qwertyuiopasdfghjklzxcvbnm qwertyuiopasdfghjklzxcvbnm qwertyuiopasdfghjklzxcvbnm qwertyuiopasdfghjklzxcvbnm qwertyuiopasdfghjklzxcvbnm qwertyuiopasdfghjklzxcvbnm qwertyuiopasdfghjklzxcvbnm qwertyuiopasdfghjklzxcvbnm qwertyuiopasdfghjklzxcvbnm qwertyuiopasdfghjklzxcvbnm qwertyuiopasdfghjklzxcvbnm qwertyuiopasdfghjklzxcvbnm qwertyuiopasdfghjklzxcvbnm qwertyuiopasdfghjklzxcvbnm qwertyuiopasdfghjklzxcvbnm Instituto Tecnológico de Mexicali Instituto Tecnológico de Mexicali Instrumentos Clínicos de Laboratorio Aplicación de Instrumentación Biomédica 01/10/2008 Luis Antonio Mendoza Gómez 04490548 Julio Cesar Camacho Figueroa 04490337
Un espectrofotómetro es un instrumento usado en la física óptica que sirve para medir, en función de la longitud de onda, la relación entre valores de una misma magnitud fotométrica relativos a dos haces de radiaciones. También es utilizado en los laboratorios de química para la cuantificación de sustancias y microorganismos.
Hay varios tipos de espectrofotómetros, puede ser de absorción atómica o espectrofotómetro de masa.
Figura 1. Espectrofotómetro
Este instrumento tiene la capacidad de proyectar un haz de luz monocromática a través de una muestra y medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha muestra. Esto le permite al operador realizar dos funciones:
1. Dar información sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra
2. Indicar indirectamente que cantidad de la sustancia que nos interesa está presente en la muestra
Componentes de un espectrofotómetro
Fuente de luz
La misma ilumina la muestra. Debe cumplir con las condiciones de estabilidad, direccionabilidad, distribución de energía espectral continua y larga vida. Las fuentes empleadas son lámpara de tungsteno y lámpara de arco de xenón.
Monocromador
El monocromador aísla las radiaciones de longitud de onda deseada que inciden o se reflejan desde el conjunto, se usa para obtener luz monocromática. Está constituido por las
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rendijas de entrada y salida, colimadores y el elemento de dispersión. El colimador se ubica entre la rendija de entrada y salida Es un lente que lleva el haz de luz que entra con una determinada longitud de onda hacia un prisma el cual separa todas las longitudes de onda de ese haz y la longitud deseada se dirije hacia otra lente que direcciona ese haz hacia la rendija de salida.
Fotodetectores
En los instrumentos modernos se encuentra una serie de 16 fotodetectores para percibir la señal en forma simultánea en 16 longitudes de onda, cubriendo el espectro visible. Esto reduce el tiempo de medida, y minimiza las partes móviles del equipo.
Funcionamiento de un espectrofotómetro de reflectancia
Los espectrofotómetros de reflectancia miden la cantidad proporcional de luz reflejada por una superficie como una función de las longitudes de onda para producir un espectro de reflectancia. El espectro de reflectancia de una muestra se puede usar, junto con la función del observador estándar CIE y la distribución relativa de energía espectral de un iluminante para calcular los valores triestímulos CIE XYZ para esa muestra bajo ese iluminante.
Figura 2. Funcionamiento de un espectrómetro de reflectancia
El funcionamiento de un espectrofotómetro consiste básicamente en iluminar la muestra con luz blanca y calcular la cantidad de luz que refleja dicha muestra en una serie de intervalos de longitudes de onda. Lo más usual es que los datos se recojan en 31 intérvalos de longitudes de onda (los cortes van de 400 nm, 410 nm, 420 nm… 700 nm). Esto se consigue haciendo pasar la luz a través de un dispositivo monocromático que fracciona la luz en distintos intérvalos de longitudes de onda. El instrumento se calibra con una muestra o loseta blanca cuya reflectancia en cada segmento de longitudes de onda se conoce en comparación con una superficie de reflexión difusa perfecta.
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La reflectancia de una muestra se expresa como una fracción entre 0 y 1, o como un porcentaje entre 0 y 100. Es importante darse cuenta de que los valores de reflectancia obtenidos son valores relativos y, para muestras no fluorescentes, son independientes de la calidad y cantidad de la luz usada para iluminar la muestra. Así, aunque los factores de reflectancia se midan usando una fuente de luz concreta, es perfectamente correcto calcular los valores colorimétricos para cualquier iluminante conocido.
Geometría óptica de un espectrofotómetro
La geometría óptica del instrumento es importante. En algunos instrumentos, se usa una esfera integradora que permite iluminar la muestra de forma difusa, de forma igualada desde todos los ángulos, mientras que la luz reflejada se recoje en un ángulo aproximádamente perpendicular a la superficie de la muestra.
