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Incertidumbredemedicinenqumica analtica.Recta decalibracin

Celia Puglisi*, Fernando Kornblit ,+

+

* DPNM Departamento de Patrones Nacionales de MedidaCEFIS Centro de Investigacin y Desarrollo en Fsica

INTI Instituto Nacional deTecnologa Industrial

CC 157 San Martn (1650) Buenos Aires - Argentina

cpuglisi@inti.gov.ar; ferk@inti.gov.ar

1.INTRODUCCIN

La evaluacin de la incertidumbre de medicinen la qumica analtica ha despertado en losltimos aos un marcado inters y ha promovidomuchas discusiones. Se acepta en general que,

para evaluar si un resultado de anlisis es aptopara el propsito al cual se lo destinar, esindispensable realizar una estimacin de laincertidumbre demedicin y compararla con losrequerimientos correspondientes. Son conocidoslos documentos de referencias en cuanto a lametodologa de evaluacin de incertidumbres demedicin en general (1), y en qumicaanalticaenparticular(2).

Esta metodologa requiere que se identifiquentodas las posibles fuentes de incertidumbre

asociadas con el proceso de medicin y que seestime su valor, ya sea por medios estadsticos(evaluacin de tipo A), o por otros medios(evaluacin de tipo B). Posteriormente secombinan estos componentes individuales paraobtener las incertidumbres estndar y expandidaparael procesototal.

El mtodo usualmenteutilizado por los qumicosanalticos para calcular incertidumbres haceusodel concepto de comportamiento global delmtodo, utilizando informacin del tipo de la

precisin o la recuperacin, obtenida de lavali dacin del mtodo o por estudioscolaborativos (3), (4), Esta metodologa, lejos decontraponerse, puede inclui rse dentro delalcance de (1) y (2), para modelos de medicinadecuados. Sin embargo, el anlisis de lasdistintas fuentes de incertidumbre permiteevaluar las etapas del procesodemedicin y, por

1.- INTRODUCTI ON

There is growing recognition of the importance

of measurement uncertainty to assuring

reliability of chemical analysis. It is generally

accepted thatin order to demonstrate fitnessfor

purpose of analytical results it is necessary toevaluate the uncertainty of measurement and

compare this value with the requirements. The

referencedocumentsprovidingmethods for this

evaluation are well known, both for general

measurements (1) and for chemical

measurements(2).

This methodology requires the identification of

all possible sources of uncertainty associated to

the measurement process and an estimation of

their value,either bystatistical methods(TypeA)

or by other means (Type B). Later on theindividual components are combined to

calculate the standard and expanded

uncertainty for thewholeprocess.

The most popular method generally used by

analytical chemists to evaluate uncertainty i s

based on the concept of "global behavior of the

method", using information such asprecision or

recovery,obtainedduringthemethodvalidation

or from collaborative studies (3), (4). This

method is included in the procedures described

in (1) and (2), using the proper measurementmodel, buttheanalysis ofthedifferentsourcesof

uncertainties allows to identify variables that

could have a significant effect on the method

performance. In this way, the critical steps can

beidentify, controlledandimprovedif possible.

Uncertainty of measurement inanalytical chemistry.

Calibration line

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lo tanto, distinguir las que pueden ser crticas,paracontrolarlasy mejorarlassi fueraposible.

Un proceso de medicin tpico en la qumicaanaltica instrumental puede, por lo generaldividirse en dos etapas, una en la cual la

muestra se somete a un proceso previo quepuede ser de concentracin, de disgregacin,calcinacin, extraccin, etc., tendiente a aislarel analito de inters y a separarlo lo mejorposible de la matriz, y otra etapa en la cual lamuestra as procesada sesometea la medicinen algn equipo previamente calibrado. Lacalibracin involucrael establecimientodeunarelacin entrela respuestadel instrumento(porlo general lineal) y uno o ms valores dereferencia. El proceso de medicin completo,con los componentes de incertidumbre

relacionadas con cada etapa del mismo, puederesumirseenel siguienteesquema:

A typical measurement process in instrumental

analytical chemistry can be conveniently

described in terms of an isolation stage and a

measurement stage. The isolation stage can

involve processes like digestion, evaporation,

solvent extraction, etc., to separate the analite

from the matrix. The next stage consists of ameasurement in an instrument properly

calibrated.

