Autovacunas y diagnóstico

Rumiantes

Exopol Autovacunas y Diagnóstico Pol. Río Gallego D8 • 50840 San Mateo, Zaragoza. Tel 976 694 525 Fax 976 683 017

www.exopol.com • exopol@exopol.com

Abreviaturas PCR Polymerase Chain Reaction. Microbiología Incluye la microbiología y antibiograma (aerobios y/o anaerobios según los casos). ELISA (Enzyme Linked Inmunosorbent Assay). IPX Inmunoperoxidasa. IC Inmunocromatografia.

Fotografías Todas las fotografías empleadas en este folleto son propiedad de Exopol y están disponibles en nuestra web.

Precios Los precios de este folleto pueden ser modificados. Consulta los de las hojas de Toma de Muestras. Además estamos cambiando muchas de las técnicas empleadas

SI LA AUTOVACUNA

NO TE FUNCIONA

TE DEVOLVEMOS EL DINERO*

TÚ DECIDES // SIN PREGUNTAS

No siempre podemos estar seguros de que nuestras autovacunas van a ayudarte con tu problema, pero haremos todo lo posible, y nuestro compromiso es devolverte el dinero si no lo conseguimos. ¿Necesit as algo más para confiar en nosotros? * Se aplica a cualquier autovacuna. Tienes 9 meses para solicitarlo desde la fecha de envío. No se aplica a l diagnóstico.

Presentación 1

Toma de Muestras 2

Material de Toma de Muestras 4

Notas a las técnicas 5

Técnicas 6

Microbiología 6

Serología 6

IPX (Inmunoperoxidasa o

Inmunofluorescencia) 7

Abortos 10

Infertilidad 11

Perfil serológico en reproductivo 12

PCR en leche de tanque 13

Trichomonas 14

Campylobacter 15

Leptospiras 16

IBR 17

BVD/Border. Portadores asintomáticos 18

Coxiella 20

Clamidia 21

Diagnóstico 21

en campo de Clamidia 21

Toxoplasma 22

Neospora 23

Respiratorio 24

Lavado traqueobronquial en Ovino y Caprino

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Pasteurellas y Mycoplasmas respiratorios 26

Digestivo 28

Dendogramas. Comparación de Escherichia

coli 29

Diagnóstico en campo de Cryptosporidium 30

Autovacuna frente a Cryptosporidium 31

Paratuberculosis 32

Efectividad de los antiparasitarios 33

Bajas súbitas 34

Clostridiasis 35

Mamitis-Agalaxia 36

Articular 37

Ocular 40

Problemas podales 41

Problemas Nerviosos 42

Cutáneo y Linfoadenitis 43

Hemoparásitos 44

Fabricación de Autovacunas 46

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Presentación Exopol se dedica al diagnóstico y la elaboración de autovacunas veterinarias desde 1993. Trabajamos fundamentalmente con especies ganaderas. Trabajamos en toda España y aunque el marco legal lo dificulta mucho, también en Francia, Irlanda, Italia, Polonia, Rumania y Portugal. Trabajamos regularmente con la integradora porcina más grande del mundo (Smithfield Europa) y con algunos de los mayores grupos veterinarios franceses (Réseau Cristal, Labovet, Anilab, Coop Hunaudaye). Nuestra formación técnica es muy competitiva: 7 veterinarios (4 doctores), 2 licenciados no veterinarios y 3 técnicos. Podemos presumir de nuestra capacidad de trabajar en equipo. Hemos incluido en nuestro catálogo de diagnóstico a un gran número de patógenos con muchas técnicas diferentes, con el objetivo de permitirte que puedas profundizar en algunos casos.(si así lo deseas) Consulta nuestra hoja de Toma de Muestras. En algunos casos podemos presumir de ser de los primeros laboratorios en incluir como rutina en el diagnóstico de problemas reproductivos a Border (1997), Coxiella y Campylobacter (1998), Leptospiras (2000) o de hacer autovacunas de Cryptosporidium (2008), de Coxiella (2009) o de Leptospiras (2010). En las autovacunas utilizamos liposomas para inmunopotenciar los exopolisacáridos bacterianos (Amorena B., Baselga, R. y Albizu, I. 1994. Use of liposome-immunopotentiated exopolysaccharide as a component of an ovine mastitis staphylococcal vaccine. Vaccine. 12, 3: 243-249). Los liposomas se emplean en algunas vacunas frente a hepatitis e influenza en medicina humana y en algunos tratamientos anticancerosos y antifúngicos (Felnerova y cols. Liposomes and virosomes as delivery systems for antigens, nucleic acids and drugs. Curr Opin Biotechnol. 2004 Dec;15(6):518-29). Nosotros empleamos los liposomas en autovacunas veterinarias. Desde 1993 hemos fabricado más de 25.000 autovacunas diferentes (más de 30.000.000 dosis) y realizado más de 80.000 analíticas. Nuestra autovacuna de Agalaxia no se detecta en la serología convencional, lo que facilita los programas de erradicación y la podemos combinar con S. aureus, C. pseudotuberculosis, etc. Dedicamos un importante esfuerzo a la investigación. Ahora tenemos un proyecto CDTI IDI-20090420. Criptosporidiasis. Diagnóstico y Elaboración de Autovacunas. Presupuesto: 758.453,00€. Otros han sido CDTI 00-0078, 477.800€ y CDTI 050484, 450.000€. Al menos el 35% (y creciendo) de nuestra actividad y presupuesto es I+D. Tenemos colaboraciones científicas con diferentes Universidades y Centros de Investigación: Peter Kirkland, Australia. Juan Jose Ramos y Luis Miguel Ferrer. Univ. Zaragoza. Andrew Waller, Reino Unido. Pat Blackwall, Australia. Vito Martella y Laura Grazia, Bari , Italia. José Garayzabal, Ana Isabel Vela y Lucas Domínguez, Complutense de Madrid. José Penadés, CSIC León. Luis Miguel Ortega Mora y Esther Collantes, Complutense de Madrid. Daniel Villalba, Univ. de Lleida.

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Toma de Muestras La utilidad de la información que el laboratorio da al clínico está limitada por la calidad de las muestras analizadas (adecuación de la muestra a las enfermedades sospechadas, número y cantidad de las muestras, condiciones y material de recogida, conservación y envío, identificación, anamnesis, etc.) Sangre Sangre entera con anticoagulante. Refrigerada. Debe llegar al laboratorio antes de las 24 horas tras su extracción. Proteger los tubos frente a los golpes. Para PCR y tinción de hemoparásitos: EDTA. Para cultivos bacterianos o de hemoparásitos (autovacunas): Heparina.

Suero En tubos sin anticoagulante. Refrigerada. Los anticuerpos se pierden con el paso del tiempo por lo que hay que congelar el suero sin coagulo, si se van a guardar más de una semana. Nunca congelar los sueros con coágulo. Para maximizar el volumen de suero deja el tubo inclinado o invertido a temperatura ambiente unos 30 minutos tras la extracción de la sangre. Heces Para el análisis coprológico. No precisa refrigeración. No congelar. Emplear un recipiente hermético, bolsa o frasco. Recoger directamente del recto con guante o bolsa de plástico. Para cultivos bacteriológicos es mejor utilizar un hisopo rectal (tras limpiar el exterior del recto) con medio de transporte. Raspado Cutáneo Enviar en botes o tubos estériles. Para diagnóstico de ectoparásitos, infecciones bacterianas o fúngicas. No precisan refrigeración. Raspar con una hoja estéril de bisturí los bordes del área afectada tomando pelo y piel y profundizando hasta que sangre. En caso de infecciones bacterianas utiliza un hisopo tras quitar la costra o limpiar la piel. En linfoadenitis, abre el absceso y raspa la pared de la lesión con el hisopo (el pus frecuentemente es estéril). Líquido Cefalorraquídeo o Sinovial Refrigerado y en tubos con anticoagulante (heparina). Tomar la muestra con una jeringa estéril. Orina En frasco hermético y estéril. Refrigerada nunca congelada. Recoger con la máxima esterilidad, idealmente con sonda o al final de la micción. Leche No precisan refrigeración si se ha tomado correctamente de forma estéril. Utiliza un tubo estéril de boca estrecha (los venojet de 5ml son

Muestras leche. Envío correcto, tubos herméticos, identificados y protegidos de la rotura.

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ideales), los botes de orina se contaminan fácilmente por tener la boca muy grande. Selecciona animales positivos al Test California, toma la muestra previa al ordeño, limpia el pezón, desecha los primeros chorros de leche, 2-4 ml de leche son suficientes. No añadir ningún conservante. Hisopos o Escobillones Deben de llevar medio de transporte tipo Amies o Stuart. Se pueden conservar refrigerados, pero conviene enviarlos lo antes posible al laboratorio. Los hisopos permiten recoger muestras de exudados con alto contenido en bacterias, células y ADN en las cavidades nasal, traqueobronquial, cervical, rectal y conjuntival. Introduce el hisopo tan profundamente como sea posible en la cavidad y girarlo suavemente contra las paredes. Limpia siempre el exterior antes de introducir el hisopo. En cadáveres de necropsia, pueden tomarse las muestras con hisopos de órganos (es más económico en el análisis, pero la sensibilidad puede ser peor y se pueden contaminar). Órganos procedentes de necropsias y cadáveres Es imprescindible la refrigeración. Mejor no congelar si se solicita análisis bacteriológico. Hacer la necropsia inmediatamente tras la muerte o máximo 2 horas después. Guarde las mayores condiciones de asepsia posibles. Envíe órganos afectados enteros o trozos grandes con zonas afectadas y no afectadas, cada uno en un recipiente o bolsa independiente. El intestino se debe ligar en los extremos para evitar pérdidas de contenido y contaminaciones. Utiliza una bolsa hermética para cada órgano. Recuerda que los animales muertos muchas veces no son la muestra más significativa ni la mejor. Si es posible, sacrifica animales con síntomas y que respondan al cuadro observado en la explotación. Evita en lo posible el envío de cadáveres enteros especialmente en verano. Fetos No hay problema con los fetos pequeños. Envíalos dentro de una bolsa con suero de la hembra y la placenta (en otra bolsa). Los fetos grandes (terneros) se descomponen y conviene enviar los órganos en bolsas independientes: cabeza, pulmón, hígado, bazo, riñón, cuajar y suero de la hembra. Animales vivos Utiliza una caja resistente. Haz numerosos orificios de aireación en la caja, especialmente en verano. No ponga agua ni comida. Coloqua en el fondo material absorbente para los excrementos. Envíelo a última hora de la tarde.

Caja con muestra refrigerada. Envío correcto, el feto está envuelto en plástico hermético y acompañado de la refrigeración adecuada.

