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Submitted on 1 Jan 2001

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Expression protéique, protéome Caractérisation desfacteurs d’hôtes affectant la sécrétion de protéines

hétérologues chez Lactococcus lactisPhilippe Langella, Sébastien Nouaille, Jacqueline Commissaire, Alexander

Bolotine, Alexandra Gruss, Yves Le Loir

To cite this version:Philippe Langella, Sébastien Nouaille, Jacqueline Commissaire, Alexander Bolotine, Alexandra Gruss,et al.. Expression protéique, protéome Caractérisation des facteurs d’hôtes affectant la sécrétion deprotéines hétérologues chez Lactococcus lactis. Le Lait, INRA Editions, 2001, 81 (1-2), pp.19-28.�10.1051/lait:2001109�. �hal-00895455�

Expression protéique, protéome

Caractérisation des facteurs d’hôtes affectantla sécrétion de protéines hétérologues

chez Lactococcus lactis

Philippe LANGELLA, Sébastien NOUAILLE, Jacqueline COMMISSAIRE,Alexander BOLOTINE, Alexandra GRUSS, Yves LE LOIR*

Génétique Appliquée, URLGA-INRA, 78352 Jouy-en-Josas Cedex, France

Abstract — Characterization of host factors affecting heterologous protein secretion inLactococcus lactis. Lactococcus lactisis the model organism for Lactic Acid Bacteria (LAB) and isa GRAS bacterium. It is therefore a good candidate for the secretion of heterologous proteins oftherapeutic interest. In order to investigate new potential uses for LAB, we study host factors involvedin the production, the stability and/or the secretion of heterologous proteins in L. lactis. Our strategyuses a random insertional mutagenesis performed on a L. lactisMG1363 derivative strain carryinga uspnuccassette in its chromosome. The uspnuccassette encodes a hybrid precursor composed ofthe signal peptide of the Usp45 secreted protein and the staphylococcal nuclease (Nuc) which isused here as a reporter protein for the secretion process. Nuc activity of bacterial colonies is readilydetectable in vivo and this provides an efficient screening for the selection of secretion mutants. Wethus selected and analyzed six L. lactismutants affected in Nuc secretion. Five out of the 6 corre-sponding genes were identified. Three of them seem to be involved in the production and/or secre-tion of proteins: 2 genes are homologous to unknown peptidases and one is homologous to a genelocated downstream of a transcription regulator. Combination of different strategies should providenew insight of the secretion process in L. lactisand could result in the construction of secretionmutants with enhanced capacities.

Lactococcus lactis / secretion / heterologous protein / random mutagenesis

Résumé — Lactococcus lactis, bactérie lactique modèle, présente une parfaite innocuité hygiénique.Elle constitue, de ce fait, un bon candidat pour la sécrétion de protéines d’intérêt thérapeutique. Unepartie de nos travaux dans ce domaine concerne la caractérisation des facteurs d’hôte impliqués dansla production, la stabilité et/ou la sécrétion de protéines hétérologues chez L. lactis. La stratégieemployée consiste en une mutagenèse par transposition aléatoire sur le chromosome. Cette mutage-nèse est menée sur une souche de L. lactisportant une cassette uspnucintégrée sur le chromosome.La cassette uspnuccode pour un précurseur hybride composé du peptide signal d’Usp45, protéine

Lait 81 (2001) 19–28 19© INRA, EDP Sciences, 2001

* Correspondance et tirés-à-partTél. : (33) 1 34 65 20 91 ; fax : (33) 1 34 65 20 65 ; e-mail : leloir@biotec.jouy.inra.fr

Ph. Langella et al.

1. INTRODUCTION

L’efficacité de sécrétion d’une protéinedépend de ses caractéristiques intrinsèquestelles que son peptide signal (PS) et/ou sastructure, mais également de la capacité del’organisme hôte à prendre en charge le pré-curseur. Chez les bactéries, différents sys-tèmes interviennent pour assurer la sécré-tion des protéines. Certains sont spécifiquesd’une protéine (par exemple, couple bacté-riocine-transporteur ABC), d’autres pren-nent en charge une grande variété de pré-curseurs. C’est le cas de la voie générale desécrétion (VGS) qui assure la sécrétion de lamajorité des protéines sécrétées (caractéri-sées par un PS en position N-terminale duprécurseur). Nous nous intéressons à la VGSde Lactococcus lactisdont peu d’élémentsont été identifiés, et ce, en dépit du séquen-çage du génome de L. lactis [1]. Dix-septet 15 gènes de la VGS ont été identifiés res-pectivement chez Escherichia coliet chezBacillus subtilis[8, 12]. L’analyse de laséquence du génome de L. lactisn’a per-mis l’identification que de 6 de ces facteurs :deux signal peptidases (qui clivent les PSdes précurseurs), deux protéines de la machi-nerie de sécrétion (SecY, élément du Trans-locon, complexe assurant la translocationdu précurseur à travers la membrane cyto-plasmique et SecA qui pilote le précurseurvers le Translocon) et enfin, Ffh et FtsY(éléments du complexe chaperon qui

