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Tema 1

ADN recombinante

Manipulacin in vitro de cidos nucleicos (ADN) Enzimas que actan sobre cidos nucleicos: protenas purificadas extradas de bacterias. De manera

natural forman parte del ciclo celular normal. - ADN polimerasas: sintetizan ADN - Nucleasas: cortan o degradan - Enzimas de modificacin de extremos: para conseguir residuos concretos - Ligasas: unen fragmentos de ADN Nucleasas Enzimas que degradan ADN y/ o ARN rompiendo los enlaces fosfodister entre nucletidos. Se

clasifican segn su actividad: - Exonucleasas: eliminan nucletidos de los extremos hacia el interior de la molcula. No ataca a

molculas circulares. - Endonucleasas: cortan en medio de la molcula o cadena

Pueden ser especficas de ADN o ARN, de cadena simple (ss) o doble (ds)

Ejemplos: Exonucleasa del fago : ADN ds 5 3 Exonucleasa III: ADN ds 3 5 Nucleasa Bal31: exonucleasa 3 5 especfica de ADN ds. Tambin es endonucleasa sobre

ARN ss Nucleasa S1: endonucleasa de ss, tanto ADN como ARN. Tambin corta la segunda cadena

de molcula ds cuando hay una muesca DNasa I: especfica de ADN. Corta preferentemente en pirimidinas (C y T). Uso en

produccin de muescas y mapeo de unin de protenas. Endonucleasa RNasa A: especfica de ARN ss. Elimina ARN presente en preparaciones de ADN y la

cadena de ARN en un hbrido ADN: ARN RNasa H: actividades endonucleasa, exo 5 3 y exo 3 5 sobre ARN presente en

hbridos hbrido ADN:ARN

Endonucleasas de restriccin o restrictivasCatalizan el corte de molculas de ADNds en sitios especficos. Los fragmentos obtenidos son

especficos y se denominan fragmentos de restriccin. Reconocen una secuencia corta bicatenaria: sitio o diana de restriccin

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Forman parte de los sistemas de restriccin-modificacin (RM) bacterianos, no ataca al ADN bacteriano porque est metilado. Defensa /proteccin frente a la entrada de ADN extrao.

Sistemas RMDesempean, en la clula bacteriana, una funcin de proteccin gentica, dirigida a impedir el

establecimiento en su interior de material gentico exgeno que pudiera codificar productos capaces de alterar la vida celular.

El sistema incorpora dos actividades enzimticas ambas con una misma especificidad de secuencia. - Metilasa: metil-transferasa (M). la metilacin protege al ADN en sitios especficos - Endonucleasa (R): cataliza la rotura de las dos hebras de ADN si no se encuentra metilada al

menos una de ellas. El sitio o diana de reconocimiento es una corta secuencia de pares de bases, constituido por las dos

hebras Hay tres tipos de sistemas RM: Sistemas RM tipo I: tienen tres subunidades (metilasa, restrictasa y especificidad). Reconocen y

metilan una secuencia, pero el corte se produce fuera de la diana de reconocimiento y en secuencia no especfica

Sistemas RM tipo III: tienen dos subunidades: metilacin /especificidad y restriccin. El corte se produce fuera de la diana de reconocimiento.

Sistemas RM tipo II: Actividad restrictasa y metilasa en protenas distintas. Reconocen y actan sobre la misma secuencia (diana de reconocimiento). Rotura en sitios especficos y definidos.

Tipos I y III Tipo II

Endonucleasas de restriccin tipo II

Son de una gran especificidad, actan sobre una diana concreta Nomenclatura: EcoRI

- 3 primeras letras indican gnero y especie de donde se aisl - 4 letra indica cepa - Nmero romano indica orden de aislamiento

Dianas - Secuencia ADNds: cataliza la hidrlisis simultnea de las dos hebras de un ADN bicatenario y no

acta sobre estructuras monohebra. - Entre 4-8 bp (pueden ser ms). Constituida por una secuencia especfica de algunos pares de bases. - Generalmente palindrmicas

Punto de rotura simtrico respecto del eje de la diana, uno en cada hebra. Pueden producir extremos:

- Romos: rotura en enlaces enfrentados - Cohesivos (5 protuberantes o 3 protuberantes): rotura en enlaces no enfrentados

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Romos Cohesivos

5 protuberantes 3 protuberantes

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Isosquizmeros Reconocen y cortan la misma secuencia, en algunos casos de manera distinta, comparten el sitio de

restriccin.

Ambas enzimas reconocen y cortan la misma secuencia, en algunos casos de manera distinta. SmaI rompe por puntos enfrentados, por el enlace central de la diana, y XmaI rompe entre la primera y la segunda C.

Endonucleasas de especificidad relajada. En alguna posicin de la diana no requiere base especifica, sino que acepta ms de una. La relajacin de la especificidad aumenta la probabilidad de aparicin de la diana, por tanto el tamao medio de los fragmentos obtenidos sern ms pequeos.

Anlisis y separacin de fragmentos de ADN mediante electroforesisMigracin de molculas de ADN a travs de un soporte reticulado (matriz) dentro de un tampn por

accin de un campo elctrico. El comportamiento de una molcula viene definido por su movilidad electrofortica, que depende de la carga, el tamao y la forma de la misma.

Matriz

Soporte reticulado a travs del cual se desplazan las molculas que se analizan. El entramado tridimensional forma poros cuyas dimensiones deben permitir el paso de las molculas. Un entramado denso produce poros pequeos y las molculas de tamao similar o mayor encuentran gran resistencia y se retrasan .

Agarosa: polisacrido de estructura lineal, derivado de algas. Insoluble a temperatura ambiente, pero soluble a 100 C. Cuando se enfra gelifica. Por sus poros pueden desplazarse molculas con dimensiones medias (hasta 40-50 kb)

Poliacrilamida: polmero formado por acrilamida y N, N-metilbisacrilamida. La concentracin de ambos reactivos define el grado de reticulacin del gel. Son estables qumica y mecnicamente en un

Enzimas que producen extremos compatibles

CCCGGGGGGCCC

CCCGGG

GGGCCC SmaI

CGGGCC

CCGGGC XmaI

CYCGRG AvaI

CCSGG CauI

WGGCCW HaeI

GCNNNNGC BspCI

Y: pirimidina (C/T)

R: purina (A/G)

S: G/C

W: A/T

N: cualquiera

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amplio rango de pH y temperatura. Polimeriza mediante agentes qumicos. Presenta mayor poder de separacin al permitir una mayor densidad de reticulacin, una red ms tupida y unos poros menores. Se suele aplicar al anlisis de fragmentos pequeos (5-500 pb), por ejemplo el aislamiento y purificacin de pequeos fragmentos de ADN amplificados y de secuenciacin. Permite separar fragmentos de cidos nucleicos que se diferencian en 1 nucletido.

Tampn

Ofrece una conductividad apropiada en el medio, mediante la aportacin de una concentracin moderada de iones, y para mantener un valor constante de pH a lo largo de todo el proceso asegurando una carga constante en las molculas que se estn separando. Mantienen la temperatura que aumenta por el paso de la corriente y de la resistencia presentada por el medio y el soporte, y puede afectar al soporte (matriz) y a la estructura de las molculas.

Varios tipos que puede afectar a la movilidad de las molculas.

ADN es cido, por tanto tiene carga negativa y migrar hacia el polo positivo. Se colocarn las muestras siempre en el polo negativo.

Preparacin de muestra

Muestra disuelta en tampn de carga: compuesto de alta densidad (glicerol o ficoll), para que la muestra no flote en el gel, ms uno o dos colorantes, para separar tamaos de molculas. De color oscuro sern las molculas pequeas y de color claro las grandes. El colorante permite seguir la marcha del proceso.

Marcadores de tamao: patrn conocido de tamaos, se obtienen comercialmente. Mezcla de fragmentos de tamao conocido.

Visualizacin del gel: Tincin con bromuro de etidio que se intercala entre las bases, emite fluorescencia (naranja intensa) con luz ultravioleta. Cuando las molculas de cido nucleico estn saturadas de etidio la fluorescencia emitida es proporcional a la cantidad de cido nucleico, lo que permite disponer de un procedimiento alternativo para su cuantificacin.

Factores que influyen en la separacin

Tamao fragmentos: a mayor tamao, menor distancia recorrida - Agarosa: 50 bp- 40 kb - Poliacrilamida: 5-500 bp Concentracin de agarosa/ poliacrilamida: grado de reticulacin del gel Conformacin/ topologa de las molculas: importante en

plsmidos (molculas circulares) - Forma circular: migran ms rpido sufren superenrollamiento

facilitando su movimiento a travs de la matriz. A mayor superenrollamiento mayor ser su movilidad.

- Forma circular abierta: migran ms lento, no presentan superenrollamiento.

- Forma lineal: intermedia, serpentean a travs de los poros y avanzan segn su tamao.

FC

FLFCA

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ADN polimerasasEnzimas que sintetizan ADN ADN polimerasa dependiente de molde: requieren una hebra molde que dirija la seleccin del dNTP

que ha de ser incorporado. Necesitan un cebador o primer de oligonucletidos.

Actividades de las polimerasas

- Sntesis 5 3

Exonucleasa 3 _ 5 : corrige errores

Exonucleasa 5_ 3: degrada por delante si se encuentra una cadena y sintetiza por detrs. ADN polimerasas utilizadas en investigacin

ADN polimerasa I E. Coli. Temperatura ptima 37C

5 3 sntesis

3 5 exonucleasa

5 3 exonucleasa

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Posee las 3 actividades. Rellena huecos en un ADN ds que los contenga, es la base de participacin en sistemas de reparacin in vivo. Degrada los extremos 5 fosforilados de un ADN ds o un hbrido ADN: ARN.

Aplicaciones: - Uso en marcaje de ADN: se hace una muesca en una hebra y se ceba con nucletidos marcados

radiactivamente. Klenow polimerasa: fragmento grande de ADN polimerasa I de E coli

Carece de actividad 5 3 exonucleasa Uso en marcaje de ADN y relleno de extremos. Aplicaciones: - Relleno de extremos de ADN ds con terminales 3 retrados formando terminales romos. - Marcaje de extremos 5 protuberantes, solamente

Taq polimerasa ADN polimerasa de Thermus aquaticus Termoestable, temperatura ptima 72 C. Soporta hasta 95 C Presenta: - Actividad ADN polimerasa 5 _ 3 sobre un ADN ss cebado. - Actividad exonucleasa 5 _ 3 dependiente de la actividad polimerizadora Aplicaciones: - Secuenciacin de ADN - Amplificacin de regiones especficas de ADN mediante PCR

Retrotranscriptasa Transcriptasa reversa, dependiente de ARN. Utiliza ARN como molde. Sntesis de ADNc (copiado) Aplicaciones de las ADN polimerasas: PCR

Polymerase Chain Reaction o Reaccin en cadena de la polimerasa. Amplificacin directa y dirigida de un fragmento de ADN ARN.

