EPSTEIN BARR VIRUS EBNA IgM ELISA · Epstein-Barr virus (EBV) is a member of the Herpetoviridae...

EPSTEIN BARR VIRUS EBNA IgM ELISA

KAPDEBNM

EPSTEIN BARR VIRUS EBNA IgM ELISA EN

23.09.2019 2/12 version 2

CONTENT

1 Introduction ..................................................................................................... 3

2 Test Principle.................................................................................................... 4

3 Materials Provided ........................................................................................... 5

4 Other Material Required for Manual Test Performance ................................... 6

5 Storage and Stability ........................................................................................ 6

6 Preparation of Reagents ................................................................................... 6

7 Preparation of Samples .................................................................................... 7

8 Assay Procedure ............................................................................................... 7

9 Working Schedule ............................................................................................ 8

10 Quality Control ................................................................................................. 9

11 Results Interpretation ...................................................................................... 9

12 Safety Precautions ......................................................................................... 10

13 Procedural Notes............................................................................................ 10


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Enzyme immunoassay for the detection of IgM antibodies to Epstein-Barr virus nuclear antigen in human serum or plasma

1 Introduction

Epstein-Barr virus (EBV) is a member of the Herpetoviridae family (HHV4). An infected human is the source of infection that spreads mainly through air-borne transmission or direct contact. EBV is an etiologic agent of infectious mononucleosis (IM) and it is also related to Burkitt’s lymphoma and nasopharyngeal carcinoma. 90% of people become infected with EBV during childhood. After the incubation period (1-2 month) some people develop typical symptoms of IM – fever, pharyngitis and lymphadenopathy. Symptoms of EBV infection are influenced by patient age and immune system status. EBV persists latently in the organism for the rest of the individual’s life and can be reactivated.

Diagnosis of the disease is based on an anamnesis, a clinical picture and laboratory tests. Determination of specific IgA, IgG and IgM antibodies against particular EBV antigens (VCA, EBNA-1, EA-D) using ELISA method is a powerful tool for the detection and determination of stage of EBV infection.

VCA: Anti-VCA IgG antibodies have an anamnestic character and persist in infected individuals for their entire life. Seroconversion can be detected in the early phase of the primary infection. A significant rise in IgG anti-VCA antibodies indicates reinfection or reactivation. Determination of IgG antibodies avidity enables differentiation between a primary and past infection or reactivation. IgM and IgA antibody responses are typical for active infection. High levels of IgM anti-VCA are usually present in acute and convalescent phases of IM, while in EBV reactivation IgM response is low and often undetectable and IgA response is more pronounced. After recovery, both IgM and IgA antibodies may persist for several weeks or months.

EBNA-1: During the acute phase of primary infection IgM antibodies are detected, while IgG antibody response is delayed. Absence of IgG anti-EBNA with concomitant presence of IgG and IgM anti-VCA is a diagnostic marker of infectious mononucleosis. Long term absence of IgG anti-EBNA-1 antibody may indicate immune deficiency.

EA-D: IgM and IgG antibodies to EA-D antigen are additional markers of primary EBV infection. High titres of IgG anti-EA-D are typically present in late acute and convalescent phases of infectious mononucleosis.


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2 Test Principle

The kit is intended for detection of specific IgM antibodies in a sample by means of a sandwich type of the ELISA method (i.e. a solid phase coated with specific antigen – antibody from the analysed sample – labelled antibody). The labelled antibody (conjugate) is an animal immunoglobulin fraction to human IgM conjugated with horseradish peroxidase. Peroxidase activity is determined in the test by a substrate containing TMB. Positivity is indicated when blue colour appears; after stopping solution has been added, blue changes to yellow. The yellow colour intensity is measured by a photometer at 450 nm, and it is proportional to the concentration of specific IgM antibodies in the sample.

Antigen used

Recombinant antigens with highly specific immunodominant epitopes of EBV EBNA-1


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3 Materials Provided

Microtiter Plate 1 pc

coated with antigen, 12 x 8 breakable wells in bag with desiccant

Negative Control 1 × 2 ml

Solution containing no specific human antibodies, ready to use

CUT-OFF 1 × 3 ml

Solution containing specific human antibodies in cut-off concentration, ready to use

Positive Control 1 × 2 ml

Solution containing specific human antibodies, ready to use

Conjugate 1 × 15 ml

Solution containing peroxidase labelled animal immunoglobulin to human IgM, ready to use

Sample Diluent 11 1 × 105 ml

Buffer with protein stabilisers and IgG/RF sorbent, ready to use

TMB Solution 1 × 15 ml

Chromogenic substrate solution containing

TMB/H2O2 ready to use

Wash Solution 1 × 75 ml

20× concentrated buffer

Stop Solution 1 × 15 ml

Acid solution, ready to use

Instructions for use 1 pc


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4 Other Material Required for Manual Test Performance

Single and multichannel pipettes

Disposable tips

Microplate washer

Timer

Incubator (37°C)

Microplate reader

5 Storage and Stability

Store the kit at +2°C to +8°C. Do not freeze. If the kit is stored as described, the labelled expiration date is valid. The expiration date is indicated on the package. The opened kit should be used within three months.

Sample Preparation and Storage

The following human body liquids can be used for testing: serum and citrate plasma. Anticoagulants in the plasma (except for citrate) as well as bacterially contaminated, haemolytic or chylous samples can affect the test results.

Samples can be stored at +2°C to +8°C for one week. For a longer period, store samples at -20°C. Diluted samples should be used as soon as possible.

6 Preparation of Reagents

Dilute the Wash Solution 1:20 (1 part of solution and 19 parts of distilled water); e.g. 75 ml of the concentrated Wash Solution + 1425 ml of distilled water.

Salt crystals might develop in the bottle with the concentrated Wash Solution. Prior to use, it is necessary to dissolve the crystals by warming the bottle in a water bath. The diluted Wash Solution is stable at +2°C to +8°C for one week.

The Controls (positive, negative and CUT-OFF) are ready to use, do not dilute further!

The Conjugate is ready to use, do not dilute further!

TMB Solution is a one-component chromogenic substrate solution ready to use, do not dilute further!