permettent l’arrimage du précurseur à lamembrane et sa prise en charge par le Trans-locon). Du point de vue de la sécrétion deprotéines, les lactocoques ne sécrètent enquantité détectable qu’une seule protéine,Usp45, de 45 kg.mol–1 et de fonction incon-nue [15].

Pour une meilleure connaissance des fac-teurs d’hôtes impliqués dans la sécrétion,une approche par mutagenèse aléatoire a étéinitiée au laboratoire. Ces recherches aurontpour conséquence, sur un plan cognitif, unemeilleure connaissance des gènes impliquésdans la sécrétion de protéines chez L. lactis.Sur un plan appliqué, elles permettront laconstruction de mutants hypersécréteurs uti-lisables pour la production de protéinesd’intérêt.

L’outil employé pour la mutagenèse partransposition aléatoire, pGhost:ISS1, estcomposé d’un plasmide à réplication ther-mosensible contenant une séquence d’inser-tion (ISS1, isolée de L. lactis) capable des’insérer de manière aléatoire dans le chro-mosome [7].

L’identification de mutants altérés dans lasécrétion est effectuée à l’aide d’une pro-téine rapporteur de la sécrétion, la nucléasede Staphylococcus aureus(Nuc) [14]. ChezS. aureus, Nuc est synthétisée sous formede précurseur (préNuc). Lors de la sécré-tion, le PSNuc est clivé et deux formes sécré-tées sont détectées : NucB (18,8 kg.mol–1) etNucA (16,5 kg.mol–1). NucA résulte du

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sécrétée par L. lactis,et de la partie mature de la nucléase de Staphylococcus aureus(Nuc) utilisée icicomme protéine rapporteur de la sécrétion. L’activité de Nuc, facilement détectable in vivo sur les colo-nies bactériennes, constitue un crible efficace pour la sélection de mutants affectés dans la sécrétion.Six mutants de L. lactisaffectés dans la sécrétion de Nuc ont ainsi été sélectionnés et analysés. Cinqdes 6 gènes correspondants ont été identifiés. Trois semblent particulièrement impliqués dans laproduction et la sécrétion de protéines : 2 sont homologues à des gènes de peptidases inconnues et unest homologue à un gène situé dans une région potentiellement régulatrice d’un facteur de trans-cription. Différentes approches par mutagenèse devraient déboucher sur une meilleure connaissancede la machinerie de sécrétion de L. lactis et la construction de mutants hyperproducteurs ou hyper-sécréteurs.