Tenemos que conocer la secuencia o parte de ella del fragmento a amplificar, estas regiones son utilizadas como cebadores

Objetivos: - Amplificar cantidad ADN disponible - Detectar secuencia nica - Obtener molculas de ADN bicatenario para obtener una secuencia concreta, se precisan dos

cebadores

La reaccin de amplificacin consiste en la repeticin de un ciclo integrado por tres etapas: - Desnaturalizacin del ADN molde mediante la elevacin de la temperatura para conseguir la

unin de los cebadores. - Hibridacin de cebadores: reduciendo la temperatura se induce su unin a las zonas

complementarias del ADN desnaturalizado. Tras la unin de cada cebador a su secuencia complementaria, se forma una estructura monocatenaria cebada, sustrato de las polimerasas.

- Elongacin: llevando la disolucin a una temperatura adecuada y en presencia de un gran exceso molar de los cuatro dNTPs, la polimerasa elonga el sustrato cebado.

5 5

3

3

53

5 3

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Para realizar la PCR se necesita: Molde de ADN que se quiere amplificar Cebadores: oligonucletido monocatenario de secuencia idntica a una corta regin de

cada una de las dos hebras, localizadas en los extremos de la regin que se quiere amplificar.

Polimerasa Tampn con Mg2+, imprescindibles para el funcionamiento de la polimerasa

Ciclo 1

Se aumenta la temperatura Los cebadores reconocen los extremos Polimerizacin, temperatura a 94C. temperatura ptima 50-60C. ptima 72C, la de la enzima. Depende del porcentaje de G/ C. 1000 pb /m

Ciclo 2 Ciclo 3

Aumenta exponencialmente

20 ciclos 106 copias

Se consigue el fragmento exacto que se quiere

amplificar

Paso 1: Desnaturalizacin Paso 2: Hibridacin Paso 3: Polimerizacin

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El producto mayoritario es un fragmento de ADNds cuyos extremos corresponden a los terminales 5 de los cebadores y cuya longitud est definida por la posicin de stos en la secuencia del ADN original. Durante la reaccin se producen otras molculas ms largas cuya concentracin en la mezcla no aumenta o lo hace de forma lineal. nicamente la concentracin del segmento limitado por ambos cebadores crece de manera exponencial, con lo que, tras varios ciclos de amplificacin, este producto es mayoritario.

La temperatura es el parmetro esencial a controlar, que ha de ser muy alta en la primera etapa para asegurar la desnaturalizacin, se reduce en la segunda para permitir la unin a los cebadores y la ms adecuada para el buen funcionamiento de la polimerasa sin que se afecte la integridad del molde cebado en la ltima etapa.

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Caractersticas de las polimerasas a emplear en PCR: - Termoestable - Fidelidad:

Tasa de error Taq polimerasa 10-4 Tasa de error Pfu polimerasa 10-6

Limitaciones de la PCR: - Tenemos que conocer la secuencia a amplificar o las regiones flanqueantes - Lmite de tamao del fragmento a amplificar: unas 5-10 kb. Funciona mejor con 5 kb

Diseo de cebadores

5-GATTTTGCAATCGGCGATCGCGTCCGCTTGGCCGCTCAGCCACCCTACCTAAAAAGTGCTGACCCGTTGC-3

3-CTAAAACGTTAGCCGCTAGCGCAGGCGAACCGGCGAGTCGGTGGGATGGATTTTTCACGACTGGGCAACG-5

La longitud de los oligonucletidos cebadores suele ser del rango de 15-30 . cuanto mayor sea su tamao, mayor es la probabilidad de que se asocien a secuencias no perfectamente complementarias y conduzcan a la amplificacin de productos no especficos. Cuanto ms corto sea el cabador, ms perfecta tiene que ser su complementaridad con el molde y ms especfica ser la amplificacin, aunque su unin al molde es ms dbil y con menor rendimiento.

La composicin de bases de los cebadores es importante por el efecto que tiene sobre la estabilidad del hbrido; lo ideal es que tengan un 50% de GC. Si el porcentaje es inferior interesa una mayor longitud, para evitar una baja temperatura de fusin.

Deben evitarse secuencias con bases repetidas (ms de 3-4 seguidas) para dificultar uniones no correctas.

Hay que reducir la posibilidad de formacin de estructuras bicatenarias no productivas : - Intramoleculares: cebadores con estructura secundaria - Intermoleculares: cebadores parcialmente complementarios entre s.

Desnaturalizamos

5-GATTTTGCAATCGGCGATCGCGTCCGCTTGGCCGCTCAGCCACCCTACCTAAAAAGTGCTGACCCGTTGC-3 3-CACGACTGGGCAACG-5

3-CTAAAACGTTAGCCGCTAGCGCAGGCGAACCGGCGAGTCGGTGGGATGGATTTTTCACGACTGGGCAACG-5 5-GATTTTGCAATCGGC-3

Polimerizacin 5-GATTTTGCAATCGGCGATCGCGTCCGCTTGGCCGCTCAGCCACCCTACCTAAAAAGTGCTGACCCGTTGC-3 3-CTAAAACGTTAGCCGCTAGCGCAGGCGAACCGGCGAGTCGGTGGGATGGATTTTTCACGACTGGGCAACG-5

5-GATTTTGCAATCGGCGATCGCGTCCGCTTGGCCGCTCAGCCACCCTACCTAAAAAGTGCTGACCCGTTGC-3 3-CTAAAACGTTAGCCGCTAGCGCAGGCGAACCGGCGAGTCGGTGGGATGGATTTTTCACGACTGGGCAACG-5

Los cebadores han de estar presentes en la reaccin a una concentracin adecuada. Para la amplificacin de secuencias especficas se utilizan cebadores especficos derivados de regiones

conocidas que flanquean a la secuencia blanco. Cuando la secuencia es desconocida se utilizan cebadores arbitrarios. Los cebadores solapantes se emplean para reducir la presencia de productos de amplificacin inespecficos; el resultado de una primera reaccin es utilizado como sustrato de una segunda con cebadores ms cortos de secuencia idntica e incluida en la de los primeros.

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Aplicaciones de la PCR

Obtencin de grandes cantidades de un fragmento determinado de ADN Deteccin de una secuencia concreta de ADN en diferentes muestras y /o en muestras

contaminadas Diagnstico de enfermedades: Deteccin de mutaciones, deleciones, inserciones y genes

concretos. Las deleciones o inserciones pueden deducirse de variaciones de tamao de los productos amplificados.

Deteccin de patgenos: - Anlisis de muestras microbiolgicas basado en la deteccin de secuencias especficas de

microorganismos utilizando cebadores especficos. - Deteccin de infecciones basado en la amplificacin selectiva de ciertas secuencias. Produccin de sondas Reconstruccin y amplificacin de ADN a partir de muestras degradadas, para realizar estudios

evolutivos. Los fragmentos degradados sirven como cebadores para la PCR.

Amplificacin de secuencias largas a partir de fragmentos de degradacin cortos. La PCR es capaz de regenerar piezas del

ADN original de tamao mucho mayor. Teniendo en cuenta que los fragmentos de la muestra, resultado de la degradacin del ADN original, solapan unos con otros, las etapas de desnaturalizacin e hibridacin inducir la formacin de hbridos con extremos 3 retrados que podran ser elongados por la polimerasa para generar fragmentos de mayor longitud. Este mecanismo se repite varios ciclos y el resultado es la recuperacin de largas molculas de bicatenarias a partir de pequeos fragmentos iniciales.

As se han conseguido preparar grandes trozos de ADN de especies extinguidas, a partir de muestras de fsiles, permiten un estudio de la evolucin molecular.

Construccin de un ADN sinttico con cebadores solapantes

ADN sinttico que incorpora las secuencias de los 6 cebadores iniciales

Se puede construir un gen sinttico mediante ciclos sucesivos de PCR a partir de oligonucletidos sintticos y solapantes, que se van aadiendo ordenadamente a la reaccin, actan como cebadores.

Fragmento de ADN

reconstruido

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Introduccin de modificaciones en las secuencias de ADN En los extremos (promotores, dianas de corte,)

Cambios en los extremos de la molcula Se introducen cebadores que incluyan en su extremo

5 la secuencia de una diana de restriccin ausente en la regin que se quiere amplificar. Aunque esta regin no hibride con el molde (como una pequea cola), la presencia de bases no apareadas en el extremo 5 no afecta a la capacidad de olignucletido para cebar la polimerizacin, en los siguientes ciclos de PCR la secuencia extra resulta incorporada y se crean molculas de doble hebra que contienen las nuevas secuencias dianas en sus extremos.

Para expresar el gen en otro organismo se colocan promotores en el gen.

- Mutaciones en puntos interiores (mutagnesis dirigida).

Se trabaja con 4 cebadores, 2 terminales y 2 internos. Los dos cebadores internos son dos oligonucletidos sintticos, complementarios, que contienen en su interior la alteracin (sustitucin, delecin o insercin) que se desea incorporar. Su hibridacin sobre la hebra molde no es perfecta, pero la reaccin funciona.

En la primera amplificacin se utilizan uno de los cebadores extremos y el interior de la hebra complementaria, generndose un fragmento que nace en un terminal de la regin y finaliza en la zona que incluye mutacin. En una segunda, la PCR se lleva a cabo sobre el molde cebado con el otro oligonucletido interno (portador de la mutacin) y el procedente del 2 extremo del DNA blanco; se consigue un 2 fragmento desde la zona central mutada hasta el segundo extremo de la secuencia blanco. Se purifican los fragmentos amplificados y se eliminan los cebadores y se mezclan ambos productos que se unen por la secuencia central mutada, presentan 3 retrado que puede ser elongado por la polimerasa hasta completar el molde. Finalmente, una tercera reaccin de PCR con los dos cebadores terminales conduce a la amplificacin de la secuencia portadora de la alteracin deseada,

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- Modificacin de la secuencia: Deleciones

Amplificacin de de una parte de una secuencia del ADN mediante la utilizacin de cebadores de la regin interna, no terminales. Y de una manera ms amplia, en un conjunto de reacciones de PCR cebadas por una serie de oligonucletidos progresivamente desplazados (solapantes), se puede generar un conjunto de mutantes de delecin perfectamente definidos.

Un cebador en una cadena y varios solapantes en la otra, tres cebadores que hibridan en tres regiones diferentes

Obtencin ADN monocatenario - PCR asimtrica

Permite la produccin de grandes cantidades de una determinada secuencia monocatenaria, para secuenciar.

Se utilizan 2 cebadores a distinta concentracin (difieren en un factor de 100) la reaccin produce inicialmente fragmentos de ADNds, pero llega un momento en que el cebador limitante se agota; el segundo contina cebando la sntesis de una de las hebras. El resultado es la amplificacin de una secuencia de ADN ss en cantidad suficiente para el anlisis de su secuencia. El producto no sirve de molde y no se consigue tanto.

