" EXTRACClON Y PURlFlCAClON DE ACID0 GIBERELICO"
INFORME FINAL DE SERVICIO SOCIAL.
BIOTECNOLOGIA DE LANFt. . TRABAJO REALIZADO EN LAS INSTALACIONES DEL DEPARTAMENTO DE
~ +" I
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EFECTUADO POR: LAURA OFELIA
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h.. ' .)N: 1
ASESORADO POR: DR. C3UíLLERMQ:LARlOb DE ANDA
CONTENIDO
1 TITULO 2 INTRODUCCION 3 GENERALIDADES
3.1 GIBERELINAS 3.1.1 ESTRUCTURA QUlMlCA Y PROPIEDADES 3.1.2 PRODUCCION DE ACID0 GIBEREUCO 3.1.3 USOS
3.2 PRINCIPIOS DE EXTRACCION LIQUIDA 3.2.1 ANTECEDENTES 3.2.2 DEFINíCION 3.2.3 COEFICIENTE DE PARTICION 3.2.4 FACTOR DE EXTRACCION
3.3 OBJETIVO GENERAL 4 MATERIALY METODOS
4.1 MATERIAL 4.2 CUANTIFICACION DE ACID0 GIBEREUCO
4.2.1 CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA 4.2.2 CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCJON
5 EXPERIMENTO 1 : EXTRACCION PRELIMINAR 5.1 OBJETIVO 5.2 METODOLOGIA 5.3 RESULTADOS Y DISCUSION
6.1 OBJETIVO - 6 EXPERIMENTO 2: PURIFICACION ADICIONAL
. 6.2 METODOLOGIA 6.3 RESULTADOS Y DISCUSION
7.1 OBJETIVO
7.3 RESULTADOS Y DISCUSION
7 EXPERIMENTO 3: OPTlMlZAClON DE LA TECNlCA
. 7.2 METODOLOGIA
8 CONCLUSIONES GENERALES 9 RESUMEN 10 BlBUOGRAFfA CITADA
. -
?
1 TITULO:
"EXTRACC16N Y PURIFICACION DE ACID0 GlSERELtCO "
2 INTRODUCCION - ._
-. Los reguladores de crecimiento vegetal sustancias que intervienen en el metabolismo de las deprimiendo alguna etapa de su desarrollo. Esta
.. " - . - - "" . . - - - - - . . - . . -. . .. . . . - ó fitohormonas son piantas, activando o característica de las
. . ".
fitohormonas las hace atractivas desde el punto de vista comercial, con un mercado que comprende cerca del 65 . % de los agroquimicos (4): El ácido giberélico (GA3), con su amplio campo de acción forma parte importante de este grupo. "
. " .
- " "" - . -. - . . . I
" .El &ido giberhlico se produce idustrialmente via microbiana por fermentación sumergida del hongo Giberella fuiikurof. La separación de este &ido orgánico es muy importante desde el punto de vista económico; la rentabilidad "" . de un proceso industrial basado en la fermentacibn sumergida depende del buen diseño de la fermentación y de la separación del principio activo.. Estas dos etapas tienen igual importancia, puesto que no es comercialmente atractiva una tecnolgía fermentativa sin un buen método de extracción.
"
Se ha reportado que la extracción y purificación de ácido giberélico puede representar un porcentaje considerable en el costo total del proceso (9).
Los problemas que encontramos en la extracción y purificación del &ido giberélico son la .baja concentración en que se presenta en el medio de cultivo final y la presencia de sustaniias extrañas como ácido acético, lactic0 además de otras giberelinas. ' ' I,
El objetivo de este trabajo, fué .obtenerk&taJes de ácido giberélico con pureza igual o mayor al 90 % a* drtii del caldo de fermentación. Este trabajo forma parte de un proyecto global .de investigación, realizado .QI
Departamento de Biotecnología de WbJFJ. . ,: . . * .
En este informe de servicio social se presentar&'' el trabajo seguido que nos llevó a seleccionar la metodología para la recuperación de obtención de cristales con pureza mayor 6 igual'i 90 %.
. " m:.
3 GENERALIDADES
3.1 GIBERELINAS
3.1.1 ESTRUCTURA QU~MICA.Y.PROPIEDADES..- -.
Las giberelinas son ácidos diterpenoides basados en el esqueleto de giberelano que contiene un núcleo llamado gibano (fig.2) (11). Este grupo incluyen compuestos . como ácido giberélico ó giberelina 3, giberelina 4 y giberelina 7. Estos son los más importantes de un grupo de 51 giberelinas conocidas (15). Las diferencias extructurales entre ellas residen en los diferentes substituyentes en las posiciones 4a, 7, 8, y la ausencia ó presencia del anillo lactónico gama.
. . "
- - - . " En este ' grupo el ácido giberélico es el más importante 4
comercialmente. Es un constituyente natural de las plantas, capaz de producir profundos efectos fisiologicos y morfológicos en ellas a muy bajas concentraciones. Químicamente se define (2) como un ácido tetracíclico dihidroxilactónico . Su estructura se muestra en la figura 3.
I
I
GIBANO GIBERELANO
ACID0 Gl8ERELtCO
Fdrmula motecult!#? C 18 H 22 O 6. P.F.: 22t-230 C(Merck 1989). Solubilidad: soluble en et&, ."inetand, acetona, solución lig. alcalinas y acetato. Lig. soluble en agua y éter. Ratación óptica: + 83 (c.. en etanol). A pH básico es un I
Bcidornonobásico de pK=4. Monometil éster: P:F:209-210 C. Rotación óptica: I
+75 (~0.5 en etanol). Derivado acetilado: P.F.: 233-234 C. Rotacibn óptica: + 150 (c.. 0.4 en etanol).
4
I
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I
Estabilidad y degradación: Las giberelinas generalmente son estables en ' agua, pero GA3 es uno de los menos estables en este medio. Acido mineral diluido lo convierte en ácido alogiberélico que calentado a 1 0 0 C forma ácido gibérico. El tratamiento con álcali diluido lo convierte a un isómero (16).
