Majallah-i Dānishgāh-i ̒Ulūm-i Pizishkī-i Qum (Qom Univ Med Sci J) 2019 May

63 Majallah-i Dānishgāh-i ̒Ulūm-i Pizishkī-i Qum (Qom Univ Med Sci J) 2019;13(3):63-73

International License Creative Commons Attribution License 4.0

Isolation, Molecular Identification, and Phylogenetic Analysis of

Antimicrobial Agents Producing Actinomycetes in Farming Saline Soils of

Qom City, (Iran)

Zahar Yosefi 1 , Seyed Soheil Aghaei1 , Abbas Morovvati1 , Mohammad Reza Zolfaghari1*

Original Article

1Department of

Microbiology, School of

Basic Sciences, Qom Branch,

Islamic Azad University,

Qom, Iran.

*Corresponding Author:

Mohammad Reza

Zolfaghari; Department of

Microbiology, School of

Basic Sciences, Qom

Branch, Islamic Azad

University, Qom, Iran.

Email: zolfaghary-mr@qom.iau.ac.ir

Received:14 Nov, 2018

Accepted: 2 Feb, 2019

Abstract Background and Objectives: Actinomycetes are Gram-positive and

filamentous bacteria that are the major microorganism in soil.

According to studies, three quarters of all known antibiotics are

produced by actinomycetes. The present study aimed to investigate

actinomycetes in farming saline soils of different regions of Qom

province in terms of antibacterial property.

Methods: In this experimental study, first, Actinomycetes were

collected and isolated from farming saline soils of Qom province, then,

primary screening was carried out using culture and secondary

screening by agar diffusion method against pathogenic bacteria. For

molecular identification, genomic DNA of all isolates was extracted,

then their 16SrRNA gene was sequenced by PCR technique, replicated,

and positive samples, were sequences and the obtained results were

analyzed phylogenetically.

Results: In this study, out of 100 collected soil samples, 23 isolates of

Actinomycetes were isolated. Also, in addition to microbiological tests,

10 samples were sequenced using the PCR method based on the 16

SrRNA, and the isolates were 100% and 99% similar to Streptomyces

and Actinomycetes.

Conclusion: The results of this study revealed that new isolates exist in

the soil sample of Qom province, which are able to produce new

antibacterial agents and could be used in the field of industry.

Keywords: Actinomycetes; Soil; Polymerase Chain Reaction; Qom;

Molecular detection; Phylogenetic analysis; Qom, Iran.

DOI: 10.29252/qums.13.3.63

مولد مواد ضدمیکروبی هایمولکولی و آنالیز فیلوژنتیکی اکتینومیست شناساییجداسازی،

شهر قم زراعی شور یهااز خاک زایماریهای بعلیه پاتوژن

*1لفقاریاذو محمدرضا ،1 عباس مروتی ، 1سید سهیل آقایی ،1 زهرا یوسفی

شناسی، دانشکده علومگروه میکروب1

واحد قم، قم، دانشگاه آزاد اسالمی، ،پایه

.ایران

نویسنده مسئول مکاتبات: *

گروه محمدرضا ذوالفقاری؛

،شناسی، دانشکده علوم پایهمیکروب

واحد قم، قم، دانشگاه آزاد اسالمی،

.ایران

آدرس پست الکترونیکی:zolfaghary-mr@qom.iau.ac.ir

23/9/97تاریخ دریافت:

13/11/97تاریخ پذیرش:

چکیده

ی هستند که بخش اعظم ارشتهی گرم مثبت و هایباکترها، اکتینومیستزمینه و هدف:

از کل چهارمسهشده، انجام. براساس مطالعات رندیگیبرمی خاک را درهاسمیکروارگانیم

با هدف بررسی حاضر مطالعه. نندکیمها تولید را اکتینومیست شدهشناختهی هاکیوتیبیآنت

.یی صورت گرفتایباکترآنتی خواص جهت استان قم از مختلف مناطق هایاکتینومیست

ی زراعی شور استان قم هاخاکها از ابتدا اکتینومیست در این مطالعه بنیادی، روش بررسی:

ش انتشار در آگار روش کشت و غربالگری ثانویه با رو ، سپس غربالگری اولیه بهندی شدجداساز

ژنومیک تمام DNAشناسایی مولکولی، جهت انجام گرفت. زایماریبی هایباکتردر برابر

ی مثبت هانمونه، تکثیر و PCRبا تکنیک هاآن SrRNA16ژن ها استخراج شد، سپس جدایه

سکانس شدند و نتایج حاصله، از نظر فیلوژنتیک بررسی گردید.

ایزوله اکتینومیست جدا شد. 23، شدهیآورجمعنمونه خاک 100ز در این مطالعه ا: هاافتهی

براساس ژن PCRنمونه با استفاده از روش 10شناسی، ی میکروبهاتستهمچنین عالوه بر

SrRNA16 به جنس استرپتومیست و %99و 100با میزان هازولهیایابی شدند که توالی

اکتینومیست مشابهت داشتند.

ی جدیدی در نمونه خاک استان قم وجود دارد هازولهیاایج این مطالعه نشان داد نت گیری:نیتجه

در حوزه صنعت استفاده هاتوان از آنباکتریایی جدید را دارند و میکه توانایی تولید مواد آنتی

کرد.

ای پلیمراز؛ بررسی مولکولی؛ آنالیز اکتینومیست؛ خاک؛ واکنش زنجیره :هاواژهکلید

؛ قم، ایران.فیلوژنتیکی

مجله دانشگاه علوم پزشکی قم 98 خرداد، سوم، شماره سیزدهم دوره

73الی 63صفحه

مقاله پژوهشيمقاله پژوهشي

(Original Article)

:نمایید استناد زیر صورتبه مقاله این به لطفاًYosefi Z, Aghaei SS, Morovvati A, Zolfaghari MR. Isolation, molecular

identification, and phylogenetic analysis of antimicrobial agents producing

actinomycetes in farming saline soils of Qom City, (Iran).