Amplificacin secuencias desconocidas - PCR inversa En los siguientes ciclos se amplifica

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Se realiza una digestin del ADN origen con una enzima de restriccin que no presente dianas en la regin conocida, ligado (ligasa) intramolecular de los fragmentos producidos para que formen crculos. A partir de ah se realiza PCR utilizando dos cebadores diseados a partir de la regin de secuencia conocida y apuntando hacia las regiones adyacentes. La polimerasa acta sobre la molcula circular que contiene la regin conocida y amplificar un fragmento lineal con origen y final en dicha zona y que incluye las secuencias que la flanqueaban en el ADN original. La unin entre estas ltimas queda marcada por la presencia de un sitio de restriccin para la enzima usada en la digestin.

Los dos fragmentos obtenidos se amplifican con PCR.

RT-PCR: amplificacin de secuencias de ARN por retrotranscripcin y PCR.

Deteccin de molculas de ARN, clonaje de ADNc de un mensajero, construccin de bibliotecas de ADNc, obtencin de material para anlisis de secuencia.

Amplificamos usando como molde ARNm

Mtodo 1: Uso de oligo (dT), se une a la cola poli (A) de la mayora de los mensajeros eucariotas, se consigue la amplificacin de la secuencia completa de los ARNm que lleven la cola poli (A). Se construye una cadena de ADN. Hbrido ARN : ADN

Amplificacin de todos los ARNm de una mezcla Se aade ribonucleasa H que degrada ARN, dejndola actuar un

tiempo sin que destruya todo el ARN para as tener cebadores con los que la polimerasa pueda sintetizar la cadena complementaria.

Mtodo 2: Uso de oligo especfico, permite la amplificacin de un ARNm especfico entre una mezcla. No hbrida en cola poli (A), sino ms adelante, no hace falta RT-PCR. Se construye un cebador del ARNm la polimerasa elonga cadena de ADN, se consigue un hbrido ARN-ADN que se desnaturaliza y en el 2 ciclo se tienen los dos cebadores especficos para las dos cadenas. No se degrada el ARN, no molesta, se amplifica el ADN bicatenario. La cantidad de producto por PCR es proporcional a la cantidad de ARNm que hay.

Aplicaciones de las ADN polimerasas: Secuenciacin

Determinacin de la secuencia de nucletidos de un fragmento de ADN Partimos de ADN1c (unicatenario). Dos mtodos. Obtencin de coleccin de fragmentos que

comparten un mismo extremo 5, pero difieren en su extremo 3

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Mtodo de Maxam y Gilbert (rotura qumica del ADN)

Marcaje de la cadena a secuenciar. Se tienen muchas copias de las cadenas que se quieren secuenciar, que se marcan radiactivamente en extremo 5. Se preparan cantidades en alcuotas y se someten a cuatro tratamientos qumicos:

En cada muestra se elimina una determinada base, y luego se produce hidrlisis, la molcula se rompe por el lugar donde se produce la modificacin. El marcaje radiactivo se observa en 5. Se realiza electroforesis en gel de poliacrilamida, en calles distintas. Aparece la primera banda, fragmento ms grande en G+A pero no en G por tanto el nucletido es A. Se sigue secuenciando.

Mtodo de Sanger

(amplificacin

enzimtica del ADN)

G

G + A

C + T

C

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Sntesis enzimtica del ADN Secuenciamos la cadena

complementaria Uso de ddNTPs: paran la reaccin,

la polimerasa los reconoce y los coloca en la cadena sin problemas y ya no plimeriza ms.

Se marcan radiactivamente. 4 reacciones: mezcla de 4 dNTPs ms una pequea cantidad de ddATP. Cada vez que entra un ddATP la cadena se para y como est marcada radiactivamente se puede detectar.

Este mtodo es el ms utilizado y ha permitido la automatizacin.

ojo! Est escrita al revs, se lee de 5 a 3

AutomatizacinMarcaje de cada ddNTP con un fluorforo distinto, dar colores distintos en un detector de

fluorescencia. Se hace una sola reaccin con los 4 ddNTPs, la cadena acaba en un color que representa una base.

Se realiza una electroforesis capilar, que se coloca delante del detector de fluorescencia, se transfieren los datos a un ordenador que dar un cromatograma.

Se mezcla el molde con el cebador, ddNTPs, y polimerasa. Se hacen varios ciclos de PCR y se amplifica una sola cadena.

Enzimas de modificacin de extremosAaden o eliminan grupos de los extremos 5 3

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Fosfatasa alcalina Eliminacin del grupo fosfato 5 en ADN y ARN Usos:

- Eliminacin de fosfatos en 5, para su sustitucin por fosfatos marcados con 32P mediante reaccin con quinasa.

- Eliminacin de restos fosfato de los terminales 5 de fragmentos de dsADN, para impedir su dimerizacin, polimerizacin o circularizacin.

Polinucletido quinasa T4 (PNK) Cataliza la transferencia de un fosfato del ATP a un extremo 5 de ADN y /o ARN Se usan en: - Eliminacin / adicin de fosfatos dependiendo de las necesidades de clonacin - Sustitucin del fosfato 5 por grupo fosfato marcado (P

32): Marcaje de ADN y/ o ARN

Transferasa terminal o desoxinucleotidil terminal tranferasa

Cataliza la transferencia de dNTPs al extremo 3-OH de molculas de ADN (ss ds). Similar a la polimerasa pero NO COPIA MOLDE, aade nucletidos al azar. No se considera una polimerasa.

Se utiliza en: - La obtencin de homopolmeros en los extremos de una

cadena para generar extremos cohesivos de secuencia conocida. Contando el tiempo de reaccin se puede conocer los nucletidos aadidos.

- Marcaje de los extremos 3 Poli(A) polimerasa

Incorpora residuos de A a partir de ATP al extremo 3 de un ARNss, creabdo una cola poli(A)

Se utiliza en: - Marcaje de ARN y en adicin de colas poli(A) a mensajeros

como paso previo a la obtencin de ADNc

LigasasEnzimas que catalizan la unin entre dos extremos de ADN. Requiere energa en forma de ATP

NAD. Requiere Mg2+

Papel in vivo: unin de muescas (replicacin /reparacin)

- Una molcula lineal se puede unir quedando circular- Dos molculas lineales con extremos compatibles se unen formando una sola molcula - Unin de muescas durante la replicacin /reparacin, une covalentemente dos nucletidos

Ligasa de T4

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Cataliza la unin de extremos compatibles de dos molculas de ADN o de los extremos de una misma molcula.

Ms difcil, las molculas deben chocar y Se forma un apareamiento no permanente, encontrar la ligasa porque queda una muesca en cada cadena, la

ligasa la encuentra. Es ms fcil, ms eficiente y ms rpida.

Requisitos: Extremos compatibles Extremo 5 a unir debe estar fosforilado por lo menos en una de las cadenas, solo es necesaria la

fosforilacin en una cadena Si la molcula es grande se puede hacer circular y para evitarlo se alteran los extremos 5 conservando

los fosfatos en una de las molculas y eliminando los de la otra. Se desfosforila la molcula ms grande para evitar que se circularice.

Extremos de los fragmentos a unir - Extremos cohesivos generados con la misma enzima Recuperamos la diana de corte. - Extremos cohesivos generados con enzimas diferentesNo siempre recuperamos la diana de corte - Extremos romos No siempre recuperamos la diana de corte

Modificacin de extremos para generar extremos compatibles - Conversin de extremos cohesivos en romos

Eliminacin de regin monocadena: exonucleasas especfica de cadena sencilla que elimina nucletido a nucletido hasta llegar a la zona de cadena bicatenaria. No se recupera la diana de corte.

Relleno de extremos: polimerasas + dNTPs. Sintetiza lo que falta. Slo si tenemos 5 protuberantes!. Se recupera la diana de corte.

- Conversin de extremos romos en cohesivos: consiste en la construccin de una regin homopolimrica en los extremos 3 de un ADNds Homopolmeros terminales: Transferasa

terminal. Se forma una cola poli(G) y otra poli( C )

Extremos romos

Extremos cohesivos

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Linkers: cortas secuencias ADNds de extremos romos con dianas para enzimas de restriccin que producen extremos cohesivos. Se pueden sintetizar y tener grandes cantidades. Una gran concentracin facilita la unin. Se requiere cortar con enzimas de restriccin.

Adaptadores: Piezas cortas de ADNds con extremos cohesivos correspondientes a dos enzimas diferentes. No requiere corte

Pueden fabricarse con dos oligonucletidos Pueden fabricarse uniendo dos linkers y cortando despus

Modificacin de extremos para favorecer /evitar la ligacin

Fosforilacin de extremos 5

- Polinucletido quinasa

- Unin de linkers /adaptadores construidos con oligonucletidos sintticos

- Ligacin de productos de PCR

Desfosforilacin de extremos 5

- Fosfatasa alcalina

- Evitar autoligacin de los extremos de una misma molcula de ADN

Dos extremos cohesivos

GATCCGGCCG GCCGGCTTAA

EcoRI

BamHI

Un extremo romo y otro cohesivo

GCCGGCTTAACGGCCG

CCGGATCCGGGGCCTAGGCC

Linker

CCGAATTCGG GGCTTAAGCC

Linker

CCGGATCCGG GGCCTAGGCC

CCGAATTCGG

GGCTTAAGCC

GATCCGGCCG GCCGGCTTAA

EcoRI

BamHI

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Clonacin de ADN recombinanteClon: conjunto de clulas derivadas de una nica clula progenitora y, por lo tanto, poseedoras de

idntico contenido gentico. Clonar un ADN significa aislar y disponer de una clon de clulas portadoras de una misma molcula de ADN recombinante.

Aplicaciones: - Aislamiento y amplificacin de secuencias gnicas - Estudio de regiones genmicas medias y grandes, y de genomas completos - Produccin de protenas y otros compuestos

La secuencia que interesa clonar se corta con la enzima de restriccin adecuada o se amplifica con PCR. Luego se una a un vector que es el que permite integrar el inserto en otro organismo. El vector es el ADN recombinante.

Luego se cultivan las clulas y se obtienen muchas copias del inserto.

Para recuperar el ADN recombinante se rompen las clulas hospedadoras.

Las clulas hospedadoras ofrecen todos los sistemas genticos y bioqumicos y actan como un laboratorio especializado donde se lleva a cabo el proceso diseado.