Interchangeability of reagents

The Sample Diluent, TMB Solution and the Avidity Solution are interchangeable between some ELISA of DIAsource ImmunoAssays S.A., provided they have the identical numeric marking (e.g. Sample Diluent 2, Sample Diluent 3, etc.). Further information relative to this interchangeability can be requested to DIAsource ImmunoAssays S.A.


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7 Preparation of Samples

Mix gently the Sample Diluent prior to use.

Dilution of sera and plasma samples

Dilute well mixed samples 1:101 with the Sample Diluent:

E.g.: 10 µl of sample + 1 ml of the Sample Diluent

Mix well and incubate 10 minutes at room temperature.

8 Assay Procedure

Allow all reagents to come to room temperature and mix well. If you do not use a whole microplate, return unnecessary strips into the bag with desiccant. Seal the bag tightly and store at +2°C to +8°C. Keep dry!

1. Dispense the controls and the diluted samples according to the working schedule.

• Leave A1 well empty (blank).

• Pipette 100 µl of the Negative Control into 1 well.

• Pipette 100 µl of CUT-OFF into 2 wells.

• Pipette 100 µl of the Positive Control into 1 well.

• Pipette 100 µl of the diluted samples (see Chapter Preparation of Samples) into the other wells.

2. Cover the microplate with the lid and incubate at 37°C for 30 minutes.

3. Aspirate the content of the wells and wash 5× with the working strength Wash Solution. Fill the wells up to the edge. Finally, tap the inverted microplate thoroughly on an absorbent paper to remove solution remnants.

4. Pipette 100 µl of the Conjugate into all wells except A1 well.

5. Cover the microplate with the lid and incubate at 37°C for 30 minutes.

6. Aspirate the content of the wells and wash 5× with the working strength Wash Solution. Fill the wells up to the edge. Finally, tap the inverted microplate thoroughly on an absorbent paper to remove solution remnants.

7. Pipette 100 µl of TMB Solution into all wells. Avoid contamination – see Chapter Procedural Notes.

8. Cover the microplate with the lid and incubate at 37°C for 30 minutes. Keep out of light.

9. Stop the reaction by adding 100 µl of the Stop Solution in the same order and intervals as the substrate was added.

10. Read the colour intensity in wells against blank (A1 well) using photometer set to 450 nm. The absorbance should be read within 30 minutes after stopping the reaction.


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9 Working Schedule

BL TS 4

NC TS 5

CO

CO

PC

TS 1

TS 2

TS 3

A

B

C

D

E

G

H

F

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

BL Blank (empty well)

NC 100 µl

CO 100 µl

PC 100 µl

TS 1-x 100 µl diluted tested sample


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10 Quality Control

The test is valid if:

The absorbance of blank is lower than 0.150.

BLANK < 0.150

The absorbance of the Negative Control is lower than half of the mean absorbance of CUT‒OFF.

< 0.5 ×

The mean absorbance of CUT-OFF is within a range of 0.150 – 0.900.

0.150 < < 0.900

The absorbance of the Positive Control is higher than the mean absorbance of CUT‒OFF.

>

11 Results Interpretation

Calculation of Index of Positivity (IP)

Divide the absorbance of a tested sample by the mean absorbance of CUT-OFF measured in the same test run:

Interpretation of the test results is described in Table 1.

Table 1 Interpretation of results

Index of Positivity (IP)

Evaluation

lower than 0.9 negative

0.9 to 1.1 borderline

higher than 1.1 positive

Examination of borderline samples, i.e. samples with Index of Positivity from 0.9 to 1.1, should be repeated from a new sample collected after 2 to 6 weeks regarding to the disease specifics.


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Serological finding can be interpreted only in the context of results of other laboratory tests and patient clinical picture.

12 Safety Precautions

The kit is intended for in vitro diagnostic use only.

The sera used for controls were tested and found to be negative for HIV 1 and HIV 2, HBsAg, HCV, TPHA. In spite of this fact, they still need to be handled as potentially infectious materials.

Some reagents contain sodium azide, which is a toxic compound. Avoid contact with skin.

The Stop Solution contains diluted acid solution. Avoid contact with eyes and skin.

It is necessary to observe the local safety rules and regulations.

For more information refer to Stop Solution MSDS.

First aid

In case of contact with eyes, flush with copious amount of water and seek medical assistance. In case of contact with skin and clothing, remove all the contaminated clothes. Wash the skin with soap and plenty of running water. In case of contact with solutions containing plasma or clinical samples, disinfect the skin. In case of accidental ingestion, flush the mouth with drinking water and seek medical assistance.

Remnants disposal

All the materials used for performing the test must be treated as potentially infectious due to the contact with biological materials. Therefore they need to be disposed together with biological waste.

Expired kit disposal

Disassemble the kit and dispose the components as biological material. Discard the packaging material as required by local regulations.

13 Procedural Notes

In order to obtain reliable results, it is necessary to strictly follow the Instructions for Use. Always use clean preferably disposable tips and glassware.

Microtiter Plate – in order to prevent water condensation on the surface of the microplate, always allow the bag with the microplate to warm up to room temperature before opening.

Wash Solution – use high quality distilled water for preparing the working strength Wash Solution.


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Washing procedure – keep to the prescribed number of wash cycles and fill the wells to the upper edge. The soak time (i.e. interval between two different wash cycles during which the wells stay filled up with the Wash Solution) should be approx. 30-60 seconds.

TMB Solution – the vessel used for multichannel pipetting should not be used for other reagents. Do not return the surplus TMB Solution from the pipetting vessel into the vial.

Non-reproducible results might be caused by improper methodology as following:

• insufficient mixing of reagents and samples before use

• improper replacement of vial caps

• using the same tip for pipetting different reagents

• reagent exposure to excessive temperature; bacterial or chemical contamination

• insufficient washing or filling of the wells (the wells should be filled to the upper edge), improper aspiration of Wash Solution remnants

• contamination of the well edges with Conjugate or samples

• using reagents from different kit lots

• contact of reagents with oxidants, heavy metals and their salts

The kit might be used for sequential examinations. When preparing working strength solutions, use only the amounts of reagents needed for the analysis.

The kit might be used in all types of automatic ELISA analysers.

If necessary, DIAsource ImmunoAssays S.A. can offer a certified modification of the Instructions for Use for the specific type of analyser.

The producer cannot guarantee that the kit will function properly if the assay procedure instructions are not strictly adhered to.


