Identification of a DNA Binding Region inGerE from Bacillus subtilis

中興大學生化所 李彥樑

DINENE L. CRATER AND CHARLES P. MORAN, JR.

Journal of Bacteriology 183:4183-4189 2001

LuxR-FixJ family 的分類

BvgA, ComA, DctR, DegU, EvgA, FimZ, FixJ, GacA, GlpR, NarL, NarP, NodW, RcsB, UhpA etc.

以 Phosphorylation 機制調控

CarR, EchR, EsaR, ExpR, LasR, LuxR, MalT, PhzR, RhlR, TraR, YenR etc.

經 Inducer誘導

GerE, SalA, SyrF, SyrG etc.

與旁兩者不同

LuxR-FixJ family

?依啟動機制不同分為三個 subfamily。

•LuxR-FixJ family 為 Bacterial regulatory protein family，成員如: FixJ, MalT, GerE etc.，以 binding DNA 來達成 regulating，功能多為 activating expression。

•因啟動機制不同而N-端序列也有所差異。•大部分成員具有類似結構：

GerE 所屬 protein family － LuxR-FixJ

具有 putative helix turn helix (HTH) motif

N C

Receiver domain DNA binding domain

GerE protein from Bacillus subtilis

•序列長度為 74 a.a.，分子量約為8.5 kD，為 LuxR-FixJ family 中最小者。•序列中 Basic a.a. 佔了17.57 %， pI = 9.16，at pH 7 charge +1.87，為 basic

protein。• GerE 為 LuxR-FixJ family C-端 DNA binding domain 的典型結構。

LuxR-FixJ family

GerE 1 MKGAEFGPKPLLTKREREVFELLVQDKTTKEIAEQLFISEKTVRNHISNTMQKLGVKGRSQAVIELIRLGELEI 74

Putative DNA binding HTH motif

Receiver domain DNA binding domain

N C

• GerE 於 Bacillus subtilis 影響 SigK-associated RNA polymerase-dependent transcription ，以調控 sporulation coat gene。

• GerE 以 Dimer 型態與 DNA 作用。

GerE 所結合的 DNA sequence

TACATATAGGCTTTTGCCTACATACTTTATGTATATCCGAAAACGGATGTATGAAA

sigK promoter

5‘3‘

sigK : … ATATAGGCttTT…

cotX : … AAATAGGgttCT…

cotG : … tTTTAGGCttTT…

cotD : … tAAgGGGTacaT…

cotC1: … GTTTGGGCcgaT…

12 bp

RWWTRGGYNNYYR → G or A

W → A or TN → G, A, T, C Y → T or C

Consensus sequence

Transcriptional Start Site

實際上 consensus sequence 所呈現的方式

實驗動機

• 已知 N-端 receiver domain 不具 DNA binding 能力，但會影響DNA binding affinity。

• 其他 DNA binding protein (Cro and Lambda repressors)會以HTH motif 與 DNA 結合，LuxR-FixJ family 的 putative HTH motif 還未有分生實驗證實。

• 有實驗指出在 sigma factor 的 putative HTH motif 點突變，會導致 DNA binding affinity 變化。

以 GerE 為最簡單模式來觀察 putative HTH motif，進而辨認出最具影響力的胺基酸。

LuxR-FixJ family 的 putative HTH motif 與 DNA 的關連性?

sigKUPforward primer

reverse primersigK250-REV

5’3’

PCR

pKW19

sigK promoter

inserts intopCR2.1-TOPO226-bp sigK

promoter

實驗

1.準備 sigK promoter (from K. Wade)

pKW19 為 Wild-type sigK promoter plasmid，之後的 muatant 都以此 plasmid 為源頭。

實驗

以psigK+2A為例

pKW19Wild-type sigK promoter

plasmid

Dpn ISite-directed PCR mutagenesis

sigK promoterTACATATAGGCTTTTGCCTACATACTTT

Transcriptional Start Site

+2 +3 +4 +5

ATAA

psigK+2ApsigK+3TpsigK+4ApsigK+5A

2. Single base pair substitution

..TATTTCC..Reverse primer

Digest parental DNA..ATAAAGG..Forward primer

psigK+2A

pKW19置換 base

pKW19psigK+2ApsigK+3TpsigK+4ApsigK+5A PCR

sigK250-REVsigKUP

3 .製備 radioactive-labeled DNA

實驗

DNase I Footprinting Assay

226-bp sigKpromoter

32

P

以 T4 polynucleotide kinase 將 [?-32P]ATP的放射線磷酸根轉移至 forward primer 的 5‘端

與 GerE 結合

觀察 binding 的變化

實驗

GerE1 MKGAEFGPKPLLTKREREVFELLVQDKTTKEIAEQLFISEKTVRNHISNTMQKLGVKGRSQAVIELIRLGELEI 74

T42A R44A

σ 70 TDYTLEEVGKQFDVTRERIRQIEAKALRKLR 599σA RTRTLEEVGKVFGVTRERIRQIEAKALRKLR 358GerE QDKTTKEIAEQLFISEKTVRNHISNTMQKLG 55NarL QGLPNKMIARRLDITESTVKVHVKHMLKKMK 199FixJ AGLPNKSIAYDLAISPROVEVHRANVMAKMK 185MalT SGYSNEQIAGELEVAATTIKTHIRNLYQKLG 879UhpA QGMAVKEIAAELGLSPKTVHVHRANLMEKLG 181LuxR EGKSSWDISKILGCSKRTVTFHLTNAQMKLN 226