Lactococcus lactis / sécrétion / protéine hétérologue / mutagenèse aléatoire

Mutants de sécrétion de Lactococcus lactis

a pour but de : (i) s’affranchir de l’utilisationde 2 plasmides et de 2 sélections antibio-tiques lors de la mutagenèse (le système demutagenèse aléatoire utilisé repose déjà surun plasmide : pGhost:ISS1) et (ii) minimiserla sélection de faux mutants qui seraientaffectés dans le nombre de copies du plas-mide (portant la cassette nuc) plutôt quedans le processus de sécrétion lui-même.La cassette uspnuca été intégrée sur le chro-mosome, au locus his (opéron de biosyn-thèse de l’histidine, inactif chez la soucheMG1363 [3]) par un double crossing-over(Fig. 1). La construction a été contrôlée paranalyse Southern et hybridation sur l’ADNchromosomique extrait de la souche. Lasécrétion de Nuc a été analysée par Wes-tern blot et immunorévélation et l’efficacitéde sécrétion (ES) de Nuc (i.e. le rapportentre les formes matures de Nuc sur la tota-lité des formes détectées) a été évaluée.Comme attendu au vu des résultats déjàobtenus avec des constructions plasmidiques(Le Loir et al., manuscrit en préparation),la souche MG1363[uspnuc] présente uneES optimale : l’ES est supérieure à 95 % etil n’y a pas de précurseur préUspNuc dans lafraction cellulaire. Dans le surnageant, NucBapparaît sous forme d’un doublet qui pour-rait être attribué à un site de clivage alternatifde PSUsp. La séquence protéique de pré-UspNuc a été soumise à une analyse pré-dictive des sites de clivage de peptidessignaux (site Expasy tools, http: //www.expasy.ch/tools/). Cette analyse ne révèlequ’un seul site de clivage du PSUsp, et nepermet donc pas d’expliquer la présence dudoublet. NucA, résultant d’un clivage pro-téolytique secondaire de NucB (éliminationdes 21 résidus N-terminaux), est minoritaireet détectée sous forme d’une seule bandedans le surnageant. Cette souche est doncappropriée pour l’identification de mutantshyposécréteurs (halo plus petit que celui dela souche parentale). Nous présenterons iciles premiers résultats obtenus lors d’unemutagenèse sur la souche MG1363[uspnuc].

clivage protéolytique du propeptide (19 rési-dus N-terminaux) de NucB. Les deuxformes sécrétées, Nuc B et A, sont actives.

Le crible Nuc d’activité nucléolytiquepermet de détecter in vivo des coloniessécrétant plus ou moins Nuc [4–6]. Desmutants hypersécréteurs apparaîtront entou-rés d’un halo intense, et des mutants hypo-sécréteurs entourés d’un halo faible ou nul.

L’intégration de pGhost:ISS1dans ungène aboutit dans la majorité des cas àl’inactivation du gène touché, mais elle peutégalement entraîner sa dérégulation. Cettemutagenèse par insertion aléatoire ne per-met pas d’identifier des gènes essentiels.Par contre, elle permet une approche aléa-toire et l’identification de gènes non essen-tiels impliqués dans la production, la stabi-lité, le repliement et/ou la sécrétion desprotéines. Après sélection du mutant et iden-tification du gène touché, ce système per-met après excision du plasmide pGhost:ISS1d’obtenir un excisant du mutant ne conte-nant plus que le gène interrompu par uneISS1.

Les résultats suivants ont été obtenus encombinant le crible Nuc et l’utilisation dupGhost :ISS1. La mutagenèse aléatoire a étémenée sur la souche de L. lactisMG1363[uspnuc] construite pour ce travail.

2. RÉSULTATS ET DISCUSSION

2.1. Construction d’une souchede L. lactismodifiéepour la mutagenèse

Nous avons construit une souche deL. lactisMG1363 portant, sur son chromo-some, une copie d’un gène hybride uspnucconstitué des signaux de transcription, tra-duction et sécrétion du gène usp45et dufragment d’ADN codant pour la partiemature de Nuc (NucB, [14]). Le produit dece gène hybride est un précurseur, préUsp-Nuc, composé du peptide signal d’Usp45(PSUsp) fusionné à NucB. Cette construction

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Ph. Langella et al.

2.2. Identification de mutants altérésdans la sécrétion et confirmationdes phénotypes Nuc

Une mutagenèse aléatoire a été menéesur la souche MG1363[uspnuc]. Environ

15000 mutants ont été criblés sur leur activiténucléolytique et 17 mutants présentent,in vivo, une sécrétion de Nuc affectée parrapport à la souche parentale. L’identificationdes 17 mutants par le crible « bleu/rose »,basé sur la taille des halos, dépend de la