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Material de Toma de Muestras PODEMOS SUMINISTRARTE ESTE MATERIAL: Hisopos Utilízalos con medio Amies (es el gel que lleva). El gel conserva las bacterias para hacer la microbiología, y las células descamadas para los estudios inmunocitoquímicos (IPX) y el ADN del patógeno para el PCR. Bolsas herméticas Para el envío de órganos o fetos. Tienen un cierre hermético, muy fácil de utilizar y son altamente resistentes. Evitan que se derramen líquidos durante el transporte. PARA HACER LA MICROBIOLOGIA HAY QUE ENVIAR TROZOS GRANDES DE ÓRGANOS. Los trozos pequeños se contaminan con facilidad.

Tubos de leche Envía leche de animales infectados más una muestra del tanque. 9+1. Basta con 2ml de leche en los tubos que se emplean para sacar sangre. Tubos de sangre Tapón rojo sin anticoagulante. Tapón morado con Edta. Tapón verde con Heparina. Normalmente te pediremos un tubo de cada. En el rojo podemos hacer serología, en el morado PCR y tinciones y el verde lo empleamos para aislar por cultivo hemoparásitos y bacterias. Botes Para recoger orina u otras muestras de poco volumen. Sondas Para sacar la orina o para lavados traqueobronquiales (ver más adelante). Tubos con medio para Trichomonas Solicítalos previamente (hay que prepararlos frescos) y te indicaremos el modo de tomar la muestra (se inoculan inmediatamente después de recoger la muestra y se envían al laboratorio). Kits de diagnóstico en campo Puedes hacer en el campo el diagnóstico de Clamidias, Rotavirus y Cryptosporidium. Ganas tiempo y ahorras dinero.

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Notas a las técnicas Diagnóstico directo En los diagnósticos directos encontramos el patógeno directamente: lo aislamos por cultivo en microbiología, evidenciamos su ADN/ARN en PCR, lo vemos al microscopio después de marcarlo con un anticuerpo mediante IPX, lo vemos en microscopia tras una tinción, etc. Este diagnóstico es definitivo. Si, por ejemplo, encontramos ARN de BVD por PCR sin ninguna duda hay BVD. Ojo, además de BVD podemos encontrar un segundo patógeno y te corresponde a ti interpretarlo. Diagnóstico indirecto No vemos el patógeno pero encontramos los anticuerpos que ha producido. El problema está en la interpretación. Por ejemplo un animal vacunado con Clamidia inactivada es seropositivo y un animal infectado también. Si tienes abortos no sabes si la seropositividad corresponde a la vacuna o a infección. Si un animal abortado es seropositivo a Neospora, no hay vacuna, sólo puede ser infección pero, ¿los anticuerpos son de una infección reciente (estos abortos) o a una antigua? Para contestar a estas preguntas en los diagnósticos serológicos (indirectos) hay que hacer comparaciones: - Sano con enfermos. - Antes y después del problema. - Utilizar perfiles serológicos, -….. Tablas y técnicas Los datos que incluimos en el texto y tablas los hemos adaptado a las técnicas y capacidades que tenemos en nuestro laboratorio. Si envías muestras a otros laboratorios consulta con ellos. Por ejemplo, algunos laboratorios hacen una tinción de Stamp para Clamidias y Coxiella, nosotros empleamos el PCR.

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Técnicas

Microbiología La muestra la sembramos en diferentes medios de crecimiento y la incubamos (incluso durante varios días, eg. los Mycoplasmas). Una bacteria en el medio se multiplica exponencialmente y llega a formar una colonia visible. La especie que forma cada colonia la identificamos con pruebas bioquímicas (ahora también con PCR). Es frecuente que en una muestra aparezca más de una especie de bacterias. A las especies de interés se les hace un antibiograma.

Serología Buscamos anticuerpos. Los anticuerpos se producen tras el contacto con el patógeno, pero no indican que el patógenos esté presente en ese momento (un animal que se infectó y elimino la infección hace años, normalmente tiene anticuerpos durante años). Hay muchas técnicas diferentes para buscar anticuerpos: ELISA (Enzyme Linked Inmunosorbent Assay), Inmunofluorescencia, Aglutinación, Inmunocromatografia, Fijación del complemento, Seroneutralización, etc. El ELISA es la más frecuente y la que se emplea en casi todas las campañas. Existen muchos tipos de ELISA. ELISA (ejemplo simplificado)

Añadimos al pocillo el antígeno (rojo, normalmente se compra la placa preparada). Añadimos un suero problema. Si hay anticuerpos (naranja), se pegarán al antígeno (rojo). Añadimos un segundo anticuerpo (azul, antianticuerpo) con un enzima (* como la inmunoperoxidasa) que se pegara al primero anticuerpo (naranja). Añadimos un sustrato. Si nuestro suero problema se ha pegado al antígeno, el segundo anticuerpo también se habrá pegado y al añadir el sustrato, la enzima (*) produce un cambio de color (vira a azul) que es lo que se ve en el pocillo.

Las bacterias depositadas en las placas se extienden (diluyen) con un asa en toda la superficie de crecimiento

En estas placas, que aportan todos los factores de crecimiento, las bacterias se multiplican durante 24-48 horas (o varios días) en estufas de incubación a 37ºC

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PCR Real Time En el PCR multiplicamos un trozo del ADN/ARN del patógeno por eso podemos detectar al patógeno aunque haya cantidades muy pequeñas y este muerto. De la muestra (hisopo, órgano, leche, sangre, suero, heces, etc.) extraemos el ADN/ARN. Añadimos una sonda para un gen que es exclusivo de un patógeno y añadimos las enzimas para que empiecen a multiplicar ese ADN/ARN. Los reactivos llevan fluorescencia que se “revela” cuando se incorpora a las fibras de ADN. En cada ciclo una hebra de ADN da lugar a 2 (1, 2, 4, 8, 16, ….) y cada vez aparece más fluorescencia que es lo que lee el equipo (ver las curvas de arriba, en cada ciclo de la máquina aparece más fluorescencia en las muestras positivas, más copias del ADN). En la gráfica cada color pertenece a una muestra diferente. En este caso la muestra roja es la que más patógenos contiene (eg Coxiella), por eso la respuesta positiva aparece antes (en un ciclo de replicación anterior). LA PCR ES LA TÉCNICA DE ELECCIÓN pero puede dar falsos positivos (eg. si las sondas se eligen mal o no están bien validadas) y falsos negativos (eg. inhibidores en heces). Como siempre nosotros validamos nuestros PCR con otras técnicas y/o con otros laboratorios especializados.

IPX (Inmunoperoxidasa o Inmunofluorescencia) Buscamos un antígeno determinado marcandolo con un anticuerpo (100% específico, monoclonal). El antígeno son las proteínas del virus, lipopolisacárido de las bacterias, la pared de los parásitos, etc. Ponemos un poco de la muestra (células aisladas de la muestra) en un porta.

Añadimos un anticuerpo monoclonal específico para el agente buscado (BVD/Border, Clamidia, Mycoplasma, Coxiella, etc.) Añadimos un anticuerpo que se une al primer anticuerpo (si ha reconocido el antígeno) y que lleva una enzima. Añadimos el sustrato (Como ves es parecido al ELISA). Si hay cambio de color es positivo. En la foto se ve el citoplasma “marrón”. La causa es que en el citoplasma hay virus BVD o Border. El control negativo no se marca (azul).

BVD/Border+BVD/Border -

Ciclo número

Número

de copias

replica

das del ADN

patógeno

Curva de amplificación del PCR

¿Que muestra tienemás o y cual menos ADN del patógeno?

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PAQUETES DE DIAGNÓSTICO

PRECIOS FIJOS � MAS ECONÓMICO � MAYOR SENSIBILIDAD

Ahorra enviando muestras de varios animales

Al trabajar con PCR podemos hacer pooles de

varias muestras, por eso la segunda y las

siguientes son mucho más económicas (no se

aplica cuando se necesitan resultados

individualizados de cada muestra). Al trabajar con

muchas muestras mejoramos considerablemente

el resultado.

Mayor número de muestras estudiadas = Mayor

sensibilidad

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PANELES DIAGNÓSTICOS

Aborto Básico (primer aborto 90 €, 2-5 Siguientes 10 €): BVD, IBR, Coxiella, Campy. f. veneralis, Leptospira, Neospora. Infertilidad Básico (primera muestra 90 €, 2-5 Siguientes 10 €): BVD, IBR, Coxiella, Campy. f. veneralis, Leptospira, Trichomonas.

Reproductivo Plus (90/pool €, tras hacer el básico): Listeria, Clamidia, Salmonella, Campy. f. fetus, Trichomonas (en abortos), Neospora (en infertilidad). Respiratorio (primera muestra 90 €, 2-5 Siguientes 10 €): Micro*, BVD, IBR, BRSV, PI3, Mycoplasma bovis. Digestivo lactante : Micro*, BVD, Coronavirus, Rotavirus, Clostridios, Cryptosporidios. Digestivo adultos: Micro*, Paratuberculosis, Coprología. Control en Leche de Tanque PCR (90€): BVD, Clamidia, Coxiella, Leptospira, IBR. Hemoparásitos (primera muestra 90€, 2-5 Siguientes 10 €): Anaplasma marginale, Anaplasma phagocytophilum, Babesia bovis, Babesia bigemina, Theilera annulata. Ocular (primera muestra 60 €, 2-5 Siguientes 10 €): Micro*, Clamidias, Mycoplasma bovis, IBR.

Fetos: + 25 euros en concepto de necropsia, toma de muestra y eliminación.

Reproductivo Básico (primer aborto 90 €, 2-5 Siguientes 10 €): Toxoplasma, Campy. f. fetus, Coxiella, Clamidia, Leptospira, Salmonella. Reproductivo Plus * (90 €/pool, tras hacer el básico): Border, Listeria, Myc. agalactiae, Neospora, Campy. f. veneralis.

Respiratorio: Micro*, Clamidia, Mycoplasma, PI3, Visna-maedi Digestivo lactantes: Micro*, Clostridios, Cryptosporidios, Coronavirus, Rotavirus. Digestivo adultos: Micro*, Paratuberculosis, Coprología. Articular/Ocular (primera muestra 60 €, 2-5 Siguientes 10 €): Micro*, Clamidia, Mycoplasma agalactiae. Nervioso: Micro*, Listeria, Visna, Cenuro. Mamitis 9 leches + Tanque (60 €): Micro*, Mycoplasma agalactiae.

Animales/Fetos: + 25 euros en concepto de necropsia , toma de muestra y eliminación.

