
2.1.2. Liquides coelomiquesde poissons de pisciculture
Soixante géniteurs de truites arc-en-ciel enpériode de reproduction et provenant d’un éle-vage intensif, chroniquement infecté par la SHV,ont été prélevés au hasard.
La pression exercée artificiellement surl’abdomen des poissons permet la récolteconjointe des mufs et du liquide coelomique danslequel ils baignent. Séparés des oeufs par simplegravité, des parts aliquotes de ces surnageantsont été conservés, d’une part, congelés à unetempérature < -70 °C pour la recherche de virus
par RT PCR et, d’autre part, dilués au 1/2 dansune solution saline de Earle, supplémentée enantibiotiques et en antimycotiques, mis en contactpendant une nuit à une température compriseentre +2 °C et +8 °C, pour la mise en évidence duvirus par examen virologique en culture cellu-laire [10, 11]. !.
2.1.3. Sérums de poissons de pisciculture
Des prélèvements sanguins ont été réaliséssur ces mêmes animaux, afin d’effectuer larecherche d’anticorps neutralisants (ACN)sériques par séroneutralisation en microplaques[ 12].
2.2. Production de viruset cultures cellulaires
La lignée cellulaire EPC (Epithelioma papu-losum cyprini ) [9J a été utilisée pour l’isole-ment, la multiplication, l’identification et letitrage du virus et pour les tests de séroneutrali-sation lors de la recherche d’anticorps et la lignéecellulaire RTG,, (Rainbow trouf gonad) (ATCCCCL 55) [19] a été utilisée pour les tests de com-paraison de sensibilité lors de l’isolement duvirus.
2.3. Souches virales
Les treize souches virales testées dans le cadrede ce travail appartiennent au groupe des rhab-dovirus (tableau !.
2.4. Techniques virologiqueset sérologiques
Les deux lignées cellulaires EPC et RTG2 ont
été multipliées dans du milieu de Stoker tam-ponné à pH 7,4 avec du tampon Tris HCI 0,19 Met supplémenté avec 10 % de sérum de veaufoetal. Elles ont été incubées pour la multiplica-tion respectivement à 29 °C ± 2 °C et à20 °C ± 2 °C. Les techniques de production etd’entretien de ces cellules, déjà décrites par deKinkelin et al. [7], ont été définies dans le textefrançais deréférence [11].
Les virus ont été produits sur cultures de cel-lules EPC incubées à 14 °C ± 1 °C en milieu deStoker avec 2 % de sérum de veau foetal. L’effet
cytopathogène (ECP) apparaît en 3-4 j. Le sur-nageant infectieux a été centrifugé, filtré, etconservé à une température <_-70 °C. L’identi-fication du virus a été effectuée par double neu-tralisation avec les anticorps spécifiques de réfé-rence, anticorps monoclonal CIO, (Sanofi SantéNutrition Animale, Libourne, France) pour laSHV et anti-sérum 720, (de Kinkelin, Inra Jouy-en-Josas, France) pour la NHI [10, I 1]. ].
Le titrage a été réalisé par la méthode desplages sous agarose selon la technique déjàdécrite par de Kinkelin et al. [7].
La recherche de la présence des anticorps neu-tralisants (ACN) à partir des sérums a été réaliséeselon la technique de séroneutralisation déjàdécrite par Hattenberger et al. [13] et établie dansle texte français de référence [12].
2.5. Techniques de biologie moléculaire
2.5.1. Extraction de l’ARN viralet de l’ARN viral transcrit
(ARN messager)
Deux cents pL de surnageant de cultures cel-lulaires infectées, de liquide coelomique, ou200 mg de broyat de rein - rate ou d’encéphaleont été portés dans un milieu chaotrope (Guani-dine / citrate / sarcosyl) de façon à réaliser simul-tanément la lyse cellulaire et la libération desacides nucléiques tout en inhibant les activitésRNAses et DNAses cellulaires selon la techniquedécrite par Chomczynski et Sacchi [3J. ] .
Les acides nucléiques (ARN messager, ARNviral et ADN cellulaire) n’ont pas été précipitésà l’isopropanol comme il est dit dans la publi-cation citée mais ont été fixés sur une matricede silice puis élués à chaud selon le protocolesuivant.
