Raportare ştiinţifică Denumirea proiectului “Hyperthermic magnetic nanoparticle ablation of

liver and pancreatic tumors” (NANOABLATION)

Rezumatul etapei Carcinomul hepatocelular si adenocarcinomul pancreatic sunt printre cele mai agresive tumori maligne, aflate pe locul 3 si respectiv 4 in ceea ce priveste mortalitatea globala. Ambele sunt diagnosticate frecvent in stadii avansate de boala, cand intereventia chirurgicala nu se mai poate efectua. Ablatia tumorala a fost dezvoltata pentru pacientii inoperabili, in principal pentru cei cu metastaze hepatice sau carcinom hepatocelular, dar si pentru pacientii cu adenocarcinom pancreatic. In acest moment sunt dezvoltate mai multe metode de ablatie, dintre care cea mai utilizata este ablatia cu radiofrecventa, asigurand o supravietuire similara rezectiei hepatice. Eficacitatea ablatiei cu radiofrecventa (ARF) este buna dar limitata datorita cresterii impedantei tesuturilor la temperaturi de peste 100 de grade Celsius, prin efectul izolator al tesuturilor carbonizate si prin imposibilitatea atingerii temperaturii tinta la distanta de electrod. De aceea in ultimii ani s-a incercat gasirea unor metode noi de ablatie tumorala. Scopul principal al proiectului este acela de a dezvolta si evalua o noua metoda de ablatie tumorala: ablatia prin radiofrecventa combinata cu captarea intratumorala de nanoparticule si inductia hipertermiei intratumorale. Sistemul dezvoltat va fi evaluat pe model porcin, model murin si explant chirurgical. Etapele proiectului sunt schematizate in Figura 1.

Figura 1: Etapele proiectului. Planul de realizare al proiectului, pentru etapa I, a cuprins urmatoarele activitati si a prevazut ca rezultate redactarea protocoalelor de lucru.

An Etape / Denumirea Activităţii Partener implicat Rezultate asteptate

2012 Etapa I Definitia modelelor experimenatele

Activitate I.1 Definitia si protocolul modelului experimental murin

UMFCV UMFCN

2 protocoale, 2 rapoarte

Activitate I.2 Definitia si protocolul modelului experimental porcin

UMFCV UMFCN

1 protocol

Activitate I.3 Protocolul de explante chirurgicale tisulare

UMFCV UMFCN

1 protocol

Activitate I.4 Raport de sinteză a conjugatilor magnetita-NH2 si magnetita-

COOH

ICMPP 1 raport

Activitate I.5 Design al testerului de nano-ablatie

INCDFM 1 set desene tehnice

Aceste activitati sunt detaliate in descrierea stiintifica.

Descrierea stiintifica Activitate I.1. Definitia si protocolul modelului experimental murin

Modele animale prin implantare pentru obținerea hepatocarcinomului și adenocarcino-mului pancreatic

Modele animale pentru hepatocarcinom (HCC) sau adenocarcinomul pancreatic (PAC) pot fi utile pentru înțelegerea mecanismelor moleculare care stau la baza patogenezei acestei malignități. Modelul murin rămâne unul dintre cele mai bune pentru a studia cancerul in vivo, datorită caracteristicilor diferite, cum ar fi dimensiunile mici, similaritatea cu oamenii și totalitatea genomului ordonat in functie de similitudinile la om [Frese KK, Tuveson DA. Maximizing mouse cancer models. Nat Rev Cancer 2007; 7: 645–658].

Modelele de implantare sunt printre cele mai utilizate pe scară largă pentru a realiza formarea HCC sau PAC la soareci. Tratamentele anticanceroase pot fi testate cu ușurință la aceste animale de laborator. În modele de implantare folosite în prezent, sunt implantate în recipiente subcutanate linii celulare sau fragmente tumorale.

Șoarecele nud (NU – / –) este cel mai des utilizat pentru această abordare. Acești soareci sunt athimici, fără păr și au un deficit de producție a limfocitelor T și B [Clarke R. Human breast cancer cell line xenografts as models of breast cancer. The immunobiologies of recipient mice and the characteristics of several tumorigenic cell lines. Breast Cancer Res Treat 1996; 39: 69-86]. Alături de soarecii nud, șoarecii cu imunodeficiență severă combinată - severe combinated immunodeficiency (SCID) sunt frecvent utilizați în modele xenograft. Acești soareci au un deficit în numărul și funcția limfocitelor T și B [Bankert RB, Egilmez NK, Hess SD. Human-SCID mouse chimeric models for the evaluation of anti-cancer therapies. Trends Immunol 2001; 22: 386–393].

Xenogrefele umane implantate subcutanat la soareci sunt utilizate preponderent în evaluarea terapiilor antineoplazice. Formarea rapidă a tumorilor, efortul minim necesar, costurile relativ scăzute și capacitatea de a măsura noninvaziv tumorile sunt principalele avantaje ale implantării ectopice, subcutanate [Heijstek MW, Kranenburg O, Borel Rinkes IH. Mouse models of colorectal cancer and liver metastases. Dig Surg 2005; 22: 16–25]. Multe grupuri de cercetare au descris importanța micromediului asupra comportamentul biologic al celulelor maligne [Harry HX Xia, Mouse models in liver cancer research: A review of current literature. World J Gastroenterol. 2008; 14(45): 6915–6923]. Multe linii de celule tumorale nu metastazează spontan atunci când acestea sunt implantate subcutanat, însă metastazează atunci când sunt implantate ortotopic. Prin urmare, interacțiunea dintre factori specifici (cum ar fi fibroblastele, celule endoteliale și celule inflamatorii) și celulele tumorale este importantă pentru dezvoltarea tumorilor [Jonkers J, Berns A. Conditional mouse models of sporadic cancer. Nat Rev Cancer 2002; 2: 251–265].

Aceste modele de implantare imită tumorile umane într-o modalitate mai bună în ceea ce privește morfologia tumorii, micromediul, potențialul metastatic și răspunsul la agenți

anticanceroși. În plus, procesele implicate în invazia locală, cum ar fi angiogeneza, pot fi examinate în micromediul lor normal [Troiani T, Schettino C, Martinelli E, Morgillo F, Tortora G, Ciardiello F. The use of xenograft models for the selection of cancer treatments with the EGFR as an example. Crit Rev Oncol Hematol 2008; 65: 200-211].

Obținerea de tumori prin implantul la rozătoare – considerente generale Dimensiuni maxime

Dimensiunile maxime admise pentru masa tumorală sunt de 2 cm diametru, atunci când tumorile sunt localizate dorsal sau pe flanc, șoarecele nesuferind de alte afecțiuni. Volumul maxim admis pentru o singură tumoră este de 0,8 cm3. În cazul obținerii de tumori multiple, volumul maxim admis este de 1,2 cm3. Ulcerațiile și necroza tegumentară Se urmărește existența ulcerațiilor sau necrozei centrale, cât și abrazivitatea tegumentară supraiacentă, iar în cazul tumorilor multiple la același animal, acestea sunt comparate între ele. Ulcerarea nu necesită eutanasiere imediată, însă poate necesita monitorizare atentă. Conduita trebuie obligatoriu stabilită de către un veterinar. O ulcerație de mici dimensiuni (sub 0,2 mm) în locul de injectare trebuie monitorizată de cel puțin 3 ori pe săptămână. Ulcerarea a 25% din aria tumorii trebuie eventual tratată de către veterinar. Ulcerațiile de peste 25% din suprafața tumorală necesită eutanasierea animalului. Ascita Atunci când tumorile conduc la dezvoltarea de ascită, aceștia trebuie cântăriți înainte de inocularea masei tumorale, greutatea fiind monitorizată ulterior la intervale regulate. Atunci când greutatea crește cu peste 120%, se impune eutanasierea. Se poate drena lichidul de ascită pentru a evita disconfortul animalului. Locul de implantare Tumorile trebuie plasate în locuri care să nu interfere cu funcțiile normale ale animalului (locomoția, alimentația, defecația/urinarea). Se consideră că flancul posterior este de preferat. Se evită implantarea intramusculară, deoarece orice distensie poate fi însoțită de disconfort. Nu se pot folosi mai mult de patru situsuri diferite pentru implantare. Monitorizarea post-implantare Înainte ca tumora să devină vizibilă, șoarecii trebuie monitorizați de cel puțin trei ori pe săptămână. După ce un nodul tumoral devine palpabil (5–7,5 mm diametru), monitorizarea trebuie efectuată zilnic. Se poate monitoriza chiar și de două ori pe zi, atunci când creșterea tumorală poate impune eutanasierea de urgență. Variabilele care trebuie urmărite la șoarecele implantat

