This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution 4.0 International License. Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschung in Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht: Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz. Untersuchungen über die Widerstandsfähigkeit der Lysosomen-Membranen III. Schutz der Leber-Lysosome vor der schädigenden Wirkung des Chlorpromazins durch Riboflavin in vivo TSCH. POPOV Lehrstuhl für Chemie und Biochemie der Tierärztlichen Hochschule Sofia (Vorstand: Prof. Dr. Iw. IWANOV) (Z. Naturforschg. 22 b, 1157—1159 [1967]; eingegangen am 17. April 1967) Chlorpromazin ruft eine Erhöhung der freien Aktivität der Lysosomhydrolasen, des Hämoglobin- zerlegenden Kathepsins und der sauren Phosphatasen in Homogenaten, hergestellt aus Lebern von Ratten, welchen einmalig subcutan die Dosis 1 mg/100 g Lebendgewicht injektiert worden war, hervor. Bei der Präinkubation der isolierten von den gleichen Homogenaten reich an Lysosomen Mytochondrialen-Fraktionen in isotonischer Lösung (0,25 M Saccharose) bei 37 °C und pH 5, stellte sich eine beschleunigte (im Vergleich zur Kontrolle) Freilegung der an die Lysosome ge- bundenen sauren Phosphatase fest. Auf Grund der hervorgehobenen Veränderungen kann man annehmen, daß Chlorpromazin die Lysosommembran labilisiert. Riboflavin, gleichzeitig mit Chlorpromazin angewandt, schützt die Lysosome vor der labilisieren- den Wirkung des Chlorpromazins. Das Chlorpromazin ruft nach einmaliger Einfüh- rung in den Organismus von Versuchstieren in gro- ßen Dosen eine Schädigung der Lysosomen-Membra- nen 2 hervor. Der Mechanismus dieser Schädigung ist noch nicht geklärt. Es wurde die Vermutung ge- äußert, daß sie sekundär ist und auf Störungen im bioenergetischen Stoffwechselablauf (Inhibition der Glykolyse, der Gewebeatmung und des oxydierenden Phosphoriiierens 3-11 ) beruht, die für gewisse Zeit zu einer Verminderung der energetischen Hilfsquel- len in den lebenden Zellen führen 12 . 5-ATP schützt die Lysosome vor der schädigen- den Wirkung des Chlorpromazins 12 . Bei der Deu- tung dieser Tatsache wurden einige Vermutungen geäußert. Von diesen erscheint nach Ansicht des Autors diejenige am annehmbarsten, die die Wahr- scheinlichkeit zuläßt, daß ein Teil des exogenen ener- giereichen Phosphats imstande ist, das Defizit an endogenem energetischem Material zu kompensie- 1 P. S. GUTH, J. AMARO, O. Z. ZELLINGER U. L. ELMER, Biochem. Pharmacol. 14, No. 5, 769 [1965]. 2 TSCH. POPOV, Wiss. Arb., WWMI-Sofia 17, 37 [1966] - bulg. 3 M. BERGER, H. J. STRECKER U. H. WAELSCH, Nature [London] 177, No. 4, 522, 1234 [1956]. 4 M. J. R. DAWKINS, J. D. JUDAN U. K. R. REES, Biochem. J. 73, 16 [1959]. 5 BERNSOHN, I. NAMAJUSKA U. B. BOSHES, J. Neurochem. 1, 145 [1956]. 6 L. G. ABOOD, Proc. Soc. exp. Biol. (N. Y.) 88. 688 [1955]. 7 M. J. CARVER, Biochem. Pharmacol. 12, 19 [1963]. 