3.1.2 PRODUCCiON DE ACID0 GlBERELlCO
Sustancias del tipo de giberelinas han sido encontradas en bacterias, hongos, algas y muchas plantas superiores. Sin embargo giberelinas libres caracterizadas químicamente se han extraido sólo del microrganismo Giberella fuiikuroi al que también se le ha llamado F-moniliforme 6 Fusarium oxisnorum . Se ha reportado que Fusarium moniliforme es el estad0 imperfecto de Giberella fuiikuroi (15).
Las giberelinas pueden producirse por fermentación líquida (7) 6 s6lida del microorganismo Giberella fuiikuroi (8,9), aunque solo se produce ' * morckdmnte por cultivo sumergido. Se han hecho mejoras de cepas por metodos de mutación como radiación ultravioleta, neutrones rápidos 6 tratamientos con rayos gama (7).
3.1.3 USOS
. L a capacidad del ácido giber6lico de producir efectos en la fisiología de las plantas se explota para mejorar cualquier tecnología que involucre el manejo de materia prima vegetal. En la- tabla 3.1 -se- ilustranalgunas de--las -- - -. -. --
aplicaciones de ácido giberélico y su efecto.
TABLA 3.1. USOS COMERCIALES DEL ACID0 GIBERELICO.
CAMPO DE APLICACION EFECTO
-. Industria Cervecera Reduce el tiempo de malteado
Cultivo de la uva Aumenta el tamaño de los y manzana frutos y mejora su
presentación.
Producción de cítricos Retarda la maduración y evita la descomposicion de
la corteza.
Cultivo de hortalizas y Inducción de la Roraci6n plantas Ornamentales
Cultivo de gramineas y Estimulante de la germina- hortalizas cibn y crecimiento
(trque.1988) e
3.2 PRINCIPIOS DE EXTRACCI~N LIQUIDA
3.2.1 ANTECEDENTES
El proceso original para el aislamiento de igiberelina consistia en adsorcion de carbón, seguido por elución con solvent$, usualmente acetona. La elución del carbón (previamente secado hasta 20 - ~30 % de humedad) se realizaba con acetona y agua. A esto seguía una purificación con acetato de etilo y solución buffer. Esta técnica presenta la desventaja de usar un solvente caro como la acetona (7).
- Borrow et al (3) describe un método en el que lb purificación se realiza por medio de la elución de carbón con metano1 amonjacal.
Otra opción consiste en el uso de resinas d4 intercambio iónico, en el cual los componentes ácidos diferentes de las1 giberelinas se diluyen tratando con álcali, seguido por el uso de resinas de intercambio aniónico y elucidn con amonio ó soluciónes buffer. Sin embargo, $1 imperante de obtener '
mejores rendimientos hizo que se desarrollaran los &todos de extracción con v solventes, en donde los ésteres organicos son u$ados para procesos a escala comercial (7).
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. . I
3.2.2 DEFINICION 1 , . .
i. >. . . _ .
j , . . .
La extracción líquida es ,un m&odo de s$paración cuyo principio radica en la distribución del soluto' en?d&fwes inmi$cibles, frecuentemente agua y un solvente orgánico. Esta. medida de la dislribucidn del soluto en dos fases se llama coeficiente de partición (1). . .
. * ., . ,
I
. I I
3.2.3 COEFICIENTE DE PARTICION I I
c ?
Cuando una sustancia'sn sotución se PO e en contacto con una segunda fase inmiscible, la sustancia tiende .a distrib z irse entre Pas dos fases. Este fencimeno se explota en las operaciones de extracción líquido-líquido, pues
El grado en que se presenta la redistribución del soluto se rige por condiciones termodiniimicas, y depende de interacciones moleculares entre el Soluto y los solventes individuales. Esto se cuantifica en t,érminos del * coeficiente de partición, que puede definirse como sigue (1).
CP = C-solvente / C-alimentación
donde C-solvente y C-alimentación son las concentraciones en el equilibrio del soluto deseado en las fases del solvente y la alimentación respectivamente. En general, el coeficiente de partición es función de los niveles de concentración presentes en el sistema.
La partición del soluto se ve afectado fuertemente por medio de propiedades de la solución (vg. pH, fuerza iónica, etc.). También puede modificarse por medio de aditivos que interactúan con el soluto o el solvente para causar cambios en la distribución de soluto entre l a s fases.
~ .~
3.2.4 FACTOR DE EXTRACCIÓN
El coeficiente de partición puede usarse para determinar las concentraciones relativas de un soluto en dos fases inmiscibles en el equilibrio, pero por sí solo no define el grado de separación real; esto también está gobernado por los volúmenes relativos de las dos fases. Evidentemente, a medida que se aumenta el volumen del solvente, una mayor proporción del soluto se presentará en el solvente y la fase acuosa tendrá menos soluto. El grado de separación 6 factor de extracción puede definirse como:
FE = (CP V-solvente)/V-alimentado
que da efectivamente las capacidades de las dos fases para el soluto bajo condiciones de equilibrio. Aquí V-solvente y V-alimentación son el volumen del solvente y de la fase alimentada, respectivamente. De esta relacih es evidente que a mayor coeficiente de partición será menor la cantidad de solvente requerida para alcanzar el grado de separación deseada, y lo que es más importante, mayor será la concentración del soluto en el extractante. Este
. efecto concentrante es deseable si el producto finaí es un material puro.
. . La separación de una substancia de un solvente a otro es de poco inter&. El valor de la extraccion-iíquida radica en la posibilidad dé separar
._ . ~ ". . - -
dos 6 más substancias basadas en su diferencia en partición. Si un soluto tiene un CP mucho más grande de 1 y el otro es mucho menor de 1, una sola extracción causará una separación completa. Esto sucede si los dos solutos son muy diferentes químicamente, y en este caso sin duda pueden separarse los dos solutos más fácilmente por otro método. La extracción liquida es adecuada para la separación de compuestos con semejanza quimica siempre y cuando tengan diferencias en cuanto a su valor de CP. Si l o s dos solutos tienen CP similares una sola extracción causará una separación parcial con un enriquecimiento de un soluto en un solvente y un enriquecimiento de un soluto en el otro solvente. Para hacer una separación adecuada, debemos repetir el proceso varias veces. También la modificación de propiedades de solución (pH, fuerza iónica) puede crear diferencias en el CP de los solutos, aumentando así la eficiencia de extracción.