Starea generală, inclusiv închiderea involuntară a ochilor Scăderea consumului de apă/hrană Deshidratarea Scăderea în greutate sau a scorului BC Depresia, manifestată prin agresivitate anormală sau comportament deosebit Dificultate în respirație Semne neurologice sau deformări ale craniului Poziție cocoșată sau modificarea aspectului blănii Patologie cutanată Mobilitate redusă Modificarea aspectului fecalelor/urinii Agresivitate mult crescută Secreții oculare/nazale.

  Scorul de condiție corporală (scorul BC)   Condiția fizică a animalului este factorul decisiv în stabilirea gradului de progresie a tumorii. Scorul BC este util în stabilirea condiției de sănătate a animalului. Este de obicei folosită scorificarea pornind de la valoarea “1” (emaciat) până la “5” (obez) (Figura 2). Șoarecii trebuie eutanasiați dacă: - Scorul atinge valoarea 1/5 - Scorul este 2/5 și este în scădere activitatea și responsivita-tea - Tumora afectează postura rozătorului, independent de di-mensiunea tumorii - Veterinarul concluzionează că este etic să fie eutanasiat ani-malul. Figura 2: Scorul de condiție corporală Protocol pentru obținerea de xenogrefe la șoareci de laborator Recoltarea celulelor de la subiecții umani 1. Fragmentele de tumoră sunt recoltate din masele tumorale obținute de la subiecții supuși intervențiilor chirurgicale cu tentă curativă, în urma semnării formularelor de consimțământ informat, conform protocolului aprobat în prealabil de comisiile de etică. 1.a – Se notează informații referitoare la pacient – nr. foii de observație, vârstă, sex, data rezecării, caracteristicile tumorale, eventualele investigații prealabile. 2. Recoltarea fragmentelor se face în recipiente conice de 50 ml. 3. Se dezintegrează și se omogenizează conținutul celular cu un bisturiu, într-un vas Petri. 4. Se adaugă ser și se centrifughează la 900–1000 rpm, 3 minute, la temperatura camerei. 4.a – Se asigură mediul aseptic pentru procedurile următoare. 5. Se extrag aproximativ 100 microlitri cu o seringă de 1 ml fără ac, care este apoi închisă cu un ac de calibrul 16. 6. Se depozitează seringa pe o tavă cu gheață. 7. Se folosește gel pentru fiecare injectare (aproximativ 100 microlitri per seringă). Prepararea celulelor tumorale 1. Cresterea celulelor în mediu complet și excluderea oricărui contaminant 2. Atunci când celulele sunt 70-80% confluente, cu 3–4 ore înainte de recoltare, se înlocuiește mediul cu mediu proaspăt pentru a elimina celulele moarte și detașate. 3. Se scoate mediul și se spală celulele cu PBS. Se adaugă o cantitate minimă de tripsină-EDTA. Se dispersează celulele și se adăugă mediu complet (10:01 – 5:01). Se centrifughează imediat la 1500 rpm pentru 2–5 minute și se spală de două ori cu PBS. 4. Se numără celulele folosind un hemocitometru. Utilizarea colorației albastru trypan exclude celulele moarte. 5. Mixarea 1:1 a celulelor cu soluția albastru Trypan (Trypan Albastru: diluție la 0,8 mm în PBS se păstrează la temperatura camerei, este stabil timp de 1 luna). Celulele viabile exclud albastrul Trypan, în timp ce celulele moarte se colorează în albastru. 6. Celulele trebuie să fie suspendate în volum, astfel încât 300 μl să conțină numărul necesar de celule pentru injectare. De obicei, 3,0 x 106 celule sunt necesare pentru fiecare injectare.

Pregătirea șoarecilor 1. Șoarecii trebuie să fie la vârsta de 4–5 săptămâni 2. Aclimatizare dureaza 3–5 zile după sosirea șoarecilor. 3. Șoarecii sunt anesteziați pentru injectarea ulterioară. 4. Se folosește soluție iodată pentru sterilizarea zonei de injectare. Prepararea injectării celulelor 1. Curățați și sterilizați zona de inocularea cu o soluție de etanol și / sau iod. 2. Utilizați o seringă de 1 cc și un ac de calibrul 27 sau 30. 3. Se amestecă celulele și se extrag într-o seringă fără ac. Folosind unui ac provoacă o presiune negativă puternică, , care poate provoca deteriorarea celulelor și liza acestora. 4. Se injectează celulele (3,0 x 106) subcutanat în flancul inferior al soarecilor. 5. Tratamentul poate fi început după 1–3 săptămâni, atunci când tumorile au ajuns la un volum mediu de ~ 50–60 mm3. 6. Diametrele tumorale sunt măsurate cu etriere digitale, iar volumul tumorii in mm3 este calculat prin formula: Volum = (lățime)2 x lungime / 2. Izolarea liniilor celulare tumorale 1. Se eutanasiază șoarecele. 2. Se spală pielea cu o soluție de alcool etilic. 3. Se îndepărtează tumora și se depozitează într-o soluție de 5ml PBS conținând fungicide și antiseptice. 4. Se clătește în această soluție. 5. Se îndepărtează tumora din PBS și se plasează pe o palcă sterilă. 6. Se îndepărtează țesutul cutanat și se clătește a doua oară dacă este necesar. 7. Se fragmentează fin cu un bisturiu. 8. Se transferă pe mediu steril. 9. Se centrifughează la 800 rpm. 10. Se îndepărtează mediul, rămânând aproximativ 300 microlitri 11. Se adaugă 2 ml de soluție tripsină 0,25% și se amestecă 5 minute 12. Se centrifughează la 800 rpm. 13. Se suspendă în soluție DMEM/F12 cu 10% FCS. 14. Se centrifughează la 800 rpm pentru 5 minute. 15. Se resuspendă în mediu H14 steril 16. Se expune pe placă acoperită de vitrogen. 17. Mediul se schimbă a doua zi și se urmărește atent orice semn de contaminare. Activitate I.2. Definitia si protocolul modelului experimental porcin

Animalele sunt plasate în adăposturi speciale din cadrul Biobazei UMF Craiova, cu 2

zile înaintea interventiei în vederea acomodării, sub supraveghere medico-veterinară, bene-ficiind de apă ad libitum şi o dietă alcătuită din cereale măcinate, şrot de soia şi floarea-soarelui, spaţiu de mişcare adecvat, ciclu lumină-întuneric 12/12h, ventilaţie şi temperatură constantă. Verificarea stării de sănătate a animalelor, înregistrarea greutăţii şi realizarea deparazitării sunt asigurate în prealabil în Laboratorul de Analiză din cadrul Direcţiei Sanitar-Veterinare a Judeţului Dolj. După instalarea în adăposturi, animalele sunt inspectate zilnic de către personalul veterinar al Biobazei UMF. Toate procedurile anestezico-chirurgicale, îngrijirile perioperatorii şi protocolul de necropsie respecta legile naţionale si legislatia EU, de asemenea protocolul de lucru este expus şi aprobat de către Comisia de Etică din cadrul Universităţii de Medicină şi Farmacie Craiova.