8 B. CENTURY U. M. K. HORWITT, Proc. Soc. exp. Biol. (N. Y.) 91,493 [1956]. ren. Diese Auffassung ist sehr hypothetisch und er- fordert Beweise für ihre Bekräftigung. Es wurde festgestellt, daß das Chlorpromazin we- gen seiner partiellen Strukturanalogie zum Isoallox- azin einige Flavinenzyme kompetitiv hinsichtlich des FAD * inhibiert. Ein solcher kompetitiver Inhibito- ren-Effekt ist bezüglich der D-Aminosäure-Oxydase (I.e. 13-15 ) nachgewiesen; es gibt jedoch Arbeiten, denen zufolge das Chloropromazin auch auf die Akti- vität der Flavin-Enzyme, die der Gruppe der Gewebe- atmungs-Fermente angehören, Einfluß hat. KURO- K A W A zufolge (zit. nach GABAY u ) beeinflußt das Chlorpromazin die Succinodehydrogenase-Aktivität — aktiviert oder inhibiert. Die mitgeteilten Angaben ließen die Vermutung aufkommen, daß bei gleichzeitiger Anwendung gro- ßer Dosen von Riboflavin und Chlorpromazin die ungünstigen Wirkungen des letzteren auf den bio- energetischen Stoffwechselablauf bis zu einem gewis- 9 BERNSOHN, I. NAMAJUSKA U. L. S. G. COCHRANE, Federat. Proc. 14,182 [1955]. 10 H. WAND, Naturwissenschaften 51, No. 9, 220 [1964]. 11 K. F. GEY et al., Biochem. Pharmacol. 14, No. 4, 507 [1965]. 12 CH. POPOV, C. R. de l'Academie Bulgare des Sciences 19, No. 11, 1071 [1966]. * Flavinadenin dinukleotid. 13 K. YAGI, T. NAGATSU U. T. OZAWA, Nature [London] 177, 891 [1956]. 14 S. GABAY U. S. K. HARRIS, Biochem. Pharmacol. 14, 17 [1965]. 15 S. GABAY U. S. K. HARRIS, Biochem. Pharmacol. 15, No. 3, 317 [1966].
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This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.
Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.
Untersuchungen über die Widerstandsfähigkeit der Lysosomen-Membranen
III. Schutz der Leber-Lysosome vor der schädigenden Wirkung des Chlorpromazins durch Riboflavin in vivo
T S C H . P O P O V
Lehrstuhl für Chemie und Biochemie der Tierärztlichen Hochschule Sofia (Vorstand: Prof. Dr. Iw. IWANOV)
( Z . Natur forschg . 22 b , 1 1 5 7 — 1 1 5 9 [ 1 9 6 7 ] ; e i n g e g a n g e n am 17 . A p r i l 1967)
Chlorpromazin ruft eine Erhöhung der freien Aktivität der Lysosomhydrolasen, des Hämoglobin-zerlegenden Kathepsins und der sauren Phosphatasen in Homogenaten, hergestellt aus Lebern von Ratten, welchen einmalig subcutan die Dosis 1 mg/100 g Lebendgewicht injektiert worden war, hervor. Bei der Präinkubation der isolierten von den gleichen Homogenaten reich an Lysosomen Mytochondrialen-Fraktionen in isotonischer Lösung (0,25 M Saccharose) bei 37 °C und pH 5, stellte sich eine beschleunigte (im Vergleich zur Kontrolle) Freilegung der an die Lysosome ge-bundenen sauren Phosphatase fest.
Auf Grund der hervorgehobenen Veränderungen kann man annehmen, daß Chlorpromazin die Lysosommembran labilisiert.
Riboflavin, gleichzeitig mit Chlorpromazin angewandt, schützt die Lysosome vor der labilisieren-den Wirkung des Chlorpromazins.
Das Chlorpromazin ruft nach einmaliger Einfüh-rung in den Organismus von Versuchstieren in gro-ßen Dosen eine Schädigung der Lysosomen-Membra-nen 2 hervor. Der Mechanismus dieser Schädigung ist noch nicht geklärt. Es wurde die Vermutung ge-äußert, daß sie sekundär ist und auf Störungen im bioenergetischen Stoffwechselablauf (Inhibition der Glykolyse, der Gewebeatmung und des oxydierenden Phosphorii ierens3 - 1 1 ) beruht, die für gewisse Zeit zu einer Verminderung der energetischen Hilfsquel-len in den lebenden Zellen führen 12.