Préparation de la matrice silice
Six grammes de silice (Sigma - Aldrich,Saint-Quentin Fallavier, France) ont été mélan-gés à 50 mL d’eau dans une éprouvette bouchéeà l’émeri et laissés en sédimentation 24 h à tem-
pérature ambiante. Après élimination du surna-geant par aspiration, la silice a été à nouveaumélangée à 50 mL d’eau et laissée en sédimen-tation 5 h à température ambiante.
Après élimination du surnageant par aspira-tion, 60 pL d’HCI concentré ont été ajoutés. LepH obtenu était d’environ de 2 unités pH. La sus-pension finale a été soigneusement homogénéi-sée avant d’être répartie et autoclavée 20 min à121 °C.
Protocole
100 pL de matrice silice ont été ajoutés auxéchantillons préalablement préparés et agités30 s. Le mélange a été abandonné à températureambiante 5 min en agitant de temps en tempspuis centrifugé 1 min à 10-12 000 g. Le surna-
geant a été éliminé. Le culot a été suspendu soi-gneusement dans 500 pL d’éthanol à 70 % ren-fermant 0,1 M d’acétate de sodium pH 5,2, puiscentrifugé 1 min à 12 000 g et à nouveau lavé et
centrifugé comme précédemment. Le surnageanta été totalement éliminé par aspiration, puis leculot a été repris par 50 NL d’eau traitée par dudiéthylpyrocarbonate (DEPC : Sigma-Aldrich,Saint-Quentin Fallavier, France) avant d’êtreincubé 5 min à 55 °C et refroidi dans la glace.
Le surnageant qui renferme l’ARN a été centri-fugé 1 min et récupéré avant l’addition de0,5 U.pL-1 de RNase inhibiteur (Boehringer-Mannheim, Meylan, France).
2.5.2. Cible et amorces
L’amplification en chaîne par polymérase aété mise au point, après analyse des séquencesdisponibles (Banque de séquences EuropeanMolecular Biology Laboratory, Heidelberg, Alle-magne) à l’aide des programmes informatiques dePC/GENE V 6.85 (IntelliGenetics, Inc, Califor-nia, États-Unis) [14J, en utilisant commeséquence cible le gène codant pour la glycopro-téine virale dont le numéro d’accès à Genbank est
X59148 [16].
Plusieurs oligonucléotides ont été sélectionnéssur la séquence codant pour cette protéine.
Un premier couple d’amorces P1 et P2 (res-pectivement sens, position 1387 5’TCA AAGAAC CGA GTG CCT AGA TGC 3’ ; anti-sens,position 1608 5’GTC TGT GTT GTT GTC TACCCG TTT CC 3’) a permis l’amplification invitro d’une séquence spécifique de 247 pairesde bases. Une de ces amorces a servi dans l’étapede transcription inverse à initier la synthèse del’ADN complémentaire, l’autre ayant pour ciblel’ADN néosynthétisé. Un second coupled’amorces P3 et P4 (respectivement sens, position1430 5’TCT GGG AAA GTA TCC TCA TTTCTC C 3’- anti-sens, position 1571 5’GTT GTTCAT CGT CTT GTA TTG AGC 3’) s’hybridantsur des régions internes au fragment produit aucours de la première amplification a permis grâceà une seconde amplification d’augmenter la spé-cificité et la sensibilité de la réaction en produi-sant une séquence spécifique de 165 paires debases.
Les amorces ont été synthétisées à 0,2 ¡.¡molepar l’Unité de chimie organique, département deBiochimie et Génétique Moléculaire, Institut Pas-teur, Paris, France.
2.5.3. Transcription inverseet amplification en chaînepar polymérase
L’acide nucléique du virus de la SHV estconstitué d’un ARN simple brin de polarité néga-tive. En milieu cellulaire cet ARN est directe-ment transcrit en ARN messager présent en quan-tité importante lors de la réplication virale.
Afin d’augmenter la sensibilité de la réactionRT PCR, des amorces sens et antisens (P1-P2)ont été utilisées dans la réaction de transcriptioninverse de manière à produire un ADN complé-mentaire à partir de l’ARN viral et des ARNmessagers, et ceci sous l’action de la transcriptaseinverse Moloney Murine Leukemia Virus (M-MuLV).