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Summary of EPSTEIN BARR VIRUS EBNA IgM ELISA Protocol

Step No. Symbol Test steps

1 Dilute samples

serum/plasma 1:101 (10 µl + 1 ml)

2 Incubate at room temperature for 10 min

3 Pipette Controls and diluted samples – 100 µl

Blank = empty well

4 Incubate at 37°C for 30 min

5 Aspirate and wash the wells 5×

6 Pipette Conjugate – 100 μl

Blank = empty well


8 Aspirate and wash the wells 5×

9 Pipette Substrate (TMB Solution) – 100 µl

Including blank


11 Pipette Stop Solution – 100 µl

Including blank

12 Read colour intensity at 450 nm


KAPDEBNM

EPSTEIN BARR VIRUS EBNA IgM ELISA DE

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INHALT

1 Einleitung ......................................................................................................... 3

2 Testprinzip ....................................................................................................... 4

3 Bestandteile des Kits ........................................................................................ 5

4 Erforderliche, nicht im Kit enthaltene Geräte und Materialien, für die manuelle Durchführung ................................................................................................... 6

5 Lagerung und Haltbarkeit des Kits .................................................................... 6

6 Vorbereitung der Reagenzien ........................................................................... 6

7 Probenverdünnung .......................................................................................... 7

8 Testdurchführung ............................................................................................. 7

9 Arbeitsschema ................................................................................................. 9

10 Testvalidität ................................................................................................... 10

11 Auswertung der Ergebnisse ............................................................................ 10

12 Arbeitssicherheit ............................................................................................ 11

13 Technische Anmerkungen .............................................................................. 11


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Enzymimmunoassay zur Bestimmung von IgM-Antikörpern gegen das nukleäre Antigen des Epstein-Barr-Virus im

menschlichen Serum oder Plasma

1 Einleitung

Das Epstein-Barr-Virus (EBV) gehört zur Gruppe der Herpesviren (HHV4). Infektionsquelle sind infizierte Menschen. Das Virus wird durch Tröpfcheninfektion oder durch direkten Kontakt übertragen. Das EBV ist verursacht die infektiöse Mononukleose (IM, Peiffer-Drüsenfieber) und hat auch einen Bezug zum Burkitt-Lymphom und zum Nasopharynxkarzinom. 90% der Ansteckungen erfolgen im Kindesalter. Nach der Inkubationszeit (1–2 Monate) erfolgt die Entwicklung der IM mit folgenden charakteristischen Symptomen – Fieber, Pharyngitis, generalisierte Vergrößerung der Lymphknoten. Die Symptome der EBV-Infektion werden durch das Alter und den Zustand des Immunsystems beeinflusst. Nach der Primärinfektion persistiert das EBV lebenslang im Organismus und kann reaktiviert werden.

Bei der Diagnostik der Erkrankung sind die Anamnese, das klinische Bild des Patienten und die Ergebnisse der Labortests wichtig. Zum Nachweis der Infektion und zur Bestimmung der Phase der Infektion wird am häufigsten die ELISA-Methode angewendet, mit deren Hilfe die Anwesenheit spezifischer Antikörper der Klasse IgA, IgG und IgM gegen die einzelnen Antigene des EBV (VCA, EBNA-1, EA-D) im Serum oder Plasma festgestellt wird.

VCA: Die Anti-VCA Antikörper der Klasse IgA und IgM sind Marker der akuten Infektion und können sich sowohl bei der Primärinfektion, als auch bei der Reaktivierung der EBV-Infektion bilden. Die Antikörper der Klasse IgM erreichen hohe Spiegel in der akuten wie in der rekonvaleszenten Phase der infektiösen Mononukleose. Beide Antikörper-Klassen können bis zu mehreren Monaten persistieren. Die Antikörper der Klasse IgG haben anamnestischen Charakter und überdauern bei den meisten infizierten Personen lebenslang in hohen Titern. Die Serokonversion von IgG kann bereits in der Frühphase der Primärinfektion festgestellt werden, ein signifikanter Anstieg begleitet auch die Reinfektion und die Reaktivierung. Die IgG-Aviditätsbestimmung ermöglicht es, primäre von früheren Infektionen zu uterscheiden.

EBNA-1: Die Anti-EBNA-1 Antikörper der Klasse IgM sind im Verlaufe der akuten Phase der Direktinfektion mehrere Wochen bis Monate nachweisbar und bilden sich auch bei der Reaktivierung. Die Antikörper der Klasse IgG treten später auf und sind ein Leben lang nachweisbar. Nachhaltiges Fehlen von IgG-Antikörper bei infizierten Personen kann eine Immunschwäche anzeigen.


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EA-D: Die Anti-EA-D Antikörper der Klasse IgM und IgG sind zusätzliche Marker der EBV-Primärinfektion. Hohe Titer von Anti-EA-D IgG sind für die späte akute und rekonvaleszente Phase der IM typisch.

2 Testprinzip

Das Kit ermöglicht die Bestimmung spezifischer IgM-Antikörper in der Probe mittels der Sandwich-ELISA-Methode (d.h. antigenbeschichtete feste Phase - Antikörper aus der untersuchten Probe - markierter Antikörper). Der markierte Antikörper (Konjugat) ist eine tierische Immunoglobulinfraktion gegen menschliches IgM, die mit Meerrettichperoxidase konjugiert ist. Die Peroxidaseaktivität wird durch das TMB-Substrat bestimmt, das sich bei einer positiven Reaktion blau färbt. Die Enzymreaktion wird mit einer Stopplösung beendet. Die blaue Färbung schlägt in eine gelbe um. Die Intensität der Gelbfärbung wird mit dem Photometer (bei einer Wellenlänge von 450 nm) gemessen und ist proportional zur Konzentration der spezifischen IgM-Antikörper in der Probe.

