UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA
LUAN CÉSAR DA SILVA
IMUNOEXPRESSÃO DE CÉLULAS DENDRÍTICAS EM LESÕES
ORAIS POTENCIALMENTE MALIGNAS E CARCINOMA
ESPINOCELULAR ORAL
IMMUNOEXPRESSION OF DENDRITIC CELLS IN ORAL POTENTIALLY
MALIGNANT DISORDERS AND ORAL SQUAMOUS CELL CARCINOMA
Piracicaba
2019
LUAN CÉSAR DA SILVA
IMUNOEXPRESSÃO DE CÉLULAS DENDRÍTICAS EM LESÕES
ORAIS POTENCIALMENTE MALIGNAS E CARCINOMA
ESPINOCELULAR ORAL
IMMUNOEXPRESSION OF DENDRITIC CELLS IN ORAL POTENTIALLY
MALIGNANT DISORDERS AND ORAL SQUAMOUS CELL CARCINOMA
Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia de
Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas como
parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de
Mestre em Estomatopatologia, na Área de
Estomatologia.
Dissertation presented to the Piracicaba Dental School of
the University of Campinas in partial fulfillment of the
requirements for the degree of Master in
Stomatopathology, in Stomatology area.
Orientador: Prof. Dr. Pablo Agustin Vargas
Coorientador: Prof. Dr. Felipe Paiva Fonseca
Piracicaba
2019
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO
FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO
ALUNO LUAN CÉSAR DA SILVA, E ORIENTADA
PELO PROF. DR. PABLO AGUSTIN VARGAS E
COORIENTADA PELO PROF. DR. FELIPE PAIVA
FONSECA
Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): FAPESP, 2017/15633-0
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca da Faculdade de Odontologia de Piracicaba
Marilene Girello - CRB 8/6159
Silva, Luan César da, 1995-
Si38i Imunoexpressão de células dendríticas em lesões orais potencialmente
malignas e carcinoma espinocelular oral / Luan César da Silva. – Piracicaba,
SP : [s.n.], 2019.
Orientador: Pablo Agustin Vargas.
Coorientador: Felipe Paiva Fonseca.
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade
de Odontologia de Piracicaba.
1. Fibrose oral submucosa. 2. Leucoplasia bucal. 3. Carcinoma de células
escamosas. I. Vargas, Pablo Agustin, 1973-. II. Fonseca, Felipe Paiva, 1986-.
III. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Odontologia de
Piracicaba. IV. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Imunoexpression of dendritic cells in oral potentially maligant
disorders and oral squamous cell carcinoma
Palavras-chave em inglês:
Oral submucous fibrosis
Leukoplakia,
Oral squamous cell carcinoma
Área de concentração: Estomatologia
Titulação: Mestre em Estomatopatologia
Banca examinadora:
Pablo Agustin Vargas [Orientador]
Lívia Máris Ribeiro Paranaíba
Alan Roger dos Santos Silva
Data de defesa: 25-02-2019
Programa de Pós-Graduação: Estomatopatologia
Identificação e informações acadêmicas e profissionais do(a) aluno(a)
ORCID: https://orcid.org/0000-0001-9551-946X
Currículo Lattes: http://lattes.cnpq.br/9472608929730174
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Faculdade de Odontologia de Piracicaba
A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa de Dissertação de Mestrado, em
sessão pública realizada em 25 de Fevereiro de 2019, considerou o candidato LUAN
CÉSAR DA SILVA aprovado.
PROF. DR. PABLO AGUSTIN VARGAS
PROFª. DRª. LÍVIA MÁRIS RIBEIRO PARANAÍBA
PROF. DR. ALAN ROGER DOS SANTOS SILVA
A Ata da defesa, assinada pelos membros da Comissão Examinadora, consta no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da Unidade.
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, Messias e Lucrécia, meus
maiores ídolos e amores da minha vida.
“Acredite na força de seus sonhos, Deus é
justo e não colocaria em seu coração um
desejo impossível de ser realizado!”
- Autor desconhecido
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
A Deus, por me guiar e por todas as bênçãos concedidas.
Aos meus pais pelo amor incondicional. Agradeço por apoiarem e incentivarem
meu sonho. Tudo o que eu faço é para orgulhar vocês. Um dia ainda vou poder retribuir nem
que seja um terço de tudo o que vocês fazem por mim. Eu amo vocês!
AGRADECIMENTOS
O presente trabalho foi realizado com apoio da Fundação de Amparo à Pesquisa
do Estado de São Paulo (FAPESP), processo no 2017/15633-0.1
À Universidade Estadual de Campinas, na pessoa do Magnífico Reitor, Prof. Dr.
Marcelo Knobel.
À Faculdade de Odontologia de Piracicaba, na pessoa de seu Diretor, Prof. Dr.
Francisco Haiter Neto e seu Diretor Associado, Prof. Dr. Flávio Henrique Baggio Aguiar.
À Prof Dra. Karina Gonzales Silvério Ruiz, Coordenadora Geral da Pós-
Graduação da Faculdade de Odontologia de Piracicaba.
Ao Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Estomatopatologia Prof. Dr.
Márcio Ajudarte Lopes.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Pablo Agustin Vargas pela orientação e incentivo,
pelos ensinamentos, oportunidades e todo tempo dedicado a mim e a esse trabalho.
Ao meu coorientador, Prof. Dr. Felipe Paiva Fonseca, que mesmo à distância
sempre esteve disposto a contribuir mais com esse trabalho e consequentemente com a minha
formação.
Aos Profs. Drs. das Áreas de Semiologia e Patologia da Faculdade de Odontologia
de Piracicaba pelos constantes ensinamentos: Alan Roger dos Santos Silva, Edgard Graner,
Jacks Jorge, Márcio Ajudarte Lopes, Oslei Paes de Almeida e Ricardo Della Coletta. Aos
apoios técnicos essenciais da Fabiana. À Dani pela ajuda com os arquivos. Ao Emilio pelos
auxílios sempre que necessário.
Aos Profs. Drs. Raghu Radhakrishnan e Luiz Paulo Kowalski, pelo fornecimento
dos casos utilizados nesse trabalho. À doutoranda Marisol Miranda Galvis, por toda ajuda
com a amostra. Aos doutorandos Thayná Melo e Bruno Mariz pelo auxílio com as reações
imuno-histoquímicas. Ao doutorando Gleyson Amaral por todo apoio quando necessário.
À amiga Iara Aquino pela amizade que construímos durante o mestrado. Você é
um dos melhores presentes que a pós-graduação me deu. Obrigado por ser meu apoio, pelos
conselhos, conhecimentos, conversas, estudos, companheirismo e por sempre estar do meu
lado. Sou muito grato por Deus ter cruzado nossos caminhos. Amo você!
À amiga Ana Letícia, por ter embarcado nesse novo desafio comigo e pela nossa
amizade. Pelo apoio sempre que preciso e por nossas inúmeras conversas, mesmo que sem
nosso convívio diário. Amo você!
1 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP. Termo de Outorga e Aceitação de
Auxílios [acesso 2018 Nov 10]. Disponível em: http://www.fapesp.br/6569#7.
Aos amigos Rodrigo Soares e Natália Palmier, por toda amizade e amor
compartilhado esses anos. Vocês fizeram e fazem os meus dias mais felizes. À amiga Débora
Pereira por ter me acolhido e cuidado real como “irmão”. Agradeço diariamente por ser tão
parecido com você, você me inspira. Amo vocês!