Reproductivo (primer aborto 90 €, 2-5 Siguientes 10 €): PRRS, Leptospira, Clamidia, Parvovirus, Circovirus. Respiratorio (primera muestra 90 €, 2-5 Siguientes 10 €): Micro*, PRRS, Influenza, Circovirus, Mycoplasmas.

Digestivo lactante: Micro*, Clostridios, PDEV, Rotavirus, Coccidios. Digestivo cebo y adulto (60 €/muestra): Micro*, Clostridios, Brachyspiras, Lawsonia.

Animales/Fetos: + 25 euros en concepto de necropsia , toma de muestra y eliminación.

Reproductivo (primera muestra 90 €, 2-5 Siguientes 10 €): Micro*, Clamidia, Mixomatosis, Leptospira, Toxoplasma, RHD. Control Semen (90 €/pool): Micro*, Toxoplasma, Leptospira, Clamidia, RHD,

Mixomatosis, Encefalitozoon. Respiratorio: Micro*, Clamidias, Mixomatosis. Digestivo: Micro*, Clostridios, Coprología.

Animales: + 15 euros en concepto de necropsia, toma de muestra y eliminación. Microbiología*: incluye la identificación bacteriana (incluido salmonella) y antibiograma.

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Abortos Técnica Muestra PCR Cultivo Serología Órganos feto Placenta Hisopo cervical (3) Brucilla (1) - - + Sólo por serología BVD Border + - + Pulmón, Riñón ++ ++ Campylobacter fetus veneralis, C. fetus fetus

+ + - Pulmón, Cuajar, Hígado

++ Lavados prepuciales y vaginales

Coxiella burnetti + - + Pulmón, Hígado +++ +++ Chlamydia + - + Pulmón, Cuajar, +++ +++ IBR + - + Pulmón, Hígado ++ + Leptospira (2) + - + Hígado, Riñón ++ + Listeria + + + - + + Neospora + - + Encéfalo,

Corazón + -

Salmonela spp + + - Pulmón, Hígado +++ +++ Toxoplasma + - + Encéfalo,

Corazón + -

Trichomona foetus + + - - - Infertilidad (1) Oficial, (2) Serología frente a Leptospira automnalis, hardjo, bratislava, canicola, grippotyphosa, icterohemorrgiae y pomona (3) Siempre por duplicado.

Observa y Apunta: Si sólo abortan primerizas y animales jóvenes el problema ya estaba en la explotación. Si abortan animales de todas las edades el problema probablemente es nuevo en la explotación y seguramente es más grave.

Paneles diagnósticos Aborto e Infertilidad En reproductivo y fertilidad consulta los paneles de diagnóstico en primera y segunda opción. MANDA SIEMPRE MUESTRAS DE VARIOS ANIMALES. PUEDES COMBINAR FETOS E HISOPOS DE DIFERENTES ANIMALES. Muestras Abortos Feto (órganos si el ternero es muy grande), placenta y suero de la hembra. Cada patógeno tiene un órgano diana y por eso esta es la mejor muestra. Nosotros trabajamos siempre con dos órganos diana por patógeno. Hisopo cervical. Toxoplasma y Neospora pueden dar falsos negativos en el hisopo. El aislamiento para autovacunas es más difícil. Envía siempre los hisopos por duplicado, en uno hacemos el diagnóstico, en el otro hacemos el aislamiento si se necesitan autovacunas. Adjunta siempre suero de los animales abortados. Anticuerpo vs. Antígeno En el feto, placenta e hisopos localizamos el agente (antígenos o ADN). En el suero, y en líquidos fetales, localizamos anticuerpos. Los anticuerpos indican contacto con el patógeno, pero salvo con los anticuerpos en líquidos fetales que corresponden a infección del feto, la serología normalmente no indica cuando se infectó la

Aborto ovino con hemorragias y edema generalizados. Microscópicamente, se observó un infiltrado mononuclear de moderado a intenso en todos los órganos, incluido el encéfalo, siendo especialmente marcado en corazón. La sospecha fue infección viral, especialmente border, confirmado mediante inmunoperoxidasa.

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hembra, por eso la interpretación es difícil. Los sueros se pueden parear (antes y después del aborto o, en el momento del aborto y 15 días después). Algunas notas sobre Serología. Los animales vacunados con IBR no marcada son seropositivos durante años. Con vacuna de BVD inactivada se puede distinguir animales vacunados de infectados. La vacuna viva de Clamidia no seroconvierte (los seropositivos son infectados). La serología de Leptospiras se debe hacer frente a cada serovar (Leptospira automnalis, hardjo, bratislava, canicola, grippotyphosa, icterohemorrgiae y pomona).

Infertilidad Separamos el aborto de la infertilidad porque el abordaje del problema es diferente. Los patógenos incluidos en la tabla son con los que más trabajamos en los casos de infertilidad. Las seroprevalencias elevadas de BVD/Border, Neospora, Toxoplasma, y muchos otros patógenos también se han asociado con una menor fertilidad.

Técnica Muestra PCR Cultivo Serología Campylobacter + + - Chlamydia + - + Coxiella + - + Leptospira + - + Salmonela + + -

Útero matadero, lavado uterino Hisopo cervical (por duplicado)

Leche tanque

Tritrichomonas foetus + + - Lavados prepuciales y uterinos Serología frente a Leptospira automnalis, hardjo, bratislava, canicola, grippotyphosa, icterohemorrgiae y pomona.

Paneles diagnósticos Aborto e Infertilidad En reproductivo y fertilidad consulta los paneles de diagnóstico en primera y segunda opción. MANDA SIEMPRE MUESTRAS DE VARIOS ANIMALES. PUEDES COMBINAR FETOS E HISOPOS DE DIFERENTES ANIMALES. Muestras Infertilidad Úteros de matadero, lavados uterinos o prepuciales, y/o hisopos cervicales profundos SIEMPRE POR DUPLICADO. Para Leptospiras envía también orina y suero. Para hacer autovacunas de Tritrichomonas foetus tienes que tomar la muestra y llevarla directamente a un medio especial que te podemos enviar. Leche de tanque. Muy útil para hacer el seguimiento de una explotación (no para el diagnóstico de problemas clínicos). Resultados Si no encontramos ningún patógeno podemos pensar que la causa no es infecciosa y habrá que investigar más en el manejo.

Autovacunas en Abortos e Infertilidad Ovino y Caprino Campylobacter sp., Coxiella, Leptospira, Salmonella, Toxoplasma… Bovino Campylobacter fetus veneralis, Clamidia, Leptospira, Coxiella, Salmonella, Trichomonas…

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Perfil serológico en reproductivo Ponemos un ejemplo muy sencillo con un problema reproductivo en ovino o caprino. Sangramos a 10 ovejas de 1, 2 y 3 ó más partos (30 animales en total) y cogidas al azar.

Interpretación Sólo un animal (10%) de los grupos 2 y 3 son seropositivos a Toxoplasma (amarillo), por lo que no es un problema presente. El riesgo está en que no hay animales protegidos frente a Toxoplasma. Si entra en la explotación podemos tener una tormenta de abortos. Clamidia (morado) circuló e infectó a varios animales hace 2 años (partos), mientras que los animales de 1 parto son seronegativos (no infectados). Recuerda que la vacuna viva de

Clamidia protege, pero no seroconvierte. La inactivada sí seroconvierte. En este caso no sabemos si los animales de un año han sido vacunados con viva, pero seguro que no están infectados ni han sido vacunados con muerta. El virus Border (granate) ha infectado a animales de todas las edades. Probablemente los problemas reproductivos cercanos se deben a Border. Además, con esta seroprevalencia es muy posible que exista un PI (portador asintomático). Estudios retrospectivos Nosotros conservamos congelados los sueros de todos los análisis y podemos recuperarlos para hacer estudios retrospectivos. Saca sangre tras la aparición de un problema y podemos comparar con los sueros de hace unos meses. Serología empleada Saca sangre en el momento en que se producen los problemas y 15 días después. Cuando un proceso es agudo (acaba de entrar y actúa de forma fulminante) los animales seroconvierten elevándose los títulos de anticuerpos frente a ese patógeno 15 días después. Cuando la infección ha sido hace tiempo, aunque el animal sea positivo no se observa seroconversión. Otra alternativa es comparar los resultados de animales con y sin problemas. En este caso muestrea al menos 10 animales abortados y 10 sin abortar de similares grupos de edad (mejor hembras jóvenes que serán seropositivas a menos enfermedades).

Seroperfil Reproductivo

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1 2 3 ó más

Años o parto del reproductor

Por

cent

aje

de a

nim

ales

ser

opos

itivo

s

Clamidia

Border

Toxoplasma

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PCR en leche de tanque En leche de tanque podemos hacer el PCR para buscar BVD/Border, Campylobacter, Coxiella, Clamidia, IBR, Leptospira, Paratuberculosis, Salmonella, etc. Algunos patógenos se excretan en la leche. La PCR permite valorar la presencia en la explotación de ciertos patógenos causantes de problemas reproductivos o peligrosos para la salud humana en leche de tanque. Nunca se puede considerar esta analítica como un diagnóstico clínico.

Paneles diagnósticos Consulta los paneles de diagnóstico.

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Trichomonas Tritrichomonas foetus produce infertilidad en bovino. Muestras Para su aislamiento necesitamos que nos envíes muestras de mucus vaginal de vacas o de smegma prepucial de sementales. Es importante una adecuada toma de muestras (consultanos antes) y su envío en el mismo día en que han sido tomadas. Antes de tomar la muestra hay que lavar bien con agua el prepucio o la zona de la vulva y secar con papel. En el caso de los toros, si no se dispone de raspador para tomar smegma prepucial, puede hacerse un lavado introduciendo PBS dentro del prepucio con una pipeta de inseminación artificial a la que se le conecta un tubo de látex. Con una jeringa se introduce PBS, se efectúan vigorosos masajes en sentido cráneo-caudal y se recoge el líquido en un frasco, dejándolo caer por gravedad a través de la goma. Utilizar material estéril. No introducir demasiado líquido porque diluye mucho la muestra. Enviarlo siempre REFRIGERADO. Aunque los toros que están infectados lo están permanentemente, el parásito generalmente se encuentra en mayor cantidad en las hembras que han abortado recientemente, han vuelto a celo o muestran signos de piometra. Para las trichomonas, podemos suministrarte tubos con medio de cultivo para que tú introduzcas directamente la muestra en ellos.

Diagnóstico PCR Real time. Podemos hacerlo en hisopos, lavados, etc. Cultivo. Llámanos antes y te mandaremos los medios para su aislamiento. No se puede hacer serología frente a Trichomonas. Autovacunas Las autovacunas son una solución de eficacia contrastada y de uso internacional.

Cultivo de Trichomonas aislado de un toro. Observación en fresco. Microscopio de campo claro 63X.