Ablatia cu radiofrecventa cuprinde următoarele etape de lucru: 1. Pregătirea preoperatorie; 2. Anestezie generală cu intubaţie oro-traheală; 3. Pregătirea peretelui abdominal prin badijonare cu sol. Betadine®; 4. Ablatia cu radiofrecventa si ablatia combinata 5. Monitorizarea complicatiilor 6. Evaluarea ariei de ablatie prin ecografie cu contrast 7. Euthanasia şi necropsia.

A. Pregătirea pentru ablatie Pregătirea pentru ablatie prevede sistarea aportului de solide şi lichide cu 3 ore anterior

interventiei, alături de toaleta cu soluţie Polyiodine a peretelui abdominal. B. Interventia se desfasoara sub anestezie generală cu intubaţie oro-traheală(Figura 1) Premedicaţia presupune injectare intramusculară la nivelul coapsei membrului

posterior de Ketamină 20 mg/kgc, Xylazynă 2 mg/kgc şi Atropină 0.015 mg/kgc. Pentru inducţie se monteaza un cateter venos periferic 18G sau 20G (WellcathPlus™,

Wellmed, Noida, India) la nivelul venei marginale a urechii (vena auricularis caudalis) cu administrarea de Propofol 3-5 mg/kgc. Intubaţia endotraheală se efectueaza cu sondă endotraheală cu lumen simplu, de 7 mm (MedicalExpand, La Talaudiere, Franţa), cu animalul poziţionat în decubit ventral, ulterior animalul fiind repoziţionat în decubit lateral pentru intervenţia propriu-zisă (Figura 3).

Figura 3: Pregătirea anestezică a animalelor de experienţă: decubit dorsal, anestezie generală cu intubaţie oro-traheală.

Menţinerea anesteziei se realizeaza prin administrarea de Propofol – 0,5 mg/kgc/h în

perfuzie continuă, în bolus la fiecare 45 de minute Fentanyl – 3 μg/kgc, şi Pavulone® (Pancuronium Bromide, Schering-Plough) – 0,1 mg/kgc, animalul fiind perfuzat cu ser fiziologic – 5 ml/kgc/h.

Pe toată durata intervenţiei suportul funcţiilor vitale se realizeaza sub monitorizare electrocardiografică şi a SpO2 - senzorul fiind plasat la nivelul pavilionului urechii, cu ventilaţie controlată în presiune, la o frecvenţă de 22 resp./minut, cu FiO2 de 50% şi VT la valori de 7ml/kgc. După intubaţia orotraheală suinele sunt ţinute pe un circuit semiînchis de inhalare a 1% până la 3% isoflurane. La finalul pregătirii anestezice animalele sunt repoziţionate şi imobilizate în decubit lateral în vederea ablatiei cu radiofrecventa.

C. Ablatia cu radiofrecventa Se realizeaza toaleta cu soluţie Polyiodine la nivelul hipocondrului drept si epigrastrului. Sub ghidaj ecografic (Aloka SSD 5500; Aloka, Tokyo, Japan) se alege locul unde se va realiza ablatia. Acesta trebuie sa fie la distanta de capsula hepatica, vase mari sau colecist. Ablatia cu radiofrecventa se realizeaza cu un generator de radiofrecvenţă model 1500X (Angiodynamics, USA) si dispozitiv de ablatie cu diametru 14 gauge (Starburst Xli Enhanced; Angiodynamics, USA ) cu lungime de 12 cm. Dispozitivul prezinta 9 electrozi activi ce se deschid ca o umbrela, realizand o arie de ablatie cuprinsa intre 4 si 7 cm, in functie de deschiderea umbrelei. Ablatia combinata (radiofrecventa si nanoparticule) se va realiza conform instructiunilor partenerilor ce vor realiza dispozitivul de ablatie combinat si nanoparticulele. Pentru ablatia la nivelul pancreasului, abordul va fi ecoendoscopic iar dispozitivul folosit va fi un cateter EUS-RFA 1Fr - 0.33mm, lungime de lucru 180 cm. Imediat dupa ablatie se efectueaza ecografie standard pentru evaluarea ariei de ablatie si a complicatiilor imediate. Dupa 12 - 24 de ore se realizeaza ecografie standard si cu contrast pentru evaluarea dimensiunii ariei de ablatie. O doza de 2,4 ml de substanta de contrast (Sonovue - Bracco, Milan, Italy) se injecteaza pe o vena periferica in bolus, urmata de injectarea a 5 ml ser fiziologic. Se inregistreaza examinarea in totalitate, pana la 5 minute de la injectare. Se evalueaza incarcarea cu contrast a ariei de ablatie atat vizual cat si cantitativ. O alta evaluare prin ecografie cu substanta de contrast va avea loc la doua saptamini de la ablatie. Dupa doua saptamini de la ablatie suinul este eutanasiat cu pentobarbital sodic administrat intravenos (200mg/kgc, în bolus). Se efectueaza necropsia si exemenul histopatologic si imunohistochimic al leziunilor hepatice si pancreatice. Se compara dimensiunile ariei de ablatie in ecografia cu contrast cu cele masurate pe piesa de necropsie. Pentru indeplinirea obiectivelor proiectului, UMF Craiova a achizitionat generatorul de radiofrecventa model 1500X precum si dispozitive de ablatie pentru abord transcutan si ecoendoscopic. Activitate I.3. Protocolul de explante chirurgicale tisulare

1. Definirea criteriilor de includere

1.1. Dimensiunea lotului de studiu: se vor include 10-15 pacienti cu HCC in stadiile 0 si/sau A conform clasificarii BCLC;

1.2. Pacienti de ambe sexe, cu varste cuprinse intre 18 si 80 ani; 1.3. Etiologia hepatopatiei de baza: VHC, VHB (±VHD), alcool 1.4. Pacientii trebuie sa indeplineasca conditiile pentru rezectie chirurgicala cu tenta

curativa: 1.4.1. nodul unic ≤ 5 cm sau maxim 3 noduli, fiecare ≤ 3 cm; 1.4.2. localizarea limitata la un singur lob hepatic 1.4.3. rezerva functionala hepatica suficienta: clasa Child-Pugh preoperator: A sau B

(7puncte); - se va urmari, pe cat posibil, includerea unui sublot de pacienti cu HCC in

absenta cirozei, pentru a evalua daca starea parenchimului netumoral influenteaza eficienta tratamentului cu RFA sau MNP (se va incerca pastrarea unui raport 1:2 intre pacientii cu HCC fara ciroza si, respectiv, cei cu ciroza). 1.4.4. patenta vaselor hepatice (artera hepatica, vene hepatice) si a venei porte si a

ramurilor segmentare intrahepatice; 1.4.5. absenta unei contraindicatii operatorii sau anestezice sau a unei comorbiditati

majore cardiace sau respiratorii; 1.5. Semnarea unui consimtamant informat, aprobat in prealabil de catre Comisia de Etica

a UMF Cluj-Napoca;

2. Se vor exclude pacientii

2.1. care nu au semnat consimtamantul informat 2.2. cu varse <18 si > 80 ani 2.3. cu HCC care depaseste stadiul A BCLC si criteriile Milano pt rezectia cu tenta

curativa 2.4. cu alte neoplazii, cu sau fara determinari secundare hepatice 2.5. cu ciroza hepatica clasa Child Pugh B(≥8) sau C 2.6. cu tromboza venei portte sau a ramurilor intrahepatice, tromboza venelor hepatice,

tromboza, stenoza sau ocluzia arterei hepatice; 3. Protocolul de evaluare preoperatorie a pacientilor, care va cuprinde:

3.1. evaluare clinica: inaltime, greutate, TAM, FC, aprecierea encefalopatiei hepatice in conformitate cu criteriile West Haven), aprecierea IP, istoricul de tratamente antivirale, de scadere a HTP sau hipolipemiant, istoricul de decompensari clinice (episoade de hemoragie variceala, ascita, sepsa, insuficienta renala); antecedentele de HCC si terapii ablative anterioare – aprecierea eventualei recurente sau recidive;

3.2. evaluare biologica si functionala: hemoleucogama completa, coagulograma, AST, ALT, Bil-T, Bil-D, GGT, FA, Alb, PCR, Na, K, BUN, Cr, TG, Col, HDL-Col si AFP; Se va calcula scorul Child-Pugh si MELD.

