Recherche d’une thérapie de la maladie de Lesch-Nyhan:

Identification de molécules «HPRT like» issue d’un

criblage virtuel et à haut débit

HGPRT

Nouveau concept

Maladie de LN

SFEIM, Vendredi 17 juin 2016 F. Augé, C. Petitgas, M.C. Burgevin, L. Mockel, A. Olivier-Bandini, J.F. Gibert, F. Chesney, O. Curet, B. Daignan-Fornier, B. Pinson, M. Ledroit, I. Ceballos-Picot.

Métabolisme des purines Maladies neurologiques

Une collaboration public-privé…

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Institut de Biochime et Génétique Moléculaire

Dr. Daignan Fornier Dr. Pinson

• Expertise du métabolisme des purines

• Expertise dans le développement des tests sur levures

Open Innovation Access Platform

Laboratoire de Biochimie Métabolique. Dr. Ceballos-Picot

• Experte Française de la maladie de Lesch-Nyhan (L-N)

• Recherche translationnelle à partir de cellules de patients

Recherche amont • Criblage haut débit • Développement de tests in-vitro • Validation de hits • Optimisation des leads

Sponsoring (Dr. Cheng Seng) • Développement des tests in-vivo • Prise en charge du projet après

validation du concept.

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… pour lutter contre une maladie rare.

allopurinol

Origine génétique (maladie rare, 1/250000) • Première description par les docteurs Lesch et Nyhan en 1964

• Maladie causée par une mutation sur le gène HPRT1 (chromosome X)

• Les hommes sont affectés, les femmes sont porteuses

• HGPRT est une enzyme ubiquitaire exprimée par tous les organismes

Syndrome • Hyperuricémie (goutte et lithiases rénales)

• Troubles neuro-comportementaux (dystonie, désordres cognitifs,

automutilation)

Diagnostic et prise en charge • En France le diagnostic est réalisé par les centres de référence

« maladie héréditaire du métabolisme ».

• L’hyperuricémie est traitée par l’allopurinol

• Pas de médication efficace pour les troubles neurologiques

• La prise en charge se fait par immobilisation physique des patients sur

une chaise et le port de gouttières pour empêcher l’automutilation

Corrélation entre phénotype et génotype* • L’ensemble des symptômes est rencontré chez les patients ayant une

perte complète de l’activité de l’enzyme HGPRT.

• Le spectre des symptômes est fonction de l’activité résiduelle de HGPRT

• Une activité de 10% est suffisante pour éviter les automutilations.

*Rong Fu, Irene Ceballos-Picot et al; Brain (2014) 137; 1282-1303

Zoom sur les mutations du gène HPRT1

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Phénotype HRH

Phénotype HND

Phénotype LND

PDB structure = 1BZY

Source : Irène Ceballos-Picot et al. OJRD (2015) 10;7

• Des mutations nombreuses (sup 600) et non localisées

sur la protéine.

• HGPRT n’est pas une cible thérapeutique possible.

HGPRT est une enzyme de la voie de recyclage des purines

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Recyclage

Dégradation

Synthèse

de novo

Source : KEGG pathway database : http://www.genome.jp/kegg/pathway.html

HGPRT APRT

Un concept innovant visant à modifier la sélectivité de l’APRT

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Allopurinol XO

XO = Xanthine Oxydase

Normal

LND

APRT+AMS = APRT + Allosteric Modulator of Selectivity

= HGprt-like activity

Aprt + AMS

Substrat APRT ?

Développement d’un test sur levures et criblage

Benoit Pinson et Bertrand Daignan-Fornier

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• Principe du test

o Knockdown des enzymes clés de la

voie de recyclage des purines chez la

levure o Pas de croissance des levures

o Expression de l’APRT humaine dans

les levures o Les levures croissent sous adénine (Voie 1)

o Les levures ne peuvent croître sous

hypoxanthine sauf si modulation allostérique

(voie 2)

• Le criblage

o Librairie Prestwick (1300 cpds).

o 7 jours et 14 jours de croissance

Voie 1 Voie 2

2µL d’adenine

8 composés testés

par plaque

Milieu SD casa W

+ Hypoxanthine

+ levure

(ade2Δ hpt1Δ apt1Δ + hAPRT)

Aucun hit identifié

Développement d’un test biochimique et premier criblage

8

4633 composés testés (100µM) : criblage virtuel & prestwick

Hypoxanthine Guanine Adenine

HGprt

PRPP/Mg2+

HGprt

PRPP/Mg2+

Aprt

PRPP/Mg2+

IMP Inosine monophosphate

GMP Guanosine monophosphate

AMP Adenosine monophosphate

Kit de détection basé sur la

polarisation de fluorescence

0.001 0.01 0.1 1 10 100 10000

100

200

300

2µg/ml antibody2nM tracer-AF633

IMP x 5

AMP x 1

GMP x 2.5

PRPP x1250

D-ribose-5-phosphateadenineguaninehypoxanthine

[product, µM]