5 - A T P schützt die Lysosome vor der schädigen-den Wirkung des Chlorpromazins 12. Bei der Deu-tung dieser Tatsache wurden einige Vermutungen geäußert. Von diesen erscheint nach Ansicht des Autors diejenige am annehmbarsten, die die Wahr-scheinlichkeit zuläßt, daß ein Teil des exogenen ener-giereichen Phosphats imstande ist, das Defizit an endogenem energetischem Material zu kompensie-
1 P. S. G U T H , J. A M A R O , O . Z . ZELLINGER U. L. E L M E R , Biochem. Pharmacol. 14, No. 5, 769 [1965].
2 T S C H . P O P O V , Wiss. Arb., WWMI-Sofia 17, 37 [1966] -bulg.
3 M. B E R G E R , H. J. STRECKER U . H. W A E L S C H , Nature [London] 177, No. 4, 522, 1234 [1956].
4 M. J . R . D A W K I N S , J . D . JUDAN U. K. R . R E E S , Biochem. J . 73, 16 [1959].
5 BERNSOHN, I. N A M A J U S K A U . B . BOSHES, J. Neurochem. 1, 145 [1956].
6 L. G . A B O O D , Proc. Soc. exp. Biol. (N. Y . ) 8 8 . 688 [ 1 9 5 5 ] . 7 M. J. C A R V E R , Biochem. Pharmacol. 12, 19 [1963]. 8 B. CENTURY U. M. K. H O R W I T T , Proc. Soc. exp. Biol. (N. Y . )
91,493 [1956].
ren. Diese Auffassung ist sehr hypothetisch und er-fordert Beweise für ihre Bekräftigung.
Es wurde festgestellt, daß das Chlorpromazin we-gen seiner partiellen Strukturanalogie zum Isoallox-azin einige Flavinenzyme kompetitiv hinsichtlich des FAD * inhibiert. Ein solcher kompetitiver Inhibito-ren-Effekt ist bezüglich der D-Aminosäure-Oxydase ( I . e . 1 3 - 1 5 ) nachgewiesen; es gibt jedoch Arbeiten, denen zufolge das Chloropromazin auch auf die Akti-vität der Flavin-Enzyme, die der Gruppe der Gewebe-atmungs-Fermente angehören, Einfluß hat. K U R O -
K A W A zufolge (zit. nach G A B A Y u ) beeinflußt das Chlorpromazin die Succinodehydrogenase-Aktivität — aktiviert oder inhibiert.
Die mitgeteilten Angaben ließen die Vermutung aufkommen, daß bei gleichzeitiger Anwendung gro-ßer Dosen von Riboflavin und Chlorpromazin die ungünstigen Wirkungen des letzteren auf den bio-energetischen Stoffwechselablauf bis zu einem gewis-
9 BERNSOHN, I . N A M A J U S K A U. L. S . G . COCHRANE, Federat. Proc. 14,182 [1955].
1 0 H . W A N D , Naturwissenschaften 5 1 , No. 9, 220 [1964]. 11 K. F. GEY et al., Biochem. Pharmacol. 14, No. 4, 507 [1965]. 1 2 C H . P O P O V , C . R . de l'Academie Bulgare des Sciences 1 9 ,
No. 11, 1071 [1966]. * Flavinadenin dinukleotid.
13 K. Y A G I , T. N A G A T S U U . T. O Z A W A , Nature [London] 177, 891 [1956].
1 4 S . G A B A Y U . S . K. H A R R I S , Biochem. Pharmacol. 14, 17 [1965].
1 5 S . G A B A Y U. S . K. H A R R I S , Biochem. Pharmacol. 15, No. 3 , 317 [1966].
sen Grade verhütet werden können, was in Anbe-tracht der geäußerten Vermutung hinsichtlich des Mechanismus der die Lysosome schädigenden Wir-kung des Chlorpromazins zu einer geringeren Labili-tät der angeführten Strukturen führen wird.
In der vorliegenden Arbeit werden die Ergebnisse der Untersuchungen über die Stabilität der Lyso-some aus den Lebern von Ratten mitgeteilt, die mit Chlorpromazin und Chlorpromazin + Riboflavin be-handelt wurden.
Material und Methoden
Zu den Versuchen wurden weiße Ratten vom Stamm Wistar von 100 — 140 g Gewicht benutzt.
Nach 12-stdg. Hungern wurde den Versuchstieren subkutan Chlorpromazin (CPZ) in einer Dosis von 1 mg/100 g Lebendgewicht verabfolgt. Ein Teil der mit CPZ behandelten Ratten erhielt sofort danach eine in-traperitoneale Dosis von 1 mg/100 g Lebendgewicht Riboflavin und zweitmalig nach 2 Stdn. ebenfalls intra-peritoneal 0,5 mg/100 g Lebendgewicht Riboflavin. Bei einem Teil der Versuchstiere wurde das Riboflavin in-nerlich mittels Magensonde in einer Dosis von 2 mg pro 100 g Lebendgewicht einmalig sofort nach der CPZ-Injektion verabfolgt.