3.3. evaluare imagistica prin: 3.3.1. ecografie abdominala:

aprecierea in modul B a: dimensiunilor lobilor hepatici, splinei, a formatiunii tumorale (3 diametre), a diametrelor venelor sistemului port, prezentei si cantitatii ascitei.

studiul color si power Doppler ai parametrilor hemodinamici globali (vena porta, artera hepatica, artera splenica) si de la nivelul formatiunii/lor tumorale.

CEUS – cu cuantificarea pe cubele TIC a intensitatii maxime, a timpului de umplere, a curbei de spalare.

3.3.2. imagistica sectionala cu substanta de contrast (CT sau IRM – in cazul din urma se va prefera examinarea cu dublu contrast, vascular si hepatocitar specifica).

3.4. evaluare endoscopica pentru aprecierea prezentei si a gradului varicelor esofagiene (0, 1, 2 sau 3).

3.5. evaluare hemodinamica: masurarea gradientului de presiune porto-hepatic pentru aprecierea gradului HTP.

3.6. evaluarea morfologica a nodulului de HCC – recoltare de fragmnent tisular prin punctie biopsie ecoghidata. Din punct de vedere histopatologic se vor efectua coloratii normale (hematoxilina-eozina) si imunohistochimice, in urma carora se va aprecia: gradul de diferentiere a HCC, gradul infiltrarii grase (steatozei intratumorale), invazia microvasculara, invazia stromala, atipiile celualre, numarul mitozelor, expresia functionala a HCC in ceea ce priveste activitatea CK7, CK19, VEGF/VEGF-R, CD34, Glypican3, HSP70. Se va face de asemenea si o evaluare a tesutului hepatic peritumoral.

4. Protocolul operator va consta in: 4.1. inspectia si palparea ficatului; 4.2. efectuarea ecografiei intraoperatorii a ficatului in vederea identificarii unor posibili

noduli de HCC care ar fi putut scapa evaluarii imagistice preoperatorii; in masura posibilitatii, se va efectua CE-IOUS.

4.3. efectuarea hemihepatectomiei – dreapta sau stanga, functie de localizarea nodulului de HCC; Se va urmari interesul pacientului, si efectuarea anastomozelor vasculare in sensul functionarii ficatului restant. In acelasi timp, se va urmari pastrarea unor pediculi vasculari indeajuns de lungi la nivelul explantului hepatic pentru a se permite realizarea modelului experimental.

4.4. prelevarea explantului hepatic continand HCC in urmatoarele conditii: 4.4.1. se cateterizeaza fiecare pedicul vascular al explantului si se infuzeaza o

cantitate totala de 1400 UI Heparina / kgc astfel: (i) 200 UI Heparina / kgc prin pediculul arterial; (ii) 500 UI / kgc prin pediculul portal si (iii) 700 UI/kgc prin pediculul venos;

4.4.2. explantul se cantareste, ai apoi se plaseaza intr-o punga de plastic sterila continand solutie Custodiol HTK ® (folosita in mod uzual pentru prezervarea organelor in vederea transplantarii) prevazuta cu sigiliu autoadeziv;

4.4.3. plasarea acesteia intr-un alt container steril - continand de asemenea solutie Custodiol ® pentru a evita orice contact cu aerul, si inchiderea ermetica a acestuia;

4.4.4. Fragmentul de ficat plasat in cele doua containere se plaseaza intr-un recipient de transport plin cu gheata si se transporta de la sala de operatie la laboratorul unde vor avea loc experimentele.

5. Realizarea modelului experimental presupune: 5.1. extragerea explantului din containerele de transport si plasarea intr-o baie de plastic

continand ser Ringer (solutie cristaloida cu o compozitie apropiata a plasmei) cu temperatura constanta de 5,5oC.

5.2. realizarea sistemului de perfuzie a ficatului izolat dupa cum este ilustrat in figura urmatoare, unde literele reprezinta: A: rezervorul principal, dotat si cu un filtru unidirectional – continand 1 l solutie Custodiol; B: pompa rotativa bidirectionala; C: „capcana” de bule de aer cuplata cu un infuzor pentru solutia functionalizata (50 ml Custodiol + 50 ml Solutie continand MNP). Rata infuziei programata este de 5 ml/min; D: Manometru; E: Rezervorul portal (camera de preaplin) ce contine si o „capcana” de bule de aer; F: Baia de organ umpluta cu solutia Ringer

G: Termometru; pH-metru

6. Realizarea experimentelor propriu zise, de

testare a eficientei RFA si termocoagularii induse cu MNP. 6.1. Testarea procedurilor de ablatie tumorala. Se

vor testa fiecare tehnica individual, cat si combinatia acestora.

6.1.1. Pentru RFA, acul se plaseaza in centrul nodulului sub ghidaj ecografic, iar ulterior se cupleaza la generatorul de curent alternativ (50-200 W). In functie de dimensiunea tumorii, se va mentine curentul intre 8 si 20 minute, pentru a

obtine o zona de ablatie cu un diametru cu 1 cm mai mare decat diametrul tumorii initiale.

6.1.2. Pentru termocoagularea indusa de MNP, se va plasa ficatul intr-un camp magnetic, respectandu-se indicatiile partenerilor care vor manufactura prototipul de MNP

6.1.3. Combinatia tehnicilor presupune aplicarea concomitenta atat a RFA cat si campului magnetic, in conditiile infuziei continue cu solutie continand MNP.

6.2. Controlul temperaturii este extrem de important, toate tehnicile producand necroza de coagulare. Asfel, se va urmari de la distanta temperatura atat la nivelul tumorii cat si al parenchimului adiacent folosind un termometru cu senzor rapid de otel ce se insera sub ghidaj ecografic la nivelul tisular dorit.