Qom Univ Med Sci J 2019;13(3):63-73. [Full Text in Persian]

64 1398 خرداد، سومشماره سیزدهم،مجله دانشگاه علوم پزشکی قم/ دوره

International License Creative Commons Attribution License 4.0

و همکاران زهرا یوسفی ...مولد مواد ضدمیکروبی علیه هایمولکولی و آنالیز فیلوژنتیکی اکتینومیست شناساییجداسازی، و همکاران نسرین جاوید تبریزی ...

مقدمهگروه غالب از یاگرم مثبت و رشته هاییباکتر ،هااکتینومیست

صورت آزاد یا ساپروفیت در هستند که به جمعیت میکروبی خاک

گرم، یهاازجمله خاک، آب ؛متفاوتی اکولوژیک هاییستگاهز

دارای ی نیزبندازنظر رده شوند ویرسوبات دریایی و غیره یافت م

یکرومونوسپورا، نوکاردیا و مهمی مانند م یهاجنس

توانایی تولید ،که به دلیل بزرگی ژنوم هستنداسترپتومایسس

هاییم، آنزهایکتبیوآنتی مانندهای ثانویه انواعی از متابولیت

ها را کشهای غذایی و آفتیتصنعتی، مواد ضد توموری، متابول

باشد.میدارند. خاک منبع مهمی برای جداسازی اکتینومیست

ند که در اها اغلب موجوداتی هتروتروف و مزوفیلاکتینومیست

درجه سلسیوس رشد کرده و اکثراً به شرایط اسیدی 25-30ی دما

مورفولوژیکی و فیزیولوژیکی هاییژگیهمچنین و ،اندحساس

G+C (75-57% )با درصد باالی DNAمتنوعی داشته و دارای

گرم مثبت با هاییلسگروه بزرگی از با ،موجودات ین. اباشندمی

. در (3) دهندرا تشکیل میفیالمنت تمایل در تشکیل زنجیره یا

دارند که ازنظر قراربزرگی یهادستهها، یاین گروه از باکتر

مورفولوژی، نیاز به اکسیژن، تشکیالت دیواره باکتری و توانایی

و علت تشابهاتی که ازنظر مورفولوژی اما بهتند، تولید اسپور متفاو

یژگی. وشوندمی یدارند، در کنار یکدیگر بررس زایییماریب

تمایل به شودیها دیده ممتشابهی که در تمامی اکتینومیست

که رشد هایییلگاهی باسهمچنین تشکیل فیالمنت است،

ممکن است در هنگام تقسیم سلولی نتوانند از یکدیگر کنندیم

ها با قطری در سلولطویلی از هاییرهبنابراین زنج ؛جدا شوند

. این زنجیره ازنظر شکل ظاهری کنندیمیکرون را ایجاد م 1حدود

به آن میسلیا دلیلهمین به است کههای قارچی مشابه میسیلیوم

.(1-2) گویندیم

بیوتیکینیمی از آنت و دارند زیادی کاربردهایها تاکتینومیس

. آیدیمها به دست مصرفی و تولیدی جهان از استرپتومایسس

که هستند های ثانویهمتابولیت ینترازجمله مهم هابیوتیکیآنت

. شودیها تولید ماکتینومیستوسیله این داروها به %50بیش از

یها منشأ بیشترین تعداد داروهاومیستناکتی نیز ازلحاظ تاریخی

هایینهزم دربا کاربرد بسیار ییهاجدید و مولکول بیوتیکییآنت

(.1-3) باشندمی درمانی

این یبندو طبقه شناسایی برای هاروش نیترجیرا ،حاضر حال در

، همچنین بیوشیمیایی ی،مورفولوژ یهایژگیو از استفاده ،هایباکتر

ی هاژن بین در، باشدها مینآدر مختلف یهاژن توالی مقایسه

ها باکتری تکامل طول در SrRNA16اینکه نواحی لیدله ب مختلف

هایباکتر شناسایی همین منظور برایشده هستند؛ بهمحافظت بسیار

ی ابرجسته جایگاه هااکتینومیست ،مطالعات براساس .اندمناسب بسیار

و ضدسرطانی ،یکیوتیبیآنت مواد تولید جهت یغربالگر منظوربه

زمینه در مفید ماده هاده ساالنه که دارند غیره و ییغذا هایمتابولیت

به و جداسازی هایباکتر این از یو صنعت غذایی ورزی،کشا دارویی،

امر این راستای در قدم اولین البته (؛4) شودیم عرضه مصرف بازار

از گروه این و فعال مستعد یهاهیسو ییو شناسا مهم، جداسازی

و جداسازی زمینه در داخلی مطالعات همچنین .باشدمی هایباکتر

این بررسی .شده است انجام مختلف مناطق از اکتینومیستشناسایی

زمینه این در جامعی پژوهش تاکنون دهدیم نشان هاو داده منابع

که کندیم پیدا اهمیت بیشتر زمانی مسئله این .است نگرفته صورت

بوده منطقهی کشورها بین در هامیاقل نیترمتنوع دارای بدانیم کشور

تولید زمینه رد قدرتمندی تاکتینومیس یهاهیسو توانیم که

و شناسایی در آن هاکیوتیبیآنت ژهیوبه ،ثانویه هایمتابولیت

ها در جریان رقابت خود با از گونه یبعض (.4کرد ) یجداساز

منظور محدود کردن رقبا و ادامه بقای خود، اقدام به یکدیگر و به

های بیشتر متابولیت ،کنند. در حقیقتهای ثانویه میتولید متابولیت

دیگر عملکردهای مهاری مانند وخاصیت ضدمیکروبی دارای نویه ثا

کشخاصیت ضد توموری، ضد قارچی و یا حتی در نقش علف

با هدف حاضر مطالعه ،موضوع اینتوجه به اهمیت با (.5) هستند هایمولکولی و آنالیز فیلوژنتیکی اکتینومیست جداسازی، شناسایی

یهااز خاک زایماریهای بمولد مواد ضدمیکروبی علیه پاتوژن

انجام شد. SrRNA16ژن از استفاده با شهر قم زراعی شور

روش بررسی

براساس استان قم شور زراعی یهانیزمدر این مطالعه بنیادی،

(، به مناطق Multistage Sampling) یاچندمرحله یریگنمونه

ندمختلف )شمال، جنوب، شرق، غرب، مرکز و حومه( تقسیم شد

به این صورت که ابتدا ؛ شد یآورک جمعخا نمونه 100تعداد و

یرـمتیـانتـس 5-15ق ـد و از عمـار زده شـنـسطحی خاک ک هیال

65

1398 خرداد، سوم، شماره سیزدهممجله دانشگاه علوم پزشکی قم/ دوره

International License Creative Commons Attribution License 4.0

و همکاران هرا یوسفیز ...مولد مواد ضدمیکروبی علیه هایمولکولی و آنالیز فیلوژنتیکی اکتینومیست شناساییجداسازی، و همکاران نسرین جاوید تبریزی ...