Aos amigos Raísa Sales, João Scarini e Bruno Mariz pelo grupo que formamos.
Vocês foram essenciais nesse último ano. Sou muito grato por Deus e as circunstâncias terem
nos unido. “Room for two” pra sempre!
Aos amigos do programa de pós-graduação que ainda estão na luta e aqueles que
já concluíram sua passagem por aqui, Patrícia, Isabel, Carolzinha, Rachel, Léo, Florence, meu
muito obrigado pela amizade e todos os ensinamentos. Aos demais colegas do programa pela
convivência diária, amizade e apoio.
Ao Rebanho e Since 1995 por serem os melhores do mundo. Eu amo demais
vocês! Obrigado por sempre me apoiarem, entenderem minha ausência e torcerem por mim.
À minha família, por serem minha base.
RESUMO
O câncer de boca representa um grave problema de saúde publica em todo o mundo. Cerca de
90% das neoplasias de boca são carcinomas espinocelulares (CEC). O CEC possui etiologia
multifatorial, variando na incidência global representando a sexta malignidade mais comum
em todo o mundo, porém, em alguns países asiáticos, como Sri Lanka, Índia, Paquistão e
Bangladesh, é ainda mais prevalente. Em aproximadamente um terço dos casos, o CEC pode
surgir de lesões orais potencialmente malignas (LOPMs), como a leucoplasia oral (LO) e a
fibrose submucosa oral (FSO). Entretanto, o potencial de transformação maligna dessas lesões
é difícil de ser determinado apenas por parâmetros clínicos e microscópicos. Desta forma, a
importância do sistema imunológico no desenvolvimento e comportamento de lesões
potencialmente malignas (como a LO e a FSO) e francamente invasivas (como o CEC) tem
sido amplamente investigada. Nesse sentido, o objetivo desse trabalho foi determinar a
distribuição de células dendríticas (CD) imaturas, células de Langerhans e CD plasmocitóides
em FSO, CEC derivado de FSO, LO e CEC. Para isso, 14 casos de FSO, 9 de CEC-FSO, 8 de
LO 45, 45 de CEC e 8 de mucoceles foram retrospectivamente recuperados e tiveram seus
diagnósticos confirmados. Imunorreações contra CD1a, CD207 e CD303 foram realizadas e o
número de células positivas foi quantificado. Os resultados mostraram uma diferença
significativa para o anticorpo CD1a+ (p <0,01) e CD207+ (p <0,01). Uma diminuição
significativa foi observada em células CD1a+ em FSO (p≤0,05), CEC-FSO (p ≤ 0,01) e CEC
(p ≤ 0,001) quando comparado ao epitélio normal. Para as células CD207+ a significância foi
observada no CEC-FSO (p ≤ 0,05), e no CEC (p ≤ 0,01) quando comparado com o epitélio
normal, e na FSO quando comparada com o LO (p ≤ 0,05). Não houve diferença significativa
para o CD303 (p:0,09). Diante disso, concluímos que a diminuição do número de células
CD1a+ e CD207+ pode estar associada ao desenvolvimento de CEC, e nas LOPMs pode ser
um indicador de transformação maligna.
Palavras-chave: Fibrose Submucosa Oral. Leucoplasia Oral. Carcinoma Espinocelular. CD1a.
CD207. CD303.
ABSTRACT
Oral cancer is a public health major problem worldwide. Approximately 90% of oral
neoplasms are squamous cell carcinomas (OSCC). OSCC has a multifactorial etiology,
varying in the global incidence representing the sixth most common malignancy in the world,
but in some Asian countries like Sri Lanka, India, Pakistan, and Bangladesh, it is even more
prevalent. In approximately one-third of cases, OSCC can arise from oral potentially
malignant disorders (OPMDs), such as oral leukoplakia (OL) and oral submucous fibrosis
(OSMF). However, the malignant transformation potential of these OPMDs is difficult to
determine only by clinical and microscopic features. Thus, the importance of the immune
system in the development and behavior of OPMDs (such as OL and OSMF) and frankly
invasive lesions (such as OSCC) has been widely investigated. In this line, the aim of this
study was to determine the distribution of immature dendritic cells (DC) and plasmacytoid
DCs in OSMF, OSMF associated with OSCC (OSMF-OSCC), OL and OSCC. For this,
fourteen cases of OSMF, 9 of OSMF-OSCC, 8 of OL 45, 45 of OSCC and 8 of mucoceles
were retrospectively retrieved and had their diagnoses confirmed. Immunoreactions against
CD1a, CD207 e CD303 were performed and the number of positive cells quantified. The
results showed a significant difference for CD1a+ (p<0.01) and CD207+ (p <0.01) antibodies.
A significant decrease was observed in CD1a+ cells in OSMF (p≤0.05), OSMF-OSCC (p ≤
0.01) and OSCC (p ≤ 0.001) when compared to normal epithelium. For CD207+ the
significance was observed in OSMF-OSCC (p ≤ 0.05), and OSCC (p ≤ 0.01) when compared
with normal epithelium, and in OSMF when compared with OL (p ≤ 0.05). There was no
significant difference in CD303 (p: 0.09). In conclusion, the decrease in the number of CD1a+
and CD207+ cells may be associated with the development of OSCC, and in OPMDs might
be an indicator of malignant transformation.
Key-words: Oral Submucous Fibrosis. Oral Leukoplakia. Oral Squamous Cell Carcinoma.
CD1a. CD207. CD303.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AR – Antigen retrieval
CDs – Células Dendríticas
CEC - Carcinoma Espinocelular
CEC-FSO – Carcinoma Espinocelular associado à Fibrose Submucosa Oral
CL – Células de Langerhans
DCs – Dendritic Cells
FSO – Fibrose Submucosa Oral
HPV – Papiloma Vírus Humano
INCA – Instituto Nacional do Câncer
LO – Leucoplasia Oral
LOPM – Lesões Orais Potencialmente Malignas
MHC – Complexo de histocompatibilidade
OL – Oral Leukoplakia
OMS – Organização Mundial da Saúde
OPMD – Oral Potentially Malignant Disorders
OSCC – Oral Squamous Cell Carcinoma
OSMF – Oral Submucous Fibrosis
OSMF-OSCC – Oral Submucous Fibrosis associated with Oral Squamous Cell Carcinoma
pDCs – Plasmacytoid Dendritic Cells
SI – Sistema Imunológico
TFG-b – Fator de Transformação do Crescimento-beta
WHO – World Health Organization
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO....................................................................................................................13
1.1 Fibrose Submucosa Oral e Carcinoma Espinocelular Oral associado à Fibrose
Submucosa Oral............................................................................................................13
1.2 Leucoplasia Oral e Carcinoma Espinocelular Oral.......................................................15
1.3 Sistema imunológico: o papel das células Dendríticas em lesões da cavidade
oral.................................................................................................................................18
2 ARTIGO: CD1a+ and CD207+ cells are reduced in oral submucous fibrosis and oral
squamous cell carcinoma……………………………………………………………………..20
3 CONCLUSÃO......................................................................................................................38
REFERÊNCIAS......................................................................................................................39
ANEXOS
ANEXO 1: CERTIFICADO DE APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM
PESQUISA ...............................................................................................................................51
ANEXO 2: VERIFICAÇÃO DE ORIGINALIDADE E PREVENÇÃO DE
PLÁGIO........................................................................................................................52
ANEXO 3: COMPROVANTE DE SUBMISSÃO DO ARTIGO................................53
13
1 INTRODUÇÃO
O carcinoma espinocelular (CEC) é a neoplasia maligna mais comum da
cavidade oral, representando um importante problema de saúde pública em todo o mundo,
devido a sua alta prevalência, especialmente em indivíduos do sexo masculino (Curado et
al., 2016; Mello et al., 2018).