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3.3 OBJtIVO GENERAL
Optimización de la técnica de extracción y purificación de kid0 giberélico a nivel de laboratorio, a partir de un caldo de fermentación, para obtener c r i s t a l l e s con pureza igual 6 mayor del 90 %.
I
4 MATERIALY METODOS
4.1 MATERIAL
"" -~ "" " ._ REACTIVOS
ACETATO DE ETILO. T.J. BAKER CARBON ACTIVADO. T.J. BAKER ETER. MERCK SOLUCION DE HCI .1 N SOL DE NaOH .1 N SULFATO DE SODIO HEPTAHIDRATADO. T.J. BAKER CLORURO DE SODIO. T.J. BAKER
. - .. .. .. .. ". . "" - .. . ". - .
MATERIAL
2 MATRACES ERLENMEYER DE 500 ml. 2 MATRACES ERLENMEYER DE 300 ml. 1 VASO DE PRECJPITADOS DE 3 tt. PAPEL WHATMAN #42 EMBUDO DE SEPARACION DE 500 ml. .. EMBUDO BUCHNER MATRAZ KITASATO MATRAZ DE BOLA AGITADOR MAGNETIC0 TUBOS PARA CENTRIFUGA . .
. . . '"3
It
.. I . -. d.'
EQUIPO
-
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4.2 CUANTIFICACION DE ACID0 GIBERELICO
4.2.1 " CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA
REACTIVOS
B FASE MOVIL : BENZENO
- . ACETATO DE ETlLO ACID0 PROPIONIC0
- SOLUCION REVELADORA: ETANOL ACID0 SULFURIC0 CONCENTRADO " " " _ - -
- - - - - ._ - - - - .. -
MATERIAL " "
" . - - - . ~-
SILICON . -
- " CROMATOFOLIOS DE SILICA GEL # MERCK 5555 - -
EQUIPO CUBAS PARA CROMATOGRAFIA * V
HORNO MICROJERINGA DE 100 MICROUTROS
. -
-
LAMPARA DE LUZ ULTF?AWOLETA
4. DEJAR REPOSAR LA CUBA CON LA FASE MOVIL POR 30 MIN. PARA PERMTIR LA SATURACION.
- "_ - " - . . . - - . . - 5. COLOCAR EL.-CROMATOFOLIO EN-LA- CUBA Y DEJAR CORRER LA FASE MOVIL HASTA QUE LLEGUE A 1 CM DE LA PARTE SUPERIOR.
6. REVELAR EL CROMATOFOLIO ESPREANDO CON LA SOLUCION REVELADORA.
7. SECAR EN HORNO A 110 C POR 10 MINUTOS.
8. EN UN CUARTO OBSCURO ILUMINAR LA PIACA CON LUZ ULTRAVIOLETA. SE LOCALIZA LA MANCHA ELIPSOIDAL QUE ESTA A LA ALTURA DEL ESTANDAR Y SE MARCA CON LAPlZ LOS EXTREMOS DEL EJE MAYOR Y MENOR DE LA ELIPSE.
9. SE MIDE LA DISTANCIA DE LOS EJES MAYOR Y MENOR, SE CALCULA EL AREA DE LA ELIPSE Y SE OBTtENE LA CONCENlRAClON DE LA MUESTRA POR MEDIO DE UNA ECUACION DE CALIBRACION.
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EQUIPO CROMATOGRAFO HPLC i!
DETECTOR DE ONDA VARIABLE UV; REGISTRADOR
MEMBRANAS POUCARBONADAS(.45 MK;&S)
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. . .
$
COLUMNA M-BENDAPAK C. (WATER A550510 P/N'2734) ; I '
, . . . . j , F . .
REACTiVOS a
METANOL DESTILADO EN VIDRIO O ,EQUIVALENTE SOLUCION AL .5 % DE KH2P04 GRADO ANAUTICO SOLUCION DE ACiDO FOSFORiCO AL 8 .5% PESO
i
PREPARACION DE FASE MOVIL:
MEZCLAR 70 % VOLUMEN DE KH2P04 Y 25 % VOLUMEN DE CH30H. FILTRAR, DEGASIFICAR Y DEJAR QUE ALCANZE TEMPERATURA AMBIENTE.
&
CONDICIONES CROMATOGRAFICAS:
1. VOL DE INYECCION 20 MICROLITROS. 2. FLUJO = 2 ml/min 3. DETECTOR UV A 204 nm. 4. TEMPERATURA AMBIENTE. 5. RANGO 0.4 AUPS EN EL REGISTRADOR.
PREPARACION DEL ESTANDAR:
PESAR CON CUIDADO 50 mg. DE ACID0 GIBERELIC0 IRS EN UN FRASCO VOLUMETRIC0 DE 100 ml: DILUIR A VOLUMEN CON FASE MOVIL NO FILTRADA Y MEZCLAR. ..
PREPARACION DE ENSAYO:
1. PESAR CON CUIDADO 50 mg. DE LA MUESTRA EN UN FRASCO VOLUMETRIC0 DE 100 ml. DILUIR A VOLUMEN CON FASE MOVIL NO FILTRADA Y MEZCLAR. '-
PRUEBA DE ADECUACION DEL SISTEMA:
CROMATOGRAFIAR INYECCIONES POR DUPUCADO DE LA PREPARACION ESTANOAR Y DETECTAR UN Pic0 CON TEMPO DE RETENCION DE ENTRE 7 Y 9 MJNUTOS. LA RESPUESTA DEL PICO PARA LAS INYECCfONES DUPLICADAS NO DEBE VARlAR POR MáS DEL 2 %. .S1 ESTA PRECISION NO SE OBTEN€, CONTINUAR INYECTANDO tA PREPAWCION
INYECCIONES SUCESIVAS.