The calibration of the instrument requires to

establish a relationship (usually linear) between

theinstrument response when a referencesample

is measured.

Thisprocesshasbeen summarized in thefollowing

diagram:

Preparacin delas disoluciones

de calibracin

Dosaje de lasdisoluciones de

calibracin

Medicin de la sealproducida por las

disoluciones

Clculo de la rectade calibracin

Tratamientoprevio de la

muestra

Dosaje de lamuestra

Medicin de la sealproducida por la

muestra

Clculo de laconcentracin

del analito

Componentesasociados a

purezamediciones

volumtrcaspesadasProcesos decertificacin

incertidumbreasociada al ajuste

(falta de linealidad)

Incertidumbreasociada,estimada por

recuperacinanlisis de CRManlisis de muestrasenriquecidas

Incertidumbre combinada

repetibilidad

del volumen

de inyeccin

repetibilidaddel equipo

Components

Asociated to:4Purity

4Volumetricmeasurements

4Weighing

4Certificationprocess

Preparation of

calibratigsolutions

Dosage

of the calibratingsolutions

Sample

preparation andpre-treatment

Uncertainty

estimated using:

4recovery data4analysis of CRM

4analysis ofenriched samples

Dosage of

sample

Repetibility ofthe injection

process

Measurement of

the calibrationresponses

Repeatability ofthe instrument

Measurement of

the sampleresponse

Calculation of thecalibration curve

Uncertainty associated toThe fitting

(lack of linearity)

Calculation of theconcentration of

analiteCombined uncertainty

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Los factores mostrados en cuadros grisesrepresentan componentes de incertidumbre queafectan a algunas delas variables de entrada quesedescribenen estetrabajo.

A continuacin se propone un procedimiento

para la evaluacin de la incertidumbre en laconcentracin del anali to, combinandoadecuadamente todas las contribuciones. Enparticular,nohasidohastaahorasuficientementediscutida en la bibliografa la inclusin de lasincertidumbres asociadas a las concentracionesdelasdisoluciones decalibracin u otro materialde referencia utilizado para calibracin, en elmodelo matemtico utilizado para ajustar lacurvadecalibracin.

Un ejemplo deestetratamiento puedeverseen laNormaISO 6143, recientementemodificada, parael casode lamedicin decomposicindemezclasdegasespor cromatografa gaseosa(5).

En el presente trabajo no sern considerados loscomponentes asociados al tratamiento previo dela muestra, los cuales deben discutirse para cadacaso en particular y validarse para cada mtodoespecfico.

Los datos experimentales obtenidos para laconfeccin de l a curva de calibracin puedenexpresarsecomo:

2.MODELOASOCIADOALAMEDICION

donde las x representan las concentraciones

asignadas a los materiales de referencia y las y

indicanlascorespondientesrespuestasgeneradaspor el equipo o sistema de medicin.

Considerando el caso de comportamiento lineal,la expresin matemtica para la recta decalibracin es:

n

n

y = a + bx

This paper proposes a procedure to evaluate the

uncertainty in the concentration of the analite,

adequately combiningall thecontributions.

Up to now, the inclusion of the uncertainties

associated to the calibrating solutions or to other

reference materials used for calibration of the

measuring instrument in the mathematical

model used to fit the calibration curve has not

been convenientlydiscussedin theliterature.

An example of this calculation can be found in

the ISO Standard 6143, recently modified,

dealing with the analysis of gas mixtures by gas

chromatography (5).

The uncertainty components associated to the

isolation stage will not be discussed in this case,

as they should be analyzed in each particular

caseand validated foreachparticular method.