Figura 3. Geometría estándar de un espectrofotómetro de reflectancia
Otros instrumentos, por el contrario, iluminan la muestra desde un ángulo determinado y recojen la luz reflejada desde otro ángulo. Un caso típico es que la muestra se ilumine desde un ángulo de 45º con respecto a la superficie y que la luz reflejada se mida desde un ángulo 0º. A esto se le llama "geometría 45º/0º. Lo contrario es la geometría 0º/45º. Las geometrías basadas en la esfera antes mencionadas se conocen como D/0 y 0/D. Es extremadamente difícil establecer la correspondencia de medidas tomadas entre instrumentos cuya geometría óptica no sea idéntica. Para la mayoría de las superficies, la
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reflectancia cambia según los ángulos de iluminación y observación. Las cuatro geometrías estándares establecidas por CIE son:
1. Iluminación difusa y toma de la luz en la normal (D/0).
2. Iluminación en la normal y toma de la luz difusa (0/D).
3. Iluminación a 45º y toma de la luz en la normal (45/0)
4. Iluminación en la normal y toma de la luz a 45º (0/45).
Los colorímetros miden los valores triestímulos de forma más directa y funcionan usando tres filtros de amplio espectro. En consecuencia, los colorímetros no pueden proporcionar datos de reflectancia espectral, pero muchas veces son preferibles a los espectrofotómetros debido a su bajo coste de fabricación y facilidad de transporte.
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Cromatografía
En cromatografía de gases se incluyen todos los métodos cromatográficos en los que la fase móvil es un gas (gas portador), siendo la fase estacionaria un líquido (CGL) o un sólido (CGS). Se desarrolla en una columna cerrada en la que se encuentra retenida la fase estacionaria y por la que se hace pasar el gas portador, la técnica de separación es la elución.
Iniciado el proceso cromatográfico los componentes de la mezcla se distribuyen entre la fase estacionaria y la fase móvil; la elución tiene lugar forzando el paso de un gas inerte a través de la columna. La fase móvil no interacciona con el analito y su única misión es la de transportar la muestra.
La cromatografía gas-sólido tiene una fase estacionaria sólida en la cual se produce la retención de los analitos debido a la adsorción física sobre la superficie del sólido. Esta técnica ha tenido una aplicación limitada debido a la tendencia de los picos de elución a formar colas y a la retención semipermanente de gases activos sobre la fase estacionaria.
La cromatografia gas-líquido (objeto de estudio en este capítulo) se basa en la distribución del analito entre una fase móvil gaseosa y una fase estacionaria líquida inmovilizada sobre la superficie de un sólido inerte (soporte) o en las paredes interiores de la columna, si ésta es capilar. La técnica ha sido ampliamente desarrollada en los últimos años en el análisis de compuestos volátiles (punto de ebullición inferior a 400oC). La limitación es debida a que las muestras se deben de introducir como gas en cabeza de columna; cuando son líquidas sevolatilizan instantáneamente en el bloque de inyección del cromatógrafo. Martin y Synge, en 1941, definieron la técnica y en 1955 aparece en el mercado el primer cromatógrafo.
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Esquema de un cromatógrafo de gases
Las partes esenciales de un equipo cromatográfico son
Fuente de gas portador (botella a presión) Sistema de regulación de caudales (válvula reguladora y manómetro) Bloque termostatado de inyección de las muestras. Columna termostatada, conteniendo la fase estacionaria. Detector termostatado, con amplificador de señal y registro gráfico. Caudalímetro de precisión.
El gas portador es un gas inerte, generalmente helio, nitrógeno o argón, de elevado grado de pureza. El caudal del mismo que pasa por la columna, ha de ser conocido y controlado.
El bloque de inyección, para introducir los solutos en la corriente de gas portador y vaporizar las muestras cuando éstas no son gaseosas. Así, la temperatura del bloque ha de ser superior a la del punto de ebullición del componente de la mezcla menos volátil.
Las columnas pueden ser con relleno, en las que la fase estacionaria líquida está retenida sobre un sólido inerte (soporte) y capilares ó semicapilares, en las que la fase estacionaria se fija sobre las paredes interiores del capilar. La temperatura de la columna depende de los puntos de ebullición de los componentes de la mezcla. El detector tiene por objeto medir la variación de alguna propiedad física del gas portador originada por la elución de los compuestos. La temperatura del detector ha de ser mayor o igual que la de columna para evitar la condensación de algún compuesto eluido.
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Registro gráficamente de la medición del detector. La separación de los compuestos de una mezcla se realiza en las siguientes etapas,
1. Una vez elegida la columna y fase estacionaria, se ajustan las temperaturas de la cámara de inyección, columna y detector, así como el caudal de gas portador. Cuando la señal del detector es constante (sin ruidos la línea base) se hace la inyección de la muestra.