PROCEDIMIENTO:
INYECTAR EXACTAMENTE EL MISMO VOLUMEN DE CADA PREPARACION DE ENSAYO Y CROMATOGRAFIAR POR 20 min. APROXIMADAMENTE. MEDIR EL PICO DE RESPUESTA PARA GlBERELlNA 3 ( TR = 7-9 min.) OBTENIDO CON LA PREPARACION ESTANDAR OBTENIDO DE LA PRUEBA DE ADECUACION DEL SISTEMA PARA EL CALCULO.
CALCULOS:
RFsPUEsTA DE GA3 EN MUESTRA X ma ESTANDAR X PUREZA DEL RESPUESTA DE GA3 EN ESTANDAR mg PRUEBA ESTANDAR
- - " .- - . ~. -- ". ~ " - "" . . ~ . - " ".
5 EXPERIMENTO 1: EXTRACCIóN PRELIMINAR.
5.1 OBJETlVO
* Ensayar una técnica -de extracción y purificación de Bcido giberélico a nivel de iaboratorio previamente establecida.
* I d e n t i f i c a r los parámetros clave del proceso.
c F 5
ESTANDAR HASTA QUE ESTE 2 % DE CONCORDANCIA SE OBTENGA PARA 1
i
1
* Proponer modificaciones en los parmetros que mejoren 4 pureza de los cristales de ácido giberr5tiiwJ. .
5.2 METODOLOGIA Con la siguiente metodología nos proponemos hacer una
extracción de todas las giberelinas presentes en el caldo. Esto corresponde a la primera etapa del proceso de extracción, a la que hemos denominado etapa de extracción preliminar. . -
~ -
1 It. DE CALDO DE FERMENTACION DEL MICROORGANISMO Giberella fujikuroi
FILTRAR EL CALDO DE FERMENTACION CON GASA
FILTRAR CALDO CON PAPEL WHATMAN # 42
AJUSTAR A pH = 4 CON NaOH 1 N
. .~ . CENTRIFUGAR EN CENTRIFUGA DE CILINDRO A 8OOO RPM 10 min.
AJUSTAR A pH = 2 CON HCI 1 N EN BAhO DE HIELO -
EXTRAER CON ACETATO DE ETlLO 100 ml POR 250 r n l DE CALDO
FASE ACUOSA FASE ORGAMCA
DECOLORAR CON CARBON ACTIVADO Y FILTRAR
(0.65-0.75 girt)
EVAPORAR EL EXTRACTO HASTA SEQUEDAD A PRES1ON REDUCIDA ( 60 C)
AGREGAR 5 ml DE ACETATO DE €TILO Y REEVAPORAR
CRISTALIZAR EN SOLUCiON UE ETER-ACETATO DE ETtLO
5.3 RESULTADOS Y DISCUSION
~
- - - - .-Durante la - realización de tos experimentos - de - extracción y purificación de ácido giberélico se identificaron en cada operación los parsmetros que influyeron en la eficiencia de recuperación y en la pureza de los cristales de ácido giberélico. En la tabla 5.1 se presentan las características particulares que se modificaron en cada experimento. En el experimento 6 se analizó la concentraci6n de gibereiina 3 en diferentes etapas de la separación para monitorear rendimientos y determinar el número mínimo de extracciónes necesarias.
Adicionalmente, en el experimento B se varió la proporción del éter en la solución de cristalización para ver un posible efecto en pureza. U experimento' C se realizó para comprobar los resultados del experimento 6, usando una tknica de análisis de muestras más precisa y obteniendo muestras por duplicado. . .
TABLA 5.1 CARACTERISTICAS PARTICUDIRES DEL EXPERIMENTO.
pH ' NO. SOLUCION ANALISIS EXPERIMENTO DE EXTRAc'; DE DE . EXTRACCION CRISTAUZACtON MUESTRAS __""""""""""""""""""-~"
f.; !
A 4.4 , 3 10:2 CCF
2.0 4 ,I . . . 10:l CCF
t .' -.
, I
0 - 1 0 - 2 2.0 .. . t0:2 CCF 6-3 2.0 .:4 1 I . 10:3 CCF
c - 1 2.0 .hb I I
. ': 4 , . 1O:l HPLC c-2 2.0 1 4 . I 10:2 HPLC . c-3 2.0 4 ?0:3 HPLC
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. 'I. .-p )&y: .
i . .? .
4 . . . . .
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4 . . ,. _I__ """
Centrifugación clínica.
La centriiugación clínica elimina una gran cantidad de micetio, cuya presencia causaría una interferencia en la extracción líquida y aumentaría el tiempo requerido para la separación de las fases. Esta etapa representa sólo el 2 % de pérdida de ácido giberélico en el proceso (tabla 5.3).
Extracción liquida
6
La variable más importante es el pH del caldo al momento de extracción, puesto que tiene marcada influencia sobre el coeficiente de partidón del ácido giberélico. En este caso se hace la extracción a un pH que favorezca su afinidad por el solvente orgánico;es decir, a un pH de extracción en el que el CP de hcido giberélico sea alto. En base a experimentación y a reportes bibliográficos se determinó que el pH óptimo de extracción es 2. De esta extracción resultará un extracto orgánico donde el ácido giberélico se encuentra acompañado de otras giberelinas.
En la tabla 5.2 se presentan valores de CP para ácido giberélico a diferentes pH. Estos valores indican que a pH 2 se favorece la distribución del kidQ giberélico hacia el solvente orgánico. 2
T ,
.
TABLA 5.2 COEFICIENTES DE PARTICION (CP). m_"""""""""""""""""""~""""""""""""""
PH COEFICIENTE DE PARTICION
4.4 0.73
2.0 4.75 . ~.