Réalisation de la transcription inverse
Un NL d’ARN, 0,75 pM de chaque amorcespécifique (Pl-P2) dans un volume final de 10 0 pLd’eau traitée par du DEPC ont été dénaturés pen-dant 10 min à 65 °C, puis la transcription inversea été effectuée pendant 1 h à 37 °C avec 5 pL deBULK du kit First-Strand cDNA Synthesis (Phar-macia, Orsay, France).
Première amplification (]’A)Aux 15 pL précédents a été ajouté, dans un
volume final de 50 NL, recouvert d’une goutted’huile (Mineral oil, Sigma - Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France), un mélange réac-tionnel constitué d’ 1 X de tampon de Taq ADNpolymérase (reaction buffer 10 X : 100 mM tris-HCI, I S mM de MgCl2, 500 mM KCI, pH 8,3 à20 °C) (Boehringer-Mannheim, Meylan, France),de 200 pM de chaque désoxynucléoside tri-phosphate, (dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 100 mMchacun) (Boehringer-Mannheim, Meylan,France), de 0,6 pM de chaque amorce spécifique(Pl -P2), de 1 U de Taq ADN polymérase (5 U /pL Boehringer-Mannheim, Meylan, France).
L’amplification a été réalisée dans un ther-mocycleur PTC 100 de MJ Research (Prolabo,Fontenay-sous-Bois, France) selon un programmede 35 cycles comprenant les étapes de dénatu-ration (94 °C 1 min), d’hybridation (60 °C 1 min),et d’extension (72 °C 2 min) suivis d’une phaseterminale (72 °C 10 min).
Seconde amplifïcation (2&dquo; A)
Un NL de produit amplifié au cours de la pre-mière amplification a été ajouté à un mélangeréactionnel identique à celui présenté ci-dessusavec 1 NM de chaque amorce spécifique (P3-P4)spécifique au lieu de 0,6 pM. L’amplification aété réalisée selon les étapes successives précé-demment citées avec un nombre de 15 cycles aulieu de 35.
ÉlectrophorèseDouze pL des produits d’amplification ont
été visualisés sous ultraviolet après migration
dans du TBE 1 X ( 89 mM de Tris-base, 89 mMd’acide borique, 2 mM d’EDTA pH 8), sur gel à1 % d’agarose NuSieve GTG et 1 % d’agaroseSeaKem (FMC BioProducts, Tebu, Le Perray-en-Yvelines, France) contenant 0,5 pg mL-1 debromure d’éthidium (Sigma - Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France). La taille des frag-ments obtenus a été déterminée par comparai-son avec un témoin de poids moléculaire,constitué d’un mélange de pBR328 coupé avecBgl 1 et pBR328 coupé avec Hinfl (Boehringer-Mannheim, Meylan, France ; Marqueur VI).
2.6. Protocole de détection du virus
Les amorces spécifiques ont été éprouvéesvis-à-vis de différentes souches de rhabdovirus
présentées dans le tableau I.L’évaluation de la limite de détection du virus
de la SHV 1 par RT PCR a été réalisée sur desdilutions de raison 10 du virus titrant2! 108 LJFP!mL-!, avec un prélèvement de 100 mLpour le test virologique et de 1 mL pour la RTPCR pour chacune des dilutions.
La recherche du virus dans les différents
organes éprouvés (rein-rate, cerveau, liquide coe-lomique) a été réalisée par comparaison avec lestechniques de virologie classique [7, 1 1 et avecles techniques de biologie moléculaire.
La recherche des anticorps neutralisants(ACN) a été réalisée selon la technique de séro-neutralisation en microplaques [12].
3. RÉSULTATS
3.1. Sensibilité
La détermination de la limite de détec-tion du virus de la SHV par RT PCR et parles techniques de virologie en culture cel-lulaire sont présentés dans la figure 1 et dansle tableau II.
Après deux amplifications, la sensibilitéa été plus importante qu’après une simpleamplification. Pour un même nombre d’UFPpar mL, la sensibilité par RT PCR a été aug-mentée d’un log par rapport à celle permet-tant la dernière apparition de l’effet cyto-pathogène sur cultures cellulaires et de deux
log par rapport à celle permettant la révé-lation d’une seule plage de lyse par titrage.De plus, les résultats par RT PCR ont étéobtenus beaucoup plus rapidement que dansle cas de l’isolement et de l’identificationde virus (24 h au lieu de 72 à 120 h).