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Campylobacter en contenido de estómago de feto bovino. Tinción de plata. Microscopía de campo claro 1000x.

Campylobacter Campylobacter fetus fetus produce abortos en ovino y caprino y Campylobacter fetus venerealis infertilidad en bovino. En realidad ambos están implicados en abortos e infertilidad. Campylobacter coli y jejuni también han sido descritos como causantes de abortos, pero a veces pueden ser contaminantes (a partir de las heces), especialmente en los hisopos. Campylobacter fetus veneralis, muestras Para su aislamiento necesitamos que nos envíes muestras de mucus vaginal de vacas o de smegma prepucial de sementales. Es importante una adecuada toma de muestras (consultanos antes por teléfono) y su envío en el mismo día en que han sido tomadas. Antes de tomar la muestra hay que lavar bien con agua el prepucio o la zona de la vulva y secar con papel. En el caso de los toros, si no se dispone de raspador para tomar smegma prepucial, puede hacerse un lavado introduciendo PBS dentro del prepucio con una pipeta de inseminación artificial a la que se le conecta un tubo de látex. Con una jeringa se introduce PBS, se efectúan vigorosos masajes en sentido cráneo-caudal y se recoge el líquido en un frasco, dejándolo caer por gravedad a través de la goma. Utilizar material estéril. No introducir demasiado líquido porque diluye mucho la muestra. Enviarlo siempre REFRIGERADO. Campylobacter fetus fetus, muestras Para su aislamiento es preferible trabajar con fetos ovinos o caprinos. La principal dificultad del aislamiento es que las muestras estén en perfectas condiciones (aborto reciente, sin abrir, seco y limpio externamente con papel y refrigerado). Diagnóstico PCR Real time. Podemos hacerlo en hisopos, lavados, fetos, etc.

Cultivo a partir de órganos fetales, hisopos, lavados, etc. IPX. Inmunomarcaje. Podemos hacerlo en hisopos, lavados y fetos. No se puede hacer serología frente a Campylobacter. Autovacunas de Campylobacter

fetus Las autovacunas son una solución de eficacia contrastada y de uso internacional.

Cepa de Campylobacter fetus fetus aislada de hisopo endocervical de oveja abortada. En la placa de Columbia Blood Agar se depositaron 25 microlitros de suplemento antibiótico Preston y se extendieron. En la placa así preparada se sembró el hisopo y se incubó hasta 6 días en condiciones de microaerofilia. Obsérvese las colonias de Campylobacter muy pequeñas, no hemofílicas, con aspecto de “gota de agua” que se extienden por la placa.

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Leptospiras La Leptospira es frecuente en abortos e infertilidad. También la vemos en casos con cuadros inespecíficos, perdidas de producción lechera, bajas súbitas. A veces aparece con anemia y/o ictericia, pero esto es menos frecuente de lo que comúnmente se cree. En ocasiones la mortalidad que asociamos a otros patógenos son inducidas por una una inmunodepresión por Hemoparásitos o Leptospiras. Hay diferentes serovares. Nosotros trabajamos con los más importantes (automnalis, hardjo, bratislava, canicola, grippotyphosa, icterohemorragiae y pomona). La inmunidad es específica de serovar. Muestras Suero para hacer microaglutinación. En abortos/infertilidad fetos (riñón), placenta, úteros de matadero, hisopos cervicales (por duplicado), lavados cervicales, etc. Leche de tanque para buscarla dentro de una explotación. Orina del final de la micción o mejor obtenida con sonda (disponemos de sondas para ovino y caprino). Diagnóstico PCR Real time en orina, leche, fetos, placentas, hisopos cervicales, etc. Serología. Microaglutinación. Frente a cada uno de los serovares de Leptospira. Los anticuerpos aglutinan a Leptospiras de diferentes serovares de Leptospiras a diferentes diluciones. La reacción se observa en el microscopio. La Microaglutinación se hace con Leptospiras vivas y por eso no es un diagnóstico rápido. IPX. Inmunomarcaje (fetos, orina, hisopos), permite identificar incluso el serovar de Leptospira porque emplea anticuerpos monoclonales totalmente específicos. Cultivo (fetos, orina, hisopos). Sólo tiene interés cuando se solicitan autovacunas y no se hace en el diagnóstico rutinario. Envía siempre los hisopos por duplicado (en uno hacemos el diagnóstico, en el otro cultivamos para autovacunas).

Control Controla a los roedores (portadores) y potabiliza el agua. Utiliza autovacunas. Autovacunas Podemos hacer autovacunas frente a uno o varios serovares a la vez. La inmunidad es específica de serovar. No hay vacunas comerciales para ovino, caprino o porcino. En bovino existe una vacuna sólo frente a hardjo y otra que combina 5 serovares de Leptospira con IBR no marcada por lo que no se puede utilizar donde haya campañas de control de IBR.

Leptospira en orina. Tinción de plata.

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IBR IBR es un problema cada vez menos frecuente, al menos en rebaños lecheros. Muestras Suero. Si se ha vacunado con vacuna inactivada la serología no tiene ningún interés. Fetos, hisopos o lavados cervicales, etc. Pulmón y traquea cuando hay problemas respiratorios o lavados traqueobronquiales. Diagnóstico Serología. PCR en fetos, órganos o hisopos. IPX. Inmunomarcaje en feto, órganos o hispos. Serología frente a IBR -Todos los animales infectados con IBR y todos los animales vacunados con vacuna sin marcar son positivos en el ELISA frente a IBRgB e IBRgE. - La vacuna marcada no incluye la proteína gE. Los animales vacunados con vacuna marcada son seronegativos frente a IBRgE, pero seropositivos frente a IBRgB. Si un animal vacunado con vacuna marcada es seropositivo es porque se ha infectado, o porque en algún momento anterior de su vida fue vacunado con vacuna sin marcar. IBRgB IBRgE Animal 1 - - Ni infectado ni vacunado. Animal 2 + - Vacunado con vacuna marcada Animal 3 - + Error. Todos los IBRgE positivos deben positivos a IBRgB Animal 4 + + Vacunado con vacuna sin marcar o infectado. No se puede distinguir. Notas: - En todos los laboratorios hacemos mucha serología frente a IBRgB de animales vacunados. Sistemáticamente los animales son seropositivos y lo único que se puede concluir es que han sido vacunados. NO SOLICITES ESE ANALISIS, NO TIENE UTILIDAD (salvo confirmar que los animales han sido vacunados).

Ternero de cebo con bronconeumonía y traqueitis fibrinonecróticas. En microbiología se aislaron cultivos masivos de M. haemolytica y Pseudomona aeruginosa. Mediante inmunoperoxidasa se detectó la presencia también de Mycoplasma bovis, no encontrando positividad frente BRSV, PI-3, BVD, IBR y Adenovirus.

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BVD/Border. Portadores asintomáticos Si un animal a principio de gestación se infecta con el virus BVD o Border y no se produce aborto, el feto puede reconocer el virus como parte de su organismo y nacerá como un PERSISTENTEMENTE INFECTADO (que excretará grandes cantidades de virus que infectarán al resto del rebaño), pero será seronegativo durante toda su vida. Ojo, un PERSISTENTEMENTE INFECTADO puede tener inicialmente anticuerpos maternales. Muestras Suero: Las vacunas están marcadas, la serología tiene mucho interés. En el suero podemos buscar anticuerpos frente a la proteína p80 y antígeno viral circulante (viremia). Piel de la oreja: El virus se localiza en la piel y aquí lo podemos buscar con mayor sensibilidad. Interpretación de la serología La vacuna inactivada, la viva no, pierde la proteína p80 y no genera anticuerpos contra la p80. Cuando la serología es positiva a p80 ha habido infección con virus campo o se ha vacunado con vacuna viva. Si los animales jóvenes son seropositivos, el virus ha circulado recientemente. Si sólo los viejos son seropositivos, circuló hace algunos años, pero no ahora (ver perfil serológico). Si la seroprevalencia esta por encima del 50-60% y están infectados los animales jóvenes, probablemente existirá un Persistentemente Infectado.

ELISA de bloqueo de BVD

p80 En el ELISA de bloqueo, los anticuerpos del animal impiden que los anticuerpos del kit se unan a la placa antigenada con el virus. Cuantos más anticuerpos tenga un animal, mayor será el porcentaje de bloqueo. Un animal que bloquea más del 50% es positivo. Entre un 30 y el 50% es dudoso y por debajo del 30% es negativo. Un dudoso puede pasar a positivo si está seroconviritiendo y a negativo si está perdiendo la inmunidad (calostral o propia).

Anticuerpo monoclonal anti p80 BVDV

Muestra positiva

Substrato

Cromógrafo

Soluble

O-Phenylene diamine (OPD)

Anti IgG de ratón HRPO

Microplaca antigenada BVDV

LECTURA A 450 mm.

FRENAR LA REACCIÓN

Permite diferenciar anticuerpos post-infección de anticuerpos post-vacunales:(Vacunas inactivadas)

No es posible discriminar anticuerpos post-infección de aquellos inducidos por vacunas vivas o atenuadas

BVD

PI BVD

BVD

BVD

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El proceso de búsqueda en BVD y en Border - Sangramos a todos los animales para vida de más de 6 meses. Los animales seropositivos de más de 6 meses no pueden ser un PI. Los de menos de 6 meses pueden tener anticuerpos calostrales. En todos los animales seronegativos, y empleando el mismo suero, buscamos antígeno circulante, viremia. Un PERSISTENTEMENTE INFECTADO es virémico persistente y seronegativo, mientras que los animales infectados la viremia es transitoria, por lo que es necesario sacar suero de todos los animales virémicos a los 30 días de la primera sangría. Toda la reposición se puede estudiar a partir de los 12 meses.

PI

BVD+

BVD-

30 DÍAS

BVD-BVD

-

BVD-

BVD+

ELIMINAR

BVD+

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Coxiella Coxiella, produce abortos e infertilidad y es una zoonosis importante. Esta mucho más extendida de lo que se pensaba. Muestras Suero. De poco interés. En abortos/infertilidad placenta, úteros de matadero, hisopos cervicales (por duplicado), lavados cervicales. Leche de tanque para buscarla dentro de una explotación. Diagnóstico Serología. Como el proceso es muy prevalente conviene hacer seropérfiles o comparar sanos y enfermos. PCR Real time en leche, feto, placenta, hisopo cervical, etc. IPX. Inmunomarcaje (placenta, hisopos, lavados). Cultivo (placenta, hisopos cervicales). Envía siempre los hisopos por duplicado (en uno hacemos el diagnóstico, en el otro hacemos el aislamiento para autovacunas). Autovacunas Hacemos autovacunas con excelentes resultados tanto en abortos como en infertilidad.