A incidência do CEC revela uma importante variação epidemiológica de
acordo com a região estudada, atribuída a relação entre fatores de risco e hábitos
socioculturais (Warnakulasuriya et al., 2009; Curado et al., 2016;). Essa variabilidade
também é vista nas taxas de sobrevida, que podem ser modificadas de acordo com a etnia e
idade (Mello et al., 2018).
No Brasil, segundo o instituto nacional do câncer (INCA) foi estimado para o
biênio de 2018-2019, cerca de 14.700 novos casos de câncer de boca, em cada ano, sendo
essa considerada a quinta neoplasia maligna mais comum entre homens (INCA, 2017). Já
em alguns países do continente asiático como o Sri-Lanka, Índia, Paquistão e Bangladesh,
pode representar o tipo de câncer mais comum entre os homens (Warnakulasuriya et al.,
2009).
Muitos fatores podem estar relacionados com a sua etiologia, e diferenças nos
estilos de vida e influenciam na prevalência (Mello et al., 2018). Lesões orais
potencialmente malignas (LOPM) são lesões que podem evoluir para CEC e, algumas
dessas, independente do grau de displasia epitelial, podem apresentar alto potencial de
malignização (Maia et al., 2016).
Dentre essas lesões malignizáveis podemos citar leucoplasia oral (LO),
eritroplasia, queilite actínica e fibrose submucosa oral (FSO).
1.1 FIBROSE SUBMUCOSA ORAL E CARCINOMA ESPINOCELULAR ORAL
ASSOCIADO À FIBROSE SUBMUCOSA ORAL
A FSO é uma doença crônica insidiosa que acomete frequentemente a
população do sul e sudeste asiáticos, principalmente indianos, indicando associação com o
comportamento cultural (Khan et al., 2012; Ali et al., 2013; Tak et al., 2014; Raizada et al.,
2016, ,; Akakeri et al., 2016).
Uma série de fatores pode estar associada à etiologia da FSO, entretanto a
presença de alguns hábitos incorporados no comportamento cultural se sobressai. O
consumo excessivo de pimenta nos alimentos, a deficiência de vitaminas, a falta de água
potável, a desnutrição, susceptibilidade genética e autoimunidade também possuem
importante papel (Rajedran R. 1994; Chao et al., 2002; Radamass et al., 2005; Auluck et
al., 2008; Jayasooriya et al., 2011; Arakaeri et al., 2016).
14
Contudo, o principal fator para a sua predisposição é a atividade demasiada de
mascar a noz de areca, que pode ser uma prática realizada sozinha ou em diversas formas,
como Betel quid (paan), Gutka e Kharra. (Trivedy et al., 1999; Kaur et al., 2004; Ahmad et
al., 2006; Tsai et al., 2009; Ali et al., 2013; Tak et al., 2014; Sarode et al., 2016; Akareki et
al., 2016; Gadbail et al. 2017). Entretanto, esse produto pode ser consumido de diferentes
formas e quantidades, de acordo com os costumes da região; entre as suas misturas
podemos encontrar tabaco, cal apagada, catechu, entre outros.
Clinicamente, a FSO afeta a cavidade oral e pode se estender até a faringe ou
esôfago superior. Na cavidade oral, a mucosa vestibular, área retromolar e palato mole, são
as topografias de maior acometimento. Em estágio inicial, essa lesão se apresenta através
de ardência bucal, ulcerações ou vesiculações e enrijecimento da mucosa. Conforme a
lesão progride, uma mancha pálida e a intensidade da rigidez da mucosa se tornam
perceptíveis com bandas fibrosas submucosas palpáveis. A língua pode ficar imóvel,
reduzida em seu tamanho e desprovida de papilas. (Gondivkar et al., 2018).
A patogênese da FSO pode ser explicada pelo aumento da atividade
fibroblástica que pode ocorrer devido a uma reação inflamatória justa-epitelial. Essa
atividade fibroblástica edemaciada leva a produção e degradação de colágeno de forma
anárquica (Haque et al., 1997; Haque et al., 1998; Srinivasan et al., 2002; Ariyawardana et
al., 2006; Mehrotra et al., 2012; Kamath et al. 2016). Além disso, a noz de areca, de
natureza abrasiva, combinada com a cal apagada, de natureza alcalina, promovem traumas
químicos e mecânicos na mucosa, podendo resultar em cicatrização anormal (Angadi e
Rao 2012; Sarode et al., 2016; Gupta et al. 2016).
Esses processos ilustram a atrofia epitelial e rigidez da mucosa com
consequentemente limitação da abertura bucal. Entretanto, outros mecanismos com
interferência na expressão de colágeno e, portanto na patogênese da FSO são discutidos,
como o fator de transformação do crescimento beta (TFG-b) e a presença de cobre.
O TFG-b, secretado pelas células inflamatórias durante o processo de doenças,
atua no controle da síntese e degradação de componentes da matriz extracelular,
aumentando a expressão de colágeno tipo I (Haque et al., 1998; Yang et al., 2001; Angadi
e Rao 2010; Ranganathan e Kavitha 2011; Kale et al., 2013). Enquanto o cobre, que está
presente em altas concentrações na noz de areca pode contribuir para elevação e
insolubilidade da enzima lisil oxidase; que é fundamental para a reticulação e organização
do colágeno, (Tilakaratne et al., 2006; Auluck et al., 2008; Akakeri et al., 2012;
Tilakaratne et al.,2016).
Microscopicamente, a FSO é caracterizada pela deposição submucosa e
justaepitelial de tecido conjuntivo densamente colagenizado, hipovascular com variável
infiltrado inflamatório crônico. Alterações epiteliais incluem vesículas subepiteliais em
15
lesões iniciais e hiperqueratose com marcante atrofia epitelial em lesões mais antigas.
Displasia epitelial pode estar presente.
O potencial de malignização da FSO tem sido descrito em torno de 2,3 a 7,6%,
com o epitélio de superfície apresentando-se displásico em aproximadamente 7 a 26% dos
casos (Hashib et al., 2002; Kauor et al., 2004; Tilakaratne et al., 2006; Akakeri et al., 2016;
Raizada et al., 2016). Entretanto, esse potencial de transformação maligna é difícil de ser
determinado.
Contudo, sabe-se que a transformação das células pode ocorrer devido a uma
série de fatores, como alterações no ciclo celular, no DNA, nos queratinócitos, na
proliferação e sobrevivência de células tumorais, na angiogênese ou hipóxia tecidual
(Chaturved et al., 2017). Por essas condições, alguns pacientes com FSO podem
desenvolver CEC relacionado à FSO (CEC-FSO).