خاک یها. نمونهنمونه برداشته شد (گرم 400-500به میزان )

زمانی در و گرفتندقرار اتوکالوشده یهاکیبالفاصله درون پالست

انتقال یافتندواحد قم ،گاه آزاد اسالمیبه آزمایشگاه دانش کوتاه

( آلمان-)مرک CaCo3 ماریت ،هانمونهی آورجمعپس از (.6)

روز 5به مدت گرادیدرجه سانت 28و در دمای گرفت انجام

گرم 10ها از جداسازی اکتینومیست جهت .ندشد یگرماگذار

ی هارقتسپس از هر نمونه ،ابتدا سوسپانسیون ؛نمونه خاک

های محیط تهیه شد. در ادامه، از هر رقت بر روی پلیت سریالی

کشت

Inorganic Salt Starch Agar (ISP4)کشت ( آلمان -)مرک

درجه سانتیگراد انکوبه شدند 28روز در دمای 7داده و به مدت

(7.)

،هاشاهده پلیتبا م اکتینومیست یهایکلنشناسایی برای

،سفید یهارنگه بظاهر پودری یا گچی و با ییهایکلن

سپس ،شدندانتخاب بنفش وآبی ،زرد ،قرمز ،خاکستری

ییهاسمیکروارگانیم. گرفتانجام هایکلنگرم از این یزیآمرنگ

اکتینومیست )گرم مثبت یهایژگیوکه زیر میکروسکوپ دارای

( آلمان-)مرک ISP2کشت به محیط ند( بودیارشتهوآرایش

ی هاهیسوها علیه روبی جدایهکند. فعالیت ضدمیشد منتقل

یهاهیسواز .(7) گذاری صورت گرفتکبا روش دیس زایماریب

با شماره دسترسی اشرشیاکلی شامل: زایماریمیکروبی باستاندارد

،9027با شماره دسترسی دوموناس آئروژینوزاسو ،8937با شماره کلبسیال پنومونیاو 6538با شماره ساستافیلوکوک اورئو

.شداستفاده 13833

ISP2,3,4,5 یهاطیروی مح بر کلنی ،رنگجهت بررسی

روزه در 7بعد از گرماگذاری کشت داده شد و آلمان(-)مرک

تمامی .دیها ثبت گردرنگ کلنی ،گرادیدرجه سانت 28دمای

تفاده از منابع کربن اس ،تولید پیگمان مالنینی مربوط به هاتست

تجزیه ،هیدرولیز نشاسته ،رشد در دماهای مختلف ،متفاوت

، S2H ،کاتاالز ،احیای نیترات ،دازیاکس ،لیستیناز ،80-تویین

DNase بررسی منظوربه (.8) ها انجام گرفتبرای تمامی جدایه

روی محیط بررا جداشده یهاهیسو ،تولید ماده ضدمیکروبی

Hickey-trenser agar ی ارهـیدا ورتـصبه ان(ـمـآل-رکـ)م

،گرادیسانتدرجه 28در دمای هاسپس پلیتت داده، ـشـک

(.9) شدند یگرماگذارروز 10به مدت

یهابا روش جدایه 23تعداد ،هابعد از جداسازی نمونه

جدا گردید که برای انجام تست مولکولی این شناسیمیکروب

با استفاده از کیت DNA .کشت داده شدند، ابتدا هانمونه

کیت دستور اساسبر( ایران-)شرکت سیناکلون DNPتخلیص

گردید. استخراج

میکرولیتر از 18 :شاملمیکرولیتر 25در حجم PCRانجام واکنش

میکرولیتر از پرایمر 1X ،1مخلوط واکنش

27Forward: 5'-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3' ،1

میکرولیتر از پرایمر 1492Reverse: 5'-GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3'

:باشندیمدژنره صورتبه مورداستفادهتوالی پرایمرهای )

M: A/C, Y: C/T) (10 ،)1 واحد از آنزیمTaq 5و پلیمراز

درجه به مدت 95دمایی: آماده براساس برنامه DNAمیکرولیتر از

72انیه، ث 35درجه به مدت 57ثانیه، 3درجه به مدت 94دقیقه، 3

درجه 72، تیدرنهارار و کبار ت 33ثانیه با 35درجه به مدت

ای به طول بایستی قطعه PCRجام شد. )محصول دقیقه ان 5 مدتبه

%1ها بر روی ژل آگارز نمونه، ( در ادامه.جفت باز باشد 1500

ران شدند.

میزان جذب ،مثبت یهابرای تمامی نمونه یسازبعد از خالص

به PCR سپس محصولگردید، ها قرائت از نمونه هریک نوری

انگلستان جهت تعیین توالی از طریق Life BioScienceکمپانی

30و غلظت میکرولیتر 10با حجم حدود )کلون نایشرکت س

افزار نرم نتایج بااز هر نمونه ارسال گردید. (نانوگرم برمیکرولیتر

Finch TV ادامه، رد. قرار گرفت یموردبررس 1.4.0 نسخه

مطالعهبرای سپس شدند، سازیفیردها با یکدیگر همسکانس

از بانک ،شده این ژنثبت یهاتمامی سکانس ،فیلوژنتیکی

با فرمت 7نسخه Megaافزار دانلود و با نرم NCBIاطالعاتی

Fast A با هایزولهبرای نمایش ارتباط ا)درخت ژنی .بررسی شد

براساس مدل Neighbor-joining استفاده از روش با (یکدیگر

7نسخه Megaافزارنرم به کمکتعداد اختالف نوکلئوتیدی

دارای یک تیپ سکانس، در یک هاییزولهترسیم گردید. ا

کالستر قرار گرفتند و وجود حتی یک نوکلئوتید اختالف، باعث

قرارگیری ایزوله در کالستر دیگر شد.