2. Las muestras se inyectan en cantidades inferiores a 1 μl cuando son líquidas y sobre 1 ml si son gaseosas; se introducen en la cámara de inyección, donde se vaporizan, y son arrastradas hasta cabeza de columna.
3. Los componentes se fijan en una pequeña zona de la columna; por equilibrios sucesivos entre fase móvil y estacionaria cada componente se desplaza por la columna a velocidades diferentes.
4. Finalmente, los solutos que salen de la columna, pasan al detector y se obtiene el cromatograma.
Los parámetros que definen una separación cromatográfica gas-líquido son, tipo de gas portador y caudal del mismo; columna y dimensiones de la misma; fase estacionaria; tipo de detector; temperatura del bloque de inyección, de la columna y del detector.
Fase móvil
Ha de ser un gas inerte, que no interaccione con la fase estacionaria ni con el analito, como el helio, el argón, el nitrógeno y el hidrógeno. La elección del gas portador se hace, frecuentemente, en función del detector. El nitrógeno, helio y hidrógeno suele utilizarse con los detectores de ionización de llama (FID). El argón con el detector de captura electrónica (ECD). El helio e hidrógeno con el detector de conductividad térmica (TCD), por su elevada conductividad; si bien el hidrógeno es un fuerte reductor, lo que puede limitar su uso.
La velocidad de flujo se controla por medio de reguladores de presión, manómetros y medidores de flujo. El rango de presiones varía entre de 0,7 a 3,5 kg/cm2 por encima de la presión ambiental, lo que proporciona una velocidad de flujo desde 25 a 50 ml/min en las columnas de relleno y de 1 a 25 ml/min en las columnas capilares. El caudal de gas portado se mide al final de la columna, mediante un medidor de pompas de jabón.
Sistema de inyección
La eficacia de la columna obliga a que la muestra sea de un tamaño adecuado y que se aplique instantáneamente; inyecciones lentas o muestras de volumen excesivo producen ensanchamientos de las bandas y disminuye la eficacia.
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La muestra se introduce en el bloque de inyección con una microjeringa a través de una membrana de caucho o silicona (septum), figura 5.2. La cámara de inyección es de acero inoxidable o níquel con un sistema de calefacción eléctrico y un aislamiento térmico que permita mantener una temperatura constante, 50OC por encima del punto de ebullición del analito.
En las columnas de relleno, la cantidad de muestra líquida máxima es de 10 μl; en columnas capilares se utilizan muestras mucho más pequeñas, del orden de 10-3 μl. El inyector para columnas capilares suele disponer de un sistema de división de flujo (split/splitless) para que a la columna solamente pase una pequeña fracción de la muestra, desechando el resto. Las muestras gaseosas se inyectan mediante una válvula automática y en mayor cantidad.
Los requisitos que debe cumplir un sistema de inyección son producir bandas iniciales lo más estrechas posibles y no alterar la composición de la mezcla que llega a la columna.
Tipos de columnas
Existen dos tipos de columnas, principalmente, de relleno y capilares o semicapilares. Contiene la fase estacionaria y en ella tiene lugar la separación cromatográfica.
Las columnas de relleno suelen ser de cobre, acero inoxidable, aluminio, vidrio y teflón; con un diámetro interior entre 2 y 4 mm y una longitud entre 2 y 3 m. La eficacia está en torno a 1.000-2.000 (platos teóricos/m). Suelen emplearse para muestras poco complejas, máximo 10 componentes.
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La columna está rellena de un material sólido (soporte), finamente dividido y homogéneo; recubierto, por una capa de 0,05-1 μm de espesor, de fase estacionaria líquida. Está configurada en forma helicoidal, con un diámetro de unos 15 cm, para poder ser instalada en el horno termostatizado.
Las columnas capilares tienen un diámetro interior inferior a 1 mm (320-250 μm) y una longitud de 5 a 50 m. Suelen construirse con sílice fundida que le dan gran resistencia física y flexibilidad. Alcanzan una eficacia hasta de 4.000 (platos teóricos/m) y se usan para muestras complejas. La fase estacionaria se depositada sobre las paredes interiores del tubo capilar.
Otro tipo de columnas capilares son con soporte recubierto, en la que la superficie interna del capilar está recubierta de una capa de material de soporte (tierras de diatomeas) de 30 μm, lo que permiten una mayor cantidad de fase estacionaria y por tanto de muestra.
Las columnas semicapilares tienen un diámetro interior de 530 μm que admiten cantidades de muestra similares a las columnas de relleno, y proporcionan mayor eficacia que éstas.
Una de las variables importantes en el desarrollo cromatogáfico, como se indicó con anterioridad, es la temperatura de la columna; temperatura óptima es función de los puntos de ebullición de los componentes de la muestra y del grado de separación deseado.
En muestras de parecidos puntos de ebullición la temperatura óptima es ligeramente superior al punto de ebullición medio de los componentes de la muestra. En el caso de muestras complejas, en la que los puntos de ebullición de los distintos componentes son muy diferentes, se recomienda emplear una programación de temperatura, aumentando ésta continuamente a medida que avanza la separación. El aumento de la temperatura reduce los tiempos de retención.