Como na FSO, o CEC-FSO possui forte associação com a noz de Areca, e em
consequência disso, essa entidade é a neoplasia maligna mais comum do sul e sudeste
asiático, sendo um grave problema de saúde pública nessa população (Haque et al., 1997;
Srinivasan et al., 2002; Ramadass et al., 2005; Aziz, 2008; Akakeri et al., 2013; Chang et
al., 2013). Entretanto, alguns estudos sugerem que essa seja um patologia biologicamente
diferente do CEC convencional, que pode ser explicado pelos diferentes mecanismos de
carcinogênse da areca, entre eles a capacidade de memória genética de diferenciação e
maturação mais rápidas das células epiteliais (Gadbail et al., 2017; Chaturved et al., 2017).
Em contraste com o CEC convencional, o CEC-FSO é visto frequentemente
em uma população mais jovem, composta principalmente por homens. Contudo, essa
entidade está associada a melhores fatores prognósticos, como tumores bem diferenciados
e menor incidência de metástase nodal (Gadbail et al., 2017; Chaturved et al., 2017).
No entanto, um exato potencial de transformação maligna é difícil de ser
determinado. Nesse sentido, é importante destacar que uma resposta imune adequada pode
proteger a mucosa de malignização (Pellicioli et al., 2017). Por isso, o sistema
imunológico tem sido investigado no desenvolvimento e comportamento das LOPM e
francamente invasivas, na tentativa de melhor compreender os mecanismos dessa
transformação.
1.2 LEUCOPLASIA ORAL E CARCINOMA ESPINOCELULAR ORAL
A LO é a LOPM que mais acomete a cavidade oral, com prevalência global
estimada em 2,6% (Montebugnoli et al., 2012; Abdullah et al., 2014; Warnakulasuriya e
Ariyawardana, 2016). A Organização Mundial da Saúde (OMS) descreve essa lesão como
uma placa esbranquiçada que não pode ser caracterizada clínica ou microscopicamente
como nenhuma outra, o que torna o diagnóstico dependente da exclusão de outras doenças
16
que se manifestam da mesma forma (Lima et al., 2012; Arduino et al., 2013; Liu et al.,
2015; Van der Waal. 2015; Yang et al., 2017).
Várias hipóteses são discutidas a respeito da etiologia da LO. Dentre os vários
fatores causais propostos, o tabagismo parece ser o mais importante, visto que cerca de 70
a 90% dos pacientes são tabagistas, estando a presença da lesão relacionada com a
freqüência e duração do hábito de fumar. (Feller e Lemmer, 2012)
Clinicamente, essa lesão pode afetar qualquer sítio da cavidade oral e
geralmente é dividida em homogênea e não homogênea, sendo a presença de
irregularidades, coloração ou textura na sua superfície o critério para essa classificação
(Feller e Lemmer, 2012). Além disso, a LO podem ser isoladas ou difusas e múltiplas,
sendo mais comuns em mucosa jugal, lábios e gengiva.
De modo geral, microscopicamente a LO apresenta acantose e
hiperparaqueratose acompanhadas ou não de displasia epitelial. Nesse sentido, as lesões
leucoplásicas podem ser separadas em displáscas e não-displásicas, sendo a classificação
do grau de displasia baseado na presença de alterações arquiteturais do epitélio de
superfície e de atipias celulares dos queratinócitos (Smitha et al., 2011).
Entretanto, é amplamente reconhecido que os critérios microscópicos
atualmente estabelecidos pela Organização Mundial da Saúde (OMS) para classificar o
grau de displasia epitelial destas lesões em leve, moderado e intenso, é de difícil
reprodutibilidade, o que gera uma importante variação inter- e intra-observador. Por este
motivo, a proposta de classificação binária que reconhece as lesões como sendo
classificadas em baixo risco e alto risco tem ganhado mais atenção por parte da
comunidade científica e de patologistas orais, em especial pelo maior potencial de
reprodução (Kujan et al., 2006; Pontes et al., 2009; Van der Waal. 2009; Liu et al., 2010).
O grau de displasia epitelial é reconhecido como sendo o principal indicador
do potencial de transformação maligna destas lesões. Entretanto, o índice médio de
transformação maligna dessas lesões é um índice fortemente mutável, variando de limites
baixos como 0,13% a até mais de 34% em diferentes estudos, sendo considerado um valor
médio de 14.9% (Lima et al., 2012, Arduino et al., 2013, Natekear et al., 2017). Em adição
a isso, LO em mulheres e em não fumantes, tempo de duração da lesão e localização em
assoalho bucal e língua têm sido associados ao risco aumentado de transformação maligna.
LOPM como a LO podem ser responsáveis em até um terço dos casos pelo
desenvolvimento de CEC, e esse por sua vez compreende mais de 90% de todas as
neoplasias de boca. Estimativas do Globocan 2018, mostram uma aumento de 354.864
novos casos de CEC, incluindo o CEC de lábio por ano em todo o mundo (Bray et al.,
2018). Já no Brasil, o INCA estimou para o biênio de 2018-2019 cerca de 11.200 novos
casos de câncer de boca, em cada ano.
17
Como já dito, a etiologia dessa patologia é multifatorial, entretanto uma
importante associação é percebida entre o uso pronlongado e sinérgico de tabaco e àlcool
(Warnakulasuriya et al., 2010, Santos-Silva et al., 2014). Recentemente, as cepas
carcinogênicas do papiloma virus humano (HPV) foram relacionadas ao desenvolvimento
de CEC, porém, interesssantemente o CEC de cavidade oral não têm sido tipicamente
associado com o HPV, diferentemente do CEC de orofaringe, por exemplo (Patel et al.,
2011).
Comumente, o CEC afeta pacientes do sexo masculino, com mais de 45 anos
de idade, entretando a incidência de CEC nesses pacientes está diminuindo e, por outro
lado, a incidência de CEC de língua tem aumentado em pacientes brancos e jovens
(Bondner et al., 2014). Apesar dessa evidência, é pouco provavel que a ocorrência de CEC
nesses pacientes seja fruto de LOPM, visto que essas são incomuns nesse segmento
populacional (Santos-Silva et al., 2014).
Clinicamente, o sítio anatômico intraoral mais frequentemente afetado pelo
CEC é a borda lateral de lingua, seguida pelo assoalho bucal, palato mole, zona retromolar
e gengiva (Santos-Silva et al., 2014). Além disso, ele pode se apresentar em formas
leucoplásicas ou eritroplásicas, mas é principalmente visto como úlceras ou nódulos com
infiltração tecidual e margens exofíticas elevadas.
Microscopicamente, uma miríade de características pode ser observada em
vários graus de diferenciação tumoral. Tumores bem diferenciados apresentam ilhas de
células epiteliais que invadem o tecido conjuntivo, com produção de queratina. Tumores
mais indiferenciados apresentam invasão dos tecidos adjacentes de formas distintas e
destrutivas. As células tumorais apresentam diferentes graus de pleomorfismos e mitoses
atípicas (Neville BW et al., 2016).
O prognóstico dos pacientes afetados pelo CEC de cavidade oral permanece
pobre e insatisfatório, com poucos avanços sendo observados ao longo das últimas
décadas, com índices de sobrevida após 5 anos permanecendo ao redor de 50%
(Warnakulasuriya et al., 2010; Rodrigues et al., 2014). Nesse sentido um amplo número de
estudos tem sido desenvolvidos com o objetivo de identificar marcadores moleculares que
contribuam com o estabelecimento do seu risco de transformação maligna e com o
potencial de determinação prognóstica para os pacientes afetados por CEC.