Die Kontrolltiere und die nach der obigen Beschrei-bung trätierten Tiere wurden durch Dekapitation 5 Stdn. nach der CPZ-Injektion getötet. Die Lebern wurden schnell aus den Kadavern entfernt und in eine eiskalte Lösung von Saccharose (0,25 M) gelegt. Die Herstel-lung der Homogenate und ihre Fraktionierung wurden nach der früher beschriebenen Methode durchgeführt12.
Die Beurteilung der Stabilität der Lysosomen-Membranen erfolgte nach der Verteilung der sauren Hydrolasen (Hämoglobin-spaltendes Kathepsin und saure Phosphatasen) in den bei dem Differential-zentrifugieren der Zytoplasma-Extrakte (ZE) erhal-tenen Fraktionen und nach der Freilegungsgeschwin-digkeit der an die Lysosome gebundenen sauren Phosphatase bei dem Präinkubieren von isolierten, an Lysosomen reichen Mitochondrial-Fraktionen (ML-Fraktionen) in isotonischer Lösung (0,25 M Saccharose) bei 37 C und pn 5.
Die Gesamtaktivität der Hydrolasen wurde bei einem Teil der ZE nach 3 Min. langem Behandeln mit dem Homogenisator Unipan Typ 302 in hypo-tonischer Lösung bestimmt.
1 6 R . GIANETTO U. C . DE D U V E , Biochem. J . 5 9 , 4 3 3 [ 1 9 5 5 ] . 1 7 O . H . L O W R Y et al., J . biol. Chemistry 1 9 3 , 2 6 5 [ 1 9 5 1 ] . 18 C. DE D U V E , „Struktur-Komponenten der Zelle", I . L . , Mos-
kau 1962, S. 128. — russ.
Bestimmung der Enzym-Aktivität. Die Aktivität der sauren Phosphatase wurde nach der Methode von G I A N E T T O und D E D U V E 16 bestimmt.
Die Aktivität des Hämoglobin spaltenden Kathep-sins wurde nach der modifizierten Methode von L O W R Y et al.12 festgestellt.
Die Eiweißwerte wurden nach der Methode von L O W R Y et al.17 mit Rinderserumalbumin als Stan-dard ermittelt.
Material. 1. Natrium-/?-glycerophosphat (Merck) ; 2. Chlorpromazin (CPZ), Plegomazin (Egyt); 3. Riboflavin (Merck) ; 4. Hämoglobin, gewonnen aus mit isotonischer NaCl-Lösung gewaschenen und durch Plasmolyse zerstörten Rindererythrozyten, de-ren Stroma bei 100 000 g/min sedimentierte.
Alle Lösungen wurden mit Wasser, destilliert in Glasgefäßen, zubereitet.
Besprechung der Ergebnisse
Die Untersuchungsergebnisse sind in Tab. 1 und in Abb. 1 dargestellt. Aus Tab. 1 geht hervor, daß CPZ zu einer Steigerung der freien Aktivität der sauren Phosphatase und des Hämoglobin-spaltenden Kathepsins (in der vorliegenden Arbeit wird als freie Aktivität die in 400 000 g/min supernatant ge-messene bezeichnet) in den Cytoplasma-Extrakten führt, die aus den Lebern der mit CPZ behandelten Tiere hergestellt wurden. Ferner wurde eine im Ver-gleich zur Kontrolle beschleunigte Freilegung der an die Lysosome gebundenen sauren Phosphatase bei Präinkubieren in vitro der ML-Fraktionen festge-stellt, die aus den Lebern der mit CPZ behandelten Tiere isoliert wurden (Abb. 1) .
Die hervorgehobenen Abweichungen von der Norm, wie sie in bezug auf die Stabilitätsbeurteilung der Lysosome feststeht18'19, weisen eine Zerstörung der Gesamtheit dieser Organellen auf.