Placenta de cabra en un caso de aborto por Coxiella, en la que puede observarse la presencia masiva de Coxiella ocupando las células trofoblásticas. En la zona superior de la imagen puede observarse una ligera vasculitis y en la inferior necrosis. Coxiella fue demostrada por Inmunofluorescencia y mediante serología se detectó una infección activa. Asimismo, se investigó la presencia de otros agentes habitualmente relacionados con abortos en cabras, tales como Salmonella sp., Chlamydophila, Toxoplasma, Campylobacter sp., Border o Leptospira sp., todos ellos con resultados negativos.

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Clamidia Chlamydophila abortus es la principal causa de abortos en pequeños rumiantes, pero también es importante en bovino. Produce infertilidad, artritis y conjuntivitis. Muestras Suero. Tiene poco interés. En abortos/infertilidad feto, placenta, úteros de matadero, hisopos cervicales (por duplicado), lavados cervicales. Leche de tanque para buscarla dentro de una explotación. Diagnóstico Serología. Las vacunas vivas de Clamidia no seroconvierten, las inactivadas sí. Los animales vacunados y los viejos (la prevalencia es elevada) son seropositivos. PCR Real time en leche, feto, placenta, hisopo cervical, conjuntival, líquido articular, etc. Cultivo (placenta, hisopos cervicales). Envía siempre los hisopos por duplicado (en uno hacemos el diagnóstico, en el otro hacemos el aislamiento para autovacunas). Tinción. Muchos laboratorios hacen el diagnóstico utilizando una tinción de Stamp y utilizando su experiencia para distinguir Coxiella de Clamidia e incluso Brucela.

Autovacunas Hacemos autovacunas de Clamidia en Bovino.

Diagnóstico en

campo de

Clamidia El test rápido de Exopol para Chlamydophila abortus, se emplea en campo (cajas de 20 kits, 3,5€ por kit) para la detección de antígeno. Puedes mantener el hisopo refrigerado, no congelado, durante un máximo de 72 horas. Introduce el hisopo del kit hasta el cervix sin tocar las paredes de la vagina. Puedes tomar la muestra incluso 7 días después del aborto. Resultado en 20 minutos.

Negativo: Sólo aparece una banda rosa en la zona control mostrando que todo se ha realizado correctamente. No hay línea en la zona test porque no hay antígeno de Chlamydophila. Si no aparece ninguna línea en la zona control el test no es válido.

Positivo: Además de la banda rosa en la zona control aparecerá una banda en la zona test. Incluso una banda débil en esta zona debe interpretarse como resultado positivo. Pueden aparecer diferencias en la intensidad de las bandas de las zonas control y test, pero no afectan a la interpretación de los resultados.

18 gotas

Liq. de extracción

Tubo de extracción

Revolver

Hisopo

Esperar 10 min.

4 gotas

Placenta de oveja en un caso de aborto por Chlamydophila. Se observa una placentitis necrótica con trombosis y hemorragias.

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Toxoplasma El problema del Toxoplasma es la infección de hembras gestantes. Si la infección se produce fuera de la gestación no hay problema clínico. Toxoplasma es muy prevalente en ovino y caprino y mucho menos en bovino. Muestras Suero. De mucho interés. Fetos. Toxoplasma se encuentra principalmente en el cerebro y otros órganos del feto (corazón). Los hisopos y la placenta no son la muestra más adecuada y dan falsos negativos. Diagnóstico Serología. Títulos altos de aglutinación indican infección reciente. Al principio de la infección hay IgM que aglutinan mejor, luego sólo hay IgG y los títulos son más bajos. La serología se puede hacer en el feto. PCR en feto. El PCR además permite buscar Toxoplasma en las heces de los gatos, que son la fuente de la infección. IPX. Inmunomarcaje en feto. Autovacunas Podemos hacer autovacunas.

Toxoplasma gondii en cultivo (Línea celular COE)

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Neospora Neospora se transmite verticalmente de madres a hijos y horizontalmente a través de las heces de los perros. También produce abortos en ovino y caprino. Muestras Suero. De mucho interés. Fetos. Neospora y Toxoplasma se localizan en encéfalo y menos en corazón, por lo que se necesita el feto. Los hisopos no son validos por eso determinamos anticuerpos en el suero que acompaña el hisopo. Diagnóstico Serología. Extremadamente útil en el diagnóstico y en el control. PCR en fetos. El PCR además permite buscar Neospora en las heces de los perros. IPX. Inmunomarcaje en feto.

Control No guardes descendencia de los animales seropositivos. Elimina los seropositivos. Los perros de la explotación deben ser seronegativos. Consulta precios para más de 50 sueros.

Encéfalo de un feto de cabra en un caso de aborto por Neospora. Puede observarse la presencia de dos quistes de protozoo, los cuales, mediante inmunoperoxidasa, se correspondieron con Neospora, siendo negativos frente Toxoplasma.

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Respiratorio Técnica Muestra PCR Cultivo IPX Serología Adenovirus - + - Arcanobacterium pyogenes + - - Aspergillus spp + - - BVD/ Border + - + + Corynebacterium pseudotuberculosis

+ - -

Histophilus somni + - - IBR/ Herpesvirus caprino + - + + Mycoplasma sp (bovis, agalactiae, ovipneumoniae, arginini, etc.)

+ + M. bovis y agalactiae

Pasteurella (haemolytica, multocida, trehalosi)

+ - -

PI-3 - + + BRSV - + + Visna-Maedi CAE - + +

Pulmón, Lavado bronquial, Hisopo nasal profundo (se contamina con facilidad y

puede no ser representativo.

Adenomatosis - - - Pulmón Histopatología Parásitos - - - Heces Coprología

Muestras Envía siempre un trozo de pulmón muy grande (los trozos pequeños se contaminan) con traquea y corazón si hay fibrina o lesiones, dentro de una bolsa y refrigerado. Selecciona un TROZO MUY GRANDE (para evitar contaminaciones) con lesión y sin lesión (los patógenos se aíslan mejor en la zona frontera). SELECCIONAR EL ANIMAL ENFERMO es muy importante. Los animales que causan baja no tienen porque ser buenas muestras, especialmente si el proceso ha sido largo y han sido muy tratados. Lo ideal es tomar muestras de un animal con fiebre al inicio del proceso y representativo del mismo. Puedes trabajar con animales vivos con sondas traqueales (son muy fáciles de usar). La ventaja es que muestreas animales febriles al comienzo del proceso y no los que causan baja. Hisopos nasales. Limpia la nariz con un guante y papel, introduce el hisopo tan atrás como puedas y giralo sobre la pared. En las células descamadas estudiamos la presencia de virus. Sobre los restos de moco hacemos la microbiología. Recuerda que estas muestras se contaminan fácilmente y que los aislados pueden ser colonizadores de la nariz pero quizá no estar produciendo lesiones en el pulmón.

Paneles diagnósticos Consulta los paneles de diagnóstico. MANDA SIEMPRE MUESTRAS DE VARIOS ANIMALES. AL TRABAJAR CON POOLES NO ES MAS CARO Y AUMENTAMOS LA SENSIBILIDAD. Autovacunas en respiratorio Ovino Caprino

Pasteurella multocida, Mannheimina haemolytica, Birbesteinia trehalosi, Mycoplasma sp, Corynebacterium pseudotuberculosis, Arcanobacterium pyogenes, etc.

Bovino Pasteurella multocida, Mannheimina haemolytica, Histophilus somni, Mycoplasma sp, Arcanobacterium pyogenes, etc.

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Lavado traqueobronquial en Ovino y

Caprino 1. Cargar una jeringa con suero fisiológico estéril. 2- Sujetar el animal e introducir la sonda traqueobronquial por un orificio nasal, entrando cerca del tabique nasal y en dirección dorsal. 3. Una vez introducida la sonda (30-40 cm), inyectar suero fisiológico estéril (0,5cc por Kg de peso vivo). 4. Inmediatamente después, aspirar con la misma jeringa moviendo suavemente la sonda hacia adentro y hacia fuera. (Se recogen de 1 a 5 cc de suero mezclado con mucosidades). 5. Extraer la sonda. 6. Trasvasar el líquido a un tubo esteril (tubo de suero, tapón rojo). Cada sonda cuesta 1€ y te podemos suministrar todas las que necesites. NUESTRO COMPROMISO Mientras aprendes no te facturaremos la analítica de las que se contaminen (recuerdanoslo cuando mandes las muestras).

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Pasteurellas y Mycoplasmas respiratorios Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica y Pasteurella trehalosi ahora son Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica y Bibersteinia trehalosi. En bovino Mycoplasma bovis y en Ovino y Caprino M. ovipneumoniae, M.agalactiae, M. mycoides capri y M. capricolum son causas predisponentes de los problemas respiratorios en animales jóvenes. Muestras Suero. Sólo existe serología para M. agalactiae y M. bovis. Órganos, hisopos o Lavados traqueobronquiales. Diagnóstico IPX para Mycoplasmas (pulmón, lavados traqueobronquiales). Cultivo (pulmón, lavados traqueobronquiales). El aislamiento de Pasteurellas y de los Mycoplasmas de rumiantes es bastante más sencillo de lo que se piensa. Autovacunas Normalmente las hacemos combinadas Mycoplasma con Pasteurella y/o Mannheimia. No existen vacunas comerciales frente a Mycoplasmas respiratorios. Una autovacuna se elabora en sólo 15 días (incluyendo los Mycoplasmas).

Cepa de Mycoplasma mycoides mycoides LC en agar Hayflick. Aislado de un pulmón caprino. Crecimiento en caldo Hayflick y H25P en 5 días (aislamiento primario) y 2 días en resiembras. Crecimiento en agar Hayflick en 3 días procedente del caldo.

Cepa de Pasteurella multocida teñida mediante tinción de Gram. Observación en microscopio 1000X.

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AUTOVACUNAS MÚLTIPLES

MÁS ECONÓMICO � MÁS SENCILLO

Diseñamos las autovacunas para cada explotación y p or ello es posible vacunar frente a varios patógenos c on una sola aplicación. Podemos preparar viales de distint as autovacunas que se resuspenden juntas y se aplican a la vez o incluir varios patógenos en la misma autovacu na. Por ejemplo: Staphylococcus y Mycoplasmas (agalaxia ) + Pasteurellas y Mycoplasmas respiratorios. Consulta con nuestros expertos.