Fase estacionaria. Soporte sólido
La fase estacionaria de una columna cromatográfica ha de reunir una serie de requisitos como:
Baja volatilidad, su punto de ebullición debe de ser por lo menos 100oC superior a la temperatura máxima de operación de la columna.
Estabilidad térmica. Inercia química. Los valores del factor de capacidad (k´) y del factor de selectividad (α) de los analitos
deben estar dentro de los intervalos aconsejados.
La separación en cromatografía gas-líquido se debe a los diferentes coeficientes de reparto del analito entre la fase móvil y la fase estacionaria y tiene que haber un cierto grado de solubilidad de los compuestos con la fase estacionaria. Por ello, una característica muy importante de la fase estacionaria es la polaridad. Siguiendo el principio de
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"semejantes disuelven a semejantes" los solutos se retienen más en las fases líquidas de polaridad parecida, lo que permiten obtener mejores separaciones.
Las fases estacionarias compuestas de hidrocarburos y de dialquilsiloxanos son poco polares, las compuestas por poliéster son muy polares. En cuanto a posibles compuestos objeto de separación, los alcoholes, ácidos y aminas son polares; los ésteres cetonas y aldehidos tienen polaridas intermedia; y son de baja polaridad los hidrocarburos saturados.
Otro factor a tener en cuenta son los límites de temperatura que puede soportar la fase estacionaria, el límite inferior será el punto de fusión o temperatura a la que la viscosidad de la fase líquida es muy elevada, lo que haría disminuir la eficacia. El límite superior es la temperatura a la que la presión de vapor de esta fase sea 0,1 mm Hg (250oC inferior al punto de ebullición) por encima de esta temperatura se produce arrastre de la fase líquida, lo que lleva consigo efectos en el detector (ruido, suciedad), interferencias con los solutos y en suma, deterioro de la columna. En una fase líquida cualquiera, una serie homóloga se eluye según orden creciente de número de átomos de carbono. Si la fase es no polar, los solutos no polares eluyen según orden creciente de punto de ebullición. En una fase polar se retendrán más los solutos polares que los no polares a igualdad de puntos de ebullición.
Otro aspecto ha desarrollar, relacionado con la fase estacionaria, es el soporte sólido empleado en las columnas de relleno; el objetivo es el de proporcionar una superficie elevada donde depositar la fase líquida en forma de película muy fina para proporcionar una mayor superficie de contacto entre fase móvil y fase estacionaria.
Las características de los soportes sólidos son, una elevada superficie específica (1m2/g); una superficie homogénea; estabilidad térmica; geometría adecuada; baja dispersión de tamaño de las partículas, entorno a 150-250 μm; dureza mecánica; inercia química y naturaleza porosa.
Los soporte, más generalizados, son los de silíceo como las tierras de diatomeas o sintéticos; de vidrio y de polifluorocarbonados (teflón). Los soportes de diatomeas están constituidos por residuos de algas unicelulares diatomáceas que se unen formando filamentos.
Hay unas 10.000 especies de diatomeas con esqueletos diferentes, pero parecida estructura. Tienen una superficie específica de 1 m2/g. El constituyente mayoritario es de anhídrido silícico SiO2 (90%), tratado con un fundente alcalino a 1.600oC se obtiene el producto comercial conocido como Chromosorb W de superficie poco adsorbente por lo que es muy útil para separar compuestos polares.
Otro soporte es el de polvo de ladrillo refractario conocido como Chromosorb P, C-22 y Sterchomel, tiene mayor resistencia mecánica y superficie específica que el anterior, pero es muy activo y no se puede utilizar con compuestos polares.
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Los soportes de silicatos en columnas de relleno y en las paredes interiores de sílice fundida, en las columnas capilares, provocan adsorciones no deseadas de analitos polares, lo que da como resultado picos cromatográficos distorsionados.
Se ha demostrado que este fenómeno se debe a los grupos silanol (-SiOH) que se forman en la superficie de los silicatos debido a la humedad. El silanol tiene gran afinidas por las moléculas orgánicas polares. Este proceso puede desactivarse por sililación con dimetilclorosilano, Cl2Si (CH3)2, que elimina el H del silanol formando ClH.
Detectores
Un detector es todo dispositivo capaz de medir una propiedad física del gas
portador, la cual varía con la presencia de pequeñas cantidades de analito; debe reunir una serie de características:
Alta sensibilidad (relación entre la respuesta del detector y la magnitud física de la muestra detectada)
Buena estabilidad Respuesta continua y reproducible a los cambios de concentración del compuesto Respuestas adecuadas al mayor número posible de muestras Tiempo de respuesta corto Reactividad nula.