La clonacin implica: Mantenimiento dentro de la clula Transferencia a la descendencia Amplificacin (aumento del n de copias), en cada clula puede haber cientos de copias del ADN

recombinante Expresin del ADN clonado, que se pueda transcribir y traducir el gen clonado

Tres elementos clave en clonacin: Inserto (ADN a clonar) Vector Clula hospedadora

Inserto o ADN pasajero Puede ser un nico fragmento o una coleccin de secuencias, forman parte de las genotecas. Se

obtiene: - Por digestin con endonucleasas de restriccin - Digestin con endonucleasas de restriccin - Producto de PCR - ADNc, en eucariotas a partir de un mRNA

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Clula hospedadora Debe aceptar la molcula recombinante sin afectar su integridad, y permitir que se mantenga estable

en sus descendientes. La clula ms utilizada es Escherichia coli, es un organismo modelo, se han realizado mucos estudios

y se conoce casi perfectamente; tiene fcil y rpido crecimiento, los medios de cultivo utilizados son sencillos (Carbono, Nitrgeno y sales). Se divide cada 30-40 minutos. Existe una gran coleccin de mutantes.

Nos interesan mutantes deficiente en restrictasas y recombinacin para que no destruyan el vectory para evitar que el vector se integre en el cromosoma bacteriano y no pueda manipularlo.

Tambin se utilizan otras bacterias (gram-positivas y gram-negativas). A veces interesa expresar el gen en el mismo organismo del que se extrae el inserto.

En eucariotas se utilizan levaduras, Saccharomyces cerevisiae, simple y unicelular, se divide cada 3 horas.

Plantas, clulas aisladas o plantas completas. Lneas celulares animales (cultivos in vitro), tiles para trabajo con genes de organismos superiores y

terapia gnica. Embriones animales, fuente para la obtencin de individuos transgnicos, de inters para el

conocimiento de la biologa de organismos superiores.

Mtodos de introduccin de ADN en las clulas Transformacin

Captacin de ADN desde el medio extracelular Tratamiento con compuestos qumicos para alterar la envuelta, provoca poros, se da choque trmico, la

temperatura aplicada depende del organismo receptor. Las clulas tratadas qumicamente alterando su envuelta se denominan clulas competentes. Si se introduce ADN procedente de virus (sin encapsidar) hablamos de transfeccin Infeccin

Usamos un virus (partcula vrica) para introducir el ADN dentro de la clula, normalmente animales. Electroporacin

Uso de descargas elctricas para alterar la envoltura Transfeccin con ADN precipitado con fosfato de calcio

Forma clsica de introducir ADN en clulas eucariotas en cultivo, el ADN est unido al precipitado y la clula lo endocita.

Lipofeccin ADN en solucin se acompleja con vesculas formadas por lpidos catinicos (liposomas). Los

liposomas se fusionan con la membrana plasmtica. Se usa en clulas animales en cultivo, protoplastos (clulas sin pared) de levaduras o clulas vegetales Microinyeccin

Usamos un aguja /pipeta muy fina para inyectar el ADN directamente dentro del ncleo, normalmente en ovocitos de anfibio y embriones

Biolstica Bombardeamos las clulas con pequeos proyectiles de oro o tungsteno que tienen adherido el ADN.

Eficaz en clulas de pared o envoltura fuerte (clulas vegetales), para no destruir el tejido.

Vector Molcula de ADN, generalmente de pequeo tamao, con caractersticas (y /o secuencia) conocida y

capacidad de replicacin autnoma. Generalmente basados en plsmidos bacterianos o genomas vricos. Capaces de recibir al inserto y en el interior celular es capaz de hacer que el hospedador lo replique y de que sus copias se repartan correctamente entre las clulas descendientes.

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Se puede dividir en dos grandes grupos: Vectores de clonacin /propagacin: solo mantienen y propagan el inserto de inters. Vectores de expresin: poseen los elementos /seales necesarios para la transcripcin y

traduccin del inserto en la clula hospedadora. Estos elementos deben ser funcionales. - Podemos clasificarlos segn:

Origen (procariota /eucariota) Tipo de molcula (plsmido, virus, cromosoma artificial, etc) Tamao del inserto que puede incorporar Tipo de clula donde puede replicarse y /o expresarse Tipo de marcador de seleccin

Caractersticas de un vector- Origen de replicacin: debe tener un origen de replicacin (regin ori) que sea activo en la

clula hospedadora. Permite la replicacin dentro de la clula husped y el correcto reparto de copias entre las clulas hijas o su propagacin por infeccin (caso de los virus). Define el organismo /s utilizable /s como clula hospedadora.

- Marcador de seleccin. Permite distinguir/ seleccionar las clulas que contienen el vector. Los ms utilizados son genes de resistencia a antibiticos. Confiere una cualidad especial a la clula.

- Sitios de clonacin mltiple (MCS o polylinkers). Cortas secuencias que contienen mltiples dianas de restriccin de corte nico en el vector, donde se coloca el inserto.

- Marcadores de seleccin adicionales. Que permitan la deteccin/ seleccin de los recombinantes. - Seales de transcripcin y /o traduccin. En el caso de vectores de expresin. Deben ser

funcionales en la clula hospedadora.

Tipos de vectores- Derivados de plsmidos (bacterianos, de levaduras, de plantas) - Derivados de virus (bacterianos, animales o de plantas) - De origen mixto, compuestos por piezas de diferente origen. Con ms de un origen de

replicacin - Cromosomas artificiales

Vectores para el clonaje en Escherichia coli

Vectores plasmdicosLos plsmidos son estructuras adaptadas al entorno celular, disponen de las seales precisas para que

la maquinaria celular lleve a cabo su replicacin y particin y la expresin de sus genes. La posibilidad de introducir en su molcula un fragmento de ADN extrao de manera que no se vean afectadas esas funciones esenciales permite disponer de un vehculo de clonaje en bacterias.

Plsmido es una molcula circular de ADN bicatenario de pequeo tamao. En bacterias y algunos eucariotas. Admiten insertos de unas 10-15 kb. Utilizan la maquinaria celular para replicarse.

- Replicn: regin donde se producen las interacciones con los elementos replicativos, y es responsable del mantenimiento del plsmido en la clula hospedadora. Normalmente los plsmidos presentan un nico replicn. El replicn incluye el origen de replicacin (ori) y los elementos de control que actan en cis.

El tipo de replicn define: Grupo de incompatibilidad: Plsmidos con replicones idnticos o relacionados son

incompatibles N de copias del plsmido:

- Plsmido de replicacin estricta: 1-5 copias clula- Plsmido de replicacin relajada: 15-20 copias clula

Rango de hospedador: especie /s donde puede replicarse

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pBR322:

Tiene 4363 pb, le da buena capacidad de transporte, ms de 10 pb.

Contiene genes de resistencia a ampicilina (ampR) y a tetraciclina (tetR)

No tiene MCS Contiene otras dianas de restriccin repartidas,

algunas dentro de los genes de resistencia. Esto permite una inactivacin de la resistencia por insercin de un fragmento de ADN en esa zona.

Unas 20 copias por clula.

Permite inactivacin por insercin, Si introducimos un inserto en una diana interna de uno de los genes de resistencia, se pierde la resistencia correspondiente.

Si se inserta en el gen tetR las clulas obtenidas podrn ser tetS-ampR y tetR-ampR. Si se siembran en cultivo con ampicilina crecern todas las clulas que hayan sido transformadas. Si se hacen crecer estas colonias en un medio con tetraciclina solo crecern las tetR, y se pueden recuperar de la placa con ampicilina. La incorporacin del inserto en el sitio BamHI del vector lineal inactiva la funcin de resistencia a tetraciclina, pero si la ligasa los une y recirculariza el gen tetR se recompone y las clulas transformadas sern resistentes.

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Vectores serie pUC El rendimiento conseguido en la transformacin de un cultivo bacteriano es inversamente proporcional

al tamao del ADN que se intenta introducir. Cuanto menor sea el vector mayor espacio queda para el inserto. Por ello se eliminaron secuencias superfluas.

Eliminacin de secuencias superfluas: Menor tamao del vector (2,6-3,2 kb), Mayor tamao del inserto (ms de 12 kb)

Poseen un MCS, permite elegir entre diferentes enzimas de restriccin y permite realizar clonacin direccional. El clonaje direccional, donde el vector tiene MCS asimtrico, le permite recibir insertos con diferentes tipos de extremos, incluso haciendo uso de dos dianas, se puede lograr la insercin del ADN extrao en una orientacin nica y forzada al mismo tiempo que se evita la posible recircularizacin del ADN vector.

Deteccin de recombinantes mediante color (identificacin cromognica) Esta serie de vectores se ha dotado de un sistema gnico que permite distinguir clones transformados

por ADN recombinante de los que han sido transformados por vector recircularizado. Este sistema es el Opern lac.

El opern lac de E. coli es el responsable del catabolismo del disacrido lactosa. Es una unidad transcripcional compuesta por tres genes estructurales (lacZ, lacY y lacA).

LacZ codifica la enzima -galactosidasa, cataliza la hidrlisis de glucosa y galactosa de la molcula de lactosa; tambin es capaz de hidrolizar anlogos como X-gal, compuesto incoloro pero su hidrlisis conduce a un producto de color azul.

El sistema presenta una regulacin negativa inducible por su sustrato (lactosa o anlogos, como IPTG). La regin reguladora del opern est compuesta por un promotor (Plac) para la unin de la ARN-polimerasa, y un operador (Olac) secuencia que solapa con el promotor y a la que se une la protena represora codificada en el gen lacI.

En ausencia de sustrato, la protena represora se une al operador e impide la accin de la ARN-polimerasa; pero el sistema se induce por la presencia de un sustrato que se une a la protena represora inactivndola y permitiendo la transcripcin del opern.

En una estirpe normal de E. coli, el anlogo IPTG induce la sntesis de -galactosidasa, por lo que cuando crece en un medio con X-gal produce colonias azules.

lacZ (-galactosidasa) Degrada lactosa en glucosa + galactosa

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Hay estirpes mutantes incapaces de degradar lactosa porque el gen lacZ no se expresa o porque su producto no manifiesta actividad -galactosidasa, estas estirpes producen colonias blancas cuando crecen sobre X-gal. Una de estas mutaciones (M15) presenta una delecin en lacZ

En presencia de un pptido () procedente de la expresin de los primeros codones del gen lacZ, idntico a la regin N-terminal de la protena completa, la protena defectuosa recupera su actividad -galactosidasa. Ambos polipptidos se unen para formar un complejo enzimticamente activo.

El sistema incorporado a la serie pUC es un fragmento de ADN del cromosoma de E.coli que contiene el comienzo del opern lac, las regiones reguladoras (promotor y operador) y el comienzo del gen lacZ (la regin codificadora del pptido ). Inducido por IPTG se expresar pptido que lleva a cabo la complementacin sobre -galactosidasa defectuosa. Cuando las cepas mutantes lacZM15 son transformadas por un ADN que contenga este sistema, crecern en un medio con IPTG y X-gal formando colonias azules.

Se expresa en C-terminal

-galactosidasa inactiva

Expresin fragmento N-terminal lacZ

Mutantes M15

Complementacin

-galactosidasa activa

Degradacin de X-gal: color azul!