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Digestivo Técnica Muestra PCR Cultivo IPX Serología I. delg. I.grueso Hisopo rectal Heces BVD Border + - + +++ +++ ++ ++ +++ Clostridium perfringens(1) - + - - +++ + + + Coccidios(2) - - - - + + - +++ Coronavirus - + - +++ ++ ++ - Criptosporidios(1) + - - - +++ +++ ++ +++ Escherichia coli - + - - +++ + +++ ++ Parásitos(2) - - - - - - - +++ Paratuberculosis + - + +++ Válvula ileocecal

G. mesentéricos +++ ++

Rotavirus - + - +++ + +++ +++ Salmonella + + - - ++ +++ +++ ++ (1) Frotis y tinción. (2) Coprología

Muestras Heces de varios animales, cogidas directamente del recto, en un bote. Sobre las heces se pueden hacer PCR (BVD/Border) e inmunocromatografia (Cryptosporidium, y Rotavirus y Coronavirus bovinos) y la coprología. Si las heces están cogidas del recto y vienen en un bote estéril se puede hacer la microbiología. Hisopos rectales. Limpia el recto con un guante y papel, introduce el hisopo y giralo sobre la pared. En las células descamadas estudiamos la presencia de virus por inmunocitoquímica. Sobre los restos de heces hacemos la microbiología. Intestino. Es importante la fracción del intestino porque los patógenos actúan en diferentes zonas. Si es posible envíalo entero. En bovino adulto selecciona la zona lesionada (hemorragias clostridiales) e incluye la válvula ileocecal en Paratuberculosis. El envío de intestino permite valorar las lesiones por histopatología. Sueros. No existe serología para los problemas digestivos (salvo en paratuberculosis).

Paneles diagnósticos Consulta los paneles de diagnóstico. MANDA SIEMPRE MUESTRAS DE VARIOS ANIMALES. AL TRABAJAR CON POOLES NO ES MAS CARO Y AUMENTAMOS LA SENSIBILIDAD. Autovacunas en Digestivo Ovino Caprino Bovino Salmonella sp, Escherichia coli, Cryptosporidium parvum

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Dendogramas. Comparación de Escherichia coli La tipificación de diferentes aislamientos de Escherichia coli, obtenidos de distintas muestras, nos permite identificar cuántas cepas hay dentro de una explotación y, nos permite comparar los aislamientos obtenidos en diferentes fechas, en diferentes momentos productivos (p.e. lactación, destete) o en diferentes localizaciones (p.e. naves o parques). La tipificación fenotípica nos ayuda a seleccionar las cepas en las que posteriormente podemos determinar los factores de virulencia, valorar la sensibilidad antibiótica y elaborar autovacunas incluyendo la o las cepas responsables y, así, comprender la epidemiología de muchos procesos causados por E. coli. Para la tipificación comparamos las características fenotípicas de las cepas y exigimos una homología superior al 98% (punto de corte vertical en la gráfica) para considerar dos cepas iguales. En la gráfica inferior vemos 3 cepas diferentes: La 3_6/2008 separada de la 2_6/2008 y 4_7/2007 que son la misma cepa y separada también de la tercera cepa a la que pertenecen los 4 aislados de arriba. Ejemplo de tipificación Se trata de una explotación con diarreas recurrentes en animales lactantes y asociadas a E. coli. Se quiere comprobar si el E. coli aislado en diferentes parideras es el mismo o no. En el dendograma se ve que uno de los aislamientos de la primera fecha (1_6/2008) es análogo a 3 aislamientos de la segunda fecha (7/2007) es la cepa 1. Otro aislamiento de la segunda fecha se aisló también en la primera fecha (cepa 2). De la cepa 3 sólo hay un aislamiento. Los resultados indican que probablemente existen dos cepas implicadas en el problema. Es este caso sería interesante estudiar la presencia de factores de patogenicidad y el antibiograma en ambas cepas. En su caso haríamos la autovacuna con estas cepas.

Cepa 1 Cepa 2 Cepa 3

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Diagnóstico en campo de Cryptosporidium Exopol Cryptosporidium IC detecta antígenos de Cryptosporidium spp. en heces Exopol Rotavirus IC detecta antígenos de rotavirus en heces de bovino. Las muestras se deben conservar en frío (sólo 1 ó 2 días) hasta el momento de utilizarlas. Previamente el dispositivo y las muestras de heces se deben acondicionar a la temperatura ambiente (15-30ºC). No abrir el envase hasta el momento de la prueba. Preparación de la muestra (ver dibujo): 1. Sacar el palito que viene en el vial (1) para recoger la muestra. 2. Con ayuda del palito se toma una muestra de las heces recogidas. Para ello se pasa el palito por la muestra recogiendo una pequeña cantidad de heces, si la muestra fuera líquida se tomarán 100 µl de la misma con una pipeta. Se introduce en el tampón cerrando el tubo. (3) Agitar para facilitar la dispersión de la muestra. 3. Agitar el tubo de dilución de la muestra para asegurar una buena dispersión. Cortar la punta del tapón (4). 4. Sacar el dispositivo de reacción Exopol Cryptosporidium IC/ Exopol Rotavirus IC de su envase para utilizarlo inmediatamente. 5. Para cada muestra o control se debe usar un tubo de dilución de la muestra y un dispositivo diferente. Tomar 4 gotas o 100 µL del líquido y depositarlas en la ventana circular marcada con una flecha o una S en el dispositivo, evitando añadir partículas sólidas con el líquido (5). Si se da el caso de que el test no funciona debido a la presencia de partículas sólidas en la ventana circular, retirarlas y añadir una gota de tampón hasta que se vea avanzar al líquido (zona de reacción y de control). 6. Leer el resultado a los 10 minutos (las líneas coloreadas aparecen).

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Autovacuna frente a Cryptosporidium Hacemos autovacunas mixtas de Cryptosporidium con Escherichia coli. Estas autovacunas las hemos desarrollado con el Proyecto CDTI (Centro para el Desarrollo Tecnológico Industrial) IDI-20090420. Criptosporidiasis. Diagnóstico y Elaboración de Autovacunas. Presupuesto del proyecto: 758.453,00 € Muestras Heces de animales con diarrea. Hisopos siempre por duplicado (en uno hacemos el diagnóstico, en el otro el cultivo). Multiplicamos los Cryptosporidium en células donde conseguimos que expresen todas sus fases, de modo que en las autovacunas tengamos antígenos de todas ellas y no solo de los ooquistes.

Cultivo in vitro de Cryptosporidium parvum en células cordón umbilical ovino fetal (COE). Tinción de Kinyoun 1000 x. Localización intracitoplasmática de diferentes estadios del parásito > 5 x campo

Ooquistes de Cryptosporidium parvum.

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Paratuberculosis Mycobacterium paratuberculosis crea problemas crónicos en las explotaciones. Animales individuales Cuando existe la sospecha en una animal individual envía suero e hisopos rectales o heces En el suero se buscan anticuerpos y en los hisopos el antígeno o el ADN de la Mycobacteria (PCR). Recuerda que los animales infectados pueden tardar años en seroconvertir, por eso ante una sospecha clínica recomendamos hacer la PCR y la serología. Si alguna de las pruebas da positivo conviene eliminar el animal. En Exopol comenzamos con la serología (más económico) si es positiva no seguimos, si es negativa confirmamos con el PCR buscando ADN de la Mycobacteria. Rebaños Sangra a todo el efectivo cada 6-9 meses hasta que todo el rebaño sea seronegativo. Consulta precios para más de 50 sueros. Propuestas de diagnóstico y precios aproximados Heces o hisopo u órganos PCR Real Time (podemos trabajar pooles de heces) 30€ Suero ELISA 4,7€

Cuando mandes muestra de un animal con sospecha clínica envía el suero y las heces (o hisopo). - Primero hacemos el ELISA en suero si es positivo el animal esta infectado y no hacemos el PCR y sólo cuesta 4,7€. - Si es seronegativo puede ser que no haya seroconvertido y entonces hacemos la PCR.

Mycobacterium paratuberculosis. Frotis a partir de una válvula ileocecal de bovino adulto. Se realizó una tinción de Ziehl Neelsen. Observación en microscopía de campo claro 1000X. Se observan los bacilos teñidos de color rojo intenso acido alcohol resistentes sobre fondo azul.

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Efectividad de los antiparasitarios En este protocolo (caso real) se valoró la efectividad de tres tratamientos en 3 grupos de 10 ovejas a las que se tomó muestras directamente del recto antes del tratamiento y 11 días después. Aunque el número de animales es poco relevante para extraer conclusiones científicas sí es válido para tomar decisiones dentro de una explotación. En la tabla se ve que el tratamiento 1 fue el más eficiente. Una propuesta que permite reducir el costo de la analítica podría ser hacer 3 pooles de 3 animales cada uno y compararlos antes y después del tratamiento. De este modo el número total de análisis sería de 6 frente a 20 en el caso estudiado.

Animales positivos antes y después de los 3 tratamientos diferentes.

Antes del tratamiento Después del tratamiento

Grupo 1 2 3 1 2 3

Protozoarios

Eimeria 4 2 4 - 2 -

Giardia - - - - - 1

Nematodos digestivos

Trichostrongilidos 9 6 9 1 2 3

Nematodirus 3 3 5 - 1 1

Trichuris - - - - - -

Strongyloides 3 4 6 - - 1

Nematodos pulmonares 3 1 - - 1 -

Cestodos

Moniezia (expanda/benedeni) - 1 - - - -

Trematodos

Fasciola hepatica - - - - - -

Dicrocoelium dendriticum - - - - - -

(Paramphistomum/ Cotilophorum) - - - - - -

.

Verme adulto del género Dictyocaulus en traquea de ovino

Hígado de oveja adulta con cisticercosis visceral ovina caracterizada por la presencia de trayectos parasitarios provocados por la migración de la fase larvaria de la Taenia hydatigena.

Ooquiste del género Eimeria esporulado. Heces de ternero.

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Bajas súbitas Técnica Muestras PCR Cultivo IPX Tinción Órganos Bacillus anthracis - - - +++ Hígado, Bazo, Pulmón BVD + - + - Pulmón, Intestino Clostridium novyi, septicum, sordellii, chauvoei

- + + ++ Pulmón, Hígado, Bazo, Músculo

Clostridium perfringens - + + + Intestino delgado Hemoparásitos(1) + - - + Sangre de vena marginal con edta y

con heparina Leptospira + - + + Riñón Pasteurella (haemolytica, multocida, trehalosi)

- + - - Pulmón, Hígado, Bazo

Salmonella + + - - Pulmón, Hígado, Bazo, Intestino (1) Bajas continuas, no súbitas.