Portanto, seguindo a lógica de que o sistema imunológico pode auxiliar na
compreensão dos mecanismos de transformação maligna, bem como na capacidade de
reconhecer células malignas precursoras e destruí-las, temos demonstrado em estudos
anteriores o papel das células dendríticas (CDs) em algumas lesões. E nesse caminho,
encontramos uma redução de CDs em CEC labial e queilite actínica (Gomes et al., 2016),
bem como em CEC (Pellicioli et al., 2017).
18
1.3 SISTEMA IMUNOLÓGICO: O PAPEL DAS CÉLULAS DENDRÍTICAS EM
LESÕES DA CAVIDADE ORAL
O papel do sistema imunológico (SI) em lesões da cavidade oral tem sido
amplamente investigado, prinicipalmente pela sua capacidade de regular LOPM e lesões
francamente invasivas (Pellicioli et al., 2017). Entretanto, mecanismos de invasão tumoral
podem induzir à falhas desse sistema que pode ser explicada por muitas razões, como o
desenvolvimento de variantes tumorais que escapam ao reconhecimento imunológico ou à
regulação negativa das moléculas de classe do complexo de histocompatibilidade (MHC)
(Moreira et al., 2010).
William Coleu, em 1893, usou bactérias vivas como um estimulante imune
para tratar câncer, sendo criado o conceito de que o SI pode reconhecer e controlar o
crescimento do tumor. Contudo, devido à capacidade das células tumorais de evitar o seu
reconhecimento e eliminação por esse sistema, se faz um desafio entender como novas
abordagens podem auxiliar no controle dessa proliferação (Yang, 2015).
Sendo assim, podemos destacar a participação das CD que possuem uma
importante função no processo de apresentação antigênica aos linfócitos T CD4+. As CDs
são células que oferecem um número elevado de moléculas do MHC tipos I e II
responsáveis por dar início à resposta imune mediada por linfócitos B e T (Banchereau e
Steinman, 1998; Wang et al., 2017). Quando presentes na pele e mucosa recebem o nome
de células de Langerhans (CL), que, por sua vez, apresentam receptores para
imunoglobulinas e sistema complemento (Banchereau et al., 2000).
Essas células podem ser reconhecidas pela sua morfologia característica, em
que apresentam extensões dendríticas e alongadas. Entretanto, as CDs, podem sofrer várias
modificações moleculares e morfológicas, passando a expressar novos marcadores de
superfície e perdendo seus prolongamentos citoplasmáticos. Ao longo do processo
imunológico e após entrar em contato com os antígenos na epiderme, as CDs migram em
direção aos linfonodos para apresentação de antígenos aos linfócitos e assim dar início a
resposta imune (Albuquerque et al., 2003; Uphadyay et al., 2012).
Atualmente, são conhecidos três subtipos de CDs: convencionais,
plasmocitóides e derivadas de monócitos. As CDs convencionais ainda são subdivididas
em células migratórias ou células residentes em linfonodos. As CDs plasmocitoides são
caracterizadas por um subtipo raro e pela sua morfologia semelhante a plasmócitos. As
CDs derivadas de monócitos, são capazes de reconhecer antígenos e se localizam em
órgãos periféricos (Lande e Gilliet, 2010; Kushwah e Hu, 2011).
O uso de diferentes marcadores de CDs pode fornecer importantes informações
quanto à presença e distribuição destas células, mas também quanto ao seu processo de
maturação (Kikuchi et al., 2006). As CDs podem ser encontradas em dois diferentes
19
estados. As CDs no estado imaturo podem ser marcadas pelo CD1a e CD207; no estado
maduro podem ser marcadas através do CD40, CD54, CD58, CD80, CD83, CD86
(Mellman e Steinman, 2001). Já as CD plasmocitoides são imunoexpressadas por CD4,
CD45RA, CD303, CD123 e ILT-3.
Peliciolli et al., (2017) avaliaram a expressão de CDs e células T em displasia
epitelial e CEC, através dos marcadores CD1a, CD83 e CD303. Os resultados mostraram
uma significante diminuição das CDs. E também sugeriu que as CD plasmocitoides podem
desempenhar um importante papel na defesa do organismo contra os tumores, devido ao
aumento dessas células em CECs.
Narayanan et al., (2015) avaliaram a presença de CDs em 39 casos de FSO,
sendo submetidos à analise imuno-histoquímica através do marcador CD1a. Os resultados
mostraram um número significativamente maior de CDs na FSO do que nos tecidos
normais, além de maior prevalência também no estágio avançado da lesão.
Gomes et al. (2016) investigaram a distribuição de CDs em queilite actínica e
CEC de lábio, através dos marcadores CD1a e CD83. Os resultados sugeriram que a
dimuinção de CD1a+ e aumento de CD83+ poderia representar um dos principais passos
para o desenvolvimento de câncer de lábio.
Jardim et al. (2018) investigaram a distribuição de CDs em CEC de língua e
assoalho bucal, através dos marcadores CD1a e CD83. Os resultados mostraram que a
diminuição das células CD1a+ pode estar relacionado com maiores taxas de recorrência e
sobrevida diminuída.
Além dos trabalhos citados acima, vários grupos investigaram a relevância de
CDs no contexto da carcinogênese oral, entretanto os estudos possuem uma significativa
variabilidade na forma de interpretar os resultados obtidos e no modo de identificar as CDs
por meio de diferentes marcadores imuno-histoquímicos. Contudo, a maioria dos estudos
disponívies na literatura que analisaram CDs em neoplasias malignas e lesões precursoras
apresentam sua diminuição (Jardim et al., 2018). Nesse sentido, nós buscamos melhor
entender a importância das CDs para o desenvolvimento de CEC oral e de suas LOPM.
20
2 ARTIGO
CD1a+ AND CD207+ CELLS ARE REDUCED IN ORAL SUBMUCOUS FIBROSIS
AND ORAL SQUAMOUS CELL CARCINOMA
Running title: CD1a+ and CD207+ in oral squamous cell carcinoma
Key-words: Oral cancer, premalignant lesions, leucoplakia, immune response
Authors: Luan César da Silva1, Felipe Paiva Fonseca
2, Oslei Paes de Almeida
1, Bruno
Augusto Linhares de Almeida Mariz1, Márcio Ajudarte Lopes
1, Raghu Radhakrishnan
3,
Luiz Paulo Kowalski4, Pablo Agustin Vargas
1.
1Department of Oral Diagnosis of Piracicaba Dental School, University of Campinas;
Piracicaba, São Paulo, Brazil
2Department of Oral Surgery and Pathology, School of Dentistry, University of Minas
Gerais, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brazil;
3Department of Oral Pathology and Microbiology of the Manipal Academy of Higher
Education;
4Department of of Head and Neck Surgery and Otorhinolaryngology, A. C. Camargo
Cancer Center, São Paulo, Brazil.
Correspondence
Pablo Agustin Vargas, Department of Oral Diagnosis – Oral Pathology, Piracicaba Dental
School, University of Campinas
Av Limeira, 901 – 13414-016
Piracicaba, São Paulo, Brazil.