66

1398 خرداد، سومشماره سیزدهم،مجله دانشگاه علوم پزشکی قم/ دوره

International License Creative Commons Attribution License 4.0

و همکاران هرا یوسفیز ...مولد مواد ضدمیکروبی علیه هایمولکولی و آنالیز فیلوژنتیکی اکتینومیست شناساییجداسازی، و همکاران نسرین جاوید تبریزی ...

روش از اکتینومیست، اشدهجدمتابولیت شناسایی دقیق ماده برای

HPLC ،FTIR و اسپکتروفتومتر به کار برده شد؛ بدین ترتیب که

که بیشترین میزان ابتدا سوسپانسیون اسپوری از سویه موردنظر

نآ، سپس گردیدتهیه را نشان داد زایماریبی هاهیسومقاومت به

روز در انکوباتور 10را به محیط مایع مناسب تلقیح کرده و

در گرفت.قرار (200RPMدرجه و دور 30در دمای )ردار شیک

دقیقه 10به مدت 10000مقداری از محیط مایع با دور مرحله بعد،

،میکرون عبور داده شد 2/0رویی از فیلتر عیو ما شدسانتریفوژ

اتیل استات را در قیف سپس مقدار مساوی از مایع رویی و

دید. با استفاده از فاز آلی جدا گر دکانتور مخلوط کرده و

ایع حاصل از م وگرفت عمل آبگیری انجام ،تیوسولفات سدیم

آمده جهت دستمایع به، تیدرنها که کاغذ صافی عبور داده شد

ارسال گردیدآزاد قم دانشگاه شیمی زمایشگاه آبه شناسایی

(12-11.)

هاافتهیشهر مناطق شور ی زراع یهااز خاک نهنمو 100تعداد در این مطالعه،

مورد مشکوک به گونه 23که ی شدآورمربوط جمع یقم و روستاها

ی مورفولوژی و بیوشیمیایی، هاتستپس از انجام واکتینومیست بود

الی 3خاک از عمق یهانمونه آمد. به دستمورد استرپتومایسس 10

از متریسانت 3صورت که ابتدا بدین ؛برداشته شدند یمتریسانت 10

از یمتریسانت 10عمق سپس تا ،الیه سطحی خاک برداشته شد

استریل دارپیز یهاسهیبه درون کرا ها شد. نمونه یبردارخاک نمونه

شدند. منتقلریخته و به آزمایشگاه و ظروف پالستیکی

لحاظ تولید ماده شده ازانتخاب استرپتومیست هیسو 10

ند،کشت داده شد ISP4و ISP2 یهاطیروی مح ،ضدمیکروبی

شکل، لحاظ از .گردید بررسی هایو پشت کلن سطحرنگ سپس

نامنظم یاهیبا حاش یارهیصورت دابه به رنگ سفید و هایکلن

ISP4به شکل پودری روی محیط کشت های. ظاهر کلنبودند

ها به استرپتومیسس یهای. رنگ توده اسپوری کلنمشاهده گردید

و زرد، سبز، قرمز، بنفش، سفید آبی، خاکستری، متنوع یهارنگ

، آبی، یازرد، قهوه یهابه رنگ استرپتومیسس یهایپشت کلن

بررسی فعالیت ضد میکروبی ی. برابودسبز، قرمز، نارنجی و بنفش

ATCCشماره با ییایباکتر یهاهیسواز ، موردنظرهای جدایه

قدرت مناسب، با ایجاد هاله عدم رشد S1هیسو گردید.استفاده

مقاوم به وس اورئوسکوکاستافیلوبیشتری جهت توقف رشد

از )aureus Staphylococcus Resistant-Methicillin(سیلین متی

سایر توسط جادشدهیهاله عدم رشد ا کهیرصورتد خود نشان داد؛

جهت پی بردن به مناسب نبود.برده نام یهایباکتر هیبرعل ،هاهیسو

FT-IRاز طیف ،متابولیت موجود در محیطساختار تقریبی

شده در این منظور ابتدا طیف از متابولیت خشک یاستفاده شد. برا

مربوط به 2943پیک Aطبق نمودار سپس ،شرایط خأل گرفته شد

C-H ،مربوط به 1606 اروماتیکC=O ،1064 مربوط بهC-Cl به

رت صوفرمول بسته شیمیایی ترکیب به ،تیدست آمد و درنها

C11H12Cl2N2O5 ثبت گردید. مقایسه این داده با سایت جهانی

NIST Chemistry طبق نمودارB ، مطابقت متابولیت موردنظر را

.بیان کرد کلرامفنیکلبا داروی

67 1398 خرداد، سوم، شماره سیزدهممجله دانشگاه علوم پزشکی قم/ دوره

International License Creative Commons Attribution License 4.0

و همکاران هرا یوسفیز ...مولد مواد ضدمیکروبی علیه هایمولکولی و آنالیز فیلوژنتیکی اکتینومیست شناساییجداسازی، و همکاران نسرین جاوید تبریزی ...

با فرابنفش از متابولیت - نتایج طیف اسپکتروفتومتری مرئی

نانومتر 273ماکزیمم جذب محلول حاوی متابولیت موجطول

،کروماتوگرافی مایع با کارایی باال .(C نمودار) آمد دستبه

(HPLC) ،های کروماتوگرافی است. یکی از پرکاربردترین روش

با این دستگاه بررسی ، Dطبق نمودار کلرامفنیکلنمونه استاندارد

نمودار دشدهییت تولشد. سپس منحنی استاندارد با منحنی متابول

D حاصل از دستگاه ،HPLC و نتایج گرفتقرار ارزیابیمورد

ثبت گردید.همخوانی این دو

اسپکتروفتومتری از متابولیت فیط : Cنمودار

است. تابولیتبا نمونه م کلرامفنیکلمقایسه کروماتوگرام استاندارد : Dنمودار

انجام شد و DNA، استخراج هانمونهدر ادامه، بر روی تمامی

هاآنبر روی PCRتوسط واکنش SrRNA16توالی ژن تکثیر

صورت گرفت.