The experimental data obtained for the

calculationofthecalibrationcurveare:

2.- MATHEMATICAL MODEL ASOCIATED TO

THEM EASUREM ENT

where x designatethe concentration assigned to

the calibration standards and y the

correspondingmeasuredresponses.

Assuminga linear behavior:

i

i

( ) ( ) ( )nn yxyxyx ,,....,,,, 2211

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dondeel smbolo _

significapromedio,(por

ejemplo, y .),

Se denominar e = y _ a bx al i-simo

residuo respecto de la recta. Esto es, a ladiferencia, en direccin del eje , entreel punto(x,y)ylarectadecalibracin.

La desviacin estndar residual dada por la

frmulasiguiente:

i i i

i i

_

y

(2)

indica si es correcto el modelo lineal paraajustar alosdatos,y asu vez cuantifica(con n-2

grados de libertad) la incertidumbre estndarasociadaatal ajuste.

Luego de obtener la recta de calibracin, paradeterminar la concentracin de la muestraanalizada se mide la misma en forma repetida,

por ejemplo veces ( ), obteniendorespuestasy ,...,y .

Finalmente, la concentracin incgnita(resultadodelamedicin) escalculadacomo

m 1m o1 om

(3)

wherethesymbol meansaverage,(E.g. ) and .

_

To check whether or not thefitting is correct, the

residual atxi can becalculated:e = yi i_a_bx I

This is the amount by which the actual observed

value differs from the fitted value. This is the

difference, in thedirection of the axe, between the

value (x, y) and the calibration line (the fitted

value). Theresidual standard deviation is given by

thefollowingformula:

y

i i

This valueindicates if thepostulated linear model

to fit the data is correct and at the same time this

quantity can be use to evaluate ( with n-2 degreesoffreedom) thestandard uncertainty associatedto

such fitting.

After the calibration curve have been obtained

with the above mentioned procedure, the

concentration of an unknown sample can be

measured getting the responses of the measuring

instrument.

If the number of measured replicates is m

and the obtained responses are , the

concentration of the sample ( result of themeasurement)canbecalculated as

( ),

y ,...,y

m 1o1 om

y se obtiene segn la estimacin usual decuadrados mnimos, de acuerdo con lassiguientesfrmulas:

(1)

theleastsquareestimatesarecalculated:

;;2

xbya

S

yxyxb

x

=

=

nyxyx ii= nyxyx ii=( )222 xxxS = ( )222 xxxS =

2

2

=

n

es

i

e

b

ayx

= 00

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Como a y b se obtienen de la ec.(1), debeentenderse que los datos de entrada para elclculodex son x ,...,x , y ,...yn , y ,...y .

Por lo tanto, para evaluar la incertidumbre dex ,

debern tenerse en cuenta, por un lado, las

incertidumbres(estndar) individualesasociadasa cada uno de los componentes de entrada:u(x ),...,u(x ), u(y ),...,u(y ), u(y ),...,u(y ), ascomo tambin las correlaciones entre ellos. Porotro lado deben considerarse los coeficientes desensibilidad (1) asociados a cada una de estascontribuciones, a fin de combinarlas. Laexpresin matemtica de estos coeficientes desensibilidadseencuentraen el item3.

Se suponen de aqu en adelante las siguienteshiptesis parael modelo:

(a) Las componentes de incertidumbreu(y ),...,u(y ), asociadas a los valores deobtenidoscomorespuestadel instrumentoparalaconfeccin de la recta de calibracin sonconsideradas todas del mismo orden y sedesignan comou . En casode queestasuposicin

no se cumpla, la recta de calibracin deberaobtenerse por el mtodo de cuadrados mnimosponderados.

(b) Las componentes de incertidumbreu , asociados a las respuestas del

equipo de medicin al medir la muestraincgnita, son consideradas todas del mismoorden ysedesignan comou

Sesuponequeloscomponentesdeincertidumbreasociados a los diferentes valores de no sern

siempredel mismoorden.