Bei der kombinierten Anwendung von CPZ und Riboflavin sind die mitgeteilten Veränderungen, die eine Schädigung der Lysosomen-Membranen aufwei-sen, schwächer ausgeprägt. Wie aus Abb. 1 und aus den Resultaten der Tab. 1 ersichtlich ist, beseitigt das Riboflavin die schädigende Wirkung des CPZ nicht vollständig. Ein derartiger Effekt wäre auch nicht zu erwarten, da CPZ den Literaturangaben zu-
19 J. T. DINGLE, I. M . SHARMAN U. T. M O O R E , Biochem. J. 9 8 . No. 2, 476 [1966].
Aktivität des Hämoglobin-spaltenden Kathepsins (/j.g Tyrosin/15 Min./mg Eiweiß)
Zahl der Gesamt- Freie Freie Aktivität Tiere Aktivität Aktivität % der gesamten
1. Kontrolltiere 5 2. Tiere, behandelt mit CPZ 6 3. Tiere, behandelt mit CPZ 7
± Riboflavin
1. Kontrolltiere 5 2. Tiere, behandelt mit CPZ 5 3. Tiere, behandelt mit CPZ 5
Tab. 1. Verteilung der Lysosomen-Hydrolasen (Hämoglobin spaltendes Kathepsin und saure Phosphatase) in Cytoplasma-Extrakten, hergestellt aus Lebern von Kontrolltieren und Tieren, behandelt mit CPZ und CPZ + Riboflavin.
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^ 20
Abb. 1. Freilegung der sauren Phosphatase aus ML-Fraktio-nen, isoliert aus Homogenaten der Lebern von Kontrolltieren und den mit CPZ sowie CPZ+Riboflavin behandelten Ver-suchstieren. Die Mengen der zur Bestimmung der Enzym-aktivität benutzten Fraktionen wurden 0, 15, 30, 50 und 90 Min. in isotonischer Lösung (0,25 M Saccharose) bei 37 °C und ph 5 (0,1 M Acetatpuffer) präinkubiert. Am Ende der für das Präinkubieren erforderlichen Zeit wurde ein Substrat (Na-/?-Glycerophosphat) hinzugefügt, das die Endkonzentra-tion 0,05 M sicherte, wonach das Inkubieren 10 Min. fortge-setzt wurde. Die freie Aktivität ist prozentual zu der gesamten, in den Fraktionen nach langdauerndem Präinkubieren (2 bis 2lh Stdn.) unter gleichen Bedingungen bestimmten Aktivität ausgedrückt. • • Kontrolltiere; O o behandelt
mit CPZ; x x behandelt mit CPZ + Riboflavin.
folge außer den Flavinenzymen noch andere Glieder der bioenergetischen Kette hemmt. Es ist möglich, daß das Riboflavin bei Anwendung in großen Dosen wegen seiner kompetitiven Beziehungen zum CPZ
nur den Inhibitoren-Effekt des letzteren auf die Fla-vinenzyme beseitigt, ohne imstande zu sein, die an-deren Störungen zu normalisieren.
Die bei den vorliegenden Untersuchungen erhalte-nen Ergebnisse zeigen, daß das Riboflavin die Lyso-some vor der Chlorpromazin-Schädigung schützt. Diese Tatsache steht im Einklang mit der Behaup-tung, daß CPZ die angeführten Strukturen indirekt schädigt; bisher bestehen aber noch viele ungeklärte Fragen, die Gegenstand künftiger Untersuchungen sein werden.
Auf Grund der mitgeteilten Angaben könnte das Riboflavin zu den die Lysosomen-Membranen in vivo stabilisierenden Mitteln zugerechnet werden. Da sich dasselbe nicht als aktiv hinsichtlich der durch andere Substanzen (2.4-Dinitrophenol, CC14) hervorgeru-fenen Schädigungen erweist, wird es sich wahrschein-lich als ein Stabilisator mit spezifischer Wirkung er-weisen.
Der Umstand, daß die einen Substanzen (Korti-son, Hydrokortison u. a.) die Lysosome sowohl in vitro als auch in vivo bezüglich verschiedener Labili-satoren stabilisieren können, die anderen aber einen derartigen Effekt nur hinsichtlich eines oder meh-rerer ähnlich schädigender Agentien hervorrufen, er-fordert den Begriff Stabilisator im relativen Sinne aufzufassen.