اولیه، PCRدر واکنش %1در ژل آگارز هانمونهنتایج الکتروفورز

را نشان داد که موردنظر بازی مربوط به تکثیر ژن جفت1498باند

نمونه مثبت و برای سکانس 20، شدهیآورجمعنمونه 100از

ارسال گردید.

باند داده است. موردنظرکه با پرایمرهای شدهیآورجمعی هاونهنم 1-6ی هاشماره 100bp: سایز مارکرSM 1شکل شماره

.باشدیمکنترل مثبت برای پرایمرهای یونیورسال 8کنترل منفی و نمونه 7نمونه

68 1398 خرداد، سومشماره سیزدهم،مجله دانشگاه علوم پزشکی قم/ دوره

International License Creative Commons Attribution License 4.0

و همکاران هرا یوسفیز ...مولد مواد ضدمیکروبی علیه هایمولکولی و آنالیز فیلوژنتیکی اکتینومیست شناساییجداسازی، و همکاران نسرین جاوید تبریزی ...

نمونه برای بررسی سکانس به PCR، 10ید نهایی تست أیبرای ت

که پس از گردید ارسال( Source bioscienceکمپانی )انگلستان

در SrRNA16 هاییتوالی بررسی . براشدندلیز آنا ،بررسی

و مشخص شد انجام NCBIبانک اطالعاتی ، BLAST قسمت

هاجدایهشده از این ثبت یهاآمده با ژندستبه یهایتوالگردید

.تطبیق دارد

در ابتدا و انتهای (Sequence trimmingاز ویرایش سکانس ) بعد

نوکلئوتیدی از ژن در بین 1459به دلیل کیفیت پایین(، قطعه آن )

چندگانهسازی فیردهم 7نسخه Mega برنامهبا هاسکانس

(Multiple sequence alignment شد، سپس مورد آنالیز )

شماره شکلطبق توانیمی قرار گرفت. با انجام این کار اسهیمقا

ی انجام داد.ترقیدقبررسی 2

.Neighbor-joining با متد هاهیسونوکلئوتیدی از ژن در میان 1380قطعه براساس: دندروگرام ژنی 2شماره شکل

جا ارائه داد. متوسط اختالف یک صورتبهاطالعات، آنالیز ژن را

هاهیسودر میان هاژنتوالی %60بود که %5، هاهیسوسکانس بین

%38متغیر، %2 دستخوش تغییرات شده بود. از نآ %40ثابت و

نژبود. ) Singletoصورتهب %62 و Informative صورتبه

SrRNA1 با ییتنهاژن معتبر مطرح است که به عنوان یکبه

ارتباط ژنتیکی توانیم هاهیتوالی آن در بین سو یاسهیبررسی مقا

یهایدر توال شدهمیزان اختالف مشاهده (کرد. ینیبشیها را پآن

.باشدیها مکننده اختالف ژنومی آن، منعکسهاهیدر بین سو ژن

مطالعات از له)حاصموجود در بانک ژنی SrRNA1 یهایتوال

از یامجموعه شد و با پرایمرهای یونیورسال تعیین توالی (مختلف

برای انجام آنالیز به دست آمد. SrRNA1نسبی ژن یهایتوال

که د، نیاز به داشتن ناحیه مشترک ژنی بوهاهیواحد روی تمام سو

ی، ـژن یاـهیـوالـه تـه همـانـدگـنـسازی چفیردبعد از انجام هم

به دست آمد.مشترک هایدر میان تمام توالجفت باز 1459 قطعه

بحث هایماریمردم با شنیدن نام باکتری به یاد انواع و اقسام بیت اکثر

و بوده ضرریها نسبتاً بکه بیشتر آناین در حالی است ؛افتندیم

از یکیها بر زیانشان برتری دارد. مفید آن راتیتأث جهیدرنت

ها اکتینوباکتریا ،مؤثر در زندگی بشر یهاسمیکروارگانیم نیترمهم

ها به شمار جمعیت میکروبی اکثر خاک نیترکه جزء مهمهستند

تخریب، یدهانیدر فرآ توانندیخاک م یهای. این باکترندیآیم

و تجزیه سوبسترایی مواد غنی شرکت کنند. همچنین ییزداسم

بافرد و پیچیده های منحصربهاکتینوباکتریاها قادر به تولید متابولیت

محیطی، زیست دارویی و صنعتی یهانهیفراوان در زم یکاربردها

. باشندیم

69

1398 خرداد، مسو، شماره سیزدهممجله دانشگاه علوم پزشکی قم/ دوره

International License Creative Commons Attribution License 4.0

و همکاران هرا یوسفیز ...مولد مواد ضدمیکروبی علیه هایمولکولی و آنالیز فیلوژنتیکی اکتینومیست شناساییجداسازی، و همکاران نسرین جاوید تبریزی ...

جنس اکتینوباکتریا نیتربه جداسازی و بررسی مهم مطالعهدر این

کهییپرداخته شد. ازآنجا (استرپتومایسس و اکتینومیست)