3.2. Spécificité
L’amplification de l’ADN obtenu après latranscription inverse des différentes souchesde SHV étudiées a produit les fragmentsattendus de 247 paires de bases après la 1 rc
amplification et de 165 paires de bases aprèsla 2e amplification. Cette technique s’estmontrée spécifique des quatre sérotypes du
virus de la SHV mais aucune réaction posi-tive n’a été observée avec les autres souchesde rhabdovirus indiquées dans le tabletiu I(fïgure 2).
3.3. Étude des produits biologiques
La comparaison de la mise en évidencedu virus de la SHV I dans des échantillons
biologiques (rein-rate et cerveau de truitesinoculées expérimentalement et liquidescoelomiques de géniteurs en période dereproduction) par les techniques classiquesde virologie et par RT PCR est présentéedans les tabletilix III et IV.
Les travaux antérieurs ayant montré quele virus est facilement détectable par exa-men virologique en culture cellulaire dansles organes pendant la période qui suitimmédiatement l’infection, seule la tech-nique RT PCR a été réalisée sur les organesdes truites sacrifiées à J+7 et les résultats
par les deux techniques ont été comparés à
partir de J+30. À cette date les résultats posi-tifs par analyses RT PCR réalisées sur leséchantillons de rein-rate étaient plus nom-breux que par analyse virologique (sept RTPCR+ contre quatre virologie+), alors quec’est l’inverse dans les échantillons de cer-veau (trois RT PCR+ contre cinq virolo-gie+). À J+60, seule l’analyse RT PCR réa-
lisée sur les échantillons de rein-rate s’estrévélée positive pour trois poissons. À J+150tous les échantillons ont été négatifs.
C’est ainsi que globalement de J+30 àJ+60, 13 échantillons, (dix échantillons derein-rate et trois de cerveau) issus de neufpoissons se sont révélés positifs par RT PCRcontre seulement neuf par analyse virolo-gique (quatre de rein-rate et cinq de cer-veau) pour six poissons.
Par ailleurs, à partir des 60 échantillonsde liquides coelomiques de géniteurs enpériode de reproduction provenant d’unepisciculture chroniquement infectée, l’ana-lyse comparative de la mise en évidence duvirus de la SHV 1 a donné 28 résultats posi-tifs par RT PCR contre seulement I parl’examen virologique classique (tableau /V).
La recherche des anticorps neutralisantsdans le sérum de ces mêmes géniteurs a misen évidence que 1 d’entre eux étaient por-teurs d’anticorps. Sur ces 11 poissons, sixétaient négatifs par RT PCR et par examenvirologique, quatre étaient positifs par RTPCR et négatifs par examen virologique etun était positif par les deux techniques.
4. DISCUSSION
L’utilisation de la méthode d’amplifica-tion génique par RT PCR pour la mise enévidence du virus de la SHV à partir de sur-nageants infectieux, de broyats d’organesou de produits sexuels a été comparée enterme de sensibilité, de spécificité et de rapi-dité aux techniques classiques de virologieen culture cellulaire.
La comparaison de la sensibilité des deuxméthodes (figure /, tableau I! montre quela technique RT PCR est plus sensible carelle permet de détecter un nombre plusimportant de particules virales. En effet,l’écart de sensibilité porte sur un log dans lecas de la révélation du virus par effet cyto-pathogène sur cultures cellulaires sensibles,et de deux log pour la détection des plagespar titrage sous agarose.
La double amplification a permis d’aug-menter la spécificité du fragment produitpar simple amplification et la sensibilitédans des échantillons faiblement contaminésou pouvant contenir des inhibiteurs de laréaction de RT PCR (fïgure 1). Concernantla spécificité de la réaction, les deux ampli-fications des quatre sérotypes de SHV uti-lisés ont produit les fragments attendus etont montré qu’il n’existait pas de croise-ment avec les autres souches de rhabdovirusétudiées. En ce qui concerne notamment laNHI, ces résultats corroborent ceux de Bru-chhof et al. [2] (figure 2, tableau 7).