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Figure 1. Construction de la souche parentale L. lactisMG1363[uspnuc]. La cassette uspnuca étéclonée dans un fragment de chromosome de L. lactis MG1363 correspondant à la région his (opéronde biosynthèse de l’histidine, inactif chez MG1363). Le vecteur utilisé est pGhost4, plasmide à répli-cation thermosensible (rep ts). La construction a été établie chez L. lactis, à 30 °C (températurepermissive pour la réplication du pGhost4). Par passage à 37 °C, un événement de recombinaisonhomologue par simple crossing-over a été sélectionné (SCO, phénotype Nuc+ et Erythromycinerésistant). Le mutant obtenu est stable à 37 °C. Une culture à 30 °C de ce mutant SCO entraînel’activation de la réplication du pGhost4 ce qui déstabilise la région d’intégration en générant del’ADN simple brin, hautement recombinogène. Un deuxième événement de recombinaison homologuepeut alors intervenir. La structure finale résultant d’un double crossing-over (DCO) aboutit à unretour au phénotype sauvage (DCO2) ou à l’obtention du mutant désiré MG1363[uspnuc] (DCO1, phé-notype Ery sensible et Nuc+).Figure 1. Construction of the parental strain L. lactisMG1363[uspnuc]. The uspnuccassette was clonedinto a MG1363 hischromosomal fragment (non expressed in MG1363) on pGhost4, a thermosensi-tive vector. The plasmid was introduced in L. lactis. The strain was grown at 30 °C, permissive tem-perature for pGhost4 replication. A single crossing-over event was selected after growth at 37 °C. TheSCO mutant is then grown at 30 °C where pGhost4 replicates and generates a structure stimulatinghomologous recombination through a fragment upstream (DCO2) or downstream (DCO1) the usp-nuccassette. The actual mutant resulting from a double crossing-over event is identified by Nuc+ andEryS phenotypes.

Mutants de sécrétion de Lactococcus lactis

révélées par Western, chez M2 ne sont passignificativement différentes de celles sécré-tées par la souche parentale, alors qu’il avaitété identifié sur boîte comme mutant hyper-sécréteur. Par contre, M2 présente un profilatypique de sécrétion caractérisé par la dis-parition de la bande supérieure du doublet deNucB ce qui peut suggérer l’absence de cli-vage alternatif du PS. L’immunorévélationde NucB sous forme d’un singulet (bandeinférieure atténuée) observé ici pour M1 n’apas été confirmée. Le mutant M1 sécrèteNucB sous forme d’un doublet, comme lasouche parentale.

Dans les fractions cellulaires, il y a accu-mulation de précurseur pour M2 et M9 et,dans une moindre mesure pour M4 et M14.

capacité des cellules à sécréter Nuc maisaussi d’autres paramètres tels que la taillede la colonie, sa « vitalité » après mutage-nèse et/ou la densité des colonies sur laboîte. Les Western effectués sur des cul-tures en phase stationnaire des 17 mutantsont permis de déterminer que seulement6 d’entre eux sont réellement affectés dansla sécrétion de Nuc (Fig. 2). Les phénotypesobservés in vivo chez les 11 autres semblentdonc être dus aux limites du crible pouvantentraîner la sélection de mutants faux posi-tifs.

L’analyse par Western des surnageants deculture a montré que M1, M13 et M14 sonthyposécréteurs et que M4 et M9 sont hyper-sécréteurs. Les quantités de Nuc sécrétées,

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Figure 2.Confirmation des phénotypes Nuc des 6 mutants identifiés. Les extraits des protéines pré-sentes dans les fractions cellulaires (C) et dans le milieu de culture (S) en phase stationnaire sont trai-tés par SDS-PAGE et immunorévélés avec des anticorps anti-Nuc. La souche témoin utilisée est lasouche parentale MG1363[uspnuc] contenant le gène hybride uspnucsur le chromosome. Troisformes de Nuc sont détectées, le précurseur (préUspNuc), et les 2 formes sécrétées : NucB sousforme d’un doublet et NucA. Les phénotypes Nuc observés sur boîte sont rappelés sous l’immuno-révélation.Figure 2.Confirmation of Nuc phenotypes for the 6 identified mutants. Protein samples from cellular(C) and supernatant (S) fractions of stationary phase cultures were analyzed by immunorevelation onWestern blot after SDS-PAGE. Secretion of Nuc in the 6 mutants was compared to the parentalstrain MG1363[uspnuc]. Three Nuc forms were detected : the precursor form (preUspNuc) and2 secreted form NucB (as a doublet) and NucA. Nuc phenotypes observed on Petri plates are givenbelow the Western blot.

Ph. Langella et al.

Ceci suggère une diminution de l’ES de Nucdans ces mutants. Celle-ci n’est probable-ment pas liée à la saturation de la machine-rie de sécrétion consécutive à la surproduc-tion de préUspNuc chez M4 et M9. En effet,des niveaux de production nettementsupérieurs ont déjà été obtenus à l’aide deconstructions plasmidiques et aucune accu-mulation de préUspNuc n’a été observée(Le Loir et al., manuscrit en préparation).Dans le cas de M2 et M14, l’accumulationde précurseur pourrait résulter d’une muta-tion altérant la biosynthèse (ou la régula-tion) d’un facteur nécessaire à la sécrétion depréUspNuc. La forme NucA est détectéedans la fraction cellulaire des mutants M1,M4 et M9. Aucune corrélation ne sembleexister entre cette présence et le phénotypeNuc.