Verwendetes Antigen

Rekombinante Antigene mit hochspezifischen, stark immunogenen Epitopen von EBV EBNA-1


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3 Bestandteile des Kits

Beschichtete Platte 1 Stck.

mit gebundenem Antigen, 12 x 8 zerbrechlichen Vertiefungen im Beutel mit Trocknungsmittel

Negative Kontrolle 1 × 2 ml

Lösung ohne spezifische menschliche Antikörper, gebrauchsfertig

CUT-OFF 1 × 3 ml

Lösung mit grenzwertiger Konzentration spezifischer menschlicher Antikörper, gebrauchsfertig

Positive Kontrolle 1 × 2 ml

Lösung mit spezifischen menschlichen Antikörpern, gebrauchsfertig

Konjugat 1 × 15 ml

Lösung mit tierischem Immunoglobulin gegen menschliches IgM, Peroxidase-Konjugiert, gebrauchsfertig

Verdünnungslösung für die Proben 11 1 × 105 ml

Puffer mit Eiweißstabilisatoren und IgG/RF Sorbens, gebrauchsfertig

TMB-Lösung 1 × 15 ml

Einkomponenten-Substratlösung, TMB/H2O2,

gebrauchsfertig

Waschlösung 1 × 75 ml

20× konzentrierter Puffer

Stopplösung 1 × 15 ml

Säurelösung, gebrauchsfertig

Arbeitsanweisung 1 Stck.


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4 Erforderliche, nicht im Kit enthaltene Geräte und Materialien, für die manuelle Durchführung

Ein- und Mehrkanalpipetten

Einmalspitzen

Wascher

Stoppuhr

Inkubator für 37°C

Photometer für Mikrotiterplatten

5 Lagerung und Haltbarkeit des Kits

Das Kit muss bei einer Temperatur von +2°C bis +8°C gelagert werden. Bei Einhaltung der Lagerungsbedingungen gilt das auf der Verpackung des Kits angegebene Haltbarkeitsdatum. Der angebrochene Kit sollte innerhalb von drei Monaten verbraucht werden. Das Kit darf nicht einfrieren!

Proben und ihre Lagerung

Als Probe kann menschliches Serum und Zitratplasma verwendet werden. Mit Bakterien verseuchte Proben, hämolytische Proben oder Proben mit Chylus und im Plasma enthaltene Antikoagglutinationsmittel (Zitrat ausgenommen) können das Testergebnis beeinflussen.

Die Proben können bei einer Temperatur von +2°C bis +8°C höchstens 1 Woche lang aufbewahrt werden. Frieren Sie die Proben bei längerer Lagerung bei -20°C ein. Verdünnte Proben sind möglichst bald zu untersuchen.

6 Vorbereitung der Reagenzien

Verdünnen Sie die Waschlösung im Verhältnis 1:20 (1 Teil Lösung und 19 Teile destilliertes Wasser). Z.B. 75 ml konzentrierte Waschlösung + 1425 ml destilliertes Wasser.

In der Flasche mit der Waschlösung können sich Salzkristalle bilden. Diese Kristalle müssen vor Gebrauch durch Erwärmung im Wasserbad aufgelöst werden. Die verdünnte Lösung ist eine Woche lang bei +2°C bis +8°C haltbar.

Die Kontrollen (positive, negative und CUT-OFF) sind gebrauchsfertig, nicht weiter verdünnen!

Das Konjugat ist gebrauchsfertig, nicht weiter verdünnen!

Das TMB-Lösung ist eine chromogene Einkomponenten-Substratlösung und gebrauchsfertig, nicht weiter verdünnen!


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Austauschbarkeit der Lösungen

Die Verdünnungslösung für die Proben, TMB-Lösung und Aviditätspuffer können problemlos mit einigen ELISA-Produkten von DIAsource ImmunoAssays S.A. austauschbar, wenn sie die gleiche numerische Kennzeichnung aufweisen (z.B. Verdünnungslösung für die Proben 2, Verdünnungslösung für die Proben 3, usw.). Weitere Informationen zu dieser Austauschbarkeit können Sie bei DIAsource ImmunoAssays S.A. anfordern.

7 Probenverdünnung

Mischen Sie die Verdünnungslösung für die Proben vor der Verwendung schonend.

Verdünnung der Serum- und Plasmaproben

Verdünnen Sie die gründlich gemischten Proben 1:101 mit der Verdünnungslösung für die Proben:

z.B: 10 µl Probe + 1 ml Verdünnungslösung für die Proben.

Gut mischen und 10 Minuten bei Labortemperatur inkubieren.

8 Testdurchführung

Es ist sehr wichtig, alle Reagenzien vor ihrer Verwendung auf Raumtemperatur zu bringen und gründlich zu mischen. Sofern Sie nicht die gesamte Platte verwenden, so legen Sie die nicht benötigten Strips in die Verpackung mit dem Trocknungsmittel zurück, verschließen diese luftdicht und lagern sie bei +2°C bis +8°C. Sorgfältig vor Feuchtigkeit schützen!

1. Pipettieren Sie die Kontrollen sowie die verdünnten Proben gemäß dem Arbeitsschema.

• Lassen Sie die Vertiefung A1 leer (Blank).

• Pipettieren Sie 100 µl der Negativen Kontrolle in 1 Vertiefung.

• Pipettieren Sie 100 µl CUT-OFF in 2 Vertiefungen.

• Pipettieren Sie 100 µl der Positiven Kontrolle in 1 Vertiefung.

• Pipettieren Sie 100 µl der verdünnten Proben (siehe Kapitol Probenverdünnung) in die restlichen Vertiefungen.

2. Decken Sie die Platte mit dem Deckel ab und lassen Sie sie 30 Minuten bei 37°C inkubieren.

3. Saugen Sie den Inhalt der Vertiefungen ab und waschen Sie 5× mit Arbeitswaschlösung. Füllen Sie die Vertiefungen bis zum oberen Rand. Verbleibende Flüssigkeit zum Schluss durch Ausklopfen auf saugfähigem Papier entfernen.

4. Pipettieren Sie 100 µl Konjugat in alle Vertiefungen mit Ausnahme von A1.


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5. Decken Sie die Platte mit dem Deckel ab und lassen Sie sie 30 Minuten bei 37°C inkubieren.

6. Saugen Sie den Inhalt der Vertiefungen ab und waschen Sie 5× mit Arbeitswaschlösung. Füllen Sie die Vertiefungen bis zum oberen Rand. Verbleibende Flüssigkeit zum Schluss durch Ausklopfen auf saugfähigem Papier entfernen.

7. Pipettieren Sie in alle Vertiefungen 100 µl TMB-Lösung. Achten Sie auf Verschmutzungen – siehe Kapitol Technische Anmerkungen.