های ثانویه متابولیت ها شهرت زیادی در تولیداسترپتومایسس

عنوان میکروارگانیسم مناسب برای تولید متابولیت به ؛دارند

(.13،14ب شدند )انتخا

از غربالگری مطالعه،آمده در این دستبا توجه به نتایج به

زراعی شور استان یهاشده از خاکهای جداسازیاکتینومیست

توانایی تولید ماده هیسوکیسویه جداشده، تنها 10از قم،

این در نظر گرفتنرا دارا بود. با MRSA هیضدمیکروبی عل

زراعی شور استان قم یهاکرد خاکعنوان توانیمشاهدات م

منبع خوبی برای جداسازی استرپتومیست و تواندیم

میکروبیال باشد. پس از شناسایی های مولد ماده آنتیاکتینومیست

،SrRNA16میکروبیولوژیک با استفاده از پرایمرهای یونیورسال

یبر رو تیکه درنها گرفتانجام PCRواکنش هانمونه بر روی

نمونه برای 10 ،از این تعداد و بوداین نتایج مثبت ،هنمون 23

کانس پس از آنالیز با نتایج حاصل از س .سکانس ارسال گردید

با نیز ارسالی یهابررسی و برای نمونه 7نسخه Megaافزار نرم

geneشده از سکانس موجود درثبت یهااستفاده از سکانس

bank ، دادج درختچه نشان . نتایگردیددرختچه فیلوژنتیک رسم

های جداشده ها و اکتینومیستها بسیار مشابه به استرپتومیستنمونه

.هستندشده از ایران و ثبت

Preshant یهاهیجداسازی سو ،2010وهمکاران در سال

ها برای خاک انجام دادند. آن یهااسترپتومیست را از نمونه

، با انجام میستعنوان جنس استرپتوجداشده به یهاهیشناسایی سو

ین، تست ئتست هیدرولیز نشاسته، هیدرولیز کاز شامل: ییهاتست

و تست H2S دیسوکروز، تست کاتاالز، تست اکسیداز، تست تول

ها را مثبت نشان داده که همه این تستیاهیسو کردندعنوان ،لیپاز

متذکر شد البته باید ؛ها باشداز جنس استرپتومیسس تواندیم

باید صورت SrRNA16 یزهایعی با توجه به آنالشناسایی قط

بخش مولکولی در بررسی و ،در مقایسه با این مطالعه تا گرفتیم

یترقیمثبت برای سکانس ارسال و نتایج دق یهانمونه تحقیق،این

یهای(. در مطالعه حاضر پس از بررس15)آید به دست

مثبت برای یاها، نمونهاولیه و جداسازی نمونه شناسیبمیکرو

ارسال و رسم درختچه ژنتیکی انجام شد که ،تعیین سکانس

رار ـه قـاخـا در یک شـهتـومیسـتینـت و اکـاسترپتومیس یهانمونه

، 2009توسط مصطفی اوسکای در سال یادر مطالعهگرفتند.

که جدا شد (مولد یک ترکیب ضد قارچی)گونه استرپتومیست

یکی و بودمؤثر یوژن گیاهی و جانورپاتی هاقارچ هیعل هیاین سو

هاسویه مابقینسبت به یتریقدرت ضد قارچی قو نیز هاهیاز سو

روش فعالیت ضد میکروبی این سویه با .از خود نشان داد

Cross streak ( 16روی مولر هینتون آگار نشان داده شد.)

ابولیت حاصله که مت شدندآنالیز FTIR و HPLC مطالعه،در این

بر روی CLSIول ابراساس جد ومشابه کلرامفنیکل بود

و شتخاصیت مهاری دارئوس واستافیلوکوکوس ا یهایباکتر

بود. ریتأثیدیگر ب یهایوی باکترربر

موفق به جداسازی سویه 2007مصطفی ال نگار در سال

مصر شد. ابتدا با توجه به یهااز خاک HAL64استرپتومیسس

عنوان بهرا ها آن، سلولی این استرپتومیسس وارهیاختار دو س شکل

سپس با انجام آنالیز سکانس ،جنس استرپتومیسس شناسایی کرد

این باکتری همان استرپتومیسس گردیدمشخص SrRNA16 ژن

هیسویه مولد ماده ضد میکروبی قوی عل نیا که باشدیم

اثر این ماده کهیدرصورت ؛بود زایماریگرم مثبت ب یهایباکتر

کمتر ،گرم منفی یزایماریب یهایباکتر هیضد میکروبی عل

توسط این سویه با دشدهیتول کیوتیبیآنت گزارش شد. همچنین

Sephadex LH-20 Columnسپس با گردید،سیلیکاژل جدا

با دشدهیتول کیوتیبیخلوص آنت ،تیدرنها کهشد یسازخالص

ساختار شیمیایی ناسایی با ش ،در ادامه. شدثابت HPLCروش

یزهایشده با استفاده از آنالیسازخالص کیوتیبیآنت

،کیوتیبیاین آنت گردید مشخص ،اسپکتروسکوپیک

Kosinostatin یک کویینوسیکلین کیوتیبیآنت نی. اباشدیم

(. 11) شودیتولید م TP-A0468میکرومونوسپورا وسیلهبه است و

ه جهت پی بردن به ساختار تقریبی شدمطالعه انجام در مقایسه با

که شد استفاده FT-IRاز طیف ،متابولیت موجود در محیط

صورت فرمول بسته شیمیایی ترکیب به ،تیدرنها

C11H12Cl2N2O5 ثبت گردید. مقایسه این داده با سایت

مطابقت متابولیت موردنظر را با داروی NIST Chemistryجهانی

، SrRNA16 ژن جه به نتیجه آزمایش. با توبیان کرد کلرامفنیکل

ت ـشباه هـک ودـبا ـهاسترپتومیسس ءزـج ،اییـاسـورد شنـم هیوـس

70 1398مجله دانشگاه علوم پزشکی قم/ دوره سیزدهم، شماره سوم، خرداد

International License Creative Commons Attribution License 4.0

و همکاران هرا یوسفیز ...مولد مواد ضدمیکروبی علیه هایمولکولی و آنالیز فیلوژنتیکی اکتینومیست شناساییجداسازی، و همکاران نسرین جاوید تبریزی ...