6.3. Evaluarea eficientei ablatiei tumorale se va face prin examen histopatologic. Se va realiza disectia explantului hepatic si extractia de fragmente tisulare de la nivel tumoral, din zona de ablatie non-tumorala si din tesutul hepatic nontumoral. Dupa prelevare si stocare in atmosfera de azot lichid, piesele se ocriotmizeaza si se monteaza in parafina, iar ulterior sectiunile urmand a fi colorate cu hematoxilina si eozina. Se vor urmari:

6.3.1. modificari ale arhitecturii celulare: ratatinare, hipereozinofilie si/sau vacuolizare citoplasmatica;

6.3.2. modificari nucleare: nucleomegalie, multinucleatie, hipercromazie, modificari simplastice, sau nuclei picnotici sau fragmetari nucleare, prezenta de corpi apoptotici;

6.3.3. necroza de coagulare 6.3.4. modificarile de la nivelul matricii extracelulare 6.3.5. colorare imunoshistochimica pentru evidentierea proteinelor de soc termic

(HSP 27 si 70) – examinare sub imunofluorescenta NOTA: Toate secventele din protocol care implica MNP ce urmeaza a fi dezvoltate in cadrul proiectului pot suferi modificari in functie de progesul dezvoltarii compusilor si de functionalizarea acestora. Bibliografie:

1. Mocan L, Tabaran FA, Mocan T, et al. selective ex-vivo photothermal ablation of human pancreatic cancer with albumin functionalized multiwalled carbon nanotubes. Int J Nanomed 2011; 6:915–928

2. J.G. Abraldes, Rodriguez-Vilarupa A, Graupera M, et al. Simvastatin treatment improves liver sinusoidal endothelial dysfunction in CCl4 cirrhotic rats. Journal of Hepatology 2007; 46:1040–1046

3. Arefiev A, Prat F, Chapelon JY, Tavakkoli J, Cathignol D. Ultrasound-induced tissue ablation: studies on isolated, perfused porcine liver. Ultrasound Med Biol 1998; 24(7):1033-1043

4. Iancu C, Mocan L, Bele C, et al. enhanced laser thermal ablation for the in vitro treatment of liver cancer by specific delivery of multiwalled carbon nanotubes functionalized with human serum albumin. Int J Nanomed 2011; 6:129-141

5. Bilchik AJ, Wood TE, Allegra DP. Radiofrequency Ablation of Unresectable Hepatic Malignancies: Lessons Learned. Oncologist 2001; 6(1):24-33

6. Roncalli M, Park YN, Di Tomaso L. Histopathological classification of hepatocellular carcinoma. Digestive and Liver Disease 2010; 42S: S228–S234

Activitate I.4. Raport de sinteză a conjugatilor magnetita-NH2 si magnetita-COOH Nanoparticulele de magnetita sunt utilizate foarte mult in ultimele decenii in realizarea

de modele experimentale pentru aplicatii in biomedicina ca sisteme transportoare de medicamentei, rezonanta magnetica nuclearaii si hipertermieiii datorita proprietatilor importante care le au (dimensiuni nanometrice, biocompatibilitate, superparamagnetism)iv. Scopul proiectului este de a utiliza particulele de magnetita ca model pentru imbunatatirea procedurilor de ablatie termica din ficat si tumori pancreatice, prin utilizarea ablatiei prin radio-frecventa, precum si pentru a dezvolta metode pentru eliberare de medicamente antitumorale la tinta si inducerea de hipertermie tumorii. Medicamentele propuse pentru incapsulare vor fi incarcate la suprafata particulelor de magnetita, iar prin dirijarea in camp magnetic are loc eliberarea lor la tesuturi tinta. Aceasta metoda se ramarca prin reducerea toxicitatatii datorita administrarii de cantitati mai mici de medicament, crescandu-se eficienta tratamentuluiv. 1. Raportul de sinteza a conjugatilor magnetita-NH2 1.1. Metoda prin co-precipitare (Conjugat I)

O propunere de sinteza a conjugatilor magnetita-NH2 o constituie obtinerea particulelor de magnetita prin co-precipitare in absenta stabilizatorului urmata de acoperirea particulelor de magnetita cu stabilizator biocompatibil pentru utilizarea ulterioara a conjugatilor in aplicatiile biomedicale.

Protocol pentru obtinerea de particule de magnetita Peste o solutie 1M de FeCl3·6H2O si 2M de FeCl2·4H2O 2M in HCl 2M, se adauga o

solutie de NH4OH (0.7 M) pana la atingerea unui pH cuprins intre 9 si 11 sub agitare puternica si atmosfera inerta la temperatura camerei. Dupa atingerea pH-ului bazic are loc formarea magnetitei cu aparitia unui precipitat de culoare neagra.

Protocol pentru obtinerea de conjugati magnetita-NH2 Particulele de magnetita obtinute se disperseaza intr-o solutie de dicloretan (15% w/w)

cu surfactant (de ex. 3-aminopropiltrietoxisilan - 80% w/w). Amestecul de reactie este mentinut sub agitare energica si atmosfera inerta la temperatura de 81 (temperatura de reflux a dicloretanului), timp de 24 h in prezenta de di-laurat de dibutil-staniu (catalizator) pentru formarea legaturilor Si-O-Fe, prin condensarea gruparilor hidroxilice de pe suprafata particulelor de magnetita (Fe-OH) si gruparile etoxisililice din structura monomerului. Monomerul nereactionat si solventul se indeparteaza prin distilare la vid, utilizand un evaporator rotativ. Particulele magnetice se purifica pentru separarea oligomerilor siloxanici rezultati in timpul reactiei si pentru indepartarea catalizatorului de condensare si apoi uscate la vid moderat la temperatura de 35 timp de 24h.

Scheme 1. Reprezentarea particulelor de magnetita cu grupari amino pe suprafata

1.2. Metoda prin interschimbarea invelisului hidrofob de acid oleic cu invelis hidrofil silanic (Conjugat II)

Scheme 2. Schema de principiu pentru obtinerea de particule cu grupari amino pe suprafata in

doua etape

Aceasta metoda propusa are loc in doua etape: (i) obtinerea de particule hidrofobe prin mojarare; (ii) schimbarea caracterului hidrofob intr-unul hidrofil al suprafetei particulelor de magnetita prin interactiuni covalente.

(i) Mojararea este o reactie care are loc la temperatura camerei, intr-o camera izolata sub atmosfera de argon, intr-un mojar cu pistil in care sunt adaugate pe rand clorurile de fier hidratate (FeCl3X6H2O si FeCl2X4H2O) si surfactantul acid oleic-oleilamina (raport molar 1:1). Amestecul de reactie se mojarareaza 10 min dupa care se adauga NaOH in stare solida (pelete mojarate) si se continua mojararea timp de 30 min, timp in care are loc formarea unei paste de culoare neagra, aceasta fiind un indiciu pentru prezenta magnetitei in sistem. Produsul de reactie este purificat pana la indepartarea totala a precipitatului de NaCl format in timpul reactiei. 2. Raportul de sinteza a conjugatilor magnetita-COOH (Conjugat III)

Scheme 3. Obtinerea particulelor hidrofile cu grupari carboxilice pe suprafata

Protocol pentru obtinerea de conjugati magnetita-COOH (Conjugat III) Particulele de magnetita se obtin prin reactia de co-precipitare a sarurilor de fier (FeCl3X6H2O si FeCl2X4H2O) in prezenta de solutie amoniacala. Stabilizarea particulelor se realizeaza la temperatura de 90°C in conditii de reflux, in atmosfera inerta, in prezenta acidului citric, sub o agitare energica timp de 30 min. Produsul este purificat prin spalari succesive si centrifugari pentru indepartarea excesului de surfactant. Diseminare

Trei participari la conferinta internationala BiomMedD'2012 1. A. Fifere, N. L. Marangoci, A. Durdureanu-Angheluta, M.Pinteala, Theoretical study of the inclusion complexes of propiconazole with β-cyclodextrin based on AM1 and PM3 methods, BiomMedD'2012, 29 August – 1 Septembrie, 2012, Contanta, Romania