"-I""""""""""""-"""""""""""-
(GB. PAT 1 174 924)
En el experimento B se hizo un análisis más profundo de la concentración de ácido giberélico en diferentes etapas del proceso, con el fin de saber el número mínimo de extracciones necesarias para extraer las giberelinas del caldo ( proporción = 100 ml. acetato de etilo/250 mi. caldo por extracción). Se observó que cuatro extracciones a pH 2 son suficientes para extraer todas las giberelinas del medio de cultivo. La grafica 5.1 ilustra más claramente lo anterior.
+ .
.~ ... ..
.
TABLA 5.3 ANAUSIS DE CONCENTRACIONES DE GA3 EN DlFERENTES ETAPAS DEL PROCESO.
____""""""""""_I - MUESTRA CONCENTRACION VOLUMEN GA3 PERDIDAS
- - " ~ - --- ~ - -4alm . ~ "" ~ .. mr "" % "
"
.. - """"""""""-
- - ~
"
CALDO . - - . . . .
-. . . . FERMENTADO 690 lo00 690.0
SEDIMENTO CENTRIFUGACION 51 O 25 12.75
ler. EXTRACTO ORGANIC0 ANTES 1 O 0 0 290 290.0 F1_LTRACION . .. "
ler; .EXTRACTO
- _ . " - -
"" - " .. - "
" ." "_ - - .
- - .- - " " - - 'ORGANICO DESPUES 1500 113 169.5
. flLTRAClON
20. EXTRACTO ORGANIC0 ANTES 626 377 236.0
- - _ _ " " . -. - - - - - - . "
344 143.5
382 126.8
;=-:-= -. a0:mC"o "" "- " .
.. . . __ .~ - - ORGANIC0 DESPUES 273 254 69.34 FILTRACIQN. c ~ . . ~
40. EXTRACTO ORGANIC0 ANTES 30 307 9.2 RLTRACION
. .
. .
2
17
13
a
*
.EXTRACTO ACUOSO DESPUES DE LA N.C. loo0 N.C. MTRACCiON.
N.C. - No cuant#icable: la cantidad de ateido giberetic0 8s muy pequeña para ser
Decoloración
La decoloración elimina una gran cantidad de impurezas que interfieren en la cristalización. Se debe hacer el número de decoloraciones necesarias para que el extracto orgánico esté totalmente transparente, de F i
I i
esta forma nos aseguramos de que se eliminaron la mayor cantidad de impurezas que pudieran interferir en la cristalización. Las pérdidas, en promedio de 12.7 %, son considerables (gráfica 5.2).
Evaporación
La evaporación debe hacerse a presión reducida y baja temperatura para prevenir la degradación de ácido giberético. La reevaporación es i r t i 1 para eliminar impurezas.
c
Cristalización .. . -. - "
Es un punto critico. Para que el ácido giberélico cristalice es esencial la pureza del extracto orgánico. En el extracto orgánico evaporado se detectó un ligero olor a ácido acético; por lo que se piensa que esta es una de las principales impurezas que interfieren en la cristalización.
Ma inc6gnita fué la proporción de acetato de etilo-éter más favorable en cuanto a pureza de cristales. Estos solventes se seleccionaron en base a bibliografía(G.B.PAT 1 174 924). Con este fin se dividió el extracto orgánico decolorado y filtrado en tres pwtes iguales, se evaporaron y cristalizaron por separado, cada una con una solución de cristatización diferente. Los datos de la experimentación B no fueron concluyentes, por ía falta de una técnica adecuada de análisis de cristales. Por, esta razón se repite el experimento B, usando cromatografía tiquida de alta resolución (HPLC) para d s i s de los cristales y haciendo cada corrida experimental por duplicado.
i
, , .
% B
TABLA 5.4. CARACTERISTICAS DE LOS CRISTALES.
""_"___"___"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""~ EXPERIMENTO PESO PUREZA GA3 P.F PORCENTAJE
CRIST. CRIST. RECUPERADO RECUP. 6 (mg) ( m ( C) ""__""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""
32.9 -
7.76 . .. -
-. 6.5 - - 120.0 - - 75 90
59.7 81.4 49
22.2
233.8 49.5 99.6
139.5 66.3 92.5
65.7 64.1 42.1 1
226 - 228 11.63
182 - 1 8 4 35.2
198 - 201 2.7
198-201 23.2
215 - 217 10.6
216 - 217
195 - 197 9.7
203-205
213 - 214 10.3
214 - 21 5
Se comprueba que hay un efecto de la proporción de acetato de etiloaer en la pureza de los cristales; se 'obtiene una mayor pureza cristalizando en la solución de acetato de etilo-éter proporción 10:l (grafica 5.3). En cuanto a la recuperación, no se registra un efecto claro de la solucibn de cristalización. La diferencia del porcentaje de recuperación en cada duplicado d e t experimento se debe a que no hubo un control exacto en cuanto a el nlimero de decoloraciones de cada muestra. La decoloración, como ya se ha explicado es un factor importante de pérdidas en el proceso.
De acuerdo a estas consideraciones se decidió trabajar con la mezcla acetato de etilo-6ter de propordon 1 O: j en todas los experimentos posteriores.
L
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.. ..
"
"
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~ "-"
I t I
I I
I I
I 1
1 I
I I
1 I I
Por último, la tabla 5.5 nos muestra la conveniencia de cambiar la tecnica de análisis por cromatografía ~ - -. .. . .. en capa fina a una con mayor exactitud, al menos para cuantikar pureza de cristales: "
concentración de ácido giberélico para varios análisis cromatográficos de una muestra única con concentración real de 305 mg/ml.
Estos Ib~"-valotes-- -de . .- . -.
.~ .