داشت. در مقایسه نتایج تندایبا استرپتومیسس یصددرصد

نیز به یها به استرپتومیست و برخبخشی از جدایهمطالعه حاضر،

د. در درصدی داشتن 100 تشابهها جداشده از ایران اکتینومیست

انجام شد ( 1386سال )همکاران که توسط حامدی ویامطالعه

جداسازی Nocardiopsisنام جنسی از خانواده اکتینومایستاسه به

مختلف بیوشیمیایی یهاشد که بعد از شناسایی با توجه به تست

بوده وجدید ، این سویه گردید مشخص ،گرفتهصورت

Nocardiopsis iraniensis نیاهمچنین . (17د )ش یگذارنام

استافیلوکوکوس هیسویه قادر به تولید ماده ضد میکروبی عل یسازنهیدر پی بهدر مطالعه فوق سیلین بود. مقاوم به متی وسرئوا

دریافتند بیشترین ،شرایط تولید ماده ضد میکروبی در محیط مایع

%10مذکور در حضور هیسووسیله به کیوتیبیمقدار تولید آنت

نامیدندها این باکتری را هالوفیل . آنباشدیم pH=5/7 نمک و

(18). Young از یاهیجداسازی سو در پی 2002در سال

هیبتواند مولد ماده ضد میکروبی علکه ها اکتینومیست

(Vancomycin-Resistant Enterococcus) VRE باشد، موفق به

لد شد که مو KH-614سویه استرپتومیسس ییجداسازی و شناسا

که ییزهایدر پی آنالهمچنین بود. VRE هیماده ضد میکروبی عل

به گرفتروی ماده حاصل از محیط کشت مایع این سویه انجام

فعالیت نکهیاین نتیجه رسید که ماده حاصله عالوه بر ا

(. 19)هست نیزتوموری آنتیفعالیت دارای ؛ضدمیکروبی دارد

Sing یقاتی که انجام دادند قدر پی تح 2009در سال و همکاران

هند جداسازی یهاسویه استرپتومیسس آلکالوفیلی را از خاک

ها روی آن ؛میکروبیال بودکردند. این باکتری مولد یک ماده آنتی

و درصد تحمل pHمثل )شرایط رشدی این باکتری یسازنهیبه

شرایط بهینه برای تولید این ماده ضد میکروبی )کار کردند (نمک

در .(باشدیم 8برابر pHو %2 باکتری در حضور نمک اینتوسط

روی بر ییهاشیآزماآمده از انجام دستمطالعه حاضر نتایج به

بیشترین تواندیکه م یاهیسونشان داد جداشده از خاک یهاهیسو

. است E.P2 هیرا داشته باشد، سو VRE هیاثر ضد میکروبی عل

،توسط این استرپتومیسس شدهایجاد هاله عدم رشدهمچنین قطر

(.20-21بود ) متریلیم 26

سویه استرپتومیسس ( در بررسی1388سال )همکاران حسام و

Syaneus ، ماده ضد میکروبی را از محیط کشت مایع این سویه

. استخراج این ماده ضد میکروبی با حالل آلی کردندجداسازی

هایروشبا آن یسازو خالص یجداساز ، همچنیناتیل استات

TLC وGC مورد مشکوک به 23 مطالعه، (. در این22) شدانجام

مورفولوژی و یهاخانواده اکتینومیست بود که پس از انجام تست

ی بررسیمورد استرپتومایسس به دست آمد. برا 10 ،بیوشیمیایی

با ییهایاز باکتر نیز موردنظر هایجدایهفعالیت ضد میکروبی

با ایجاد هاله S1هیسوشد که در نتیجه، استفاده ATCCشماره

عدم رشد مناسب، قدرت بیشتری جهت توقف رشد

سیلینمقاوم به متی استافیلوکوکوس اورئوس

)aureus Staphylococcus Resistant-Methicillin( از خود

عدم رشد ایجادشده توسط سایر هاله کهیدرصورت ؛نشان داد

جهت پی بردن به و ده مناسب نبودبرنام یهایباکتر هی، علهاهیسو

FT-IRاز طیف ،ساختار تقریبی متابولیت موجود در محیط

صورت فرمول بسته شیمیایی ترکیب به ،تیدرنها شد که استفاده

C11H12Cl2N2O5 مقایسه این داده با سایت جهانی گردیدثبت .

NIST Chemistry را کلرامفنیکلمتابولیت موردنظر با داروی

یکی از ، (HPLC)مایع با کارایی باال ی. کروماتوگرافبیان کرد

منحنی استاندارد که های کروماتوگرافی استپرکاربردترین روش

HPLC، حاصل از دستگاه دشدهیبا منحنی متابولیت تول

ژن . و نتایج همخوانی این دو را نشان داد گرفت قرار یموردبررس

SrRNA16 با ییتنهاهعنوان یک ژن معتبر مطرح است که ببه

ارتباط ژنتیکی توانیم هاهیتوالی آن در بین سو یاسهیبررسی مقا

ها براساس بررسی مولکولی این جدایهکرد. ینیبشیها را پآن

PCR، 10ید نهایی تست أیو برای تشد انجام SrRNA16 یهاژن

میزان اختالف . گردیدنمونه برای بررسی بیشتر سکانس

کننده ، منعکسهاهیدر بین سو ژن یاهیشده در توالمشاهده

، هاهیمتوسط اختالف سکانس بین سو بود وها اختالف ژنومی آن

%40ثابت و هاهیها در میان سوتوالی ژن %60 برآورد شد که 5%

یهایابی برای نمونهپس از توالی. بوددستخوش تغییرات شده ن آ

میزان تو جه درختچه فیلوژنتیک بررسی ،مثبت برای هر سکانس

ها رسم گردید.قرابت جدایه

71

1398 خرداد، سومشماره ، سیزدهممجله دانشگاه علوم پزشکی قم/ دوره

International License Creative Commons Attribution License 4.0

و همکاران هرا یوسفیز ...مولد مواد ضدمیکروبی علیه هایمولکولی و آنالیز فیلوژنتیکی اکتینومیست شناساییجداسازی، و همکاران نسرین جاوید تبریزی ...