Los detectores más comunes son: a) Detectores de conductividad térmica, se basa en los cambios en la conductividad
térmica de la corriente de gas portador debido a la presencia de moleculas del analito que abandona la columna. Responde a la concentración del soluto en el gas portador y no es destructivo.
El elemento principal es una "célula de conductividad térmica" que consiste en un bloque de material buen conductor del calor, con una cavidad a través de la cual fluye el gas portador. En su interior, se coloca un hilo de platino, a temperatura 40ºC superior a la del bloque. La pérdida de calor del elemento caliente depende de la conductividad térmica del gas.
En el bloque se perforan dos cavidades, conteniendo cada una de ellas un hilo de platino calentado; por una de ellas pasa gas portador puro y por la otra el gas portador que sale por la columna, para medir conductividades relativas.
Los elementos sensores están incorporados a un puente de Wheatstone; cuando pasa solamente gas portador puro a través de ambas células, el puente se equilibra a cero; cuando eluye un componente, la conductividad térmica de la mezcla (gas portador-analito) varía, por lo que cambia la temperatura del elemento sensible de la correspondiente célula. Como consecuencia de esto, hace lo mismo la resistencia
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del filamento y se desequilibra el puente, produciendo una variación de potencial que se mide en un milivoltímetro.
Un último requisito es que la conductividad térmica del gas portador ha de ser elevada, caso del helio e hidrógeno que es de seis a diez veces mayor que la mayoría de los compuestos orgánicos.
Otras consideraciones sobre el detector de conductividad térmica son, la sencillez, el amplio rango lineal, respuesta a todo tipo de compuestos, carácter no destructivo, y baja sensibilidad (10-8 g soluto/ml) que impiden su utilización con columnas capilares, debido al pequeño tamaño de las muestras.
b) Detector de ionización de llama, es uno de los más usados en cromatografía de gases; el gas portador procedente de la columna se mezcla con hidrógeno que sale por una tobera. En el extremo de ésta, se aporta aire y forma una llama que quema e ioniza los compuestos separados en la columna.
En la parte superior se encuentran dos electrodos entre los que se establece una diferencia de potencial; el analito ionizado en la llama y ocasiona un paso de corriente entre los electrodos que se registra, figura 5.4. Los gases portadores que se utilizan son el helio, nitrógeno e hidrógeno.
Este detector es insensible a grupos funcionales como carbonilo, alcohol, halógenos y amina que originan en la llama pocos iones; lo mismo ocurre con el He, Ar, Kr, Ne, Xe, O2, N2, CS2, H2S, SO2, NO, N2O, NH3, CO, CO2, H2O, CH4, SiHCl3, SiF4. Por otra parte, posee una elevada sensibilidad (10-13 g soluto/ml) y es destructivo.
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c) Detectores de captura electrónica, se basa en la captura de los electrones libres procedentes de la ionización del gas portador; disminuyendo, por tanto, la intensidad de corriente de ionización. Son muy sensibles (10-14 g soluto/ml) y no son destructivos.
La célula de conductividad consta de un ánodo, un cátodo y una fuente radiactiva de Ni63 que produce partículas ß. Entre el ánodo y el cátodo se establece una diferencia de potencial suficiente para recoger todos los electrones pero no los iones.
Se utiliza Argón-metano 95-5 como gas portador para evitar la formación de iones metaestables. Cuando el Ar-CH4 se introduce en la célula, sus moléculas se bombardean por las partículas ß y la ionización del gas da origen a electrones libres. La atracción de estos electrones al ánodo crea una corriente base.
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Si una muestra susceptible de capturar electrones (hidrocarburos clorados) se encuentra en la corriente de gas portador y entra en la célula de captura electrónica reduce la corriente, produciéndose una disminución en la señal de salida del detector, figura 5.5.
Su aplicación principal es para compuestos órganoclorados (pesticidas, herbicidas) aunque también es válido para aromáticos polinucleares, nitrocompuestos, anhídridos y compuestos de azufre, así como el NO2 y SO2 procedente de chimeneas.
d) Acoplamiento de cromatografía de gases con otras técnicas instrumentales, proporciona una herramienta muy potente en la identificación de los componentes de una mezcla compleja; la tendencia actual es utilizar como detectores selectivos, que controlan continuamente el efluente de la columna, técnicas instrumentales como Espectrometría de Masas y Espectroscopía Infrarroja; todo ello ayudado de un ordenador para el almacenamiento de los datos espectrales, y posterior presentación como espectros y cromatogramas.
Aplicaciones analíticas
La aportación analítica de la cromatografia de gases al análisis químico tiene dos vertientes, la primera es su capacidad en la separación de compuestos (orgánicos, inorgánicos, bioquímicos, etc.). La segunda es emplear los tiempos o volúmenes de retención para la identificación cualitativa, mientras que el área de los picos proporciona información cuantitativa.