2. N. L. Marangoci, A. Durdureanu-Angheluta, R. Ardeleanu, F. Doroftei, A. Fifere, M. Pinteala, Polysiloxane ionic liquids as good solvents for β-cyclodextrin-polydimethylsiloxane polyrotaxane structure, BiomMedD'2012, 29 August – 1 Septembrie, 2012, Contanta, Romania 3. A. Durdureanu-Angheluta, N. L. Marangoci, F. Doroftei, A. Fifere, M. Pinteala, Surface modification of magnetite particles observed by electronic microscopy, BiomMedD'2012, 29 August – 1 Septembrie, 2012, Contanta, Romania 1 Participare la un training organizat de Institutul de Biologie si Patologie Celulara "N. Simionescu", in cadrul SCOLII DE STUDII AVANSATE “Nicolae Simionescu”: Noi abordari de biologie celulara si moleculara pentru progresul cercetarii biomedicale in perioada 9-11 noiembrie in Brasov (Dr. Adrian Fifere). i Jain TK, Morales MA, Sahoo SK, Leslie-Pelecky DL, Labhasetwar V. Iron oxide nanoparticles for sustained delivery of anticancer agents. Mol Pharm 2005;2:194–205. ii Zhao M, Kircher MF, Josephson L, Weissledre R. Differential conjugation of tat peptide to superparamagnetic nanoparticles and its effect on cellular uptake. Bioconjugate Chem 2002;13:840–4. iii Hilger I, Fruhauf K, AbdraW, Hiergeist R, Hergt R, KaiserWA. Heating potential of iron oxides for therapeutic purposes in interventional radiology. Acad Radiol 2002;9:198–202. iv De Palma R, Trekker J, Peeters S, Van Bael MJ, Bonroy K, Wirix-Speetjens R, et al. Surface modification of gamma-Fe2O3@SiO2 magnetic nanoparticles for the controlled interaction with biomolecules. J Nanosci Nanotechnol 2007;7:4626–41. v Fahima Dilnawaz, Abhalaxmi Singh, Chandana Mohanty, Sanjeeb K. Sahoo, Dual drug loaded superparamagnetic iron oxide nanoparticles for targeted cancer therapy, Biomaterials 31 (2010) 3694–3706

Activitate I.5: Design al testerului de nano-ablatie I.5.1. Introducere. Nano-ablatia la frecvente joase si campuri ridicate Procedura de nano-ablatie implica injectarea nanoparticulelor magnetice, functionalizate sau nu, in regiunea tesutului malign si aplicarea ulterioara a unui camp magnetic alternativ in vederea degajarii unei anumite cantitati de caldura in aceasta regiune. Exista doua efecte care concura la acumularea nanoparticulelor magnetice in zonele afectate de tumori maligne: - permeabilitatea crescuta la corpuri straine a vasculaturii tesuturilor maligne, asa-numitul efect EPR (enhanced permeability and retention) [1]; - functionalizarea nanoparticulelor cu antigeni care sa le ataseze tesuturilor maligne (imunomicele de tip polyetilen-glicol-fosfatidilethanolamina [2]). In continuare, vom considera ca aceasta problema spinoasa a dirijarii nanoparticulelor spre tesuturile maligne este rezolvata si ne vom concentra asupra proceselor de hipertermie propriu-zisa. Scopul acestui prim capitol este analiza timpilor de relaxare implicati in hipertermia magnetica si investigarea posibilitatii de a se obtine efect de hipertermie la frecventa scazuta (pe cat posibil, 50 Hz), ceea ce ar conduce la o simplificare considerabila a dispozitivelor pentru generarea campului magnetic alernativ (acestea putand fi alimentate direct de la reteaua electrica domestica). Campul magnetic alternativ aplicat este sinusoidal cu frecventa f: H(t) = Hac sin(2�f t) si este evident pentru oricine ca puterea degajata este proportionala cu <B(t)H(t)>, sau mai precis cu produsul f x Hac

2 x��, unde � este susceptibilitatea magnetica a nanoparticulei. In acelasi timp, studii clinice au pus in evidenta o valoare maxima a produsului f x Hac tolerata bine de posibilii pacienti: f x Hac < 4.85 x 108 Am-1s-1 [3]. In general, se aplica un camp magnetic alternativ de frecvente de ordinul sutelor de kHz, pana la 1 MHz (105-106 Hz), asadar exista o limitare in intensitatea campului magnetic aplicat de ordinul a 5 x 102 - 5 x 102 Am-1s-1. Pe de alta parte, se poate arata ca puterea absorbita de o nanoparticula raportata la produsul (f x Hac) este data de [4]:

2

00 )π2(1

)π2(π

f

fH

fH

Pac

ac (1)

unde �0 este partea imaginara a susceptibilitatii pe unitate de volum, iar � un timp caracteristic de relaxare magnetic al nanoparticulelor. Exista doua efecte care concura atunci cand se inverseaza directia campului magnetic [5]: a) relaxarea de tip Néel, specifica fenomenului de superparamagnetism. Aceasta este data de un timp specific de relaxare �N, exprimat de:

Tk

KVm

B0N exp (2)

b) relaxarea Browniana, legata de rotatia nanoparticulei ca un intreg in campul magnetic aplicat. Aceasta este data de timpul de relaxare �B:

Tk

VH

BB

3 (3)

In ecuatiile dinainte, kB este constanta lui Boltzmann, T este temperatura absoluta, Vm este volumul magnetic, iar VH este volumul hidrodinamic al nanoparticulei, � este viscozitatea, K este constanta de anizotropie de volum, iar �0 este timpul specific legat de frecventa incercarilor de inversie a magnetizarii, luat prin conventie ca 10-9 s. Pentru cele mai multe cazuri de interes, kBT ≈ 25 meV la temperaturi ambiante, K este de ordinul 104 J/m3 ≈ 6.25 x 10-5 eV/nm3. Pentru nanoparticule cu dimensiuni specifice de ordinul a 10-20 nm, timpul de relaxare Néel variaza intre 1.22 x 10-8 s si 0.49 s, iar pentru nanoparticule mai mari relaxarea Néel practic nu mai are loc. In acelasi timp, timpul de relaxare Boltzmann, pentru o viscozitate de 1 mPa·s si un volum similar este de ordinul a 2.5 - 5 x 10-7 s. Timpul cel mai scurt dintre �N si �B guverneaza procesul global de relaxare si intervine in ecuatia (1), deoarece:

BN

111

(4)

In realitate, se poate vedea usor ca ecuatia (1) prezinta un maxim pentru frecventa fmax = (2��)-1. Acest lucru face ca in marea majoritate a aplicatiilor de hipertermie sa se recurga la valori scazute ale campului aplicat si frecvente ridicate (105- 106 Hz). Frecventele nu pot fi mai ridicate de 1 MHz, din cauza posibilitatii de a se incalzi si restul tesuturilor prin alte fenomene de inalta frecventa (incalzirea dielectrica, binecunoscuta utilizatorilor de cuptoare de microunde). Dintre cei doi timpi de relaxare mentionati anterior, timpul de relaxare Néel are o forma si mai complicata, dependenta de intensitatea campului aplicat [4]:

2

B

2

B0

2

N

)1(exp)1()1(exp)1(11

hTk

KVhh

Tk

KVh

h mm

(5)

unde:

K

nHh aac

2π B0

(6)

� fiind momentul magnetic atomic, exprimat in magnetoni Bohr (1 �B = 9.724 x 10-24 A·m2), iar na densitatea atomilor magnetici (de ordinul a 1028-1029 m-3). Variatia timpului de relaxare Néel in functie de dimensiunea nanoparticulelor (numarul de atomi magnetici), care Na = na Vm si in functie de campul magnetic aplicat este reprezentata in Fig. 1 (calcule efectuate in cadrul actualei Etape), pentru diferite constante de anizotropie. Se observa ca se pot satisface relativ usor conditiile unor timpi de relaxare Néel ridicati, imediat ce numarul de atomi magnetici din nanoparticula depaseste 3000-4000 atomi, ceea ce revine la o dimensiune medie a nanoparticulei de ordinul a 3-4 nm.