8. Decken Sie die Platte mit dem Deckel ab und lassen Sie sie 30 Minuten bei 37°C im Dunkeln inkubieren.

9. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 100 µl Stopplösung in der gleichen Reihenfolge und den gleichen Intervallen, wie das Substrat pipettiert wurde.

10. Messen Sie am Photometer bei einer Wellenlänge von 450 nm die Intensität der Verfärbung der Lösungen in den Vertiefungen im Vergleich zum Blank (Vertiefung A1), und zwar innerhalb von 30 Minuten nach dem Stoppen der Reaktion.


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9 Arbeitsschema

BL TP 4

NK TP 5

CO

CO

PK

TP 1

TP 2

TP 3

A

B

C

D

E

G

H

F

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

BL Blank (leere Vertiefung)

NK 100 µl

CO 100 µl

PK 100 µl

TP1-x 100 µl verdünnte Testprobe


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10 Testvalidität

Der Test ist gültig, wenn:

Die Blank-Extinktion ist kleiner als 0,150.

BLANK < 0,150

Die Extinktion der Negativen Kontrolle ist kleiner als die Hälfte des Durchschnitts der

Extinktion von CUT‒OFF.

< 0,5 ×

Die durchschnittliche Extinktion von CUT‒OFF liegt im Bereich von 0,150 – 0,900.

0,150 < < 0,900

Die Extinktion der Positiven Kontrolle ist größer als der durchschnittlichen Extinktion

von CUT‒OFF.

>

11 Auswertung der Ergebnisse

Berechnung des Positivitätsindex (IP)

Dividieren Sie die Extinktion der getesteten Probe durch die durchschnittliche in der gleichen Serie der Untersuchung gemessene Extinktion von CUT-OFF:

Die Interpretation der Untersuchungsergebnisse siehe Tabelle (Tabelle 1).

Tabelle 1 Interpretation der Untersuchungsergebnisse

Positivitätsindex (IP) Auswertung

kleiner als 0,9 negativ

0,9 bis 1,1 grenzwertig

höher als 1,1 positiv

Die Untersuchung grenzwertiger Proben, d. h. Proben mit einem Positivitätsindex von 0,9 bis 1,1, muss nach 2 bis 6 Wochen unter Berücksichtigung der jeweiligen spezifischen Erkrankung nach erneuter Entnahme wiederholt werden.


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Der serologische Befund kann nur im Kontext mit den Ergebnissen anderer Labortests und mit dem klinischen Bild des Patienten interpretiert werden.

12 Arbeitssicherheit

Der Test ist nur für Diagnosezwecke in vitro vorgesehen.

Die bei der Fertigung der Kontrollen verwendeten Seren wurden mit negativem Ergebnis auf HIV 1 und HIV 2, HBsAg, HCV, TPHA untersucht. Dennoch ist es erforderlich, mit den Seren so umzugehen, als seien sie potentielles Infektionsmaterial.

Einige Reagenzien enthalten das giftige Natriumazid. Vermeiden Sie Hautkontakt.

Die Stopplösung enthält eine verdünnte Säurelösung.

Schützen Sie bei der Arbeit mit dieser Lösung Ihre Augen und Ihre Haut!

Es ist notwendig, die örtlichen Arbeitssicherheitsbestimmungen einzuhalten.

Weitere Informationen erhalten Sie im Sicherheitsdatenblatt von Stop Solution.

Erste-Hilfe-Maßnahmen

Spülen Sie bei Augenkontakt Ihre Augen gründlich mit lauwarmem Wasser und suchen Sie einen Arzt auf. Entledigen Sie sich bei Kleidungs- und Hautkontakt sämtlicher kontaminierter Kleidung. Spülen Sie die Haut gründlich mit Wasser und Seife ab. Desinfizieren Sie die Haut, sofern Spritzer einer Lösung, die Plasma oder eine klinische Probe enthält, auf diese gelangen. Spülen Sie bei zufälligem Verzehr Ihren Mund mit Trinkwasser aus und nehmen Sie ärztliche Hilfe in Anspruch.

Resteentsorgung

Sämtliche zur Testdurchführung verwendeten Hilfsmittel sind hinsichtlich des Kontakts mit biologischem Material als potentiell infektiös zu betrachten. Deshalb sind sie als biologischer Abfall zu entsorgen.

Entsorgung des Kits nach Ablauf der Haltbarkeitsdauer

Zerlegen Sie das Kit in seine einzelnen Komponenten und entsorgen Sie diese als biologisches Material. Entsorgen Sie die Verpackungen und Verpackungsreste gemäß den örtlichen Vorschriften als sortierten Abfall.

13 Technische Anmerkungen

Um zuverlässige Ergebnisse zu erzielen, ist die genaue Einhaltung der Anleitung notwendig. Verwenden Sie bei der Arbeit stets Hilfsmittel höchsten Sauberkeitsgrades. Bevorzugen Sie Hilfsmittel für den einmaligen Gebrauch.

Mikrotiterplatte – Bringen Sie vor dem Öffnen den Beutel mit der Mikrotiterplatte auf Labortemperatur, damit auf der Plattenoberfläche kein Wasserdampf kondensiert.

http://slovnik.seznam.cz/de-cz/?q=S%C3%A4ure


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Waschlösung – verwenden Sie zur Vorbereitung der Waschlösungs-Arbeitsverdünnung hochwertiges destilliertes Wasser.

Waschen – halten Sie die vorgeschriebene Anzahl der Waschzyklen ein und füllen Sie die Vertiefungen bis zum oberen Rand. Die Zeitdauer, während der die Vertiefungen zwischen den Waschzyklen mit der Waschlösung gefüllt verbleiben (soak time), sollte etwa 30 – 60 Sekunden betragen.

TMB-Lösung – verwenden Sie die Pipettierwanne für TMB-Lösung für keine anderen Lösungen. Füllen Sie den Lösungsrest aus der Pipettierwanne nicht in die Flasche zurück.