Como parámetro cualitativo se encuentra el tiempo de retención (tR) o el volumen de retención (VR); sin embargo, su dependencia de variables tales como temperatura de la columna, velocidad de flujo y composición de la fase estacionaria, le hace poco fiable. Pese a ello, si se observan tiempos de retención muy parecidos para un patrón (sustancia conocida) y una muestra problema cuando cambian las condiciones de operación, las probabilidades de que ambas sean la misma sustancia aumentan.
Otro parámetro cualitativo es la "retención relativa" que requiere un patrón interno B que permite obtener un valor de α que sirve como índice para identificar un compuesto A.
El parámetro que proporciona mayor fiabilidas es el "índice de retención de Kovats" que se basa en una comparación entre la posición del pico de un analito y los picos de dos o más parafinas normales. El sistema de índices de retención de Kovats está basado en la
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elección de series homólogas de parafinas normales como patrones de referencia dando un valor del índice I=100n a cada parafina normal de n átomos de carbono.
Para un compuesto que eluye entre las parafinas de (n) y (n+m) átomos de carbono, el índice de retención de Kovats viene dado por la expresión,
It es el índice de retención de Kovats del compuesto i
(t´R) es el tiempo de retención reducido del compuesto i y de las parafinas de (n) y (n+m) átomos de carbono
El índice de retención de Kovats depende solamente de la fase estacionaria y de la temperatura, por lo que es fácilmente reproducible de unos instrumentos a otros. Es una constante para cada compuesto para unas condiciones experimentales determinadas, permitiendo la identificación cualitativa de compuestos. Este método es más laborioso que el de las retenciones relativas, requiere disponer de una serie de patrones de hidrocarburos saturados lineales y es una ayuda importante para la selección de fases estacionarias líquidas.
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Electroforesis
La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas (proteínas o ácidos nucleicos) según la movilidad de estas en un campo eléctrico a través de una matriz porosa, la cual finalmente las separa por tamaños moleculares y carga eléctrica, dependiendo de la técnica que se use. Los ácidos nucleicos ya disponen de una carga eléctrica negativa, que los dirigirá al polo positivo, mientras que las proteínas se cargan con sustancias como el SDS (detergente) que incorpora cargas negativas de una manera dependiente del peso molecular. Para la separación se usa un gel de agarosa o poliacrilamida (fibras cruzadas, como una malla). Al poner la mezcla de moléculas y aplicar un campo eléctrico, éstas se moverán y deberán ir pasando por la malla, por la que las pequeñas se moverán mejor, más rápidamente. Así, las más pequeñas avanzarán más y las más grandes quedarán cerca del lugar de partida.
Figura 4. Equipo de electroforesis
La electroforesis es un método de laboratorio en el que se utiliza una corriente eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoleculas según su tamaño y carga eléctrica a través de una matriz gelatinosa.
Fue empleado por primera vez por en el año 1937, pero su importancia vino a incrementarse cuando en los años cincuenta E. L.Durrum y Arne W.K. Tiselius , impulsaron la electroforesis de zona, nombre que se asigno a la separación de materiales en un campo eléctrico en presencia de algún tipo de soporte; aunque este termino se limito originalmente al análisis de coloides y partículas submicroscopicas , se ha convertido en estos últimos años en una metodología aplicada a sustancias de bajo peso molecular.
Fundamento
Cuando una mezcla de moléculas ionizadas y con carga neta son colocadas en un campo eléctrico, estas experimentan una fuerza de atracción hacia el polo que posee carga opuesta, dejando transcurrir cierto tiempo las moléculas cargadas positivamente se
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desplazaran hacia el cátodo (el polo negativo) y aquellas cargadas positivamente se desplazaran hacia el ánodo (el polo positivo).
Figura 5. Separación de moléculas
El movimiento de las moléculas esta gobernado también por dos fuerzas adicionales; inicialmente la fricción con el solvente dificultará este movimiento originando una fuerza que se opone , por otro lado las moléculas tienen que moverse en forma aleatoria o movimiento browniano debido a que poseen energía cinética propia denominado difusión. La energía cinética de las moléculas aumenta con la temperatura, por ello a mayor temperatura mayor difusión.
La suma de todas estas fuerzas provoca que las moléculas no migren de una manera homogénea, de tal manera que, si las moléculas son colocadas en un cierto lugar de solución, los iones comenzaran a moverse formando un frente cuya anchura aumentara con el tiempo.
Para reducir la anchura de este frente podemos reducir el movimiento de las moléculas empleando un medio que oponga mas resistencia a dicho movimiento. Una forma común de hacer esto es formar un gel. El gel consiste de un polímero soluble de muy alto peso molecular que atrapa moléculas de agua y forma un tamiz que dificulta el movimiento de los solutos, consecuentemente, la migración electroforética de las moléculas será mas lenta, pero el ensanchamiento del frente se vera reducido también.