""" . . .. - +" =: z " " "
__yI"~""""~"""""""""--"""""""
- .-= -"" - - - m" "_ "" - - - - " ~NCENTRACION ~ DE LA MUESTRA
- - "- s . ." - - - - .-. "DETERMtNADO POR CCF
292
337
"Y- ""
'.% DESV.. ESTANDAR = 28.4 PORCENTAJE DE ERRbR =: 9.43
CONCLUSIONES 5 Cuatro extracciones del caido de fermentación a pH 2, son
suficientes para la separación de las giberelinas presentes en el caldo. Sin embargo, esta técnica por sí sola no es suficiente para producir cristales con la pureza deseada.
b r
Se identifica a la pureza del extracto como crucial para la eficiente i cristalización del ácido giberélico. I:
En base a estos resultados se decidió cristalizar en la solución acetato de etilo-éter de proporcion 1O:l en los experimentos posteriores,
d - .
por ser la que favorece la pureza de los cristales. ..
Se analizó la pureza de los cristales por HPLC, por ser una tbcnica con más precisión que la de cromatografía en capa fina.
. - -
6 EXPERIMENTO 2: PURlFlCAClON ADICIONAL.
6.1 OBJETIVO "
- "" - _ _ ". - J ." " - . . * OBTENER CRISTALES CON PUREZA DE 90 % A PARTIR DE CRISTALES DE LOS EXPERIMENTOS ANTERIORES, CON PUREZA INFERIOR O IGUAL AL 80 %.
f r
. _ - - _ _ . - " -
6.2 METODOLOGIA b 6.
Estos experimentos corresponden a la segunda etapa del proceso de extracción y purificación, en donde esperamos obtener cristales de ácido giber6iico a-partir de los cristáles.obtenidos- de la etapa anterior. Por esta razón se le llamó a esta etapa purificación adicional. Esta purificadón se hará pot medio de la separación de las giberelinas 4 y 7 del ácido giberélieo.
f 1 E:
- " - " . -.
DISOLVER LOS CRISTALES EN AGUA-METANOL PROPORCION 50:50 ". " .
HASTA LLEGAR A UNA CONCENTRACION FINAL DE 2.8 q/ml
AJUSTAR A pH 4 CON NaOH 1 N
EXTRAER CON ACFTATO DE mLo z VECES, CADA EXTRACCION CON - 40 ml DE ACETATO POR 1 8 0 ml DE CALDO.
"
FASE ACUOSA FASE B R G A N I C A
AJUSTARApH=2CONHU DIUllDo EN FRlO
- "" TABLA - 6.7. CARACTERISTICAS FlSlCAS DE LOS CRISTALES PURIFICAI)OS.
".
- """ """""""""""""""""""""~~"~~~""""~
NO. CRlST CONT GA3 CRlST CONT GA3 RECUP P.F. TOT GA3 TOTAL RECUP GA3 TOTAL GA3
"""-"""I__ -"""".""""""" m_ """1
-
h P . (mg) ("/.I (mg) (mg) (%I (ma (%I ( C)
. .. "
. -
7 -494 "
- 2 " 760 67
-395 115 05 . 75 19 213-214
""""""""P -1-
: Como se . . puede -. ver los ta pureza. de los cristales no fue la esperada.
A pH 4 se favorece !a solubilidad .de ácido gibr4iico en agua @.B.PAT. 1174 924), debido a su eo&i$ión de ácido débil; en cambio, la sdubiiidad en agua de sustancias de baja polaridad, corno l a s giberelinas 4 y 7 no es alta en estas condicionesi?. Al hacer la extracd6n del emcto acuoso con aC8tato de etilo a pH 4,;.0btuvikoS una solucicHI acuosa con &ido giberélico prácticamente , + *
libre de giberelinas 4 y 7. Al e>$taer y evaporar esta solución los cristales no alcanzaron pureza deseada. Esto ms lteva a pensar que la presencia de las gibereRnas.4 y 7 no tiene efecto marcado en la pureza de los cristales. La baja pureza se debe probablemente a otro tipo de"' impurezas, que no s8 eliminan
La purificación adicional presenta bsja eficiencia de recuperación. No debernos.olvidar que a las pérdidas en esta etapa del proceso hay que sumarle las pérdidas por la fase anterior: la extracción preliminar.
CONCLUSIONES
Esta metodologia no es la adecuada para la obtención de cristales de &do giberélico con pureza mayor a 90 %. Deben hacerse modificaciones enfocadas a la eliminación de impurezas diferentes a las giberelinas 4 y 7.
Una desventaja de la purificacicin adicional radica en su bajo porcentaje de recuperación.
7 EXPERIMENTO 3: OPTlMlZAClON DE LA TECNICA.
.7.1 OBJETIVO
* Optimización de la técnica de extracción y purificación de cristales para producir cristales con pureza mayor al 90% mediante un experimento diseñado por arreglo ortogonal.
* Ptoponer cambios en la técnica que permitan obten@ cristales de ácido giberélico con la pureza deseada en una sola e x t r d n , sin pasar por !a etapa de extracción .
i
i
METODOLOGIA
Este experimento se disetió para obtener cristales de ácido giberélico ". " - " --con-pureza de al-- menos 90 YO en--una-sola etapa, sin tener que-fecurtir a la
purificación adicional, que como vimos en el inciso anterior, resulta ineficiente.
- - . . . - . . . - - - . Para lograr esto se hizo el diseño del experimento de acuerdo al arreglo ortogonal (10) manejando tres variables en dos niveles. Se parte de la hip6tesis de que la extracción con éter, el número de reevaporaciones y la temperatura de evaporación del extracto orgánico son las variables que más pueden influir en ta pureza de los cristales. Los niveles a que se manejará cada variable se seleccionaron en base a la experiencia adquirida en los experimentos anteriores.
TABLA 7.1. Niveles manejados para las variables a optimizar (10).
TABLA 7.2 DISEÑO EXPERIMENTAL PARA TRES VARIABLES A DOS NIVELES. """""~"""""""""""""~""""-~~"""""""""""""""~""""""
. . ~ - -. .. NIVEL DE -VARIABLE -.
EXPERIMENTO A B C
"""""""""""""~~""""""~""""""""""""""""""""~
1 1 1 1
2 1 2
3 2 1 2
1""" """""""""""""
"
. . .