Email: [email protected]
21
Abstract
Background: Oral squamous cell carcinoma (OSCC) is associated with
different etiological and sociocultural factors, and may arise from previous oral
potentially malignant disorders (OPMD) such as oral leukoplakia (OL) and oral
submucous fibrosis (OSMF). Immune system cells, including dendritic cells (DCs) have
been studied in several malignant neoplasms to determine their importance for human
carcinogenesis. Therefore, this study investigated the distribution of immature DCs,
Langerhans cells and plasmacytoid DCs in OSMF, OSMF associated with OSCC
(OSMF-OSCC), OL, and OSCC.
Methods: Fourteen cases of OSMF, 9 of OSMF-OSCC, 8 of OL¸ 45 of
OSCC and 8 of normal epithelium were retrospectively retrieved and their diagnoses
confirmed. Immunoreactions against CD1a, CD207 e CD303 were performed and the
number of positive cells quantified.
Results: A significant decrease of CD1a+ was found in OSMF (p≤0.05),
OSMF-OSCC (p ≤ 0.01), and OSCC (p ≤ 0.001) when compared to normal epithelium.
For CD207+ the significance was observed in OSMF-OSCC (p ≤ 0.05), and OSCC (p ≤
0.01) when compared with normal epithelium, and in OSMF when compared with OL (p
≤ 0.05). There was no significant difference for CD303, but increased in CD303+ was
observed in OSCC when compared with normal epithelium.
Conclusion: The decrease in the number of CD1a+ and CD207+ cells
may be associate to the development of oral OSCC, and in OPMDs they might be
indicators of malignant transformation
Keywords: premalignant lesions, oral submucous fibrosis, oral squamous
cell carcinoma, immune response.
22
Introduction
Oral squamous cell carcinoma (OSCC) accounts for more than 90% of all
oral malignant neoplasms, representing the sixth most common malignancy worldwide
(Curado, 2016). In some Asian countries like Sri Lanka, India, Pakistan and Bangladesh,
OSCC is even more prevalent (Warnakulasuriya, 2009). This variability in the global
incidence of OSCC has been attributed to cultural habits, including the consumption of
tobacco, alcohol, and areca nut. In approximately one third of the cases, OSCC may
arise from oral potentially malignant disorders (OPMD), such as oral leukoplakia (OL)
and oral submucous fibrosis (OSMF).
According to the World Health Organization (WHO), OL is defined as a
whitish plaque that cannot be characterized clinically or microscopically as any other
entity (Van der Waal I, 2015; Yang, 2017). Tobacco smoking has been observed in 70-
90% of the patients with OL, (Feller & Lemer, 2012) and the risk of malignant change
varies significantly depending on clinical and pathological features.
OSMF represents a public health problem, mainly in India. Previous studies
have associated OSMF with use of areca nut, which is potentially carcinogenic;
however, the biological mechanisms involved are not well established (Angadi &
Krishnapillai, 2012; Gadbail, 2017). The most common malignant neoplasm in South
and Southeast Asia is OSMF associated with OSCC (OSMF-OSCC) (Akakeri &
Brennan, 2013; Chang, 2013). OSMF is a fertile soil for malignancy and various grades
of OSCC do arise in background of OSMF (Figure 1). Moreover, malignancy occurs at
an accelerated pace in OSMF due to convergence of several pathways and mechanisms
(Sharma, Kumar, Johar & Sabir, 2017). Additionally, arecoline a component of arecanut
has been shown to induce genomic instability by producing aberrances of mitotic spindle
assembly and spindleassembly Checkpoints (Wang, 2010). It seems that the OSCC
arising from OSMF and that arising from OL carry widely varying prognostic
implications, and there is an imperative need to study the same.
23
The immune system has an important role in regulating OPMD and frankly
invasive lesions. Dendritic cells (DCs) are antigen-presenting cells responsible for
starting the immune response mediated by B and T lymphocytes (Wang, 2017). An
adequate immune response protects the mucosa from malignant transformation
(Pellicioli, 2017). The distribution of DCs has been studied in several lesions for their
ability to recognize precursor malignant cells and to destroy them. We have previously
demonstrated a reduction of DC in lip SCC and in actinic cheilitis if compared to normal
lip mucosa (Gomes, 2016), as well as in OSCC if compared to normal oral mucosa
(Pellicioli et al., 2017), however, difference in the distribution of DC between OSCC
and OSMF-OSCC is unknown. Therefore, in the current study we attempted to
determine the distribution of immature DCs, Langerhans cells and plasmacytoid DCs
(pDCs) in OSMF, OSMF-OSCC, OL, and OSCC.
Material and Methods
The study was approved by the ethical committee of the Piracicaba Dental
School (protocol: 69395817.8.0000.5418). This study includes cases of OSMF (n=14)
and OSMF-OSCC (n=9) retrieved from the files of the Department of Oral Pathology
and Microbiology of the Manipal Academy of Higher Education (Manipal, Udupi,
Karnataka, India) and another 8 and 45 cases of OL and OSCC from the files of two
institutions: Piracicaba Dental School, University of Campinas, Brazil; and AC
Camargo Cancer Center, São Paulo, Brazil. Clinical information such as gender, age
and risk factors was collected from patients’ records. Eight cases morphologically
normal epithelial tissue adjacent to mucoceles were used as control.
Two independent oral pathologists reviewed the original 5µm histological
sections stained with hematoxylin and eosin (H&E) of all cases and confirmed the
diagnoses. Immunohistochemistry was carried out on 3µm sections of the original
formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Slides were dewaxed with xylene and
24
rehydrated in descending ethanol solutions (absolute, 90%, 80% and 70%). Antigen
retrieval was performed using Tris/EDTA (pH: 8.0) and the endogenous peroxidase
activity was blocked using 10% hydrogen peroxide. Slides were washed in PBS buffer
(pH 7.4) and incubated at room temperature for 120 min with the antibodies: CD207
(Clone EPR15863; Abcam, USA) CD303 (Clone 124B3.13, 1:50; Dendritics, USA) and
CD1a (Clone 010, RTU; DAKO Co., USA).
All slides were subsequently exposed to an avidin–biotin complex
containing appropriate secondary antibody (Vectastain Elite ABC kit; Vector
Laboratories, Burlingame, CA, USA). The diaminobenzidine tetrahydrochloride (Sigma,
St. Louis, MO, USA) was used for the immunochemical reactions according to the
manufacturer’s instructions; the samples were counterstained with Carazzi
haematoxylin.
Dendritic cells were manually quantified by one previously trained observer.
Ten sequential fields randomly were selected and photographed at 200x magnification
for positive cell counts. The quantification was performed based on the methodology
described by Pellicioli et al 2017. DCs were quantified in the epithelial tissue in the
OSMF and OL groups and in the epithelial infiltrative component and connective tissue
from OSMF-OSCC and OSCC groups.
The software GraphPad Prism (version 5.0, San Diego, California, USA)
was used for the statistical analysis. Data were submitted to analysis of variance
(ANOVA) and Tukey tests at a significance level of p < 0.05.
Results
Clinical data are shown in Table 1. Males predominated in all lesions. Mean
age for the OSCC group (58.5 years) was higher than in the OSMF-OSCC group (36.5
years). Use of isolated tobacco was reported in 64.4% of the cases in the OSCC group,
25
whereas the use of kharra in the OSMF-OSCC and OSMF groups was registered in
55.5% and 35.7%, respectively.