Aplicación De La Electroforesis
Fraccionamiento de las hemoglobinas Diferenciación de la hemoglobina fetal
Diagnóstico de talasemias, anemias falciformes, etc
Proteínas séricas
Proteínas urinarias
Lipoproteínas
Ácidos nucleicos
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Enzimas
Inmunoelectroforesis
Etc.
Métodos electroforéticos zonales
Son los más comunes, dada su alta aplicabilidad en diferentes campos. Son útiles para lograr la separación de mezclas complejas. Se aplican pequeñas cantidades de la disolución de proteínas a un soporte sólido, que se impregna con una solución tampón. Los soportes son en general polímeros y forman un gel poroso que restringe el movimiento de las moléculas a través del medio durante la electroforesis y disminuyen los flujos de convección del solvente.
Figura 6. Métodos electroforéticos zonales
Como soporte han sido utilizados papel (celulosa), almidón, poliacrilamida, agarosa y acetato de celulosa, entre otros. Este método tiene gran poder resolutivo por que se aplica una cantidad pequeña de proteína a una zona estrecha, mientras que la longitud del trayecto es mucho mayor que la zona de aplicación. El equipamiento requerido es simple, fuente de poder, cubeta vertical u horizontal donde se colocan el soporte y dos electrodos Los más utilizados son:
Electroforesis en gel de poliacrilamida
Los geles de poliacrilamida se forman por polimerización de la acrilamida por acción de un agente entrecuzador, es químicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser preparado de forma rápida y reproducible. Forma, además, geles transparentes con estabilidad mecánica, insolubles en agua, relativamente no iónicos y que permiten buena visualización de las bandas durante un tiempo prolongado.
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Figura 7. Electroforesis en gel de poliacrilamida.
Además tiene la ventaja de que variando la concentración de polímeros, se puede modificar de manera controlada en el tamaño del poro, lamentablemente cada vez se emplea menos en diagnostico debido a su neurotoxocidad.
Electroforesis en geles de gradientes
El uso de geles de poliacrilamida que tienen un gradiente creciente de concentración de archilamida + bisacrilamida, y en consecuencia un gradiente decreciente en el tamaño del poro, pueden tener ventajas sobre los geles de concentraciones uniformes de acrilamida.
Figura 8. Electroforesis en geles de gradientes.
En un gel en gradiente la proteína migra hasta alcanzar una zona donde el tamaño de poro impida cualquier avance. Una vez se alcanza el limite del poro no se produce una migración apreciable aunque no se detiene completamente. Una de las ventajas de este tipo de geles es que resuelve mejor las bandas pues las concentra en regiones mas estrechas, además de incrementar el rango de pesos moleculares que se pueden resolver en un mismo gel comparado con los de una concentración fija.
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Electroforesis en geles de agarosa
La agarosa es un polisacárido (originalmente obtenido de algas, como el agar-agar, pero de composición homogénea), cuyas disoluciones (típicamente de 0.5 a 2 %) poseen la propiedad de permanecer liquidas por encima de 50 grados C y formar un gel, semisólido al enfriarse. Este gel esta constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras poliméricas embebida en gran cantidad de medio líquido, que retarda el paso de las moléculas, se usa usualmente para separar moléculas grandes de alrededor 20.000 nucleótidos.
Electroforesis capilar
La electroforesis capilar se basa en los mismos principios de las técnicas electroforeticas convencionales, pero utiliza condiciones y tecnología distinta que nos permiten obtener una serie de ventajas al respecto, Esta separación de péptidos realizada sobre un capilar de silica fundida a potenciales elevados 20 a 30 Kv en un campo de 400 a 500 v/cm refrigerados por aire.
La corriente electroendosmótica (FEO) generada por los grupos silanol de la superficie interna del capilar da como resultado una corriente plana del frente del líquido que contrasta con el frente parabólico de la cromatografía líquida de alta resolución.
Figura 9. Electroforesis capilar
La ventaja de esta técnica es que el capilar de silica fundida que generalmente se cubre con una capa de polimina para darle mayor rigidez y resistencia, tiene una ventaja a través de ella que permite el pasaje de la luz UV de tal manera que la visualización es on-line. Con esta técnica descripta es posible separar cationes, aniones, proteínas, macromoléculas y sustancias no cargadas en forma simultánea.
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Isoelectroenfoque
Esta técnica, habitualmente denominada electroenfoque se basa en el desplazamiento de las moléculas en un gradiente de pH. Las moléculas amfotéricas, como los aminoácidos, se separan en un medio en el que existe una diferencia de potencial y un gradiente de pH . La región del ánodo es Ácida y la del cátodo es alcalina.
Figura 10. Isoelectroenfoque
Entre ambos se establece un gradiente de pH tal que las moléculas que se han de separar tenga su punto isoeléctrico dentro del rango. Las sustancias que inicialmente se encuentran en regiones de pH inferior a su punto isoeléctrico estarán cargadas positivamente y migraran hacia el cátodo, mientras aquellas que se encuentran en medios con pH más bajos que su punto isoeléctrico tendrán carga negativa y migraran hacia el ánodo. La migración les conducirá a una región dónde el pH coincidirá con su punto isoléctrico, tendrán una carga neta nula y se detendrán. De esta forma las moléculas amfotéricas se sitúan en estrechas bandas donde coincide su punto isoeléctrico con el pH.