Nicht nachvollziehbaren Ergebnissen können methodische Fehler zugrunde liegen, insbesondere:

• unzureichendes Mischen der Lösungen und der Proben vor der Verwendung

• Vertauschen der Flaschenverschlüsse

• Verwendung der gleichen Spitze zum Pipettieren verschiedener Lösungen

• die Reagenzien wurden zu hohen Temperaturen, bakterieller oder chemischer Kontamination ausgesetzt

• unzureichendes Auswaschen der Vertiefungen, die Vertiefungen wurden nicht bis zum Rand gefüllt, schlechtes Absaugen der Lösungsreste

• Verschmutzung der Vertiefungsränder mit Konjugat oder mit Proben

• Vertauschen der Reagenzien aus verschiedenen Kit-Chargen

• Kontakt der Reagenzien mit Oxidationsmitteln, Schwermetallen und deren Salzen.

• Das Kit kann in mehrere Tests aufgeteilt werden. Entnehmen Sie zur Vorbereitung der Arbeitslösungen nur so große Mengen Reagenzien, wie für die Analyse notwendig sind.

• Der Test kann auf allen Typen automatischer ELISA-Analysatoren durchgeführt werden. Bei Bedarf bietet DIAsource ImmunoAssays S.A. eine zertifizierte Modifizierung der Arbeitsanweisung für den jeweiligen Automatentyp an.

Bei Nichteinhaltung des Arbeitsverfahrens haftet der Hersteller nicht für die korrekte Funktion des Tests.


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Notizen


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Notizen


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Notizen


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Testschema EPSTEIN BARR VIRUS EBNA IgM ELISA

Step Symbol Einzelne Testschritte

1 Verdünnung der Proben

von Serum/Plasma 1:101 (10 µl + 1 ml)

2 Inkubation 10 Min. bei Labortemperatur

3 Pipettieren der Kontrollen (Kalibratoren) und der verdünnten Proben 100 µl

Blank = leere Vertiefung

4 Inkubation 30 Min. bei 37°C

5 Absaugen und Waschen der Vertiefungen 5×

6 Pipettieren des Konjugats 100 µl

Blank = leere Vertiefung


8 Absaugen und Waschen der Vertiefungen 5×

9 Pipettieren des Substrats (TMB-Lösung) 100 µl

Einschließlich Blank


11 Pipettieren der Stopplösung 100 µl

Einschließlich Blank

12 Photometrische Messung bei 450 nm


KAPDEBNM

EPSTEIN BARR VIRUS EBNA IgM ELISA ES

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ÍNDICE

1 Introducción ..................................................................................................... 3

2 Principio del test .............................................................................................. 4

3 Composición del conjunto ................................................................................ 5

4 Otro equipamiento necesario para hacer el test de forma manual ................... 6

5 Almacenamiento y estabilidad ......................................................................... 6

6 Preparación de soluciones de trabajo ............................................................... 6

7 Dilución de muestras ........................................................................................ 7

8 Procedimiento de trabajo ................................................................................. 7

9 Esquema de trabajo ......................................................................................... 8

10 Validez del test ................................................................................................. 9

11 Valoración de los resultados ............................................................................ 9

12 Seguridad en el trabajo .................................................................................. 10

13 Condiciones técnicas ...................................................................................... 10


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Inmunoensayo enzimático para la detección de anticuerpos de clase IgM contra el antígeno nuclear del virus Epstein-Barr en

suero humano o plasma

1 Introducción

El virus Epstein-Barr virus (VEB) es un miembro de la familia Herpetoviridae (HHV4). Un ser humano infectado es la fuente de infección que se propaga principalmente por transmisión aérea o contacto directo. El VEB es un agente etiológico de mononucleosis infecciosa (MI) y también está relacionado con el linfoma de Burkitt y el carcinoma nasofaríngeo. El 90 % de las personas se infectan con el VEB durante la infancia. Tras el periodo de incubación (1-2 meses) algunas personas desarrollan síntomas típicos de MI: fiebre, faringitis y linfadenopatía. Los síntomas de la infección por el VEB varían en función de la edad del paciente y el estado de su sistema inmunitario. El VEB persiste de forma latente en el organismo durante el resto de la vida del individuo y se puede reactivar.

El diagnóstico de la enfermedad se basa en la anamnesis, el cuadro clínico y las pruebas de laboratorio. La determinación de anticuerpos específicos de las clases IgA, IgG e IgM contra antígenos concretos del VEB (VCA, EBNA-1, EA-D) utilizando el método ELISA es una herramienta poderosa para detectar y determinar el estadio de la infección por el VEB.

VCA: Los anticuerpos de clase IgG anti-VCA tienen un carácter anamnésico y persisten en los individuos infectados de por vida. La seroconversión puede detectarse en la fase temprana de la infección primaria. Un aumento significativo de los anticuerpos de clase IgG anti-VCA es indicativo de reinfección o reactivación. La determinación de la avidez de los anticuerpos de clase IgG permite diferencias entre una infección primaria y pasada o reactivación. Las respuestas de los anticuerpos de clases IgM e IgA son típicas de infección activa. Normalmente hay presentes niveles elevados de IgM anti-VCA en las fases aguda y convaleciente de la MI, mientras que en la reactivación del VEB la respuesta de IgM es lenta y, a menudo, indetectable, y la respuesta de IgA es más pronunciada. Tras la recuperación, tanto los anticuerpos de clase IgM como IgA pueden persistir durante varias semanas o meses.

EBNA-1: Durante la fase aguda de la infección primaria se detectan los anticuerpos de clase IgM, mientras que la respuesta de los anticuerpos de clase IgG se retrasa. La ausencia de IgG anti-EBNA con presencia concomitante de IgG e IgM anti-VCA es un marcador diagnóstico de mononucleosis infecciosa. La ausencia a largo plazo de anticuerpos IgG anti-EBNA-1 puede indicar inmunodeficiencia.

EA-D: Los anticuerpos de las clases IgM e IgG contra el antígeno EA-D son marcadores adicionales de infección primaria por el VEB. Normalmente hay


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presencia de títulos altos de anticuerpos IgG anti-EA-D en las fases convaleciente y aguda tardía de la mononucleosis infecciosa.

2 Principio del test

El kit permite la detección de anticuerpos específicos de la clase IgM en una muestra mediante un ELISA tipo sándwich (es decir, una fase fija recubierta con un antígeno específico - anticuerpo de la muestra de ensayo - anticuerpo marcado). El anticuerpo marcado (conjugado) es una fracción de inmunoglobulina animal contra IgM humana, conjugada con peroxidasa de rábano picante. En la prueba, la actividad de la peroxidasa viene determinada por un sustrato con TMB, que adquiere un color azul en el caso de positividad. Después de añadir una solución de parada, el color azul cambia a amarillo. La intensidad del amarillo se mide utilizando un fotómetro a 450 nm, y es proporcional a la concentración de anticuerpos IgM específicos presentes en la muestra.