À l’exception de M2, l’analyse des phé-notypes par Western a donc confirmé lesphénotypes observés avec le test in vivo réa-lisé sur les colonies bactériennes.

2.3. Obtention d’excisants des mutants

Les analyses des mutants s’effectuent à37 °C et en présence d’érythromycine afinde maintenir le plasmide pGhost:ISS1inté-gré sur le chromosome. Ces conditions deculture constituent un stress pour les mutantset empêchent une comparaison directe etrigoureuse avec la souche parentale (cultivéeà 30 °C et sans antibiotique). Le plasmidepGhost:ISS1a donc été excisé des 6 mutantsafin de ne conserver que l’ISS1au sited’insertion. Obtenir ces excisants (notés E)revêt deux intérêts : (i) s’assurer que la muta-tion identifiée n’est ni dépendante de la tem-pérature, ni de la résistance à l’antibiotiqueet (ii) analyser la mutation dans les mêmesconditions que la souche parentale. Le phé-notype Nuc des excisants, analysé par Wes-tern (résultats non présentés), sont compa-rables à ceux des mutants correspondants :E1, E13 et E14 conservent un phénotypeNuc–, E4 et E9 un phénotype Nuc+. E2garde le profil atypique de sécrétion de Nuc.

Nous pouvons ainsi conclure que les phé-notypes Nuc observés sont indépendants del’antibiotique et de la croissance à 37 °C.Les souches ainsi obtenues portent unemutation stable à 30 °C, température opti-male de croissance de L. lactis.

2.4. Identification des gènes mutés

L’étape suivante a consisté à identifierle gène dans lequel pGhost:ISS1s’est inté-gré. L’outil de mutagenèse utilisé permetde cloner chez E. coli et de séquencer lesfragments d’ADN chromosomique adja-cents (côté EcoRI et côté HindIII) au sited’intégration de pGhost:ISS1[7].

Le clonage des jonctions EcoRI et HindIIIa été mené sur les 6 mutants précédemmentanalysés. Cependant, pour des raisons tech-niques (insert de trop grande taille outoxique pour E. coli), certaines jonctionsn’ont pu être obtenues. Sur les jonctions clo-nées, la taille de l’insert a été estimée et laséquence nucléotidique déterminée. Lesséquences ont été utilisées pour rechercherdes homologies par comparaison avec laséquence du génome de L. lactis. Les résul-tats des homologies, la taille de l’insert, ainsique les probabilités d’incertitude de ceshomologies sont rassemblés dans le tableau I.

Les homologies obtenues permettent declasser les gènes touchés dans 2 catégories.La première comprend M9 et M14 touchésdans des gènes qui ne sont pas directementimpliqués dans la sécrétion mais qui l’affec-tent indirectement à travers des perturba-tions du métabolisme global de la cellule.La seconde catégorie regroupe des gènesinconnus susceptibles d’intervenir dans lasynthèse, la maturation ou la sécrétion d’uneprotéine hétérologue (M1, M2 et M4).

2.4.1. Cas de M9, M13 et M14

Seuls M9 et M14 ont été identifiés parséquençage de leurs deux jonctions. L’homo-logie obtenue avec la jonction HindIII de

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Mutants de sécrétion de Lactococcus lactis

perturbation dans le métabolisme généralde la cellule aboutissant à une sous-pro-duction (ou à la dégradation) de préUsp-Nuc.

2.4.2. Cas de M1, M2 et M4

Les données de séquence concernantM1 établissent une homologie avec le gèneyxePde B. subtilisqui code pour une pro-téine putative de 380 acides aminés (aa ;41,6 kg.mol–1), de fonction inconnue et clas-sée dans la famille des peptidases M40 (clas-sification Rawlings et Barrett, site expasytools, http://www.Expasy.ch/tools/). Cettefamille ne contient aucune protéine carac-térisée.