Table 2 shows the distribution of DCs for all groups. We demonstrate a
significance reduction for CD1a+ and CD207+. DCs were identified as ramified cells in
normal/neoplastic epithelium and connective tissues highlighted by the specific
antibodies staining the cell membrane. Figures 2 and 3 shows a decrease in the
distribution of CD1a+ and CD207+ cells in the OSCC group when compared with the
normal epithelium used as control. CD1a+ and CD207+ cells were observed throughout
the epithelium, while, in the connective tissue, they were more prevalent in the tumor
nests of the OSMF-OSCC and OSCC lesions.
A slight increase in the amount of DCs was observed in CD303. The
concentration of CD303+ cells was increased in all groups when compared to the
control group (normal epithelium). The mean of CD303+ (Table 2) was 0.13 in the
control group, while in the other groups were found values such as 0.38 (OL), 0.21
(OSMF), 2.22 (OSMF-OSCC) and 2.73 (OSCC). However, no statistical difference was
found for CD303 for all groups studied.
Table 3 shows the significant decrease in CD1a+ and CD207+. We observed
which in CD1a was differences in OSMF (p≤0.05), OSMF- OSCC (p ≤ 0.01), and
OSCC (p ≤ 0.001) when compared to normal epithelium. For CD207 in OSMF-OSCC
(p ≤ 0.05), and OSCC (p ≤0.01) when compared to normal epithelium, and this
reduction was also seen in OSMF when compared with OL (p ≤ 0.05).
Discussion
The role of the immune system cells in oral diseases have been widely
investigated (Pellicioli et al., 2017; Gomes et al., 2016; Costa, 2016). Such cells,
especially the DCs, are responsible for recognizing the antigen, processing it, and
presenting it to T cells, essential steps to regulate the innate and adaptive immunity
26
systems (Jardim, Gondak, Galvis, Pinto, Kowalski, 2018). Our study investigated the
distribution profile of the DCs in OSMF, OSMF-OSCC, OL, and OSCC and revealed a
significant decrease of CD1a+ and CD207+ cells in oral cancer and OSMF, but not for
CD303 positive cells.
Several DC subtypes are present in the oral mucosa and the concentration of
these cells may vary according to the anatomical topography (Horav, 2014). Our
findings show a decrease in CD1a+ and CD207+ cells in all the groups studied when
compared to the normal epithelium, except in OL in CD1a+. Follow this line, it is
interesting to study the imbalance in DCs in OPMD and frankly invasive lesions, which
can result in less activity of the immune response.
Among the markers available for detecting DCs are S100, CD1a, CD83, CD207,
CD208, CD80, CD11c, CD86, CD303 and HLA-DR (Jardim et al., 2018; Perez, 2005).
In our study, CD1a, CD207, and CD303 were selected based on previous studies
investigating different malignant neoplasms and the biological behavior of such
markers. CD1a and CD207 are effective in identifying immature DCs and Langerhans
cells. CD303 is used to identify pDCs, which are resident in lymphoid or non-lymphoid
organs and are responsible for the production of type I interferon (Moschos, Varanasi &
Kirkwood, 2005; Zitvogel, Galluzzi, Kepp, Smyth & Kroemer, 2015).
DCs have been investigated in several malignant neoplasms like colorectal,
gastric, and breast (Gulobova, 2012; Hu, 2014; Iwamoto, 2003). The participation of
these cells is needed for the induction of an effective antitumor immune response
because of the ability to recognize and capture tumor antigens at the primary tumor site.
However, for this to happen, DCs needed to migrate to lymph nodes to present the
antigens them to naïve T lymphocytes (Gonçalves, 2016). This finding might account
for the significant reduction in the CD1a+ cells in all groups in our study.
A decrease in the number of DCs in oral leukoplakias has been associated with a
27
higher risk of malignant transformation (Pellicioli et al., 2017; Jardim et al., 2018).
Additionally, in OL cases DCs decreases occur in the presence of smoking habit and
increases occur in larger lesions and in the presence of dysplasia (Souto, Matias, Nunes,
Ferreira & Mesquita, 2018). Certainly, our results show higher CD207+ expression in
OL when compared to controls indicating intact DCs function in this stage (Table 2 &
Figure 2).
A reduction in the distribution of DCs was observed in the OSCC when
compared with the OL. Such reduction resulted in a decrease in the presentation of
antigens, a condition that may favor the development and the progression of OSCC
(Jardim et al., 2018). This analysis might allows better understand the role of malignant
transformation.
Previous studies show the increase of CD303+ cells was associated with
organism defense (Pellicioli et al., 2017). Our study demonstrated an increase in
CD303+ in OSFM when compared to the control group. Furthermore, the additional
increase was seeing in OL, follow of more expressive increase in OSMF-OSCC and
OSCC, respectively. This increase in CD303+ cells and a successive major production
of type I IFN can offer the course of defense mechanism (Zitvogel et al., 2005).
However, additional studies with more cases are needed for supporting this.
The antitumor immune responses may vary according to the individuals’ health
status (Gondak, Alves, Silva, Mauad, & Vargas, 2012). It is well established that OSMF
is associated with the chew of areca nuts; whereas OL it is strongly associated with the
use of isolated tobacco (Feller et al., 2012; Gadbail et al., 2017; Akakeri, 2017). It was
previously shown that in Oral mucosa DCs are decreased in smokers than in
nonsmokers, a condition that can reduce the individual’s immune response (Costa et al.,
2016).
In OSMF group further depletion of DCs occurs when compared OL group, as
28
evidenced CD207 expression. In OSCC group there is additional depletion of DCs when
compared to OSMF group. Finally, the DCs depletion is greatest in the OSCC-OSMF
group. This indicates that arecanut use may induce DCs depletion to far greater extent
than that achieved by tobacco use alone. DCs induce a specific anti-tumor immune
response to T cells, reducing tumor mass and minimizing cancer risks. The expression
of CD207 receptor on DCs allows efficient antigen presentation coupled with MHC-I
and MHC-II to CD8+T cells and CD4+Tcells, (Idoyaga, 2008) therefore downregulation
of this receptor on DCs implies suppression of T cell responses as well. A greater
decrease in DCs and downregulation of T-cell responses in cases of OSCC-OSMF might
allow the development of tumor variants that escape immune recognition, translate
faster to tumor progression, lower survival rates, and poorer prognosis when compared
to conventional OSCC.
In conclusion, the decrease in the number of CD1a+ and CD207+ cells
may be associate to the development of oral OSCC, and in OPMDs they might be
indicators of malignant transformation. Our preliminary results indicate that arecanut
chewing may produce a greater suppression of immune cell function when compared to
cigarette smoking alone. Further studies on these cellular alterations are needed for a
better understanding of the differential malignant transformation of OPMDs like OL and
OSMF, and their impact on the disease pathogenesis and prognosis.
Conflict of Interest
Silva, LC does not have conflicts of interest to declare.
Fonseca, FP does not have conflicts of interest to declare.
Almeida, OP does not have conflicts of interest to declare.
Mariz, BALA does not have conflicts of interest todeclare.
Lopes, MA does not have conflicts of interest to declare.
Radhakrisnan, R does not have conflicts of interest to declare.
29
Sharma, M does not have conflicts of interest to declare.
Kowalski, LP does not have conflicts of interest to declare.
Vargas, PA does not have conflicts of interest to declare.
Ethics committee/institute
The study was approved by the ethical committee of the Piracicaba Dental
School (protocol: 69395817.8.0000.5418).
30
Tables:
Table 1. Clinical features of OL, OSMF, OSMF-OSCC, and OSCC groups.