Helix HelixTurn

Single Alanine Substitution in GerE

實驗

240-bp gerEcoding sequence

Site-directed PCR mutagenesis

以 PCR 方式將gerE sequence 放大

pGerE-EX

Incerts intopET-26b(+)

240-bp gerE

pGerE-T42ApGerE-R44A

1.準備 gerE plasmid (from J. Brannigan)

5’3’

實驗

pGerE-EXpGerE-T42ApGerE-R44A

600 nm O.D.= 0.8In L.B. medium IPTG induce

Contains Chloramphenicol& Kanamycin

Add rifampinTransform into BL21(DE3)(pLysS)

純化

HighTrapheparin column

Run SDS-PAGE withCoomassie blue staining分析純度

Wild-type GerET42A GerER44A GerE

2. GerE protein overexpression

將菌液以lysis buffer 回溶

以 31000 g 離心取上清液

實驗

Mixture in10 mM HEPES [pH 7.5] 50 mM NaCl

1 mM EDTA [pH 8.0]1 mM DTT10 % glycerolPoly(dI-dC)

DNase I digestion

STOP buffer 酒精沈澱

DNA fragments

Run PAGE with 7 M Urea

•Wild-type•Mutant

GerE sigKpromotor

＋•Wild-type•Mutant

DNase I Footprinting

Results

TACATATAGGCTTTTGCCTACATACTTTTGTG

Mutation sigK promoter 對 binding 的影響

Wild-type GerE 對 sigK +2A 的binding affinity ，由對WT sigK的 7 pM 變為 35 pM，下降5倍。

+1 +25Wild-type

+19+5

TACATATTGGCTTTTGCCTACATACTTTTGTG

Results

+6 +25

Mutation sigK promoter 對 binding 的影響

• sigK+3T 不僅使 GerE binding affinity下降5倍，binding起始位置也由+1變為+6。

• sigK+5A 造成的affinity 變化不到5倍影響最小。

Wild-type

+19

+3T

TACATATAGACTTTTGCCTACATACTTTTGTG

+1 +25+19+5

Results

ATATAGGCTTTT

Transcriptional Start Site

+3 +5

RWWTRGGYNNYYR → G or AW → A or TN → G, A, T, C Y → T or C

Strong effectSmall effect

sigK promoter 的變化會影響 binding affinity，甚至binding position 也改變，可知此處的 base 與 GerE 有直接的關連。

Summary of mutation sigK的影響

Results

T42A-GerE以350 pM即可保護WT sigK，對 sigK+4A 則需700 pM ，如同Wild-type GerE，對WT sigK 與 sigK+4A 有binding affinity 差別。

Mutant GerE 對 DNA binding 的影響

R44的序列相對位置，為 FixJ 及σ70 recognition residue 所在，實驗結果為 DNA binding affinity 下降。

關於R44A

Results

+18 、+15 band 為 T42A-GerE特有

• T42A-GerE縮小了 DNA binding 範圍，少了10 bp。• sigK+3T promoter 造成 wild-type GerE binding 能力減弱，

T42A-GerE 不受影響，可知WT GerE 和 T42A-GerE 對DNA 的作用方式不同。

T42A-GerE 對 sigK +3T 與WT sigK 都需700 pM才能保護。

Mutant GerE 對 DNA binding 的影響

結論

位於 putative HTH motif 的 T42 產生改變後，造成 protein 與DNA interaction 的極大差異，可知在 GerE或其他 LuxR-FixJfamily 成員的 HTH motif 及其鄰近的胺基酸，與該蛋白質辨識及結合特定的 DNA 序列息息相關。

正面

N

N’C C’

S8L74Q5 L74

T42A 為何不受sigK+3T 影響

側面

N

N’C C’

•T42A 不會破壞 Dimer 的構型(Protein-protein interaction) 。

•T42A 造成的 binding 位向改變，使的 sigK+3T 影響程度降低。Complex

V. M. -A. Ducros et alJournal of Molecular Biology 2001

V. M. -A. Ducros et al

Jounal of molecular Biology 2001

GerE 結構Cartoon 圖

N

N’C C’

V. M. -A. Ducros et al

S8L74

Q5

L74

Journal of Molecular Biology 2001

Denature

AnnealMutagenic primers

PCR withPfu DNA polymerase

＋ Dpn I

圖片取自 Weaver molecular biology

Site-directed PCR mutagenesis 原理:利用特殊設計的 primers 來產生完整又具有突變的 plasmid。

圖片取自 Gene VII