یریگجهینتهای از غربالگری اکتینومیستمطالعه، با توجه به نتایج این

ه سوی 10از زراعی شور استان قم، یهاشده از خاکجداسازی

هیلعتوانایی تولید ماده ضد میکروبی هیسوکیجداشده تنها

MRSA توانیهدات ماین مشا در نظر گرفتنرا دارا بود. با

منبع خوبی تواندیزراعی شور استان قم م یهاعنوان کرد خاک

های مولد ماده برای جداسازی استرپتومیست و اکتینومیست

.میکروبیال باشدآنتی

تشکر و قدردانی ،میزاد اسالدانشگاه آ کارشناسی ارشد نامهانیاین مقاله حاصل پا

ارکنان از مسئولین دانشگاه و ک لهیوسنی. بدباشدیواحد قم م

ارشناسی ارشد که شرایط اجرای این فعالیت کآزمایشگاه

،رادسامان ژن آ انیبنپژوهشی را فراهم نمودند و شرکت دانش

.شودیصمیمانه تشکر و قدردانی م

References:

1. Mohitosh Biswas, Ajijur Rahman, Hejera Khatun, Anwar – ul Islam. Isolation and cherecterization of streptomyces sp.

ANBS – 15 and antimicrobial activities of its secondary metabolies. Bangladesh Pharm J 2011;14(1):15-20. Link

2. Bredholt H, Fjaervik E, Johnsen G, Zotchev SB. Actinomycetes from sediments the Trondheim Fjord_ Norway:

Diversity and biological activity. Mar Drugs 2008;6(1):12-24. Link

3. Singh LS, Baruah I, Bora TC. Actinomycetes of loktak habitat: isolation and screening for antimicrobial activities.

Biotechnology 2006;5(2):217-21. Link

4. Dworkin M, Falkow S, Rosenberg E, Schleifer KH. The prokaryotes. Springer; 2006. p. 430-530.

5. Usha R, Ananthaselvi P, Venil CK, Palaniswamy M. Antimicrobial and antiangiogenesis activity of Streptomyces

parvulus KUAP106 from mangrove soil. Eur J Biol Sci 2010,2(4):77-83. Link

6. Kavya Deepthi M, Solomon Sudhakar M, Nagalakshmi Devamma M. Isolation and Screening of streptomyces sp. From

coringa Mangrove soils for Enzyme production and Antimicrobial activity. Int J Pharm Chem Biol Sci 2012;2(1):110-

6. link

7. Gurung TD, Sherpa C, Agrawal VP, Lekhak B, Isolation and characterization of antibacterial actinomycetes from soil

samples of Kalapathar mount Everest region. Nepal J Sci Technol 2009 10:173-82. link

8. Atta MA. An antifungal agent produced by streptomyces olivaceiscleroticus, Az – SH 514. World Appl Sci J

2009;6(11):1495–505. link

9. Dehnad A, Parsa L, Bakhshi R, Abdi Soofiani S, Mokhtarzadeh A, Investigation antibacterial activity of streptomycetes

isolates from soil samples, west of Iran. African J Microbiol Res 2010;4(14):1542-9. link

10. Walter J, Hertel C, Tannock, GW, Lis CM, Munro K, Hammes WP. Detection of Lactobacillus, Pediococcus,

Leuconostoc, and Weissella species in human feces by using group-specific PCR primers and denaturing gradient gel

electrophoresis. Appl Environ Microbiol 2001;67(6):2578-85. PubMed

11. El-Naggar MY, El-Assar SA, Abdul-Gawad SM. Meroparamycin production by newly isolated streptomyces sp. Strain

MARO 1: Taxonemy, fermentation, purification and structural Elucidation. J Microbiol 2006;44(4):432-8. PubMed

12. Scholler CEG, Gurtler H, Pedersen R, Molin S, Wilkins K. Volatile metabolites from actinomycetes. J Agric Food

Chem 2002;50(9):2615-21. link

72 1398 خرداد، سومشماره سیزدهم،مجله دانشگاه علوم پزشکی قم/ دوره

International License Creative Commons Attribution License 4.0

و همکاران هرا یوسفیز ...مولد مواد ضدمیکروبی علیه هایمولکولی و آنالیز فیلوژنتیکی اکتینومیست شناساییجداسازی، و همکاران نسرین جاوید تبریزی ...

13. Gandhimathi R, Kiran GS, Hema TA, Selvin J, Thomas TA, Rajeetha Ravji T, et al Optimization and production of a

biosurfactant from the sponge-associated marine fungus Aspergillus ustus MSF3. Colloids Surf B Biointerfaces

2009;73(2):250-6. PubMed

14. Gandhimathi RGS, Kiran T, Hema J, Selvin T, Raviji R, Shanmughapriya S. Production and characterization of

lipopeptide biosurfactant by a sponge-associated marine actinomycetes Nocardiopsis alba MSA10. Bioprocess Biosyst

Eng 2009,32(6): 825-35. link

15. Srivastava P, Shukla S, Kumar Choubey S, Gomase VS. Isolation, purification and characterization of glucose

isomerese enzyme from streptomyces species isolated from Parbhani Region. J Enzyme Res ,2010;1(1):1-10. link

16. Oskay M. Anti fungal and antibacterial compounds from streptomycetes strains. African J Biotechnol

2009;8(13):3007-17. link

17. Kumar N, Singh RK, Mishra SK, Singh AK, Pachouri UC. Isolation and screening of soil actinomycetes as source of

antibiotics active against bacteria. Int J Microbiol Res 2010;2(2):12-16. link

18. Hamedi J, Mohammadi Panah F, Amoozegar MA, Dehghan S. Isolation of A New Moderately Halophilic Broad

SpectRum Antibiotic Producing Actinobacter. Jundishapur J Natural Pharm Products 2007;2(2):94-104. link

19. Rhee KH. Isolation and characterization of streptomyces sp. KH - 614 Producing anti VRE (Vancomycin – Resistant

entrococci) antibiotics. J Gen. Appl Microbial 2002;48(6):321-7. PubMed

20. Singh LS, Mazumder S, Bora TC. Optimization of process parameters for growth and bioactive metabolite Produced

by a salt – tolerant and alkalophilic actinomycetes, streptomyces tanashiensis strain AZD. J de Mycologie Medicale

2009;19(4):225–33. link

21. Zhong K, Gao X-L, Xu Z-J, Gao H, Fan S, Yamaguchi I, et al. Antioxident activity of a novel streptomyces strain Eril

2 isolated from the rhizosphere of rhizoma. curcumae longae. Cur Res Acteiol 2011;4(2):63-72. link

22. Atta HM. An antifungal agent produced by streptomyces olivaceiscleroticus, Az – SH 514. World Appl Sci J

2009;6(11):1495-505. link

73 1398 خرداد، سوم، شماره سیزدهمم/ دوره مجله دانشگاه علوم پزشکی ق

International License Creative Commons Attribution License 4.0