(a)

(b)

(c)

Figura 1. Dependenta timpului de relaxare Néel de numarul de atomi magnetici ai nanoparticulei si de campul magnetic aplicat. (a) Cazul unor constante mari de anizotropie: de sus in jos K = 5 x 105, 106, 2 x 106 J/m3; (b) Dependenta de campul magnetic aplicat, pentru mai multe valori ale numarului de atomi Na, K = 5 x 104 J/m3; (c) Dependenta de numarul de atomi din nanoparticula, pentru mai multe valori ale camului magnetic aplicat, K = 5 x 104 J/m3. Ceilalti parametri folositi in simulare sunt � = 1, n = 1029 m-3, T = 300 K. In aceste conditii, timpul de relaxare browniana, legata de rotatia nanoparticulei ca un intreg va guverna procesele de relaxare. Estimarea valorii acestui timp de relaxare este inca un subiect de dezbateri actuale, deoarece diverse fenomene pot interveni care sa duca la cresterea acestui timp de relaxare. In primul rand, anizotropia formei nanoparticulei � intervine intr-o formula semiempirica de tipul [4]:

2.08.0

3

BB

Tk

VH (7)

In al doilea rand, este clar ca viscozitatea mediului biologic nu este aceeasi cu a fluidelor in care se afla suspendate nanoparticulele cand sunt testate in conditii de laborator. In plus, aceste nanoparticule pot fi fixate in tesuturi, se pot aglomera, facand rotatia lor in camp magnetic improbabila. Se demonstreaza ca atat existenta unei dispersii in functie de dimensiuni a nanoparticulelor, cat si conectarea lor la proteine sau la celule izolate conduc la obtinerea unui pic al susceptibilitatii magnetice in curent alternatic �'' in jurul a 100-200 Hz [6]. Cu alte cuvinte, frecvente scazute pot induce o hipertermie eficace.

Figura 2. Extrase din prospectul Nanoscale Biomagnetics, reprezentand principiul de functionare al incalzirii prin hipertermie, al masurarilor de temperatura si cateva rezultate obtinute, extrase din catalogul companiei [7]. Realizarea experimentala a unor dispozitive penrtu inducerea hipertermiei magnetice la frecvente scazute este inca la inceput, comunitatea concentrandu-se asupra frecventelor de ordinul sutelor de kHz, in baza ecuatiei (1) si folosind modelul cuptoarelor cu inductie. De exemplu, firma Nanoscale Biomagnetics din Zaragoza (Spania), pune la dispozitia comunitatii stiintifice un tester al efectelor hipertermice la frecvente ridicate (200-800 kHz), reprezentat in Figura 2. O observatie secundara se refera la masuratoarea de temperatura, care se realizeaza folosindu-se termocupluri si incinte de tip calorimetric stabilizat. Este clar ca un asemenea tip de masuratoare nu reproduce adecvat situatia in vivo; de asemenea, modul de preparare al probelor este destul de limitat, fiind vorba in general de suspensii de nanofluide magnetice introduse in fiole inchise.

Consideratiile anterioare ne determina sa incercam sa propunem o alta solutie, constand in folosirea unei bobine activate direct de la reteaua electrica (230 V, 50 Hz), impreuna cu o masuratoare a probei expuse la ambient folosindu-se un pirometru cu radiatii infrarosii. Folosirea frecventelor scazute are avantajul principal ca, in cazul in care se merge spre o solutie clinica, dispozitive cu cost scazut (bobine alimentate de la retea) pot fi distribuite pacientilor pentru utilizare ambulatorie. Ramanerea la solutia frecventelor ridicate ar implica realizarea tratamentului prin hipertermie numai in centre specializate, intrucat costul unui generator de frecventa ridicata si de putere este mai ridicat. Folosirea unui pirometru in infrarosu si, in viitor, a unei camere de termografie in infrarosu permite detectarea eventualelor inomogenitati spatiale ale efectului de hipertermie, ceea ce este esential pentru testele in vitro. Aceste inomogenitati pot fi corelate cu alte metode de investigare, cum ar fi microscopia fluorescenta. I.5.2. Hipertermia magnetica la frecventa retelei domestice. Proiectarea bobinei de inductie Avand in vedere onbservatiile din capitolul precedent, se poate imagina usor o strategie care sa rezulte in obtinerea unui timp de relaxare Néel de ordinul a 3 ms ≈ (2� x 50 Hz)-1. Vom considera, de asemenea, ca viscozitatea intercelulara este cel putin cu 3 ordine de marime mai ridicate decat viscozitatea unui solvent uzual (adica, este de ordinul a 1 Pa·s). Pentru nanoparticule cu dimensiunea medie de 10 nm, aplicarea ecuatiilor (3) sau (7) ne conduce la o estimare a timpului de relaxare Browniana de ordinul ms, de asemenea. Vom considera, de asemenea, rezultatele experimentale raportate in lucrarea [6], cu maximul susceptibilitatii magnetice AC la cca. 200 Hz. Vom introduce timpul de relaxare obtinut � ≈ 8 x 10-4 s in ecuatia (1) si vom admite o susceptibilitate statica de ordinul a 10 �B / Oe ≡ 105 �B / T ≡ 1.165 x 10-24 m3 pe nanoparticula (dedusa, de asemenea, din curbele prezentate in [6]). De asemenea, folosindu-se frecventa retelei f = 50 Hz implica o valoare a fractiei dependente de frecventa din ecuatia (1) de 0.2. In acelasi timp, limitarea clinica mentionata anterior, exprimata ca f x Hac < 4.85 x 108 Am-1s-1 implica faptul ca se poate merge cu intensitatea campului magnetic alternativ pana la 9.7 x 106 A/m, adica pana la 12.2 T. Pentru un camp maxim aplicat de 0H ≈ 1 T si o nanoparticula cu susceptibilitatea mentionata anterior, se poate obtine o putere de cca. 2.9 x 10-17 W. Aceasta putere poate incalzi cu un grad pe secunda un numar de 106 atomi (s-a luat in considerare teorema echipartitiei energiei pe grade de libertate). Intr-un timp de 10 000 secunde (cca. 3 ore) se pot incalzi cu T = 5 grade Celsius cca. 2 x 109 atomi, corespunzand unui volum de cca. 0.02 m3, suficient cat sa degradeze ireversibil aceasta zona celulara, daca nanoparticula a fost administrata intr-o celula. Un alt calcul echivalent spune ca pentru extirparea unei tumori de 1 cm3, numarul de nanoparticule de tipul mentionat care trebuie administrate este de ordinul 1014. Masa totala a acestor nanoparticule cu dimensiunea medie de ordinul a 10 nm va fi de ordinul a 5-10 ng. Pentru un camp maxim de 10 T, valorile anterioare trebuie modificate cu un factor 100 in ceea ce priveste puterile sau volumul incalzit, sau impartite la 100 in ceea ce priveste numarul de nanoparticule necesar. In concluzie, hipertermia magnetica la frecventa de 50 Hz pare a fi fezabila, in ciuda factorului de 0.2 care apare in fractia x / (1 + x2) (unde x = 2f ) din (eventuala) nepotrivire a frecventei cu inversul timpului de relaxare. In continuare, ne vom concentra asupra parametrilor de proiectare a unei bobine care sa ofere campul maxim posibil (pana la 10 T) alimentata fiind de la frecventa retelei. O bobina cu N spire parcurse de un curent I, de raza r si inaltime h (Figura 3), cu un miez magnetic de permeabilitate magnetica relativa r, va genera un camp magnetic egal cu:

22

0

2 hr

NIB r

(8)

Inductanta unei asemenea bobine se calculeaza ca fiind:

22

220

2

π

hr

rNL r

(9)