Age*
(years)
Gender
(M:F)
Isolated
Tobacco
Alcohol Betel
quid
Kharra Gutkha
n (%) n (%) n (%) n (%) n (%)
Control (n = 8) 20.13 4:4 - - - - - - - - - -
OL (n = 8) 67.88 3:5 4 50 1 12.5 - - - - - -
OSMF (n = 14) 28.14 11:1 5 35.7 - - 4 28.6 5 35.7 3 21.4
OSMF-OSCC (n = 9) 36.56 7:2 3 33.3 0 0 0 0 5 55.5 0 0
OSCC (n = 45) 58.42 35:10 29 64.4 23 51.1 - - - - - -
*Mean age; M:F, Male: Female
31
Table 2. Quantification of positive cells for all the antibodies in each group.
Antibody Group Mean and SD p-value
CD1a ControlA 101.25 ± 58.18 <0.0001
OL
A 89.13 ± 67.60
OSMF
B 57 ± 42.97
OSMF-OSCC
B 40.11 ± 22.44
OSCCC 17 ± 10.86
CD207 ControlA 71.13 ± 47.92 <0.0001
OL
AB 75.63 ± 31.60
OSMF
A 35.67 ± 25.65
OSMF-OSCC
B 26.89 ± 26.15
OSCCC 27.71 ± 29.43
CD303 Control 0.13 ± 0.35 0.0919
OL 0.38 ± 1.06
OSMF 0.21 ± 0.58
OSMF-OSCC 2.22 ± 2.49
OSCC 2.73 ± 4.84
SD, standard deviation. Different upper-case letters indicate the statistical difference
comparing each group through the ANOVA test with significant level of P<0.05.
32
Table 3. Comparison between all the groups for CD1a and CD207 antibodies by Tukey
analysis.
CD1a OL OSMF OSMF-OSCC OSCC
Control ns 0.05 0.01 0.001
OL
ns 0.05 0.001
OSMF
ns 0.01
OSMF-OSCC
ns
CD207 Control ns ns 0.05 0.01
OL
0.05 0.05 0.01
OSMF
ns ns
OSMF-OSCC
ns
ns, no significance
33
Figure legends:
Fig. 1 - Representative clinical images of patients affected by Oral Submucous Fibrosis
(OSMF) and OSMF associated with oral squamous cell carcinoma (OSCC) (OSMF-
OSCC). (A) OSMF clinically demonstrating a whiteness and fibrosis of the retromolar area
and soft palate. (B) OSMF-OSCC with extensive ulcerative areas.
Fig. 2- Histopathological features and immunohistochemical detection of immature
dendritic cells and Langerhans cells (LCs) of control group (mucocele), oral leukoplakia
(OL), oral submucous fibrosis (OSMF), OSMF associated with OSCC (OSMF-OSCC) and
oral squamous cell carcinoma (OSCC). (A) Histologically normal oral epithelium without
dysplastic alterations (hematoxylin and eosin – H&E; 200x). (B) Microscopic features of
OL (H&E; 200x). (C) Microscopic features of OSMF demonstrating submucosal and
justaepithelial deposition of collagenated connective tissue (H&E; 200x). (D) OSFM-
OSCC with infiltrative features and cellular atipia (H&E; 200x). (E) OSCC demonstrating
infiltrative tumor nests (H&E; 200x). (F) Immunohistochemical expression of CD1a+ cells
in the epithelium tissue of the control group (mucocele). (G) OL group. (H) OSMF. (I)
OSMF-OSCC. (J) OSCC. (K) CD207+ cells in the control group (mucocele). (L) OL
group. (M) OSMF. (N)OSMF-OSCC. (O) OSCC. There was a remarkable decrease of
CD1a+ and CD83+ cells in the OSCC group.
Fig. 3- Distribution of immature dendritic cells (CD1a+), Langerhans cells (CD207+) and
plasmacytoid dendritic cells (CD303+) in the epithelial compartment of the control group,
leukoplakia, and oral submucous fibrosis, and in the tumor nests of the OSMF-OSCC and
OSCC group. Immature DC were significantly decreased in OSMF, OSMF-OSCC e
OSCC when compared to the control group, and LC also were significantly decreased in
OSMF-OSCC e OSCC when compared to the control group.
34
Fig. 1 - Representative clinical images of patients affected by Oral Submucous Fibrosis
(OSMF) and OSMF associated with oral squamous cell carcinoma (OSCC) (OSMF-
OSCC). (A) OSMF clinically demonstrating a whiteness and fibrosis of the retromolar area
and soft palate. (B) OSMF-OSCC with extensive ulcerative areas.
35
Fig. 2- Histopathological features and immunohistochemical detection of immature dendritic cells and Langerhans cells (LCs) of control group (mucocele),
oral leukoplakia (OL), oral submucous fibrosis (OSMF), OSMF associated with OSCC (OSMF-OSCC) and oral squamous cell carcinoma (OSCC). (A)
Histologically normal oral epithelium without dysplastic alterations (hematoxylin and eosin – H&E; 200x). (B) Microscopic features of OL (H&E; 200x). (C)
Microscopic features of OSMF demonstrating submucosal and justaepithelial deposition of collagenated connective tissue (H&E; 200x). (D) OSFM-OSCC
with infiltrative features and cellular atipia (H&E; 200x). (E) OSCC demonstrating infiltrative tumor nests (H&E; 200x). (F) Immunohistochemical expression
of CD1a+ cells in the epithelium tissue of the control group (mucocele). (G) OL group. (H) OSMF. (I) OSMF-OSCC. (J) OSCC. (K) CD207+ cells in the
control group (mucocele). (L) OL group. (M) OSMF. (N)OSMF-OSCC. (O) OSCC. There was a remarkable decrease of CD1a+ and CD83+ cells in the OSCC
group.
36
37
Fig. 3- Distribution of immature dendritic cells (CD1a+), Langerhans cells (CD207+)
and plasmacytoid dendritic cells (CD303+) in the epithelial compartment of the control
group, leukoplakia, and oral submucous fibrosis, and in the tumor nests of the OSMF-
OSCC and OSCC group. Immature DC were significantly decreased in OSMF, OSMF-
OSCC e OSCC when compared to the control group, and LC also were significantly
decreased in OSMF-OSCC e OSCC when compared to the control group.
CD1a+
Contr
ol
Leuko
plaki
a
OSM
F
OSM
F-OSCC
OSCC
0
50
100
150
200
CD207+
Conto
l
Lekopla
kia
OSM
F
OSM
F-OSCC
OSCC
0
50
100
150
CD303+
Contr
ol
Leuko
plaki
a
OSM
F
OSM
F-OSC
C
OSC
C
0
5
10
15
20
25
38
3 CONCLUSÃO
A diminuição do número de células CD1a+ e CD207+ pode estar associada ao
desenvolvimento de CEC;
A diminuição do número de células CD1a+ e Cd207+ em LOPMs podem ser
indicadores de transformação maligna;
Mais estudos com um maior número de casos são necessários para melhor
compreensão da transformação maligna em LO e FSO.
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ANEXO 1 – CERTIFICADO DE APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM
PESQUISA
52
ANEXO 2 – VERIFICAÇÃO DE ORIGINALIDADE E PREVENÇÃO DE
PLÁGIO
53
ANEXO 3 – COMPROVANTE DE SUBMISSÃO DO ARTIGO