Electroforesis bidimensional
La electroforesis bidimensional se basa en separar las proteínas en una mezcla según sus dos propiedades moleculares, una en cada dimensión. El procedimiento más usado se basa en la separación en una primera dimensión mediante isoelectroenfoque y la segunda dimensión según peso molecular mediante electroforesis en poliacrilamida.
Fuentes de error en la electroforesis
La electroforesis es una técnica muy sensible y puede ser afectada por muchos errores experimentales, como la temperatura durante la polimerización y la corrida del gel, velocidad de la polimerización, niveles de catalizador, pureza del reactivo, tiempo de corrida y preparación de las muestras.
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Hematología
La Hematología (de gr. hema=sangre, logo=estudio hematología=estudio de la sangre αἷμα, -ατος-, "sangre" y -λογία, "estudio") es la especialidad médica que se dedica al tratamiento de los pacientes con enfermedades hematológicas, para ello se encarga del estudio e investigación de la sangre y los órganos hematopoyéticos (médula ósea, ganglios linfáticos, bazo, etc) tanto sanos como enfermos.
La hematología es la rama de la ciencia médica que se encarga del estudio de los elementos formes de la sangre y sus precursores, así como de los trastornos estructurales y bioquímicos de estos elementos, que puedan conducir a una enfermedad.
La hematología es una ciencia que comprende el estudio de la etiología, diagnóstico, tratamiento, pronóstico y prevención de las enfermedades de la sangre y órganos hemolinfoproductores. Los médicos especialistas en este dominio son llamados hematólogos.
Las enfermedades hematológicas afectan la producción de sangre y sus componentes, como los glóbulos rojos, la hemoglobina, las proteínas plasmáticas, el mecanismo de coagulación (hemostasia), etc.
La hematología comprende el estudio del paquete celular el perfil o el estado sanguíneo, los cuales son:
Recuento de eritrocitos (y valor hematocrito) Recuento de leucocitos Determinación de hemoglobina Velocidad de sedimentación globular (VSG) Fórmula leucocitaria (recuento diferencial de leucocitos)
Los hematopatólogos usualmente están certificados en patología clínica y anatómica, y tienen años adicionales de preparación en hematopatología. La hematopatología es el estudio de no sólo las enfermedades de la sangre y la médula ósea, sino también de los órganos y tejidos que usan las células de la sangre para realizar sus funciones fisiológicas, como los nódulos linfáticos, el bazo, el timo y otros tejidos linfáticos. Los hematopatólogos se concentran en el diagnóstico de las condiciones de los tejidos hematopoyéticos y los tejidos ricos en linfocitos.
Los exámenes de hematología más comunes son:
Examen Usos
Conteo sanguíneo completo (su sigla en inglés es CBC), Para ayudar a diagnosticar la
que incluye:Conteo de los glóbulos blancos (su sigla en inglés es WBC).Conteo de los glóbulos rojos (su sigla en inglés es RBC).Conteo de las plaquetas.Conteo del volumen de los hematócritos de los glóbulos rojos (su sigla en inglés es HCT).La concentración de la hemoglobina (su sigla en inglés es HB) - el pigmento que lleva oxígeno en los glóbulos rojos.Conteo sanguíneo diferencial.
anemia, ciertos cánceres de la sangre, y para monitorizar la pérdida de sangre e infección.
Conteo de las plaquetas. Para diagnosticar, o monitorizar el sangrado y los trastornos de la coagulación o ambos.
Tiempo de protrombina (su sigla en inglés es PT). Para evaluar el sangrado y los trastornos de la coagula
Urinálisis (análisis de orina), que incluye un examen del color, nivel del pH y de la gravedad; el análisis químico para determinar la presencia de sangre, proteínas, glucosa y otras sustancias; y un examen microscópico de los glóbulos rojos y blancos, bacterias y otras sustancias.
Para diagnosticar las infecciones del riñón y de la vejiga, y otras enfermedades.
Diagnostico
Los hematólogos utilizan análisis de sangre para diagnosticar distintos desórdenes. De particular importancia son los análisis que proporcionan información sobre los componentes celulares de la sangre de un paciente. El análisis más común, llamado recuento hemático completo, indica el número de glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas en una unidad dada de sangre. Los hematólogos también examinan muestras de sangre al microscopio para identificar células sanguíneas anormales y diagnosticar enfermedades de la sangre. Además de analizar enfermedades sanguíneas, los médicos también pueden diagnosticar otros tipos de desórdenes, como la hepatitis C, una enfermedad crónica del hígado que se detecta en la sangre.