Antígeno utilizado

Antígenos recombinantes con epítopos inmunodominantes altamente específicos del EBNA-1 del VEB


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3 Composición del conjunto

Placa de microtitulación 1 ud.

recubierta con antígeno, 12 x 8 pocillos separables en una bolsa con desecante

Control negativo 1 × 2 ml

La solución no contiene anticuerpos humanos específicos, en dilución de trabajo

CUT-OFF 1 × 3 ml

La solución contiene anticuerpos humanos específicos en concentración límite, en dilución de trabajo

Control positivo 1 × 2 ml

La solución contiene anticuerpos humanos específicos en dilución de trabajo

Conjugado 1 × 15 ml

La solución contiene inmunoglobulina animal contra la IgM humana marcada con peroxidasa, en dilución de trabajo.

Solución de dilución de muestras 11 1 × 105 ml

Tampón con estabilizadores de proteínas y reactivo absorbente IgG/RF, en dilución de trabajo

Solución de TMB 1 × 15 ml

Solución de sustrato cromogénico con

TMB/H2O2, en dilución de trabajo

Solución de lavado 1 × 75 ml

Tampón concentrado 20 veces

Solución de parada 1 × 15 ml

Solución de ácido en dilución de trabajo

Instrucciones de uso 1 ud.


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4 Otro equipamiento necesario para hacer el test de forma manual

Pipetas sencillas y multicanal

Puntas desechables

Dispositivo de lavado

Temporizador

Incubadora (37 ºC)

Lector de microplacas

5 Almacenamiento y estabilidad

Almacene los kits a temperatura entre +2 ºC y +8 ºC. No se deben congelar. Si se observan las condiciones de almacenamiento, la fecha de caducidad es válida. La fecha de caducidad se indica en el envase. Tras la apertura del kit se recomienda utilizarlo dentro de los tres meses siguientes.

Dilución y almacenamiento de muestras

Como muestra para el examen se pueden usar los siguientes fluidos del cuerpo humano: suero y plasma citratado. Las muestras con contaminación bacteriana, hemolíticas o de quilosano y los anticoagulantes contenidos en el plasma (excepto el citrato) pueden afectar el resultado de la prueba.

Las muestras se pueden almacenar a entre + 2 ºC y + 8 ºC durante una semana. Para un almacenamiento más prolongado, almacene las muestras a -20 ºC. Las muestras diluidas deben utilizarse lo antes posible.

6 Preparación de soluciones de trabajo

Diluya la solución de lavado 1:20 (1 parte de solución y 19 partes de agua destilada). Por ejemplo, 75 ml de solución de lavado concentrada + 1425 ml de agua destilada.

En el frasco con solución de lavado concentrada se pueden formar cristales de sal. Es necesario disolver estos cristales antes del uso calentando el frasco en un baño de agua caliente. La solución diluida es estable durante una semana a entre +2 ºC y +8 ºC.

Los controles (positivo, negativo y CUT-OFF) se hacen en solución de trabajo, ¡no diluir más!

¡El conjugado está en la solución de trabajo, no diluir más!

Solución de TMB es una solución de sustrato cromogénico de un componente en dilución de trabajo, ¡no diluir más!


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Intercambiabilidad de las soluciones

La Solución de dilución de muestras, la Solución de TMB y la Solución de avidez son intercambiables entre algunos ELISA de DIAsource ImmunoAssays S.A., siempre que tengan la marca numérica idéntica (p. ej., Solución de dilución de muestras 2, Solución de dilución de muestras 3, etc.). Se puede solicitar más información relativa a esta intercambiabilidad a DIAsource ImmunoAssays S.A.

7 Dilución de muestras

Mezcle bien antes del uso la solución de dilución de muestras.

Dilución de muestras de suero y plasma

Diluya las muestras bien mezcladas 1:101 en solución de dilución de muestras:

p. ej.: 10 µl de muestra + 1 ml solución de dilución de muestra

Mezcle bien e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente.

8 Procedimiento de trabajo

Deje que todos los reactivos se alcancen la temperatura del laboratorio y mezcle bien. Si no utiliza toda la placa, devuelva las tiras sobrantes al embalaje con secante, ciérrelo herméticamente y almacénelo a entre +2 ºC y +8 ºC. ¡Protéjalo de la humedad!

1. Dosifique los controles y las muestras diluidas según el esquema de trabajo.

• Deje el pocillo A1 vacío (blank).

• Pipetee 100 µl del control negativo en 1 pocillo.

• Pipetee 100 µl de CUT-OFF en 2 pocillos.

• Pipetee 100 µl de control positivo en 1 pocillo.

• En los pocillos restantes pipetee 100 µl de muestras en la dilución correspondiente (véase el capítulo Dilución de muestras).

2. Cubra la placa con una cubierta e incúbela a 37 ºC durante 30 minutos.

3. Absorba el contenido de los pocillos y lave 5 veces con solución de lavado de trabajo. Llene los pocillos hasta el borde superior. Finalmente, sacuda bien los restos de solución en material absorbente.

4. Dosifique 100 µl conjugado en todos los pocillos excepto A1.

5. Cubra la placa con una cubierta e incúbela a 37 ºC durante 30 minutos.

6. Absorba el contenido de los pocillos y lave 5 veces con solución de lavado de trabajo. Llene los pocillos hasta el borde superior. Finalmente, sacuda bien los restos de solución en material absorbente.

7. Pipetee 100 µl de solución de TMB en todos los pocillos. Cuidado con la suciedad, véase el capítulo Condiciones técnicas.


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8. Cubra la placa con una cubierta e incúbela a 37 ºC durante 30 minutos. Manténgala protegida de la luz.

9. Detenga la reacción añadiendo 100 µl de solución de parada en el mismo orden e intervalos como se dosificó el sustrato.

10. Mida en el fotómetro a una longitud de onda de 450 nm la intensidad del color de la solución en los pocillos contra el blank (pocillo A1), hasta 30 minutos tras pararse la reacción.

