GLICOGENOSI DI TIPO 2Diagnostica Biochimica e

Molecolare

AOU “Santa Maria della Misericordia”Udine, 25 Novembre 2014

Glicogenosi di tipo II

• Malattia autosomica recessiva (1:40000)

• Deficit dell’enzima lisosomiale a-glucosidasi acida (GAA) o maltasiacida

• Accumulo di glicogeno nei lisosomi.

Glicogenosi tipo IIPhenotypic continuum

•Manifests in children or adults

•Progressive muscular weakness

•No cardiac involvement

•Respiratory insufficiency

•Exercise intolerance

•Swallowing difficulty

•Moderate hepatomegaly

•Elevated CK

•Residual GAA activity

Infantile onset Late onset

•Manifests soon after birth

•Rapidly progressive disease

course

•Progressive muscle weakness

•Cardiomegaly and

cardiomyopathy

•Hypotonia

•Respiratory insufficiency

•Feeding difficulties

•Moderate hepatomegaly

•Markedly elevated CK

•no GAA activity

La proteina GAA

Extracellular environment

Plasma membrane

Early endosomepH 6.0

Late endosomepH 5.0-6.0

LysosomepH <5.0

GlcNac-1-phosphotransferase

M6P-receptor

Lysosomal enzyme + M6P residue

La proteina GAA

• Precursore di 110 kDa inattivo

• Forma intermedia di 95 kDa inattiva

• Le forme di 70 e 76 kDa sono attive

ACTIVE SITE

Diagnosi di laboratorio

Tests specifici

Parametri di laboratorio non-specifici

CK, LDH, AST, ALT

Oligosaccaridi in urina

Accumulo di glicogeno in muscolo

Misurazione dell’attività enzimatica nelle cellule del paziente

Biochimico

Molecolare Analisi di mutazioni del gene GAA

Substrato(4-methyllumbelliferyl-a-D-glucoside )

+

GAA

Cellule del paziente

Prodotto Fluorescente

(4-Metilumbelliferone)

+ glucosio

Diagnosi biochimicaDosaggio dell’attività enzimatica dell’alpha glucosidasi acida

•Linfociti•Leucociti (acarbose inibitore della maltasi glucoamylase)•DBS (acarbose inibitore della maltasi glucoamylase)

20-25 gg•Coltura linfociti immortalizzati•Coltura fibroblasti

Risultati in giornata

Studi futuri

pH Acido

Diagnosi biochimica

Non sufficiente nei casi di PSEUDODEFICIENZE

Condizione presente nella popolazione generale determinata da polimorfismi

Caratterizzata da attività enzimatica ridotta non associata a malattia

c.1726G>A (p.G576S)

Presente in omozigosi nel 4% degli Asiatici

Diagnosi molecolare

Conferma diagnostica

Approfondimento diagnostico Correlazione genotipo/fenotipo

Consulenza genetica

ATG TAG

GAA gene 17q25.2 – q25.3

20Kb

Circa 400 mutazioni descritte. La maggior parte puntiformi e “private”http://www.pompecenter.nl

- prognosi

- diagnosi prenatale - identificazioneportatori

Diagnosi molecolare

Campione DNA (cellule nucleate)

PCR di ogni uno dei 20 esoni della GAA

Sequenziamento automatico

mutazioni

Conferma nei genitori

Una o nessuna mutazione

Coltura di fibroblasti

Analisi del mRNA per mutazioni di slipicing e delezioni

descritta

nuova

Patogenetica ???

Caratterizzazione in vitro dei mutanti GAA

Mutagenesi sito diretta

• Attività enzimatica• Western blot• Immunofluorescenza

pcDNA3

GAA cDNA WT

pcDNA3

GAA cDNA MUT

0

20

40

60

80

100

120

WT c.399C>A c.670C>T c.1064T>C c.2104C>T c.2188G>T

% r

esid

ua

l G

AA

acti

vit

y

Espressione di mutazioni missensoin COS-1 cells

c.1064T>C c.2104C>TGAA wt

76

11095

70

WT ALDP

Correlazione genotipo/fenotipo

Infantile GSDII

Profilo di mutazioni molto eterogeneo

Tutte le mutazioni descritte sono severe

Late onset GSDII

Mutazioni severe in eterozigosi con mutazione “mild” porta ad una forma LO

c.-32-13T>G è la più frequente

c.525delT(11.8%)

c.1064T>C(7.9%)

c.1655T>C(10.5%)

c.-32-13T>G (42.3%)

La mutazione c.-32-13T>G

ATG TAG

Normale Mutato

c.-32-13T>G

Pt#(sex)

Age(years)

First symptoms noted Mobility status % residual enzyme activity

Respiratory follow-up

onset Diagnosis At diagnosis Follow-up

1(F)

13 14 Elevated CK, AST, ALTLower limb weakness,

Fatigue

unrestricted With help 18 (M)

Reduction of pulmonary

function

2(F)

2 2 Elevated CK, AST, ALT unrestricted unrestricted NA Normal

3(F)

30 31 Elevated CK, FatigueGeneralized weakness

unrestricted With walker or wheelchair

4.3 (L)

Respiratory distress

4 (M)

18 27 Elevated CK, AST, ALTGeneralized weakness

unrestricted With help 10(M)

non invasive ventilation

5(F)

30 52 Difficulty in walking up steps

Fatigue

unrestricted With help absent Supplemental oxygen

6 (M)

22 46 Generalized weaknessFatigue

unrestricted With help 0.1(L)

Reduction of pulmonary

function

7(M)

38 38 Generalized weaknessFatigue

unrestricted With difficulty 8 (L)

Reduction of pulmonary

function

8(M)

1 2 Elevated CK, AST, ALTMuscular weakness

Impaired ambulation

With wheelchair

3.7(M)

non invasive ventilation

9(M)

1 10 Elevated CK, AST, ALT unrestricted unrestricted 0.02(M)

Normal

Clinical data of late onset GSDII patients carrying the c.-32-13T>G/c.2237G>A (p.Trp746X) genotype

Diagnosi prenatale

E’ possibile quando c’è un paziente diagnosticato in famiglia

I genitori, entrambi portatori, hanno una probabilità ¼di avere un figlio affetto

Mamma (portatrice) Papa (portatore)

Sano25%

Malato25%

Portatori50%

Non affetti 75%

Campione: Villo coriale (12^sett.) o amniociti (16^sett)

Diagnosi biochimica: Analisi dell’ attività enzimatica

Diagnosi molecolare: Analisi delle mutazioni del gene GAA presenti nella famiglia.

Solo utile in famiglie in cui le 2 mutazioni sono state caratterizzate.

Esclusione della contaminazione con DNA materno

Diagnosi prenatale

Ringraziamenti

Bruno Bembi

Andrea Dardis

Silvia CattarossiMarta DeganutoErika MaliniAnnalisa Pianta Milena RomanelloIrene Zanin