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Complementa mutante M15 MCS est dentro de lacZ

Deteccin plsmido pUC Resistencia a ampicilina En medio con X-gal: Color azul!!!

Colonias azules: vector sin modificar Colonias blancas: plsmido recombinante

Vectores basados en bacterifagos Fago

ADN bicatenario de 49 kb. Infecta a E. coli Dos tipos de ciclo: - Ciclo ltico: replicacin del fago, lisis y

liberacin de partculas vricas - Ciclo lisognico: el ADN se integra en el

cromosoma de la bacteria y permanece dormido hasta induccin de ciclo ltico

En las calvas de lisis hay ADN que se purifica

Formas del ADN de : - Forma lineal (dentro de la cpsida): en las regiones terminales presenta extremos 5 protuberantes,

formados por secuencias de 12 nucletidos, monocatenarias y complementarias entre s, son cohesivos; son sitios cos

- Forma circular cerrada (forma integrativa) debido a la asociacin de los sitios cos. Concatmeros lineales (tras replicacin; sustrato para empaquetar el ADN)

Se empaqueta cualquier fragmento de 37-52 kb de ADN flanqueado por secuencias cos.Organizacin del genoma de : los genes que codifican funciones relacionadas se encuentran

agrupados y se transcriben simultneamente. Para el ciclo ltico completo solo es necesario la regin de las protenas de la cpside y la regin de protenas de regulacin. La regin de integracin puede ser sustituida por el ADN que se quiere clonar.

Calva de lisis

Regin no esencial

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Vectores de insercin

Hemos eliminado parte de la regin no esencial. Los puntos de corte generan dos fragmentos llamados brazos

Introducimos un sitio nico de corte. Puede realizar el ciclo ltico. Tamao del inserto: unas 8 kb como mucho

Seleccin fagos recombinantes: - Punto de corte en gen cI (gen represor de lisis). Si se

coloca el inserto en medio de cI siempre realizar el ciclo ltico, calvas claras. Si ni se rompe cI se vern calvas turbias, porque realiza el ciclo lisognico y ltico. Recombinantes producen clavas ms claras.

- Fragmento lacZ con sitio de corte. En X-gal dar calvas azules

Vectores de sustitucin - Sustituimos toda la regin no esencial por un ADN

de relleno - Cambiamos el ADN de relleno por nuestro inserto - Podemos incluir sistemas de seleccin dentro del

ADN de relleno - Tamao del inserto de hasta 22 kb - No pueden producir lisogenia ni integrarse en el

genoma, pero tampoco nos interesa

Uso de la forma circular cerradaIgual que si fuera un plsmido. Transfeccin, una vez en la clula se

comporta como un virus.

Uso de la forma linealSe corta el ADN vrico y se coloca el inserto, se forman

concatmeros, se introducen las protenas de la cpside y la purificada. Empaquetamiento in vitro. Se selecciona el tamao para el empaquetamiento, ste se har cuando haya brazo izquierdo-inserto-brazo derecho. Una vez empaquetado se infecta la clula.

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Csmidos Vectores derivados del fago . Combina caractersticas de plsmido,

replicn mnimo para la replicacin de copias, y de fago las secuencias cos para empaquetar. El empaquetado es necesario para introducirlo en la bacteria, porque es un plsmido muy grande.

Plsmido que contiene sitios cos de . Necesarios para la encapsidacin.

Empaquetamos in vitro con cpside de y producimos infeccin. Dentro de la bacteria se comporta y replica como un plsmido Ojo: Aislamos colonias, no calvas!!!! Podemos clonar en ellos hasta 46-47 kb, pero para encapsidarlo no

puede tener ms de 37-52 kb Seleccionamos en funcin de los marcadores

que tengamos en el plsmido

Vectores basados en M13 M13 es un fago filamentoso de E. coli. ADN monocatenario. Infecta a travs de los pili. El ADN es

lineal dentro de la cpside pero una vez dentro de la bacteria se hace bicatenario y circular, es la forma infectiva, es la que sintetiza las protenas de la cpside, solo copias de una cadena, luego sale de la clula, no provoca lisis, la clula ralentiza su crecimiento.

El tamao no es restrictivo en este fago: a mayor cantidad de ADN, mayor se hace la cpside. Insertos de 8-10 kb pueden ser inestables.

Podemos aislar la forma replicativa y manipularla como si fuera un plsmido. No podemos eliminarle genes, ya que todos son imprescindibles. Introducimos inserto en regin intergnica II-IV III-VIII.

La volvemos a introducir en la bacteria y prosigue el ciclo. El ADN que podemos obtener de la clula es bicatenario, si lo conseguimos una vez que el fago ha salido el ADN ser monocatenario.

F-pilus

FDNA M13

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Fagmidos Plsmido que posee la regin del fago M13 que contiene el origen de replicacin. Ms eficiente en la

replicacin al ser un plsmido y admite insertos ms grandes No puede empaquetar por si solo en el interior celular, necesita de un fago M13 ayudante. Se infecta la bacteria con las dos partculas, pero se obtienen dos partculas diferentes, unas tendrn el

inserto y otras el ADN del ayudante. Se crea un ayudante mutante, que solo produzca protenas de la cpside .

Cromosomas artificiales de bacterias BACs Basados en el plsmido F de E. coli (contienen su origen de replicacin) Permiten clonar unas 300 kb

Derivados del fago P1 Similar a Podemos empaquetar en su cpside hasta 125 kb

Cromosomas artificiales derivados de P1 Combinan caractersticas de los BACs y P1 Hasta 300 kb

Fsmidos Similares a los csmidos. Contienen el origen de replicacin de F Menor n de copias que los csmidos. Ms estables

En todos estos caben ms kb para clonar y tienen un origen de replicacin especial.

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Vectores plasmdicos para expresin de protenas en E. coli

Vectores de clonacin que poseen seales de transcripcin y traduccin funcionales en E. coli

TranscripcinRegin promotora: promotor +

secuencias reguladoras (5)

Terminador

Traduccin- RBS sitio de unin al ribosoma - Secuencia Shine-Dalgarno (SD) - ATG: sitio de inicio, codifica Met - Secuencia de stop

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Regiones promotoras en E.coli - Fuerza del promotor (P): depende de la afinidad por la ARN polimerasa. - Mecanismo de regulacin (operador, op): para controlar cuando y cuanto expresamos, es muy

importante. - Dependiendo del promotor se tendr ms o menos expresin y esto depende de la afinidad por el

mecanismo de transcripcin. - Promotores hbridos funcionan mejor que los originales

Regulado por represor lac y CRP Regulado por represor trp. Ms fuerte que Plac

Permite regulacin por T

Slo se transcribe por la ARN pol de T7 Mutante lac no sensible a CRP

Hbridos entre Ptrc y Olac. Fuerte expresin regulado por represor lac

Terminadores en E.coli

No son imprescindibles, pero mejoran la expresin. Se usan terminadores de genes conocidos (rrnB ARNr 5S de E.coli)

Transcritos muy largos pueden afectar a la replicacin del plsmido y disminuir la expresin

Gen rrnB ARNr 5S E. colitL y tR de los genes tempranos de

fago

RBS sitio de unin al ribosoma Importante para la unin rpida y

eficiente del ribosoma Secuencia S-D: varia entre 3 y 9 pb. No

muy conservada No esta presente en genes eucariotas

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Tipos de secuencias a expresar - Regiones /genes procariotas que contienen sus seales nativas

o Regin promotora, terminador y RBS propios o Clonamos toda la unidad transcripcional en un plsmido de clonacin tpico

- Regiones /genes procariotas que tienen regin promotora mala El promotor es muy dbil, no tenemos buena regulacin o carece de promotor y /o

mecanismo de regulacin. El inserto contiene el RBS, la ORF y el codon de STOP

Utilizamos un vector que posee las seales de transcripcin adecuadas y un MCS Realizamos una fusin transcripcional entre las secuencias del vector y las del

inserto

- Regiones /genes que no poseen buen RBS o carecen de RBS El vector contiene el RBS (secuencia SD + ATG) Tenemos que clonar nuestra ORF en fase con el ATG del vector Fusin traduccional entre las secuencias del vector y las del inserto

Regulacin de la expresinLa mayora contienen el operador del opern lac : regulacin por represor de lac (lacI) Ojo: Tenemos el plsmido en alto/ medio n de copias : represor limitante!. En una clula normal en

estado natural, hay pocas molculas de represor, stas solo regulan una o dos copias del opern. Dos estrategias:

Estirpes de E. coli que sobreexpresan el represor lacIq, de forma constitutiva. El plsmido contiene el gen lacI bajo el control de promotor constitutivo. Si tenemos un vector

con el promotor, el operador y la protena X que queremos expresar, luego tiene resistencia a ampicilina que se lee en una direccin y el represor lacI que se lee en direccin contraria, reprimiendo a lacI la protena se expresa.

- Control de la expresin: IPTG, es un anlogo de lactosa que la bacteria no puede degradar. El IPTG se une al represor, pero no se degrada, por lo tanto la cantidad de protena producida es

proporcional a la concentracin de IPTG aadida.

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Vectores con seales de transcripcin Los usamos para genes que poseen un buen RBS El plsmido proporciona la regin promotora, seguida de un

MCS y un terminador pKK177-3

Algunos vectores posee secuencia SD justo antes del MCS: podemos clonar solo la ORF

Vectores con sitio de clonaje inmediato a un ATG Genes que no poseen buen RBS o carecen de l (genes eucariotas) El ATG est codificado en el vector, y el sitio de clonacin solapa con el ATG NcoI CCATGG NdeI CATATGFusin traduccional pTRC99a

Expresamos la protena nativa

Podemos usar cualquier otro sitio de clonacin, pero entonces la protena que se exprese tendr ms aminocidos en el N-terminal

Cuidado con la fase de lectura!!!

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- Ejemplo de fusin traduccional para expresin Queremos expresar el gen eucariota Shv en E. Coli. La secuencia del ADNc es:

Tenemos el plsmido de expresin pORF, con tres variantes que difieren en la pauta de lectura del sitio de corte EcoRI

En qu variante tendramos que clonar el ADNc digerido con EcoRI para que se expresara correctamente Shv?

Pauta de lectura correcta!!

Codon de STOP antes de llegar al inicio de Shv

Pauta de lectura incorrecta: se sintetiza un pptido de secuencia diferente a Shv

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Produccin de protenas de fusin

- Expresin in vivo de una protena hbrida obtenida por fusin traduccional de dos ORFs - El vector proporciona las seales reguladoras y una ORF con un MCS - Tenemos que clonar nuestra ORF en fase con la ORF presente en el vector - Podemos tener:

ORF del vector::ORF de inters. El gen se clona en el MCS y la protena resultante estar en N-terminal la protena del vector y en C-terminal la protena clonada. (P-ORFvector-MCS)

ORF de inters::ORF del vector. La N-terminal estar la protena clonada y en C-terminal la protena del vector (P-MCS-ORFvector)

Ventajas o inters del uso de protenas de fusinMuchas protenas eucariotas son ms estables si las expresamos fusionadas a una protena de E. coli, si

no son estables las protenas degeneran o se acumulan en bloques de inclusin y no se pueden rescatar, pero fusionadas con protenas de E.coli se vuelve estable.