9 Esquema de trabajo

BL TS 4

NC TS 5

CO

CO

PC

TS 1

TS 2

TS 3

A

B

C

D

E

G

H

F

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

BL Blank (pocillo vacío)

NK 100 µl

CO 100 µl

PK 100 µl

TV 1-x 100 µl muestra analizada diluida


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10 Validez del test

El test es válido si:

La absorbancia del blank es menor que 0,150.

BLANK < 0,150

La absorbancia del control negativo es menor que la mitad de la absorbancia media de CUT-OFF.

< 0,5 ×

La absorbancia media de CUT-OFF está en el rango 0,150 – 0,900.

0,150 < < 0,900

La absorbancia del control positivo es mayor que la absorbancia media de CUT‒OFF.

>

11 Valoración de los resultados

Cálculo del índice de positividad (IP)

Divida la absorbancia de la muestra de prueba por la absorbancia CUT-OFF media, medida en la misma serie de exámenes:

La valoración de los resultados de la prueba se indica en la Tabla 1.

Tabla 1 Valoración de los resultados

Índice de positividad (IP)

Valoración

menor que 0,9 negativo

de 0,9 a 1,1 límite

mayor que 1,1 positivo

El examen de muestras de límite, es decir, con un índice positivo de 0,9 a 1,1, se debe repetir a partir de una nueva muestra recogida entre 2 y 6 semanas después, teniendo en cuenta las especificidades de la enfermedad.


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El hallazgo serológico se puede interpretar solo en el contexto de los resultados de los otros test de laboratorio y con el cuadro clínico del paciente.

12 Seguridad en el trabajo

El kit está destinado solo para fines de diagnóstico in vitro.

Los sueros utilizados en la producción de controles se examinaron para detectar VIH 1 y VIH 2, HBsAg, VHC, TPHA, con resultado negativo. A pesar de ello, es necesario tratarlos como material potencialmente infeccioso.

Algunos reactivos contienen un componente tóxico, la azida de sodio. Evite el contacto con la piel.

La solución de parada contiene solución diluida de ácido. ¡Cuando trabaje con esta solución protéjase los ojos y la piel!

Es necesario seguir la normativa local en relación con la seguridad en el trabajo.

Para obtener más información, consulte la hoja de datos de seguridad de la solución de parada.

Primeros auxilios

En caso de contacto con los ojos, enjuague los ojos con abundante agua tibia y busque ayuda médica. En caso de contacto con la ropa y la piel, retire toda la vestimenta contaminada. Lave la piel con abundante agua y jabón. Desinfecte la piel en caso de contacto con soluciones que contengan plasma o muestras clínicas. En caso de ingestión accidental, enjuáguese la boca con agua potable y busque ayuda médica.

Eliminación de los restos

Todos los accesorios utilizados para el test es necesario considerarlos como potencialmente infecciosos debido al contacto con material biológico. Por ello, debe deshacerse de ellos junto con los residuos biológicos.

Eliminación de kits caducados

Desmonte el kit y deseche los componentes como material biológico. Deseche el embalaje y los residuos del embalaje de acuerdo con las normativas locales.

13 Condiciones técnicas

Para lograr resultados fiables, es necesario cumplir estrictamente con el manual. Utilice siempre puntas y materiales de vidrio limpios y preferiblemente desechables.

Placa de microtitulación – antes de abrir, deje siempre que la bolsa con la placa de microtitulación alcance la temperatura ambiente para evitar la condensación del vapor de agua en la superficie de la placa.


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Solución de lavado – utilice agua destilada de alta calidad para preparar la solución de lavado en dilución de trabajo.

Lavado – siga el número prescrito de ciclos de lavado y llene siempre el pocillo hasta el borde superior. El tiempo en que los pocillos permanecen llenos con la solución entre ciclos de lavado (tiempo de remojo) debe ser de unos 30-60 segundos.

Solución de TMB – no utilice para otros reactivos el recipiente de pipeteo multicanal. No devuelva el resto de la solución TMB del recipiente de la pipeta al vial.

Los resultados no reproducibles pueden venir de errores metodológicos, en especial:

• mezcla insuficiente de la solución y las muestras antes del uso

• reemplazo inadecuado de las tapas de los viales

• uso de la misma punta para pipetear diferentes soluciones

• exposición del reactivo a una temperatura excesiva; contaminación bacteriana o química

• lavado o llenado insuficiente los pocillos (los pocillos se deben llenar hasta el borde superior), mala aspiración de los restos de solución de lavado

• contaminación de los bordes de los pocillos con conjugado o muestras

• uso de reactivos de distintos lotes de kits

• contacto de los reactivos con antioxidantes, metales pesados y sus sales

El kit se puede utilizar para análisis secuenciales. Cuando prepare las soluciones de trabajo, utilice solo las cantidades de reactivos necesarios para el análisis.

El kit se podría utilizar en todos los tipos de analizadores de ELISA automáticos.

Si es necesario, DIAsource ImmunoAssays S.A. puede ofrecer una modificación certificada de las instrucciones de uso para tipos concretos de analizador.

En caso de no observarse estrictamente las instrucciones del procedimiento de trabajo, el fabricante no está en disposición de garantizar el correcto funcionamiento del kit.


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Resumen del protocolo de EPSTEIN BARR VIRUS EBNA IgM ELISA

Paso n.º Símbolo Pasos de la prueba

1

Diluir muestras

suero/plasma 1:101 (10 µl + 1 ml)

2

Incube a temperatura ambiente durante 10 min

3

Pipetee los controles y las muestras diluidas – 100 µl

Blank = pocillo vacío

4

Incubar a 37 °C durante 30 min

5

Aspirar y lavar los pocillos 5×

6

Pipetear el conjugado – 100 μl

Blank = pocillo vacío

7


8

Aspirar y lavar los pocillos 5×

9

Pipetee el sustrato (Solución de TMB) – 100 µl

Incluyendo los blanks

10


11

Pipetear solución de parada – 100 µl

Incluyendo los blanks

12

Medir la intensidad cromática a 450 nm

Date post:	19-Jul-2020
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EPSTEIN BARR VIRUS EBNA IgM ELISA · Epstein-Barr virus (EBV) is a member of the Herpetoviridae...

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