In momentul de fata, incercam sa optimizam valoarea campului magnetic dat de (8) minimizand puterea consumata de bobina. In principiu, r si h sunt date de constrangerile de utilizare (dimensiunea exterioara a bobinei); este clar ca h trebuie sa fie cat mai mic, insa pe de alta parte h este legat si de numarul de spire si de diametrul unei spire. Pentru o singura infasurare (Fig. 3), h ≥ 2r0N, unde r0 este raza conductorului folosit pentru infasurare. Rezistenta electrica a bobinei este data de:

2

3

20

82

h

rN

r

NrR

(10)

unde este rezistivitatea conductorului (2 x 10-8 ·m pentru Cu). Prima concluzie este ca rezistenta bobinei este proportionala cu N3, iar reactanta bobinei este proportionala cu N2. O a doua concluzie este ca impedanta bobinei este optima pentru valori cat mai scazute ale parametrului h. Asadar, puterea disipata este proportionala cu N2-3I, iar campul generat este proportional cu NI. In concluzie, se va urmari realizarea unei bobine cu valoare cat mai redusa a numarului de spire si valoare cat mai ridicata a curentului prin bobina. Pe de alta parte, exista o limitare a retelei domestice de cca. 10 A, corespunzand unei puteri disipate totale de cca. 2300 W. Aceasta valoare totala a puterii disipate este prea ridicata pentru a putea permite realizarea unui dispozitiv pe care pacientul sa si-l poata aplica local in regiunea afectata. Mai degraba, o putere de 23 W ar fi de dorit, corespunzand unui curent total de ordinul a 0.1 A. Campul magnetic maxim care poate fi produs cu un astfel de curent intr-o bobina cu r = 0.1 m si h = 0.01 m (10 cm, respectiv 1 cm), folosind permalloy ca material de permeabilitate magnetica ridicata (r ≈ 104), curent I = 0.1 A si N = 200 spire se poate calcula ca fiind de cca. 1.25 T. Aceasta este, in realitate, valoarea efectiva; campul maxim se obtine multiplicand cu √2, deci este de cca. 1.77 T. In aceste conditii, impedanta bobinei ar trebui sa fie de cca. 2300 . Modulul impedantei este dat de formula Z = (R + 2fL)1/2. Calculand cu valorile anterioare se obtine R = 1.28 k si L = 78.6 H, deci reactanta inductiva este de 2fL = 24.6 k. Aceasta valoare este prea ridicata. Eventual, se poate obtine un curent de 0.1 A prin intermediul unui transformator ridicator de tensiune, cu un raport de ridicare de 10:1. insa atunci, din nou, puterea disipata totala este prea ridicata. Pentru a merge mai departe, se exprima inductia magnetica in functie de tensiunea la borne U0 = 230 V ca:

2222

0

1

1

π2 NCNfr

UB

, unde

20

2

22

π

8

frh

hrC

r

(11)

Pentru valorile intrebuintate pana in prezent, se obtine factorul dinaintea celei de-a doua fractii din prima formula 23.3 T, iar C ≈ 2.6 x 10-4. Asadar, cu o buna aproximatie, B ~ 23.3 T / N. Optimul se obtine pentru o bobina fomata dintr-o singura spira insa, iarasi, solutia este nefizica, intrucat ar implica curenti mult prea ridicati. Se observa, insa, ca se obtine o valoare rezonabila a campului efectiv (1.165 T, corespunzatoare unei valori instantancee de 0Hac = 1.64 T) pentru N = 20 spire. Introducand aceasta valoare in formulele (9) si (10) obtinem L = 3.93 H, R = 1.28 . Inductanta reactiva este 2fL = 1235 , ceea ce coincide cu o buna aproximatie cu impedanta totala a sistemului. Curentul efectiv care se obtine este de 0.186 A, iar puterea disipata este de cca. 43 W.

Figura 3. Model al testerului de nano-ablatie, bazat pe formulele de calcul dezvoltate in actuala Etapa. S-a reprezentat numai intrefierul pe care va fi realizata bobina, prin infasurarea a 20 de spire din Cu de diametru 0.4-0.5 mm. Pe un suport care poate executa translatii fine in X si Y se va monta un pirometru optic IR.

In concluzie, rezultate promitatoare, cu camp maxim aplicat de peste 1 Tesla la limita superioara a bobinei, se pot obtine folosindu-se o bobina cu raza de 10 cm, inaltimea de 1 cm, formata din 20 de spire din sarma de Cu cu grosimea de 0.4-0.5 mm, bobinata pe un intrefier din permalloy cu permeabilitate magnetica relativa de 10000. Aceasta bobina poate fi conectata direct la reteaua domestica. I.5.3. Proiectul testerului de nano-ablatie Montajul complet, incluzand si un termometru fara contact de tipul pirometru cu infrarosu. este schematizat in Fig. 3. Pirometrul care va fi utilizat pentru masuratori este conceput pentru domeniul de temperaturi -50 → + 150 °C. Desi scopul acestui montaj este acela de a realiza hipertermia la frecventa retelei, el va fi utilizat, pentru inceput, si la frecvente mai ridicate, pentru studiul diferitelor tipuri de nanoparticule elaborate in cadrul proiectului. In vederea acestui deziderat, a fost achizitionata in cadrul prezentei Etape o sursa ajustabila de curent ridicat Heinzinger. In ceea ce priveste pirometrul optic-IR, s-au obtinut oferte (Fig. 4), insa el va fi achizitionat in cadrul urmatoarei Etape. De asemenea, tot atunci se vor achizitiona si diferite materiale pentru intrefier si va fi realizata masa de lucru si suportul cu translatie XY la atelierul mecanic.

I.5.4. Concluzii Nano-ablatia la frecventa retelei (50 Hz) pare fezabila, daca se are in vedere o grija suplimentara de selectie a nanoparticulelor magnetice si de caracterizare a proceselor de relaxare. Se asteapta cu interes primele rezultate in vitro. Bibliografie: [1] V.P. Torchilin, Targeted pharmaceutical nanocarriers for cancer therapy and imaging, AAPS J. 9, E128 (2007). [2] R.M. Sawant, R.R. Sawant, E. Gultepe, D. Nagesha, B. Papahadjopoulos-Sternberg, S. Sridhar, V.P. Torchilin, Nanosized cancer cell-targeted polymeric immunomicelles loaded with superparamagnetic iron oxide nanoparticles, J. Nanopart. Res. 11, 1777 (2009). [3] R. Hergt, S. Dutz, M. Röder, Effects of size distribution on hysteresis losses of magnetic nanoparticles for hyperthermia, J. Phys.: Condens. Matter 20, 385214 (2008). [4] H. Mamiya and B. Jeyadevan, Hyperthermic effects of dissipative structures of magnetic nanoparticles in large alternating magnetic fields, Nature Sci. Rep. 1, 157 (2011) . [5] S. Laurent, S. Dutz, U.O. Häfeli, M. Mahmoudi, Magnetic fluid hyperthermia: Focus on superparamagnetic iron oxide nanoparticles, Adv. Coll. Interf. Sci. 166, 8 (2011). [6] S.-H. Chung, A. Hoffmann, K. Guslienko, S.D. Bader, C. Liu, B. Kay, L. Makowski, L. Chen, Biological sensing with magnetic nanoparticles using Brownian relaxation, J. Appl. Phys. 97, 10R101 (2005). [7] Nanoscale Biomagnetics web page, http://www.nbnanoscale.com/ In concluzie, in etapa I a proiectului au fost indeplinite obectivele proiectului, prin redactarea protocoalelor de lucru pentru fiecare activitate precum si desenul tehnic al testerului de nano-ablatie.