La protena resultante conserva las actividades de ambas protenas: deteccin fenotpica Facilita la purificacin de la protena de inters: cromatografa de afinidad o secrecin al medio

extracelular Fciles de detectar e identificar en una mezcla: gran tamao y existencia de anticuerpos contra la

protena del vector. Fusin traduccional: ojo con la pauta lectura!! Existe una seal de proteolisis especfica en la secuencia frontera entre las dos protenas, hay proteasas

que reconocen una secuencia concreta y separan las protenas.

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Purificacin protenas de fusin

Cromatografa de afinidad

Exclusin por tamao.

Esquema general de preparacin de protenas nativas mediante la expresin de un producto de fusin, su purificacin por retencin por afinidad y su rotura endoproteoltica.

Ejemplos de protenas de fusin para purificacin Sistema del apndice /cola de histidina

Incluye un conjunto de vectores: Derivados de Pbr322: con ori ColE1 y gen de ApR

Promotor fuerte que reconoce la ARN-polimerasa de E.coli Operador lac duplicado, para asegurar una represin eficaz RBS bacteriano Codones de stop en los tres marcos de lectura Dos fuertes terminadores de la transcripcin Un MCS colocado en todos los marcos de lectura entre los distintos vectores Secuencia codificadora de 6 residuos de histidina para la sntesis del apndice

(tag) La protena expresada llevar un apndice de 6 histidinas en los extremos N o C-terminal. Para N-

terminal, secuencia de un vector tpico; para C-terminal, se modifica la pauta de lectura, donde codifica prolina, para que codifique histidina.

Fusionamos nuestra protena a una secuencia de 6 histidinas, La histidina tiene afinidad por el nquel. Purificamos con resina cargada con Ni

2+

Elumos con tampn que contenga imidazol, ste es un anlogo de la estructura de histidina No suele afectar a la actividad de la protena y muchas veces no se elimina

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Sistema de la GST GST es la enzima glutatin S-transferasa. La

regin N-terminal de la protena de fusin corresponde a la GST, capaz de ser retenida en columnas de glutation-Sepharosa y eluida con glutation reducido.

Purificamos con resina que contiene glutatin. Elumos con glutatin reducido.

Los vectores de la serie pGEX contienen el promotor Ptac, la regin codificadora de la GST con su RBS interno, la secuencia que codifica la seal de endopeptidasa y un pollinker.

Sistema de la MBP MBP es la protena de unin a maltosa. La protena de fusin lleva en su mitad N-terminal la MBP;

es retenida en columnas de agarosa-amilosa y eluida con maltosa. Purificamos con agarosa-amilosa. Elumos con maltosa.

Los vectores pMAL llevan el promotor Ptac, el RBS y la secuencia codificadora del gen malE que codifica a la MBP, una regin espaciadora que codifica 10 residuos de asparagina (para aislar conformacionalmente las dos mitades de la protena de fusin), una secuencia que codifica una seal de reconocimiento para una endopeptidasa y un polylinker que interrumpe el gen lacZ (lo que permite detectar recombinantes sobre X-gal)

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Algunos problemas /limitaciones de la expresin de protenas en E. coli- Toxicidad de la protena:

Podemos trabajar con un plsmido de menor nmero de copias o integrar el gen en el cromosoma

- Efecto del uso de codones La frecuencia de uso de codones sinnimos es diferente en cada especie La cantidad de ARNt para codones de baja frecuencia es limitante. Se han construidos

estirpes de E. coli con ARNt raros y son capaces de expresar protenas con codones que normalmente no expresan.

Si aparecen codones raros baja la velocidad de la traduccin y empiezan a aparecer fallos

- Plegamiento incorrecto de la protena: E. coli no posee todas las chaperonas necesarias. Si la protena no se pliega bien se forman agregados insolubles: cuerpos de inclusin,

no se pueden purificar. Podemos disminuir la velocidad de crecimiento o inducir la sntesis de chaperonas. Al

disminuir la velocidad de crecimiento la sntesis de protenas es ms lenta y se van plegando a medida que se van sintetizando. Hay mutantes que expresan chaperonas.

- Modificacin post-traduccional. Algunas protenas requieren ser modificadas tras la traduccin para ser activas. Podemos introducir los genes de las enzimas modificadoras en E. coli o bien expresar la

protena en el tipo celular adecuado

40Vectores para clonaje en bacterias diferentes de E. coli

Bacterias de inters: Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces (antibiticos), etc Utilidades: hay que modificarlas - Degradacin de compuestos - Descontaminacin de suelos - Produccin industrial de enzimas y /o antibiticos Dificultades: - Poca eficiencia en la introduccin de ADN - Falta de mutantes que carezcan de sistemas de restriccin - Limitaciones en el n de vectores replicativos y marcadores de seleccin. El origen de

replicacin define la bacteria en al que se puede clonar el vector; no hay ningn origen de replicacin funcional, los marcadores existentes no se expresan.

Dos opciones: - Plsmidos de amplio espectro, capaces de replicarse en cualquier bacteria - Vectores derivados de plsmidos naturales especficos

Ejemplo de plsmido de amplio espectro: RSF1010 - dos genes de resistencia a antibiticos, SuR (sulfonamida) y SmR

(estreptomicina) - dos orgenes de replicacin:

oriV, vegetativo oriT o nic: dirige la transferencia del plsmido por conjugacin

- tres genes que codifican protenas de replicacin: repA, repB y repC- genes para la movilizacin: mob- sitios nicos para endonucleasas de restriccin Este plsmido se puede construir y mantener en E.coli, y por conjugacin transferirlo a otras

bacterias.

Pseudomonas

Estas bacterias son capaces de metabolizar compuestos orgnicos y llevar a cabo reacciones de destoxificacin con metales pesados, por ello es de gran inters por su aplicacin en biodegradacin y biorremediacin.

Se utilizan vectores derivados del plsmido natural pVS1 de amplio espectro Resistente a la mayora de antibiticos: se usan genes de resistencia a Hg y a Amp (carbenicilina) Bacillus

Muy fcil de transformar: competente natural, como respuesta a una limitacin de nutrientes. Las molculas de ADNds son absosrbidas por la superficie de la clula competente, capta fcilmente el ADN.

Vectores derivados de plsmido natural o del fago 105, muy similar al fago . Tiene seales de transcripcin /traduccin especficas propias: factor sigma, SD y codones de inicio diferentes (UUG, GUG y CUG). Para expresar las protenas hay que usar los sistemas de la bacteria.

Vectores para clonaje en levaduras

Saccharomyces cerevisiae

Levadura unicelular no patgena que se reproduce por gemacin y crece en medios simples. Se considera organismo modelo para otros eucariotas, de rpido y fcil crecimiento en laboratorio, existen mutantes disponibles. Tiempo de generacin 3 horas, temperatura ptima 30C. Son fcilmente transformables. Permite expresar protenas que necesitan modificacin pos-traduccional.

Como marcadores de seleccin son poco usados los genes de resistencia a antibiticos se utilizan: - NeoR resistencia a G418, aminoglucsido capaz de impedir el crecimiento de las clulas

eucariotas por inhibicin de la sntesis de protenas

41- Marcadores nutricionales: complementacin de auxotrofas. Existe un gran conjunto

de cepas auxtrofas, mutantes en rutas biosintticas de aminocidos, genes implicados en sntesis de aminocidos (histidina, leucina, triptfano...) o de nucletidos (UMP), y de los genes de levadura que los complementan (HIS3, LEU2, TRP1, URA3...), aislados y purificados, lo que permite utilizar estos genes como marcadores de seleccin sobre las cepas auxtrofas correspondientes.

El gen LEU2, sintetiza leucina. El mutante leu2

- necesita medio con leucina para no morir, si se introduce un plsmido con el gen LEU2, la clula ya no necesita leucina en el medio, puesto que la sintetiza el plsmido.

Para seleccionar a la transformacin, se cultivan en un medio sin leucina, las clulas transformadas sobreviven.

Vectores plasmdicos para levaduras Plsmidos integrativos (YIPs)

Bsicamente son plsmidos bacterianos con un gen de levaduras (LEU2). Se integran por recombinacin homloga, ya que no pueden replicarse en levaduras.

Si la copia del cromosoma est mutada, podemos utilizar el gen de levaduras como marcador de seleccin de los recombinantes.

El plsmido no se replica porque no tiene origen de replicacin para levadura.

Necesitan leucina

Las clulas que llevan el plsmido sobreviven

en medio sin leucina

Gen de levaduras

pBR322

Recuperamos gen URA3 funcional!!!

42 Plsmidos replicativos (YRPs)Poseen una secuencia ARS (secuencia de replicacin autnoma) Son inestables: no segregan correctamente al dividirse la clula,

se distribuyen mal y tienden a quedarse asociados a la clula madre. Se pierden al cabo de varias divisiones.

Presenta un nmero moderado de copias, son tiles para ensayos de complementacin y se recuperan fcilmente, excepto si se ha integrado en el cromosoma.

Minicromosomas o plsmidos ARS/CENLa inestabilidad de los vectores YRP se corrige incorporando

la regin centromrica de algn cromosoma, CEN (especfica para cada especie de levadura). Estos nuevos vectores, YCp, muestran una segregacin equitativa en la divisin celular, se comporta de forma anloga a un minicromosoma.

De menor nmero de copias. La recuperacin de la secuencia clonada es difcil por la poca concentracin en la que se encuentra.

Siguen siendo inestables: se pierden!!!

Plsmidos derivados del plsmido de 2mPlsmido natural de S. cerevisiae. 50-100 copias por clula

haploide, representa 2-4 % del ADN celular total. Sin funcin conocida.

Secuencias clave para la replicacin: ori y REP1/REP2 Se comporta como un minicromosoma circular. Funciona como un plsmido bacteriano. Se ha utilizado para construir plsmidos lanzadera.

Plsmidos lanzadera E. coli-S.cerevisiae Origenes de replicacin de pBR322 (E. coli) y 2m

(S. cerevisiae), permite la seleccin de transformantes de ambos tipos celulares. Se alcanza una frecuencia de transformacin muy alta, se mantiene en forma de plsmido multicopia. Fcil recuperacin.

Tiene marcadores de seleccin, ApR para E.coli y y un gen de levadura con alguna auxotrofa.