METOGOLOGIA
CENTRIFUGAR 1 It. DE CALD9 A 8OOO RPM 20 MINUTOS
. . -. " - " "_ .. - . -. EN . CENTRIFUGA CLINICA .. . ~. .- - .. .. ""
.. . DIVIDIR EL It DE CALDO FILTRADO Y CENTRIFUGADO EN DOS PARTES
. .
" EXTRAER CON ETER - &I % VOL DEL CALDO) - ""
TRE VECES
AJUSTAR A pH 2 CON AJUSTAR A pH 2 CON HCll N HCI1 N
'i . - . . . - -. - - . - .
. "" " " ". - " . "
I I ". ~
""" -.
" " - EXTRAER CON EXTRAER CON " "
" - - - -ACETAT0 DE ETILO ACETATO DE ETILO (100 m1/250 ml caldo) - - (100 ml/250 ml caldo)
VECES 4 VECES
DECOLORAR EXTRACTO DECOLORAR EXTRACTO ORGANiCO CON
~ ORGANIC0 CON
- - .~
" -
._." - "_ - - -
. ..
I '. I
RLTRAR _I_""""" - ~ " I .. . . . . . ~ . - . . c- " ". _ _ _ I
DIVIDIR EXTRA-CTO DIVIDIR EXTRACTO
CUATRO PARTES . I CUATRO PARTES ORGANIC0 EN
" " . ORWtCO EN e:
. . -
-" "- - - - - . . - _ - - ". " _ .. ~ , ;I'
L . -
EVAPORAR EVAPORAR. 3 EVAPORAR WAPORAR A35C
I ATC REEVAPORAR REEVAPOhfiR' REEVhPOAAR REEVAPORAR
3 VECES 5 VECES:;'.. i 5VECES 3 VECES.
CRISFALZAR CRlSTAUZAFI CRISTALIZAR CRISTALIZAR I 1 ; ' , ' I t I I 84 I I
. .
MUESTRA 1 Y 2 MUESTRA 3 Y 4. t MUESTRA 5 Y 6 MUESTRA 7 Y 8
MEDIR PUNTO DE FUSION, PESO Y PUREZA DE CRISTALES POR HPLC HACER ANAUSIS DEL EFECTO DE LAS VARIABLES EN PUREZA Y NENDIMIENTO . -
:.
7.3 RESULTADOS Y DISCUSION
-. "" .- " .- . . -- -- ~ - - -- - - - "" . "" "
La cantidad total de &ido giberélico presente originalmente en el caldo de fermentación fué de 2198 mg/lt. Se analizó la concentración de ácido giberélico en el éter usado en la extracci6n para monitorear posibles perdidas . . .
"" . - - .- ~ - - -
TABLA 7.3. PERDIDAS POR 'EXTRACCION CON ETER. ___u"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""-
MUESTRA CONCENTRACION VOL. ACID0 PERDIDAS - - - - . --- (rng/lt) ml GIBERELICO %
. " (mg) """""-"-~""""""""""""~"""""""""""""""- -
CONCENTRACION EN CALDO DE FERMENTACION
. ..
21 98 " loo0 21 98 " . . ..
. ~ . " ..
ETER USADO EN . _ - 306- - 1 25 EXTRACCION
. - - . - " -
""""""""""""""""""""""~""
--"Con estos resultados nos aseguramos que la extracción con éter no tiene efecto desfavorable en la recuperación del proceso.
38.25 3.5
TABLA 7.4 CARACTERISTICAS DE LOS CRISTALES.
d MUESTRA P.F. P.F. PESO %PUREZA PESO REND. - " _
" - " _ STD. CRIST. GA3 "
~ -._ C c- m.4) (m@ __""""""""_"~""""""""""~~""""""""""""""""""""-"""-
1 210-21 2
3 21 2-21 5 - - "
4 "
" _ _ " 21 4-21 5
5 215-217 219-221
6 216-218 219-221'
7 21 5-21 7
0 213-21 4
142.3 94.0 133.8 48.7
148.8 97.0 144.4 52.6
174.3 94.2 164.2 59.7
177.5 98.0 173.5 63.2 . .
161.5 85.7 138.4 50.3
139.5 80.7 123.7 45.0
187.2 86.6 162.1 59.0
141 .O 89.0 125.5 45.6
**
* Este rendimiento se calculó dividiendo la cantidad de mg de ácido giber4lico puro entre 274.8 mg correspondiente a la octava parte de la concentración original depcaldo. Se calcula el efecto de cada Variable de esta forma:
I
EFECTO DE RESULTADO CON - RESULTADO CON LA VARIABLE = VARIABLE A NlVEL 1 VARIABLE A NIVEL 2 .
2
Vg. si se quiere ver el efecto de la extracción con éter sobre la pureza hacemos el siguiente cálculo:
- "" .- - - " " . . . ". .. . . ". .
EFECTO -DE EXTRACCION = DE EXPERIMENTOS - DE EXPERIMENTOS
CON ETER SOBRE CON EXTRACCION SIN EXTRACCION - PUREZA -CON ETER CON ETER
195.2 + 96.11 - (88.2 + 87.2) = 8.3
2 ." ~ - - - - .
. -- - Este resultado nos indica que la extracción con éter ejerce
mWn#luencia posttiva-e ta-pureza; ~ - . - - . - ~- ..
- """ - . .
T A B U 7.5 EFECTO DE U S VARIAGLES SOBRE LA PUREZA DE LOS CRISTALES.
* " - """""""""""""""""""""""""""----------------------------------
. .~ ." - " .. . .. ". - ~- - . -~ "_ .. - "" " -.. - . .
EXP. MUESTRAS NIVEL DE VARIABLE PUREZA
EXTRACC. NUMERO TEMPERATURA X "" .
. - . CON ETER REEVAP. EVAP. - " _ """"""""""""""""""""""~"""~""""""""""""""""""""""
." .