Muestras En las bajas súbitas los animales no tienen tiempo a producir anticuerpos. Envía los órganos que veas con lesiones, normalmente hemorragias, dentro de una bolsa y refrigerado. SI SOSPECHAS CARBUNCO BACTERIDIANO (Bacillus anthracis) AVISA SIEMPRE AL LABORATORIO. Cuando sospeches Clostridium perfringens envía siempre el intestino. Para hemoparásitos siempre sangre marginal con Edta y Heparina. Pueden verse en Bazo o Hígado. Sueros. No existe serología para las bajas súbitas. Propuestas de diagnóstico y precios aproximados Órganos Microbiología*, Toxinotipo Clostridium perfringens 40€ Órganos Microbiología*, Toxinotipo Clostridium perfringens, Clostridium novyi, septicum, sordellii,

chauvoei, BVD, Leptospiras 120€

Autovacunas Ovino y Caprino Pasteurella multocida, Mannheimina haemolytica, Birbesteinia trehalosi, Leptospiras,

Hemoparásitos, Bovino Pasteurella multocida, Mannheimina haemolytica, Leptospiras, Hemoparásitos,

Riñones ovinos de color muy oscuro con sospecha de intoxicación por cobre. Se diagnosticó por IPX Leptospira interrogans. El diagnóstico diferencial incluiría hemoparásitos, intoxicación por cobre, enterotoxemia por Clostridium perfringens y carbunco sintomático y bacteridiano.

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Clostridiasis Los clostridios viven en el suelo descomponiendo la materia orgánica y pueblan el aparato digestivo de los vertebrados. Muestras Cuando se sospecha una clostridiasis en la baja súbita es importante tomar las muestras de animales recién muertos, y enviarlas refrigeradas ya que la autolisis hace que todos los órganos sean invadidos post-mortem por clostridios que habitualmente habitan en el intestino. Envía los órganos que veas con lesiones, normalmente congestión o hemorragias, dentro de una bolsa y refrigerado. Cuando sospeches Clostridium perfringens envía siempre el intestino delgado. C. perfringens se multiplica allí, aunque sus toxinas produzcan lesiones en otros órganos (eg. riñón pulposo). Sueros. No existe serología para las clostridiasis. Diagnóstico Cultivo. En el intestino siempre hay Clostridios, por eso la cuantificación es importante para valorarlos. Toxinotipado para C. perfringens. IPX. Inmunomarcaje de Clostridium novyi, septicum, sordelli y chauvoei. No existe serología frente a Clostridium. Toxinotipado Clostridium perfringens Los toxinotipos se basan en la producción de las toxinas mayores: alfa, beta, epsilon y iota.

Clasificación de toxinotipos de Cl. perfringens Toxinas

Toxinotipos alfa beta epsilon iota

Tipo A ++

Tipo B + ++ +

Tipo C + ++

Tipo D + ++

Tipo E + ++

Autovacunas No se pueden hacer autovacunas frente a Clostridium porque implican muchos antígenos diferentes. Además, las vacunas comerciales funcionan muy bien.

Abomasitis hemorrágica en un ternero de 2 días con muerte súbita. Se observan hemorragias masivas con intenso edema de los pliegues abomasales. Microscópicamente, se observaron intensas hemorragias y edema, especialmente en la submucosa, necrosis epitelial, focos de inflamación neutrofílica en la submucosa y presencia de bacterias bacilares y cocoides. En cultivo microbiológico se aisló Clostridium perfringens y E. coli, resultando negativo a BVD mediante inmunocitoquímica.

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Mamitis-Agalaxia PCR Cultivo IPX Serología Arcanobacterium pyogenes - + - - Corynebacterium pseudotuberculosis - + - - Levaduras - + - - Mycoplasma sp (bovis, agalactiae, capricolum, putrefaciens, mycoides, etc.)

M. agalactiae, M. mycoides

+ + M. agalactiae, M. bovis

Pasteurella, Mannheimia - + - - Prototheca zopfii - + - Pseudomonas - + - - Staphylococcus aureus - + - - Staphylococcus coagulasa negativo - + - - Streptococcus agalactiae - + - - Streptococcus equi - + - - Streptococcus dysgalactiae, uberis, etc. - + - - Visna-Maedi, CAE - + + En leche también se puede hacer PCR de Coxiella, Leptospiras, Clamidias, BVD, Salmonella, Listeria, Visna, etc. En leche se puede buscar anticuerpos frente a BVD, IBR, etc.

Muestras Leche de animales positivos al test de california o con síntomas clínicos. La leche se puede congelar. Si se envía antes de una semana es preferible mantenerla refrigerada. Normalmente se acompañan las muestras con una de tanque. En gangrenas o bajas se puede enviar una muestra de mama (trozo grande). Sueros. Sólo existe serología frente a Mycoplasma agalactiae y M. bovis. Propuestas de diagnóstico y precios aproximados Leche (10 muestras) Microbiología, PCR M. agalactiae, M. mycoides (cabras) 90€ Leche (10 muestras) Microbiología 60€ Leche tanque

Cultivo específico: S. aureus, S. agalactiae, E. coli, Klebsiella, Pseudomonas sp. y Prothoteca

50€

Autovacunas en Mamitis Ovino y Caprino Mycoplasma sp, Staphylococcus aureus y coagulasa negativo, Streptococcus sp., etc. Bovino Mycoplasma bovis, Staphylococcus aureus, Streptococcus sp., etc.

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Articular PCR Cultivo Serología Septicemias bacterianas (Erisipella, A. pyogenes Staphylococcus, Streptococcus etc.)

- + -

Chlamydia + - + Mycoplasma sp (bovis, agalactiae, capricolum, putrefaciens, mycoides, etc.)

M. agalactiae, M. mycoides

+ +

Visna CAE (Ovino y Caprino). +++ - +

Líquido articular

Muestras Líquido articular. Si no se puede extraer introduce solución salina estéril y sacala. Si la muestra coagula es necesario utilizar heparina como anticoagulante (introducelo en un tubo de sangre de tapón verde). Sueros. Sólo existe serología frente a Mycoplasma agalactiae y bovis.

Paneles diagnósticos Consulta los paneles de diagnóstico. ENVÍA SIEMPRE MUESTRAS DE VARIOS ANIMALES. AL TRABAJAR CON POOLES NO ES MAS CARO Y AUMENTAMOS LA SENSIBILIDAD. Autovacunas en Articular Ovino Caprino Bovino Mycoplasma sp, Staphylococcus aureus y coagulasa negativo, Streptococcus sp., etc.

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AUTOVACUNAS DE MYCOPLASMAS

PROTECCIÓN SIN SEROCONVERSIÓN

Nuestras autovacunas emplean los exopolisacáridos, no los cuerpos de los Mycoplasmas. Los animales están protegidos aunque no se detectan anticuerpos. Es similar a las vacunas vivas de Clamidia que protegen pero no seroconvierten, no se detectan en los ELISA

CON AUTOVACUNA: SERONEGATIVO Y PROTEGIDO

CON VACUNA COMERCIAL: SEROPOSITIVO INFECTADO: SEROPOSITIVO

CON NUESTRAS AUTOVACUNAS SE PUEDEN

VENDER ANIMALES SERONEGATIVOS PROTEGIDOS E INICIAR PROGRAMAS DE ERRADICACION

Y CONTROL DE LA AGALAXIA

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CONTROL Utiliza nuestras autovacunas que no seroconvierten. Si utilizas vacunas comerciales, deja cada año un g rupo de corderas sin vacunar. Identificalas y no las vacune s en toda su vida. Saca suero de los animales centinelas cada 6-9 mese s para comprobar que los Mycoplasmas no se han movido. El PCR Real time de la leche de tanque permite cuan tificar la cantidad de Mycoplasma agalactiae y/o M. mycoides p or mililitro de leche. Haz cultivos de Mycoplasmas de los animales sospech osos.

ERRADICACIÓN Sangra a todos los animales y elimina los seroposit ivos. Si optas por la erradicación no vacunes o utiliza nues tras autovacunas frente a Mycoplasmas. Aunque no tengas casos clínicos, ni animales seropo sitivos por alguna de las técnicas, nunca dejes de utilizar las autovacunas porque las medidas de bioseguridad pued en no ser suficientes.

COMPRA/VENTA DE ANIMALES Compra animales seronegativos. Nunca puedes saber s i un animal es seropositivo por vacunación o por infecci ón. Si vendes animales puedes ofertar el control si has empleado nuestras autovacunas o no has vacunado.

PCR CUANTITATIVO PARA MICOPLASMA

AGALACTIAE y MYCOIDES ·Dentro del programa de control de Agalaxia podemos cuantificar cuanto M. agalactiae y M. mycoides exis te en la explotación.

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Ocular En bovino Moraxella bovis y en Ovino y Caprino Moraxella ovis son los patógenos más importantes en problemas oculares. Muestras Suero. Sólo existe serología para Mycoplasma agalactiae y M. bovis. Hisopos conjuntivales. Diagnóstico IPX para Mycoplasmas y Clamidias. PCR para Mycoplasma agalactiae y Clamidias. Cultivo (pulmón, lavados traqueobronquiales).

OVINO CAPRINO BOVINO Problemas oculares PCR Cultivo IPX Hisopo Chlamydia +++ - +++ +++ Moraxella bovis, Moraxella ovis - +++ - +++ Mycoplasma bovis, agalactiae, conjuntivae, etc. M. agalactiae +++ +++ +++ IBR +++ - +++ +++

Paneles diagnósticos Consulta los paneles de diagnóstico. ENVÍA SIEMPRE MUESTRAS DE VARIOS ANIMALES. AL TRABAJAR CON POOLES NO ES MAS CARO Y AUMENTAMOS LA SENSIBILIDAD. Bovino. Propuestas de diagnóstico y precios aproximados Hisopo Microbiologia, Mycoplasma bovis (IPX), Clamidia (PCR) 45€ Autovacunas No existen vacunas comerciales frente a Moraxella. Ovino y Caprino Moraxella ovis Bovino Moraxella bovis

Imagen microscópica de una cepa de Moraxella bovis con morfología típica de coco Gram negativo. Observación en microscopio 1000X.

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Problemas podales Frecuencia Diagnóstico Muestra Cultivo Órganos Fusobacterium necrophorum +++ + Extremidades Dichelobacter nodosus +++ + Extremidades Espiroquetas + + Extremidades

El aislamiento de Fusobacterium, Dichelobacter y las Espiroquetas es especialmente difícil. Muestras Antes de tomar las muestras ponte en contacto con el laboratorio. Sueros. No existe serología. Autovacunas Pueden hacerse si se consigue aislar la bacteria/s responsable.

Frotis de lesión de pododermatitis bovina. Espiroqueta. Tinción de plata 100x.