Se realiza la construccin /seleccin de colonias ApR

del ADN recombinante en E. coli y luego se introduce en levadura. Hay que trabajar con mutantes delecionados, que el gen no se encuentre en el cromosoma para que el plsmido no se integre, as se obtienen mayor nmero de copias.

Si tenemos copia del marcador en el cromosoma podemos tener integracin (como los YIPs)

43 Cromosomas artificiales de levaduras

YACsContiene centrmero y telmeros, mantienen la estabilidad del cromosoma. Lo construimos /mantenemos en forma de plsmido de 10-12 kb. Se puede mantener en E.coli y

levaduras. Para el clonaje, se preparan los brazos del vector a partir de un vector lanzadera mantenido como

plsmido en E.coli. Tiene ADN de relleno, secuencias centromricas, marcadores de seleccin y origen de replicacin. Los cromosomas de levaduras tienen entre 250-1700 kb Los YACs nos permiten clonar fragmentos de 600-1400 kb

Clonacin en un YAC Podemos incorporar un gen marcador en la secuencia que sustituimos para comprobar que la

clonacin se ha hecho bien. Se corta el ADN circular de forma que queden los dos brazos, cada brazo lleva un marcador de

seleccin y, en su extremo, un telmero. El inserto se une a los dos brazos quedando un ADN lineal. Se ponen marcadores de seleccin, el gen Trp y el gen URA3.

44 Vectores para expresin en levaduras Los promotores son diferentes de los de bacterias Necesitamos activadores transcripcionales y regiones reconocidas por ellos

Esquema de la regin promotora de un gen tpico de levadura.

- La caja TATA: inicio de la transcripcin, donde se une la polimerasa - Regin iniciadora o de inicio de la transcripcin - Secuencias activadoras y represoras anteriores: UAS y URS - Secuencias activadoras y represoras posteriores: DAS

Promotores ms usados: - ADH1 alcohol deshidrogenasa: inducible por glucosa, expresin constitutiva - Promotores genes GAL: promotor fuerte, inducibles por galactosa

Vectores para clonaje/ expresin en plantas

Plsmido Ti de Agrobacterium tumefaciens A.tumefaciens infecta a travs de heridas

produciendo tumores. Es capaz de transferir ADN desde su citoplasma al interior de clulas de plantas, de forma natural. Solo infecta algunas dicotiledneas.

Plsmido Ti de unas 200 kb, es el agente inductor del proceso. Es un ADNds circular, grande que codifica lsa funciones de virulencia y tumoracin. Posee numerosos genes implicados en la infeccin, en el crecimiento del tumor y en determinar la especificidad del husped.

ADN-T: fragmento de 15-30 kb que se integra en el genoma de la planta de forma estable. La integracin ocurre de forma aleatoria, si se integra en medio de un gen lo inactiva. Tiene oncogenes.

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Introduccin de genes en plantas utilizando el plsmido Ti Sistema binario de transferencia: uso de dos vectores Transferimos el ADN-T de un miniT utilizando un plsmido Ti accesorio sin ADN-T. Ambos se

introducen en A.tumefaciens, las protenas codificadas en el grande permiten que se integre el ADN del miniT.

Sistema de cointegracin Introducimos por recombinacin homloga un plsmido

de E. coli en el plsmido Ti. El plsmido recombinante resultante transfiere la regin

ADN-T que incluye ahora el plsmido de E. coli

Vectores lanzadera E. coli-plantas basados en Ti El ADN-T solo precisa de dos repeticiones de 24 pb en los extremos para transferirse al genoma de

la planta. En el vector de E.coli se clona el inserto, se necesita un plsmido accesorio. En le genoma de la

planta se integran las secuencias que hay entre los extremos. Solo se modifican las clulas afectadas. Si infectamos protoplastos, podemos regenerar plantas completas que posean el ADN transferido en

todas sus clulas.

MiniT Plsmido Ti accesorio

46 Plsmido Ri de Agrobacterium rhizogenes Similar al psmido Ti A. rhizogenes induce aumento del nmero de races adventicias, solo en algunas dicotiledneas

distintas de las que infecta A.tumefaciens. Problemas con Ti y Ri Agrobacterium slo infecta a dicotiledneas

Transferencia directa de genesEmpleamos un plsmido de E. coli (pBR322) Incubamos protoplastos con el plsmido y polietilenglicol Plsmido se adhiere a la membrana de la clula y se induce la

endocitosis. Poco eficiente. Integracin al azar por recombinacin no homloga

Marcadores de seleccin en plantas- Neo /apt: Resistencia a kanamicina, G418 o neomicina - Dihidrofolato-reductasa: Resistencia a metotrexato - hyg : Resistencia a higromicina

Vectores vricos para plantasLa mayora de virus de plantas son de tipo ARN. Difcil manejo/ manipulacin. Son muy

especficos. Vectores de ADN: Caulimovirus

- Tiene restriccin de tamao para empaquetar, como lambda - Podemos generar vectores tipo fagmido - Problema: infecta a muy pocas especies

Geminivirus - Infecta a monocotiledneas - Problema: su ADN sufre deleciones y reorganizaciones durante la infeccin

Vectores para clonacin en clulas animales

Se utilizan lneas celulares en cultivo. Mtodos de transferencia de ADN: transfeccin - Precipitacin con fosfato clcico - Liposomas - Microinyeccin - Electroporacin Marcadores de seleccin - Resistencia a antibiticos: no suelen usarse, pero se utiliza el gen neo modificado de E. coli,

confiere resistencia a G418, anlogo de kanamicina - Rutas metablicas biosintticas de precursores de ADN:

Rutas de novo: parten de compuestos simples (glicocola, aspartato) para construir las molculas de los desoxinucletidos pricos y pirimidnicos

Rutas de recuperacin: utilizan el conjunto de bases nitrogenadas y el de mononucletidos, alimentado por procesos degradativos de cidos nucleicos, para la construccin de la estructura nucleotdica.

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TK timidina quinasa: es uno de los marcadores ms utilizado. El gen codifica una enzima (timidina kinasa) con actividad implicada en una de las rutas de biosntesis de desoxinucletidos. La timidina se convierte en dTTP en una reaccin catalizada por la timidina kinasa.

Se han podido aislar mutantes defectivos en actividades de las rutas de recuperacin: - APRT-: defectivas en adenina-fosforribosil-transferasa, enzima que convierte la adenina en AMP) - HGPRT-: defectivas en hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferasa, enzima que transforma la

hipoxantina en IMP y la guanina en GMP - TK-: defectivas en timidina-kinasa

Xantina-guanina fosforribosil-transferasa (XGPRT): esta enzima de E.coli es anloga de la enzima hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferasa de mamferos. Sintetiza GMP a partir de xantina. Utiliza como sustratos hipoxantina, guanina y xantina. Un fragmento de ADN que exprese la actividad XGPRT es capaz de convertir clulas de mamfero HGPRT- en HGPRT+ y permitirlas crecer en un medio HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina).

Seales de transcripcin /traduccin

Esta seal la proporciona el vector para permitir incorporar la cola poliA al ARNm

El tipo de promotor determina el nivel de expresin y en que tipo de clulas se expresa

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Esquema de unidad transcripcional - Regin promotora: necesita la unin de protenas activadoras, factores generales de transcripcin.

Cada promotor dice donde y cuando se va a expresar el gen. La mayora tienen secuencias de reconocimiento:

La caja TATA, para la correcta ubicacin de la ARNpolimerasa II Elementos anteriores (upstream promoter elements): antes de la caja TATA y son

responsables de la velocidad del proceso de iniciacin de la transcripcin - Seales de terminacin y poliadenilacin: el transcrito primario (pre-mRNA) es modificado en su

estrmo 3, y una rotura por un punto intermedio y la sntesis de una cola poliA en 3 creado tras la rotura

- seales del procesamiento interno del transcrito primario: los genes eucariotas estn interrumpidos por intrones, que son transcritas y luego eliminadas segn un mecanismo de unin (splicing) de exones.

- Seales para la traduccin del mRNA: los mensajeros eucariotas son minocistrnicos. Tras la fase de maduracin son transportados al citoplasma para su traduccin por el ribosoma. ste entra en contacto con el mRNA por 5 que acta como sitio de unin al ribosoma. La lectura de tripletes procede desde el primer AUG hasta el codn stop. Este mecanismo no hace necesaria la inclusin de seales para la traduccin en el vector.

- Casetes de expresin para clulas eucariotas: incorporan seales de iniciacin de la transcripcin (promotor y potenciadores), un sitio de clonaje para el pasajero que se quiere expresar, un intrn y la seal de poliadenilacin.

Vectores vricos para clonacin en clulas animalesLa mayora de los vectores son bastante especficos en cuanto al tipo celular (clulas permisivas). Se

puede trabajar con plsmidos y todas sus seales pero, la clula animal tarda mucho en dividirse, aunque la protena en cuestin se expresa, el plsmido se pierde al dividirse la clula. En clulas animales no se habla de transformar sino de transfectar.

Vectores derivados de SV40. SV40 es un virus del grupo del papiloma, produce infeccin ltica en clulas de mono. Virus que infecta

a primates. Genoma de 5243 pb, circular, muy bien aprovechado. Se emplean en cultivos de clulas de rin de

mono verde africano. Slo empaqueta 5300 bp, se usa para secuencias pequeas.

Se pueden obtener 2 tipos de vectores, dependiendo de las funciones del virus que retienen:

Vectores transductores o de reemplazamiento: Realizan el ciclo vrico completo: replican y empaquetan el genoma. Tiene poca capacidad de

transporte, que se resuelve con el empleo de dos derivados defectivos del virus que no son capaces de replicar por s mismos, pero si lo hacen en una infeccin conjunta.

Mantenemos el origen de replicacin, las secuencias necesarias para empaquetar el genoma y un tamao entre 3,9-5,3 kb. Eliminamos genes de replicacin o de encapsidacin, reemplazamos por inserto. Necesitamos un virus ayudante para replicar/ empaquetar.

Un vector de reemplazamiento de los genes tardos, no tiene capacidad de encapsidar pero si de replicar, la clula infectada puede lisar pero no se consiguen partculas vricas. Un vector ayudante defectivo en genes tempranos, no puede replicar pero si encapsidar. Una transfeccin conjunta agrupa en la clula todos los genes que dirigen el ciclo completo (complementacin).

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Se puede utilizar como virus ayudante a un mutante que codifica una protena T termosensible. Tras la infeccin mixta el cultivo crece a temperatura restrictiva:

- las clulas transfectadas por el ADN mutante no producen copias, no se produce la lisis.

- solo las clulas transfectadas por ambos ADN propagarn la infeccin.

- Las clulas que tienen el ADN recombinante no encapsidan

Podemos usar clulas COS Hay vectores de reemplazamiento de la regin temprana, han sido sustituidos por el ADN pasajero. Este

ADN no se puede replicar porque carece de la protena T necesaria para el proceso, pero hay clulas capaces de aportar esta protena, son clulas COS. Tienen en el cromosoma insertado un SV40 defectivo, pero que produce la protena T necesaria para la replicacin.