1 SI 3 35C 95.2
2 3Y4 SI 5 35 c 96;l
"I___ """"~"""""""""""""u I_ """_ 3 7Y8 NO 3 65C 88.2
"- """_""""""""""""" 4 5Y6 NO 5 65 C 07.2
" """ "" ""_ - """"-" L "
# EFECTO DE U4 VARABLE
8.3 O -1.2
0". " ""
La tabla 7.5 nos lleva a hacer las siguientes observaciones:
. ' -La extracción con éter propicia la pureza de los cristales. El efecto. positivo
del 6ter en pureza se debe.probablemente a que separa contaminantes que no pueden eliminarse de otra forma. Una parte importante de estas sustancias podrían ser componentes lípidos comQ los que estb presentes en las c é l u l a s de Sib@rella fu&kuto&
.
-La evaporación a 35 C o a 65 C no influye considerablemente en la pureza. AI inicio de la experimentación se propuso ver si la evaporación a baja temperatura favorece la pureza pensando en que esto prevendría una degradación térmica del ácido giberélico. Al contrario de esta hipótesis, la temperatura no aumentó la pureza de los cristales, por lo que es factible suponer que los efectos por degradacidn son nulos.
-El número de reevaporaciones no tiene efecto en la pureza. La principal conveniencia de realizar tres reevaporaciones en vez. de cinco consiste en la disminución de tiempo del proceso.
. .
. .." " 1 1 1 " "
8
TABLA 7.6 EFECTO DE VARIABLES SOBRE EL POfiCENTAJE DE . RECUPERACION.
uI_"""""""""""""""""""""."""""""""""""""""""""""""""-
. .. .. "
.ExP. NIVEL DE VARIABLE RECUPERA- MUESTRAS CION
EXTRACC. NUMERO TEMPERATURA CON ETER REEVAP. WAP. X
- .
- "" - - - ._ - .- - . .. . . . - " -
""""1""""""""""""""""""""""""""""""""
35C 61.45 - "
- ._" - . - - " _ _ ~ - "" - -
~~""~~~""------------"""""""""""""""~ " - - " . _
3 7Y8 NO 3 65C 52.3
"-___"-____I"""""" """""""
4 5 Y 6 NO 5 65C 47.65 ..
EFECTO DE LA VARABLE
6.05 -3.5 -7.75
"._-___""""""""" P
La tabla 7.6 nos'indica que:
- La extracción con éter mejora el porcentaje de recuperaci6n de los cristales; esto podría explicarse por la poca cantidad de impurezas en el extracto orgánico final que pudieran interferir en la cristdización.
- La evaporación a 65 C tiene un efecto favorable en la recuperación, al contrario. de la evaporación a 35 C. Esto se debe a que a 65 C se, tiene la posibilidad de evaporar una mayor cantidad de sustancias extrañas que a 35 C, sustancias que probablemente interfieren en la
cristalización. Esto se ve reforzado por los resultados de la tabla 7.5, en donde la evaporación a 35 C tiene un ligero efecto desfavorable en la pureza.
- El efecto en recuperación de tres reevaporaciones es ligeramente - .. " ". mejor- que cinco, por lo- que-se - decide establecer la metodología- definitiva con t
tres reevaporaciones. -
CONCLUSIONES . .
-. . . - ..
La extracción con éter es la variable con mayor influencia positiva en la pureza de los cristales y el rendimiento del proceso.
6 8 CONCLUSIONES GENERALES
"
. .
. " . .
- " _ . . LA CRISTAUZACION ES UNA DE LA ETAPAS CRITICAS DEL PROCESO. PARA QUE PUEDA REALIZARSE A CABO ES ESENCIAL LA
.PUREZA DEL EXTRACTO ORGANIC0 DEL QUE SE OBTIENEN LOS - ." ~
CRISTALES. - . " . - . . - - . - "
-." - .. - . . " ~. LA -PROPORClON DE ACETATO DE ETILO-ETER QUE
MEJORES RESULTADOS DA EN LA CRISTALIZACION EN CUANTO A PUREZA
- . . . .
. .. . - " _ _ " - .. ' "', EXTRACClON PRELIMINAR CON ETER MEJORA LA PUREZA -DE LOS CRISTALES. ADEMAS, CON ESTA DCTRACCION EL 'PORCENTAJE DE RECUPERACION AUMENTA CONSIDERABLEMENTE. -
"
. . - . -. - L . SE LLEGO A UNA METODOlOGlA -2-PURIFICACION CAPAZ DE OBTENER CRISTALES
- " "
1 %ON PUREZA DE AL MENOS 90 %. . .
.. .
" "
DE EXTRACCION Y DE ACID0 GlBEREllCO
t
. . -."..l"""" ' -
- . . . ~ .- . ." ..
El Bcido giberélico se obtiene comercialmente por cultivo sumergido del microorganismo Giberella fujikuroi.. La separación de ácido giberélico presenta grandes dificultades, tanto por la baja concentración en-que se encuentra en el caldo de cultivo, como por la presencia de sustancias extrañas: Bcido acético, láctico y otras giberelinas.
El objetivo de este trabajo es la optimización de la técnica de extracción para obtener cristales de ácido giberetico con pureza mayor al 90 %. ~. . -
El método de extracción parte de un caldo de fermentación de Giberella fuiikuroi obtenido de un fermentador de 150 Its. AI caldo filtrado y centrifugado se le extrae con éter ( 30 % vol. éter/caldo 3 veces) y a continuación se extrae con acetato de etilo a pH 2. El extracto orgánico se decolora con carbón activado, se filtra y se evapora a 65 C a presión reducida a sequedad. Se agregan 10 ml. de acetato de etilo al extracto evaporado y se reevapora. Se repite esto último dos veces más y se cristaliza con una soluci6n de acetato de etilo-&ter proporción 1O:l.
Esta metodología es resultado de la optimización por medio de experimentos en base a un arreglo ortogonat, y con ella es posible obtener cristales con pureza de al menos 90 %.
!i t
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