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Problemas Nerviosos PCR Cultivo IPX Serología Listeria + + + - Aujeszky - - + - Toxoplasma + - + + BVD, Border + - + + EEB1, Scrapie(1) - - - - Bacterias (Streptococcus, Escherichia coli, Pasteurella, etc.) - + - - Cenurosis (2) - - - - Oestrus (2) - - - - Sarcocistosis (2) - - - - Visna-Maedi, CAE - + + (1) Sólo laboratorios oficiales. (2) Diagnóstico clínico

Muestras Envía siempre la cabeza entera del animal. El laboratorio realizará la extracción del encéfalo. En bovino no puedes enviar estas muestras. Sueros. No se puede hacer serología. En Aujeszky los animales mueren muy rápidamente y no seroconvierten. Propuestas de diagnóstico y precios aproximados Cabeza Microbiología, Listeria, Cenuros 40€

Autovacunas en Problemas Nerviosos Ovino Caprino y Bovino Listeria.

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Cutáneo y Linfoadenitis Diagnóstico Muestra PCR Cultivo Serologia Absceso Raspado Hisopo Arcanobacterium pyogenes - + - + - + Besnoitia - + + + Corynebacterium pseudotuberculosis - + - + - + Dermatofitos (Tiña) - + - - + - Ectima(1) - - - - - - Hypoderma Boris(1) - - - - - - Sarna - - - - + - Staphylococcus aureus anaerobius - + - + - + (1) Diagnóstico clínico.

Muestras Hisopos abscesos. Abre el absceso, vacialo y raspa la pared con el hisopo. Las bacterias se concentran en la zona frontera. Para Besnoitia envianos una biopsia cutánea. Cuando sospeches sarna o tiña envianos un raspado profundo (hasta que sangre un poco). Sueros. No se puede hacer serología. Autovacunas Ovino y Caprino Staphylococcus aureus anaerobius, Corynebacterium pseudotuberculosis, Arcanobacterium

pyogenes, etc. Bovino Besnoitia

Quistes de Besnoitia en la esclerótica y córnea del ojo de un semental bovino. Besnoitia cultivo. Tinción de PASS 63x. Cepa en cultivo para autovacuna. Quistes de Besnoitia observados mediante microscopía de campo claro 100x en un raspado de piel de un semental bovino.

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Hemoparásitos Anaplasma marginale, Babesia bovis y bigeminas y Theileria parva y annulata son los principales hemoparásitos de los bovinos. Estamos diagnosticando Hemoparásitos con casos clínicos (anemía, ictericia, delgadez, mal pelo, etc.), y en casos subclínicos con ligeras perdidas de producción o de fertilidad. Muestras Para su aislamiento necesitamos sangre con heparina (verde) y para el diagnóstico sangre con edta (morado). Incluye orina para el diferencial con Leptospira. Enviarlo siempre refrigerado. Sueros. No se puede hacer serología. Diagnóstico Cultivo. Siempre sangre con Heparina, el Edta inactiva los hemoparásitos. PCR (sólo en bovino). Para Babesia bigemina, Babesia bovis, Anaplasma marginale, Theileria annulata y Theileria parva Propuestas de diagnóstico y precios aproximados Sangre Ovino y Caprino Tinción de Hemoparásitos 10€ Sangre bovino PCR Real Time Babesia bigemina, Babesia bovis, Anaplasma marginale,

Theileria annulata y Theileria parva (podemos trabajar pooles de sangres) 90€

Autovacunas en Hemoparásitos Ovino Caprino Bovino Anaplasma, Babesia y Theileria.

Multiplicación de Theileria spp obtenidas de un bovino naturalmente infectado en la línea de cultivo celular COE (cordón umbilical ovino). Tinción fluorescente del DNA con Hoeschst 400x

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SI LA AUTOVACUNA

NO TE FUNCIONA

TE DEVOLVEMOS EL DINERO*

TÚ DECIDES // SIN PREGUNTAS

No siempre podemos estar seguros de que nuestras autovacunas van a ayudarte con tu problema, pero haremos todo lo posible, y nuestro compromiso es devolverte el dinero si no lo conseguimos. ¿Necesit as algo más para confiar en nosotros? * Se aplica a cualquier autovacuna. Tienes 9 meses para solicitarlo desde la fecha de envío. No se aplica a l diagnóstico.

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Fabricación de Autovacunas Paso previo: Envío de Muestras Antes de hacer una autovacuna hay que hacer el aislamiento del patógeno. Después, podemos emplear la/s bacteria/s durante años. Conviene repetir los análisis cuando veamos que la autovacuna no funciona tan bien como se esperaba. Esta prohibido hacer autovacunas de virus. Nota: Los tiempos y los protocolos indicados abajo son un ejemplo porque los tiempos y el modo de multiplicación de las diferentes patógenos es diferente. Día 1 Descongelamos la bacteria congelada y la sembramos en medios de crecimiento sólidos. Muchas veces las bacterias acaban de ser aisladas porque las muestras se han enviado con el propósito de elaborar una autovacuna y evitamos el tiempo empleado en descongelar las cepas. La gran mayoría de las bacterias congeladas crecen en 24-48 horas. El mismo día preparamos y esterilizamos un pequeño volumen de crecimiento, el cultivo iniciador, que servirá para sembrar el cultivo final y un volumen de medio de crecimiento suficiente para fabricar las dosis solicitadas. Día 2 Se inocula una suspensión del cultivo original en sólido al cultivo iniciador. Para ello una masa de bacterias del cultivo inicial en agar sangre se siembra en el medio líquido. El medio se incubará en las condiciones y medios específicos para cada patógeno. Algunas bacterias crecen sólo en anaerobiosis (ausencia de oxígeno) y tenemos que eliminar el oxígeno del ambiente donde multiplicamos la bacteria y del medio líquido en el que crecerá.

Inoculación del caldo de cultivo con la bacteria recogida de la placa de agar sangre.

Las botellas se inoculadas se incuban normalmente a 37-42ºC durante 24-48 horas.

Para iniciar la autovacuna se utiliza el crecimiento de una bacteria en agar (placa redonda) y un caldo de cultivo especialmente diseñado para su crecimiento

Vial de congelación. Las cepas se guardan congeladas e identificadas en viales de congelación durante al menos 5 años.

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Día 4 El cultivo iniciador se utiliza para iniciar el cultivo final en el volumen total necesario. En las primeras horas después de la siembra las bacterias se multiplican de un modo exponencial cada pocas horas, justo hasta que consumen la mayoría de los nutrientes del medio. En la gráfica se ve como el número de bacterias aumenta muy rápidamente (rosa). Cuando la mayoría de los nutrientes se han agotado la velocidad de multiplicación es mucho menor, pero es ahora cuando en muchas especies bacterianas aumenta la producción de los exopolisacáridos que empleamos en nuestras autovacunas. Es importante determinar el momento en el que se inactiva el cultivo porque tenemos que maximizar el crecimiento de las bacterias y al mismo tiempo impedir que las bacterias que comienzan a degradarse contaminen el medio con ADN y proteínas intracelulares.

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Gráfica: Crecimiento de bacterias (rosa) y producción de exopolisacáridos (amarillo).

Botellas de crecimiento. La de la izquierda está sin inocular. En las otras dos (de diferentes medios) hay turbidez y crecimiento bacteriano.

Las botellas se inoculadas se incuban normalmente a 37-42ºC durante 24-48 horas.

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Día 6 Inactivamos las bacterias añadiendo formol al medio de crecimiento y dejamos que el formol actúe durante 18-24 horas antes de comenzar con la purificación de los antígenos. Antes de inactivar el cultivo nos aseguramos de la pureza del cultivo. Después de la inactivación hacemos el recuento total de las bacterias. Esto nos permite ajustar las concentraciones bacterianas de modo que en las autovacunas utilizamos cantidades análogas y reproducibles de antígeno. Este mismo día comienzan los protocolos de esterilidad. En nuestros protocolos separamos parcialmente los exopolisacáridos de los cuerpos bacterianos. Por un lado concentramos los cuerpos bacterianos mediante filtración tangencial y lavamos las células descartando proteínas, restos de ADN, restos metabólicos, etc. Por otro lado procesamos los exopolisacáridos bacterianos siguiendo los protocolos ya descritos ( Vet Microbiol 1994 Apr;39, 3-4:195-204). Liposomas Los liposomas de la autovacuna se fabrican independientemente. Los liposomas son pequeñas vesículas de lípidos que después de la liofilización encerraran en su interior el exopolisacárido purificado de las bacterias. Antes de la liofilización mezclamos los liposomas con una suspensión de antígeno, que liofilizamos. En la liofilización congelamos la muestra y extraemos el agua, de modo que los liposomas se rompen. Al resuspender la autovacuna, los liposomas se cierran de nuevo incorporando el antígeno en su interior.

El proceso de elaboración de los liposomas se ejemplifica en la ilustración. Las vesículas de lípido se rompen en la liofilización y al reconstituirlas con agua atrapan al antígeno (exopolisacárido).

Recuento de bacterias en citómetro.

Observación en microscopía de campo claro del cultivo de Staphylococcus. Permite verificar la ausencia de otras bacterias y la pureza.

Liofilizador trabajando. En su interior se observan viales con liposomas liofilizándose

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Día 10 Los viales se retiran del liofilizador y se confirma que están bien. Se hacen los ensayos para confirmar la ausencia de contaminación.

Diferencias entre Autovacunas y Vacunas

Autovacuna Hay que fabricarla en cada ocasión. Utiliza las bacterias aisladas de la explotación. No tienen período de retirada en leche o carne. La autovacuna se modifica (evoluciona) con los problemas de la explotación, no es estática. Puede elaborarse para más de una enfermedad: Mamitis + Agalaxia. Para hacer la autovacuna necesitas hacer previamente un diagnóstico. Vacuna estándar Está disponible en cualquier momento. Normalmente es más barata. Algunas son muy efectivas y la autovacuna no las supera. Por ejemplo en Clostridiasis. No tienen periodo de retirada en leche o carne.

La autovacuna se envía liofilizada, lo que facilita su conservación.

El producto final se ensaya en diferentes medios para confirmar la total ausencia de contaminación.

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Esquema del proceso de elaboración de una autovacuna

Descongelación de cepas

Preparación del medio de

crecimiento en

volúmenes adecuados

Multiplicación bacteriana, inicial

Inactivación Control de

calidad

Separación de los

cuerpos bacterianos

Separación de los exopolisacáridos

capsulares

Preparación estéril

de liposomas

Mezcla de los liposomas con los exopolisacáridos

capsulares

Liofilización de la mezcla

Recuento de bacterias Citometría de Flujo.

Estimación de la carga antigénica. Ajuste

al número de dosis.

Recepción del pedido (telefono,

web)

Receta

Veterinaria

Multiplicación bacteriana final

Día 1Día 2

Día 3Día 4

Día 5Día 6

Día 7

Día 8

Día 9

Producto acabado

Día 10

Fin Control Calidad

Día 11.

Día 15

Envasado bacterina