m

P

APRT, 0.2µg/ml, 1hTris0.1M, MgCl2 1.2mM, PRPP 10µM

0.0 0.5 1.0 1.5 2.00

50

100

150

200

Vmax

Km

adenine

191.7

0.1179

hypoxanthine

2.227

~ 1.498e-016

guanine

-3.018

0.0004551

hypoxanthine

guanine

adenine

[substrate, µM]

m

P

Bonne détection de AMP, IMP et GMP. Aprt sélectif de l’adénine vs hypoxanthine et

guanine

Hypoxanthine

IMP Inosine monophosphate

Aprt

PRPP/Mg2+

Concept

Chimiothèque

Modulation

allostérique

9

A

B

C

D

36 + 766

molécules

455 + 642

molécules

582

molécules

152

molécules

• Identification de 4 poches allostériques potentielles

• Criblage virtuel effectué pour identifié des molécules pouvant se fixer sur ces

poches

• Le résultat des criblages sur les 4 poches donne la liste de molécules à cribler

Représentation schématique de l’approche

Une librairie de 2633 molécules proposée pour le criblage bas débit

Le criblage virtuel: principe

Criblage haut débit sur le test biochimique

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• Criblage primaire sur ~500.000 composés (12,5µM)

• Durée : 3 semaines

• Sélection de 860 composés (activité sup 20%)

• Re-testés en dose- réponse, contre-screen, QC.

Bilan des criblages biochimiques

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positiv

e

subs

trate

dire

ct in

tera

ction

nega

tive

0

50

100

IMP

/ A

MP

analo

g f

orm

ation

compound + hypoxanthine

or compound alone

compound + APRT

compound + APRT-hypoxanthine

positiv

e

subs

trate

dire

ct in

tera

ction

nega

tive

0

50

100

IMP

/ A

MP

analo

g f

orm

ation

compound + hypoxanthine

or compound alone

compound + hypoxanthine

or compound alone

compound + APRTcompound + APRT

compound + APRT-hypoxanthinecompound + APRT-hypoxanthine

1er criblage: (4633 composés)

• Positif = 0

• Substrats = 16

• Interaction directe = 10

2nd criblage (500 000 composés)

• Positif = 0

• Substrats = 284

• Interaction directe = 187

Différents profils possibles

• Les produits positifs dans le test biochimique peuvent être: • Soit des modulateurs allostériques (molécules recherchées)

• Soit des substrats (positif dans un test identique, sans d’hypoxanthine)

• Soit directement interagir avec le kit de détection (positif dans un test identique, sans enzyme)

2 contre-screens sont nécessaires

Profil recherché

Parmi les composés, une famille est intéressante

12

+Azaserine 1µM

normal +Azaserine 1µM +molécule X 10µM

Molécule X 10µM

• Plusieurs composés induisent la survie de

fibroblastes LN placés dans un milieu de culture

bloquant la biosynthèse de novo des purines.

• Ces composés pourraient activer une voie de

production d’IMP (GMP) induisant une survie des

cellules de patients.

• C’est l’effet que nous cherchions, mais il ne passe

pas par un modulateur allostérique de l’APRT.

Azaserine = inhibiteur irréversible de glutamine phosphoribosyl

pyrophosphate amidotransferase et FGAR amidotransferase

EC50=0,5µM

Bilan

• Partenariat public-privé pour lutter contre une maladie rare.

• Nos recherches ont montré que l’hypothèse initiale d’une réorientation de la

sélectivité de l’APRT par un modulateur allostérique de type petite molécule n’était

pas valide.

• Mais ces résultats ouvrent un second axe de recherche pouvant conduire à

l’identification de molécules présentant l’effet fonctionnel recherché in fine, mais

utilisant un autre mécanisme.

• Les résultats sont repris par les partenaires académiques afin de poursuivre la

recherche sur cette nouvelle hypothèse.

• Il reste beaucoup de travail avant de valider l’intérêt des molécules identifiées

dans le traitement de la maladie de Lesch-Nyhan • Confirmer que ces molécules restaurent les concentrations d’IMP, GMP, ATP (…) dans les cellules

des patients

• Valider l’effet observé sur la différenciation d’iPSC en neurones

• Valider le lien causal entre production d’IMP et troubles neurologiques (système dopaminergique)

• …

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Merci

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SANOFI Unité de Sciences Translationnelles • Vincent Mikol

• Anne Olivier-Bandini

• Franck Augé

• Marie-Claude Burgevin

• Françoise Chesney

• Jean-François Gibert

• Patrick Avenet

• Olivier Curet

Access Platform • Walter Englaro

• Eamonn Rooney

• Julia Frappier

Hôpital Universitaire Necker-EM

Université Paris Descartes Laboratoire de Biochimie métabolomique

et protéomique • Irène Ceballos-Picot

• Morgan Ledroit

• Julie Cahu

• Céline Petitgas

• Lionel Mockel

Université Bordeaux Segalen Institut de Biochimie et Génétique Cellulaires (IBGC), CNRS UMR 5095 • Bertrand Daignan-Fornier

• Benoit Pinson

Ma.M.E.A – Centre de référence maladies

métaboliques • Pascale de Lonlay

• Anaïs Brassier