Concernant M2, les recherches d’homo-logies ont montré que le gène potentiel tou-ché, yugD, est homologue au gène yegQd’E. coli(P(N) = 10–75) qui spécifie une pro-téine putative de 453 aa (51,2 kg.mol–1) pré-sentant un motif spécifique des peptidases dela famille U32 (Rawlings et Barrett, siteexpasy tools, http://www.Expasy.ch/tools/)qui contient une seule protéine caractérisée,

M13 n’est pas significative et ne peut êtreprise en compte. Le clonage des jonctionsmanquantes est en cours et permettra deconfirmer ou d’identifier (cas de M13) legène touché.

Les deux jonctions de M9 présentent del’homologie avec un gène codant pour uneprotéine impliquée dans le transport dupotassium entre le milieu extérieur et la cel-lule. Cette mutation doit affecter le méta-bolisme cellulaire et entraîner, pour des rai-sons non élucidées, une surproduction depréUspNuc aboutissant au phénotype Nuc+

précédemment observé.

M14 est touché dans un gène impliquédans le système PTS (Phosphoenolpyru-vate:carbohydrate phosphotransferase sys-tem). Ce système, par l’intermédiaire deplusieurs enzymes activées par des cascadesde phosphorylation, est utilisé par la cellulepour choisir la source de carbone la plusappropriée lorsque plusieurs sont dispo-nibles dans le milieu [11]. M14 présenteune croissance très ralentie par rapport àla souche parentale. Ces résultats suggèrentque le phénotype Nuc– résulte d’une

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Tableau I. Recherche d’homologie de séquence chez les gènes mutés. Les séquences des jonctionsobtenues ont été comparées à la séquence complète du génome de L. lactis IL1403. P(N) corres-pond à la probabilité que l’homologie de séquence soit obtenue par erreur. On considère qu’unehomologie obtenue avec une P(N) supérieure à 10–10n’est pas significative.Table I. Homology of the mutated genes. Sequences of the cloned junctions were compared to thecomplete genome sequence of L. lactis IL1403. P(N) is the probability that the homology is obtainedby error. A homology with a P(N) above 10–10 is not significant.

Mutant Jonction Taille de Gène de Homologie P(N) l’insert (kb) L. lactistouché

M1 EcoRI 1,2 yahD yxeP, B. subtilis, peptidase de la famille M40 10–16

M2 HindIII 0,65 yugD yegQ, E. coli, peptidase de la famille U32 10–75

M4 HindIII 1,3 yhfF yorV, C. acetobutylicum, protéine inconnue 10–41

M9 EcoRI 0,9 kup2 kup, E.coli, protéine de transport du potassium 10–42

HindIII 1,3 kup2 kup, E.coli,protéine de transport du potassium 10–59

M13 HindIII 0,9 / Homologies non significatives 0.6

M14 EcoRI 1,3 yreD ptnA, E. coli, système PTS 10–35

HindIII 1 yreD ptnA, E. coli, système PTS 10–21

Ph. Langella et al.

PrtC de Porphyromonas gingivalis, avecune activité collagènase nécessitant un cofac-teur métallique. L’analyse de la séquencepeptidique de la protéine putative YegQrévèle la présence de sites potentiels de phos-phorylation et prédit une localisation cyto-plasmique. La séquence peptidique, déduitede yugD, suggère elle aussi une localisationcytoplasmique. L’homologie avec une pep-tidase peut expliquer les phénotypes obser-vés sur la sécrétion de Nuc chez le mutantM2 : disparition d’une des bandes du doubletNucB et faible quantité de NucA (la pepti-dase touchée pourrait intervenir dans le cli-vage du PS et le clivage du propeptide).Cependant, ces 2 clivages interviennentaprès translocation (à l’extérieur de la cel-lule). Ceci serait incompatible avec la pré-diction de localisation cytoplasmique deYegQ sauf si l’on envisage une interactionentre YegQ et le translocon. Le clonage dela seconde jonction devrait nous apporterdes informations complémentaires soit enconfirmant que le gène touché est bien yegQ,soit en révélant une homologie avec un autregène.

Les recherches d’homologies ont mon-tré que le mutant M4 est touché dans le gèneinconnu yhfF, qui est homologue au gèneyorVde Clostridium acetobutylicumet ybaDde E. coli, deux gènes codant pour des pro-téines putatives de respectivement 129 aa(15,2 kg.mol–1) et 149 aa (17.2 kg.mol–1).Les fonctions de ces protéines sont incon-nues. La seule indication concernant cesgènes est leur localisation dans une région enaval d’un facteur de transcription sigmaG[13]. De par leur position, ces gènes pour-raient intervenir dans la régulation de la bio-synthèse de sigmaG ce qui pourrait avoirune action sur le niveau d’expression dupromoteur Pusp45.