Existen situaciones en lasque lasincertidumbresasociadasalos materialesdereferencia utilizadospara la calibracin u(x ) son funcin de lasconcentraciones x . Asimismo, pueden existircorrelaciones entre las incertidumbres de lasdisoluciones decalibracin, debido, por ejemplo,

o n

o

y

1 o1 om

1 n n o1 om

1 n

0y

i

1

1

o1 om

o

o

i

y

x

(y ),...,u(y )

(c) No hay correlaciones entre los componentesde a las respuestas e.(d)No hay correlaciones entrelas incertidumbresasociadasalas e yalasvariables .

incertidumbres asociadas

respuestas

y y

y y x

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The parameters a y b can be calculated using

eq.(1), andthedata used to calculatex are

To evaluate theuncertainty associated to x , two

aspectsshould betaken into consideration:

-The individual standard uncertainties

associated to each set of experimental values

- Thecorrelationbetween them

o

o

x ,...,

x , y ,...yn , y ,...y .

u(x ),...,u(x ), u(y ),...,u(y ), u(y ),...,u(y ),

In order to combine these individual

contributions, thesensitivitycoefficientsmustbe

consideredand calculated(seeitem3).

From here on, the followingassumptions will be

made:

(a ) The components o f uncer ta i nty

u(y ),...,u(y ), associated to the y values

obtained for the calibration line areconsidered

of thesameorder (a value u , common to all of

them). In case this assumption is not valid, the

calibration line should be calculated using

another model, for instance a weighted least

squarefitting.

(b) The components o f uncer tai nty

u(y ),...,u(y ), associated to the responses

obtained duringthe measurement of thesampleare also considered of the same order (a value

u , common toall ofthem).

(c) There is no correlation among the

uncertainty components assigned to the

responsesvalues( and values).

(d) There is no correlation among the

componentsofuncertaintyassociated with ,

and .

The components of the uncertainty associated

with thequantities are not necessarily of the

sameorder.

In some cases the uncertainty values u(x )

associated to the concentration x of the

calibration solutions can be proportional to the

concentration, that is to say, the value of the

1

1n o1 om

1 n 1 n o1 om

1 n

y

o1 om

0y

o

o

i

i

i

y y

y y

x

x

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3.COEFICIENTESDESENSIBILIDAD

x

Se calculan, de acuerdo a la ref. (1), como lasderivadas parciales del resultado de medicin,

respectodecadauno delos componentes deentrada,obtenindose:

o

(5)

Y por lo tanto, de la ec. (2) se obtiene elcoeficienterelacionadoconlasvariables yi

(6)

(7)

Sumando los cuadrados de todas estas

derivadas parciales, y eliminando trminos desuma nula, se obtiene la siguiente expresin,queserreemplazadaen la ec.(4):

(4)

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3.- SENSITIVIT Y COEFFICIENTS

Accordingto (1)theycanbeexpressed as:

Considering equation (3) the sensitivity

coefficients related to the variables y can be

expressedasi

Addingthesquareofall thepartial derivativesand

eliminatingthetermswithnul lvalue, thefollowingexpression is obtained, which will be substituted

intoequation(4)yieldingthefollowingformula

uncertainty associated with very diluted solutions

could bebigger than thecorrespondingvalue ofthe

concentrated solution. In some other cases a

correlation could exist between them and a

correlation coefficient, r , should be used to

indicatethedegree between and .

Takinginto account the above considerations, the

uncertainty in the measured concentration x can

becalculated usingthefollowingequation:

ij

i j

o

ofcorrelation x x

al uso de un mismo material de referencia quese diluye sucesivamente o por el uso de unmismo material volumtrico para preparardiferentes disoluciones de referencia.Llamaremos al coeficiente de correlacinentrex y x .

Aceptando las hiptesis anteriores, laexpresin general para la incertidumbre de xpuedeescribirseas:

riji j

o

( )

( ) ( ) ( ) ( )jxuixujxix

ox

jijxixcorrixu

n

i ix

ox

yu

n

i iy

oxyou

m

j oiy

oxoxu