Introduction – Thérapie génique

09/09/2004

José CORTES

Mise au point d’une technique de cartographie à haut débit des sites d’intégration d’un

vecteur rétroviral

09/09/2004

José CORTES

Introduction – Essai clinique d’Alain FISHER

09/09/2004

José CORTES

11 enfants atteints de X-SCID

Cependant

2 enfants ont développé une Leucémie

Introduction – Etudes des sites d’intégrations (1)

09/09/2004

José CORTES

L’équipe de Bushman

Virus HIV-1 : Intégration préférentielle au niveau de gènes transcriptionnellement actifs

L’équipe de Burgess

Vecteurs HIV-1 : Intégration préférentielle à l’intérieur de l’unité transcriptionnelle.Vecteurs MLV : Intégration préférentielle aux alentours du +1 de la transcription .

Introduction – Etudes des sites d’intégrations (2)

09/09/2004

José CORTES

Technique utilisée : Vecteur ou VirusADN génomique

Digestion enzymatique (site de coupure fréquent)

Ajout d’adaptateurs

PCR

Nested PCR

Clonage et séquençage

Introduction – Objectif de mon stage

09/09/2004

José CORTES

Réalisation de la technique

Résultats – 1ère partie (1)

09/09/2004

José CORTES

Analyse des jonctions vecteur-ADN génomique

NlaIII

5’5’

MmeI

catg

PVIPartie Vecteur

Côté Reverse

Séquence à analyserPLI3Côté Universel

Séquence cible de l’insertion

Site d’insertion du vecteur

schéma d’un contig réalisé par le logiciel BioEdit

Résultats – 1ère partie (2)

09/09/2004

José CORTES

211 clones bactériens séquencés

182

209

jonctions vecteur-ADNgénomique

contamination

séquences de mauvaisequalité

Résultats – 1ère partie (2)

09/09/2004

José CORTES

182

209

jonctions vecteur-ADNgénomique

contamination par HIV-1

séquences de mausaisequalité

11711

37

17

positonnées une fois

positonnées + d'1 fois

< 20 pb

non positionnables

182 jonctions

Sur 117 jonctions positionnables sans ambiguïté, 111 jonctions sont différentes.

Résultats – 1ère partie (3)

09/09/2004

José CORTES

Positions des insertions détectées sur leurs chromosomes respectifs D’après le site http://genome.ucsc.edu Les traits rouges représentent la position des intégrations détectées Les chromosomes encadrés en rouge n’ont subit aucune modification par le vecteur

Résultats – 1ère partie (4)

09/09/2004

José CORTES

Nombre de gènes et d'insertions par chormosome

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 x y

0

2

4

6

8

10

12

14

nb de gène

nb d'insertion

Résultats – 2ème partie (1)

09/09/2004

José CORTES

102 pb

1 2

100 pb

44 pb

30 pb

bPLI

bPLNPCR bPLN/bPLN

NlaIII NlaIII

Digestion NlaIII

Ligation LN2

NlaIII5’

5’

NlaIII5’

5’

MmeI

MmeI

Digestion par MmeI

NlaIIINlaIII

NlaIII

MmeI

58 pb

1 2

100 pb

20 pb

Résultats – 2ème partie (1)

09/09/2004

José CORTES

bPLI

bPLNPCR bPLN/bPLN

NlaIII NlaIII

Digestion NlaIII

Ligation LN2

NlaIII5’

5’

NlaIII5’

5’

MmeI

MmeI

Digestion par MmeI

NlaIIINlaIII

NlaIII

MmeI

100 pb

20 pb

1 2 3 4

1 : PCR bPLN/bPLI

2 : Fragment digéré par NlaIII 4 : Fragment de 26 pb purifié

3 : Purification sur billes

Puits n°4

Résultats – 2ème partie (1)

09/09/2004

José CORTES

bPLI

bPLNPCR bPLN/bPLN

NlaIII NlaIII

Digestion NlaIII

Ligation LN2

NlaIII5’

5’

NlaIII5’

5’

MmeI

MmeI

Digestion par MmeI

NlaIIINlaIII

NlaIII

MmeI

500 pb

1000 pbrégion 600-1200 pb

Résultats – 2ème partie (2)

09/09/2004

José CORTES

Analyse des concatémères

NlaIII NlaIII NlaIII NlaIII NlaIII NlaIII NlaIII NlaIII

Résultats – 2ème partie (3)

09/09/2004

José CORTES

Étiquettes obtenues :

Sur 40 séquences de concatémères, 1002 étiquettes on été extraites.

Etiquettes obtenues par extract_tag

100

609

étiquettes utilisables

étiquettes non-utilisables

Moyenne de 25 étiquettes par concatémère

Résultats – 2ème partie (4)

09/09/2004

José CORTES

Comparaison des étiquettes sur le génome

Résultats – 2ème partie (5)

09/09/2004

José CORTES

Comparaison des étiquettes sur le génome

224

96

82207

étiquettespositionnablesétiquettes à positionmultipleétiquettes nonpositionnablesétiquettes vecteur

224

96

82207

étiquettespositionnablesétiquettes à positionmultipleétiquettes nonpositionnablesétiquettes vecteur

Résultats – 2ème partie (5)

09/09/2004

José CORTES

redondance des étiquettes positionnables sur le génome

181

21 0

1 fois

2 - 5 fois

> 5 fois

Conclusion

09/09/2004

José CORTES

Objectif atteint

211 séquences -> 111 jonctions différentes sur le génome

40 séquences de concatémères -> 207 étiquettes différentes, positionnables sans ambiguïté sur le génome

Remerciements

09/09/2004

José CORTES

Olivier DANOS

Équipe Ciblage

Javier PEREA

Nathalie HOLIC-BARLET

Julie MANTOVANI

Service Séquençage

Sabine Dubus

Service Informatique

Kelly MARTINEZ

Aux Généthoniens…