3. CONCLUSIONET PERSPECTIVES

Une première mutagenèse a été menéesur une souche sécrétant efficacement la

nucléase Nuc. L’efficacité du test d’activiténucléolytique (halos rose plus ou moinsintenses) a permis de cribler rapidementenviron 15 000 colonies et d’identifier17 mutants affectés dans la sécrétion de Nuc.Les phénotypes Nuc de 6 des 17 mutantsisolés ont été confirmés. Ce résultat révèleune des limites du test puisque l’état phy-siologique des colonies après mutagenèsepeut biaiser le crible et conduire à sélec-tionner des mutants faux positifs. Les don-nées de séquence révèlent que 2 des6 mutants sont affectés dans le métabolismegénéral et non dans des fonctions directe-ment liées à la production ou à la sécrétionde protéines. Trois autres mutants semblenttouchés dans des gènes dont les fonctionsputatives permettent des corrélations plusdirectes avec les phénotypes d’altération dela sécrétion de Nuc observés. Aucune homo-logie significative n’a été trouvée pour ledernier, M13.

Il faut à présent caractériser de manièreplus précise ces gènes, notamment en clo-nant les jonctions manquantes afin de pré-ciser le contexte génétique de l’insertion etde confirmer les homologies obtenues.

Par ailleurs, nous avons débuté l’analysed’autres phénotypes, en particulier pour lemutant M2 (yugD) qui semble affecté dansle clivage de protéines sécrétées telles queNuc. À cet effet, nous avons choisi d’ana-lyser l’activité autolytique sur des extraitsprotéiques issus de l’excisant E2. En effet,AcmA, l’autolysine majeure de L. lactis, estune protéine extracellulaire subissant plu-sieurs clivages après translocation chez unesouche sauvage de lactocoque [2]. Nos résul-tats montrent que le mutant E2 produit leprécurseur d’AcmA dans la fraction cellu-laire et une forme mature dans le surnageant.Par contre, les formes issues des clivagessecondaires sont absentes du surnageant.Ceci confirme que E2 est altéré dans sacapacité à effectuer des clivages protéoly-tiques secondaires. Le gène touché, yugD, neprésente pas d’homologie avec le gène htrA,

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Mutants de sécrétion de Lactococcus lactis

RÉFÉRENCES

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codant pour une protéase de ménage, extra-cellulaire, récemment décrite chez L. lactisIL1403 [10]. La protéine YugD pourraitcependant être nécessaire à la maturationd’HtrA, ou elle pourrait exercer une fonctionsimilaire à celle d’HtrA chez L. lactisMG1363.

Nous comptons de même analyser la pro-duction et l’ancrage de PrtP, la protéase desurface de L. lactis [16], ainsi que la sécré-tion d’une autre protéine hétérologue,AmyS, l’α-amylase de Bacillus stearother-mophilus [9]. À cette fin, des plasmidescontenant les gènes prtP ou amySserontintroduits dans les excisants correspondantsaux différents mutants. L’analyse des clonesPrtP+ ou AmyS+ obtenus apportera d’autresinformations sur la capacité des mutants desécréter d’autres protéines hétérologues queNuc.

Une nouvelle campagne de mutagenèseest actuellement effectuée sur une souchede L. lactis MG1363[uspnucT] sécrétantmoins efficacement Nuc et accumulant duprécurseur préUspNucT. Son utilisation pourune nouvelle mutagenèse devrait orienter lecrible vers l’identification de mutants hyper-sécréteurs.

Les résultats obtenus démontrent l’inté-rêt d’une approche aléatoire dans l’analysed’un processus aussi complexe que la pro-duction et la sécrétion de protéines hétéro-logues chez L. lactis. La combinaison de lamutagenèse aléatoire et des données de lagénomique devrait nous permettre à moyenterme d’identifier plusieurs des gènes inter-venant dans ces processus.

REMERCIEMENTS

Nous remercions C. Delorme pour la séquencedu fragment his de MG1363 utilisé dans ce tra-vail, E. Maguin, pour le plasmide pGhost:ISS1,A. Sorokin pour les discussions concernant cetravail et S. Blugeon et C. Duplan pour leur pré-cieuse assistance technique.

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Ph. Langella et al.

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