Podemos empaquetar los vectores de reemplazamiento de genes de replicacin y tener slo virus recombinantes.

Vectores no infectivos o plasmdicos Sin capacidad infectiva pero con capacidad para

transportar pasajeros sin lmite de tamao. son pocos los tipos celulares que pueden ser infectados por el virus (clulas permisivas) pero son muchas las clulas que pueden ser transfectadas eficazmente por su ADN y en las que se alcanza gran nivel de expresin a partir de las seales virales.

Constan de: - Slo contienen el origen de replicacin de

SV40 - Promotor de amplio espectro - Seal de poliadenilacin - Intrn de la protena T de SV40 - Un MCS - Marcador de seleccin Pueden replicarse en clulas de mono, pero no empaquetarse. Si tenemos marcador de seleccin los mantenemos como si fueran plsmidos (10-100 copias) Con frecuencia de 10

-3-10

-5 tenemos integracin en el genoma. Se pueden construir vectores lanzadera.

Vectores derivados de BPV: virus del papiloma bovino Papilomavirus: produce verrugas. Especie especfico, solo infecta a vacas pero es capaz de producir una

morfologa transformada en clulas de roedor in vitro, pero no de propagarse en cultivo de tejidos. En estos sistemas celulares, el virus no produce viriones, su ADN replica dentro de la clula como un episoma pero no se propaga. Slo se obtienen virus maduros de las clulas epidrmicas de las verrugas.

50Puede replicarse en otras clulas bovinas y de roedores (en cultivo): - No se integra en el genoma - 10-100 copias por clula - no necesita marcadores de seleccin - Se transmite a la descendencia - Tiene la capacidad de transformar las clulas de un cultivo en tumorales. - Los transformantes crecen en foco o colonia Podemos construir vectores lanzadera E. coli-BPV que usamos como si fueran plsmidos.

Retrovirus Poseen un genoma RNA, su ruta replicativa pasa por una

fase en la que su informacin gentica aparece en forma de ADNds. Necesita obtener un ADNc para replicarse, insertarse en el genoma y expresar protenas. Slo infectan clulas en divisin. No provocan lisis celular, sino que funcionan como M13

Su genoma posee secuencias importantes para: - Retrotranscripcin: R, U3,U5, P y Pu - Procesamiento de intrones: S - Encapsidacin: - Integracin en el genoma: LTR (repeticiones

terminales largas). Provoca la expresin excesiva de lo que va detrs.

Muchos retrovirus son oncognicos. 2 mecanismos: Incorporacin al genoma de oncogenes: el virus transporta un gen implicado en regulacin del

ciclo celular, pero mutado Alteracin de la regulacin de los genes adyacentes: las secuencias de LTR tienen promotores

muy activos que transcriben hacia afuera

Uso de vectores derivados de retrovirusDejamos las secuencias LTR, necesarias para su integracin en el genoma, y las , dirige el proceso de

ensamblaje del virin, y sustituimos el resto por el inserto y el gen marcador.

Los genes virales, gag, pol, env, son dispensables ya que las funciones que codifican pueden ser aportadas por otro provitus. As se han construido vectores de reemplazamiento.

Se insertan en el genoma y se quedan estables en cultivo, en forma de provirus. Si le damos las protenas del virus, podemos producir partculas vricas infectivas.

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La construccin del recombinante se suele hacer en E.coli y con vectores bacterianos, mediante la unin de las secuencias retrovirales adecuadas y el ADN pasajero. Mediante transfeccin se introduce en la lnea celular que adems es coinfectada con un virus ayudante. La transcripcin de la secuencia de ADN viral recombinante da lugar a un mRNA recombinante que entra en el ciclo replicativo retroviral como RNA genmico, pudiendo ser empaquetado o convertido en provirus. La expresin de los genes retrovirales conduce a la aparicin de una mezcla de partculas virales infectivas que continan la infeccin. El ayudante es el que marca la especificidad de hospedador.

Realizan ciclo completo: obtenemos progenie de virus. Obtenemos las protenas que necesita de profago ayudante: progenie mixta

Si el profago es mutante en que impide el ensamblaje de su RNA viral, las clulas producen todas las protenas necesarias para el empaquetado, son clulas empaquetadoras. Cuando las clulas de esta lnea son transfectadas con un DNA proviral recombinante, defectivo, se producen partculas virales recombinantes infectivas y puras, sin mezcla de ningn virus ayudante, tenemos progenie pura del retrovirus recombinante.

Vectores derivados de otros virus Adenovirus

- No se integran en el genoma - Producen alta respuesta inmunolgica en organismos completos

Adenoasociados - Requieren coinfeccin con un adenovirus o virus herpes - Producen alta respuesta inmunolgica en organismos completos

Herpes - Genoma muy grande (difcil manejo) - Citotxico

Baculovirus - Para introduccin y expresin de genes en cultivos de clulas de insectos

52Genotecas Conjunto de clulas ( o virus) que albergan, fragmentado e incorporado en un vector, todo el contenido

gentico (ADN) de un cierto organismo. 2 datos siempre importantes:

Tamao de la genoteca: nmero de clones que la forman. Depende del tamao del ADN de partida y del vector a utilizar (tamao medio del inserto)

Representatividad: porcentaje de las secuencias originales que est presente en los clones de la genoteca. Es una medida de la calidad de la genoteca

Objetivos: - Conservacin del ADN de una estirpe, especie o individuo. - Aislamiento de secuencias y genes. - Estudio de grandes regiones genmicas y genomas completos. - Inicio de los proyectos de secuenciacin

Tipos en funcin del ADN pasajero mixto que contienen: Genotecas genmicas: Contienen el genoma completo de una especie, en forma de fragmentos

clonados. Genotecas parciales o bancos de genes: Contienen las secuencias de un ADN ms simple, como

un megaplsmido bacteriano o un cromosoma eucaritico aislado (genoteca cromosmica) Genotecas de ADNc: Proceden de la clonacin de los ADNc obtenidos de un tipo celular

concreto. Contienen las secuencias que han sido expresadas en la clula original. Utilizadas en para el aislamiento de genes expresados en tejidos especficos y para el estudio de los mecanismos que regulan esa expresin. Son secuencias carentes de intrones, permite su expresin en sistemas procariticos.

Genotecas genmicasContienen, fragmentado, todo el material gentico (genoma) de una especie. Nos interesa que los clones

sean solapantes

Cualidades /caractersticas de la genoteca a tener en cuenta: - Representatividad: Debe contener todas las secuencias presentes en el ADN de partida. Debe

mantenerse y no disminuir durante la conservacin y amplificacin de la genoteca. - Complejidad (o tamao): nmero mnimo de clones que debe tener la genoteca para que todo el

ADN de partida est representado. - Tamao medio de los insertos: Importante si queremos aislar genes completos de genomas

eucariotas, para lograr el aislamiento de un gen completo, la biblioteca debe contener insertos suficientemente grandes. El tamao de la genoteca depende de la relacin que existe entre la longitud del material inicial y el tamao medio de los insertos. En la prctica, necesitamos un nmero de clones independientes mayor del terico para asegurarnos la representatividad de la genoteca: N = ln (1-P) / ln (1-1/n) N: nmero de recombinantes independientes

P: probabilidad de hallar un inserto dado n: tamao ADN original /tamao medio insertos

Se aconseja la construccin de genotecas con pasajeros grandes porque son ms manejables al estar formadas por un menor nmero de clones y ofrecen ms facilidad en el aislamiento de genes completos. A ms nmero de clones mayor fiabilidad.

Pasos clave en la construccin de la genoteca: Mtodo de fragmentacin del ADN de partida

Define la complejidad de la genoteca, su representatividad y la facilidad de clonacin de los insertos.

Digestin con endonucleasas: en teora, se puede anticipar el tamao promedio de los fragmentos, pero no es real. Dependiendo de la posicin de las dianas en relacin con la secuencia de un gen, puede que la digestin con una enzima rompa al gen en varias piezas impidiendo que aparezca completo en la genoteca.

53

Fragmentacin por mtodos fsicos: ultrasonidos. Produce una rotura al azar, por sitios no especficos. Los fragmentos resultantes requieren algn tratamiento para reparar sus extremos. La rotura al azar presenta una heterogeneidad mayor, aumenta la probabilidad de aislar un determinado gen completo y disminuye la probabilidad de que se pierdan secuencias por estar localizadas en fragmentos grandes no clonables. Muchos fragmentos solaparn entre s.

Digestin parcial con una endonucleasa de diana corta (4 pb). Controlando las condiciones de digestin se pueden conseguir fragmentos de mayor tamao. produce fragmentos solapantes, aumentando las posibilidades de clonaje de cualquier secuencia y permitiendo el desplazamiento por el genoma

Seleccin del vector de clonacin Depende del tamao de los insertos a clonar. Determina la conservacin y facilidad de anlisis de la

genoteca Vectores usados en construccin de genotecas genmicas:

Genomas pequeos: Plsmidos o derivados de (reemplazamiento) Genomas grandes: BACs o YACs

Esquema para construir una genoteca con . Obtencin del ADN. Fragmentacin. ADN . Ligacin entre ambos. Empaquetamiento, en cada fago habr un fragmento de la genoteca. Amplificar la genoteca mediante cultivos, se consiguen calvas de lisis con . Para conservar la genoteca se puede congelar, en E.coli se debe aadir un agente criognico; se pueden hacer diluciones.

Digestin total con enzima A (corte poco frecuente; diana 6 bp)

Fragmentacin por mtodos fsicos (inespecfica)

Digestin parcial con enzima B (corte muy frecuente; diana 4 bp)

Fcil unir los insertos

Insertos de tamao heterogneo

Representatividad media

Clones no solapantes

Difcil unir los insertos

Insertos de tamao homogneo

Representatividad alta

Clones solapantes

Fcil unir los insertos

Insertos de tamao homogneo

Representatividad alta

Clones solapantes

54 Conservacin y amplificacin de la genoteca

Importante que la viabilidad de la genoteca y su representatividad no se pierda durante el almacenamiento y /o amplificacin. Los vectores derivados de se pueden almacenar ms tiempo sin prdida de viabilidad y pierden menos representatividad al amplificar la genoteca.

Genotecas de ADNcSe obtienen al clonar los ADNc obtenidos a

partir de los ARNm purificados de un cierto tipo celular. Refleja los genes que se estn expresando en ese tejido o momento del desarrollo. Permite identificar genes especficos. Tiene menor complejidad que las genotecas genmicas.

Representatividad: No todos los ADNc estn igual de

representados, ya que depende de la abundancia de los ARNm. A la hora del aislamiento de un clon es necesario tener en cuenta la concentracin de su ARNm en el sistema de partida.