L’étude dans le temps de la mise en évi-dence du virus à partir de lots de 15 truitesinfectées expérimentalement permet deconstater qu’au bout de 30 j le nombre debroyats de rein rate positifs par RT PCR estplus important (7) que par analyse virolo-gique en culture cellulaire (4) mais les résul-tats sont inversés quand les analyses por-tent sur les broyats de cerveau (3 et 5)(tableau III). Le nombre de résultats positifspar analyse virologique dans le cerveau (5)supérieur à celui des reins rates des mêmespoissons (4) n’est pas rare et se rencontresouvent dans le cas de maladie nerveuse ter-minale où le virus neurotrope de la SHV estmis plus facilement en évidence parce queprotégé dans le système nerveux. Parailleurs, les résultats négatifs par RT PCRdans le cerveau (3) et positifs par examenvirologique en culture cellulaire peuventêtre dus à l’hétérogénéité de la cible dansdes échantillons de très faible volume entreles différents prélèvements destinés à la RTPCR et aux examens virologiques ou encoreà une perte de la cible au cours de l’extrac-tion qui fait appel à de nombreuses étapes etqui peut mettre en défaut la reproductibilitéde la réaction lorsque l’échantillon est trèsfaiblement contaminé.
À 60 j, les trois seuls échantillons positifsont été révélés par RT PCR, signifiant unesensibilité accrue de cette technique, les par-ticules virales non virulentes ne pouvantplus être détectées par examen virologiqueen culture cellulaire. Cette différence de
sensibilité n’a pas été conservée à 150 jpuisqu’à cette date tous les résultats ont éténégatifs quelque soit la technique employée.
La sensibilité de la détection est égale-ment démontrée dans le cas d’un dépistagede masse réalisé à un instant donné. Ainsisur les 60 liquides coelomiques éprouvés parles deux techniques en comparaison, 28 ontété positifs par RT PCR pour seulement 15 5sur l’un ou l’.autre système cellulaire utilisé(tableau IV).
Lors du sondage sérologique du cheptelde géniteurs porteurs asymptomatiques étu-diés, on constate que les anticorps neutra-lisants ont été mis en évidence, chez dixpoissons sur les onze positifs, à partir detruites où le virus circulant n’a pas étédétecté par examen virologique en culturecellulaire. Cette observation n’est plus aussinette si on regarde les résultats par la tech-nique RT PCR qui augmente beaucoup lasensibilité pour la mise en évidence du viruscirculant (tableau IV).
La comparaison des techniques a portéégalement sur le temps nécessaire à leur réa-lisation. Nous avons constaté que l’isole-ment et l’identification du virus nécessitaientun délai minimal de 72 à 120 h sur culturescellulaires et environ 24 h par RT PCR.
Au vu de ces résultats de sensibilité, despécificité, et de rapidité améliorées, l’uti-lisation de la méthode d’amplificationgénique par RT PCR pour la mise en évi-dence du virus de la SHV peut constituerune alternative intéressante par rapport auxtechniques virologiques en culture cellu-laire prescrites à l’heure actuelle par la régle-mentation de la communauté européenne[4], surtout dans le cas d’investigationsurgentes et importantes en nombre qui peu-vent être demandées lors des échanges inter-nationaux de poissons vivants.
REMERCIEMENTS
Les auteurs remercient l’équipe de pathologieinfectieuse et immunité des poissons, (unité de
virologie et immunologie moléculaire de l’Inra,Jouy-en-Josas, France) pour la conduite des infec-tions expérimentales, ainsi que le pisciculteurqui nous a permis de réaliser tous les prélève-ments de terrain.
[4] Décision de la commission européenne96/240/CEE du 5 février 1996 modifiant la déci-sion 92/532/CEE fixant les plans d’échantillon-nage et les méthodes de diagnostic pour la détec-tion et la confirmation de la présence de certainesmaladies des poissons.
[5] Décret n° 85-935 du 3 septembre 1985 ajoutantles rhabdoviroses : septicémie hémorragique viraleet nécrose hématopoïétique infectieuse des sal-monidés à la Nomenclature des maladies des ani-muax réputées contagieuses. JO du 5 septembre1985, 10267.
161 Décret n° 95-1408 du 28 décembre 1995 ajou-tant à la nomenclature des maladies des animaux
réputées contagieuses la nécrose hématopoïétiqueinfectieuse et la septicémie hémorragique virale decertaines espèces de poissons ainsi que l’anémieinfectieuse du saumon. JO du 4 janvier 1996, 135.
[7] de Kinkelin P., Michel C., Ghittino P., Précis depathologie des poissons Inra, Office ineernatio-nal des épizooties, Paris, 1985.
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