Wereng batang coklat (WBC)

•Penusuk pengisap batang padi (& rumput Leersia hexandra)

•Menularkan 2 penyakit oleh 

Gejala hopperburn

virus

•Dimorfisme sayap

•Kromosom diploid=30

(28 autosom, XY dan XX)

•Ukuran genom: 1,2 Gbp

Imago makroptera Imago brakiptera

Grassy stunt Ragged stunt

• Pengendalian paling praktis adalah dengan penanaman varietas tahan

• Adaptasi tinggi untuk makan dan bereproduksi pada varietas tahan

Wereng batang coklat

varietas tahan

• Pengelompokan biotipe  1, 2, dan 3 berdasarkan spektrum virulensi pada varietas differensial (IRRI)

Varietas  Gen ketahanan Biotipe 

1 2 3 4

TN1, Pelita I/1 Tidak ada R R R R

Mudgo, IR26 Bph1 T R T R

ASD7, IR42 bph2  T T R R

Rathu Heenati, IR72, IR74 Bph3 T T T T

Babawee Bph4 T T T T

ARC10550 Bph5 R R R T

Swarnalata Bph6 R R R TSwarnalata Bph6 R R R T

T12 bph7 R R R T

Chin Saba Bph8 T T T ‐

Balamawee Bph9 R R R R

O. latifolia Bph12 ‐ T ‐ ‐

O. australiensis Bph18 T T T T

O. officinalis Bph6+Bph13 T T T T

O. minuta Bph20+Bph21 T ‐ ‐ ‐

T= tahan; R= rentan Sumber: Heong & Hardy (2009)

• Biotipe  (1, 2, 3): – perbedaan morfologi dan kimiawi sangat kecil antar biotipe;

– tidak ada penghalang untuk kawin antar biotipe

Wereng batang coklat

p g g p

– virulensi dikendalikan secara poligenik

• RAPD – studi keragaman WBC padi & L. hexandra

• DNA mitokondria – studi migrasi WBC di Cina

• SSR belum pernah dilakukan

Studi keragaman genetik WBCberdasarkan marka molekuler

• SSR – belum pernah dilakukan

Marka SSR

Genomic SSR (g‐SSR) EST‐SSR (e‐SSR)

Teknik pengembangannya

skrining sejumlah klon dari pustaka genom dengan probeberulang

in silico dari database sekuen genom

Polimorfisme Lebih tinggi Lebih rendah, karenaberkorespondensi denganp gcoding region, sehingga cocok untuk comparative mapping

Transferability antar spesies/genus

Lebih rendah Lebih tinggi

Asosiasi dengan gen Erat, dapat menjadi marka gen 

Tujuan penelitian

• Mengidentifikasi e‐SSR dari database sekuen EST

• Menggunakan e‐SSR utk analisis keragaman genetik biotipe WBCgenetik biotipe WBC

• Mempelajari transferability e‐SSR pada N. muri asal L. hexandra

Populasi WBC

• WBC dipelihara di insectary– Biotipe 1 – var. TN1 (tanpa gen ketahanan)

– Biotipe 2 – var. Mudgo (Bph1)

Biotipe 3 var ASD7 (bph2)– Biotipe 3 – var. ASD7 (bph2)

– Biotipe Y – berasal dari biotipe 1 yang dipelihara selama 2 tahun (33 generasi) pada var. YHY15 (gen tahan Bph15)

• N. muri dikoleksi dari lapangan dan dipelihara pada L. hexandra

Eksplorasi dan pengembangan marka eSSR

Parameter:Panjang min. 10 bpUnit pengulangan 2-6 bp

Downloading >37.000 sekuen EST WBC http://bphest.dna.affrc.go.jp

SSR discovery – program SSRIT http://www.gramene.org/db/markers/ssrtool

Hasil pencarian SSRTotal EST yang diperiksa: 12,303 Tinggi dibandingkan dg tanaman & sp. hewan lainnya

Parameter:- Panjang primer 18-24 basa (opt. 20)- Min. panjang pengulangan SSR=12 bp- Produk PCR 100-300 bp- Ta opt. 55oC- Kandungan GC 35-65% (opt. 50%)

Disain primer SSR – program Primer 3.0 http://frodo.wi.mit.edu/

Total EST mengandung SSR: 1519 (12,4%)Total SSR teridentifikasi: 1969

Total panjang EST yang diskrining: 7689,38 kbKepadatan SSR: 1 per 3,91 kb

Skrining SSRSSR dg pjg min. 12 bp: 502 dalam 482 klaster EST

Pada aphid 1 SSR pd 3,0 kb

Tipe pengulangan tri-nucleotida paling banyak (1327 [67,4%])

Frekuensi & distribusi SSR dalam EST WBC

•Motif AT > CG•Motif AAT, AAG > CCG•Pada hewan lain motif AG dan AAT juga dominan

Ekstraksi DNA dan genotyping WBC

Skrining 502 primer e-SSRDNA pool dari 4 biotipe WBC, DNA pool dari N. muiri

Ekstraksi DNA secara individual (bufer CTAB)

351 (70%)Pita jelas

120 (23,9%)Tidak ada amplikon

31 (6,2%)Amplifikasi lemah

N=21 per biotipe (16 ♀, 5 ♂)

155 (30,9%)polimorfik pada4 biotipe WBC

Genotyping WBCgel sekuensing poliakrilamid 6%

61 primer dipilih

324 (92,3%)dapat mengamplifikasi DNA

N.muiri,100 primer menghasilkan

ukuran pita yg sama dg yg ada pd N. lugens – sekuen

transcribed terkonservasi

196 (39%)monomorfik

Dibandingkan dengandatabase non-redundant

protein dari NCBI

109 klaster EST (31,1%) match dengan gen yang

fungsinya diketahui

Analisis dataSkor biner

(1=ada pita DNA, 0=tdk ada pita DNA)

Jaccard’s similarityStruktur populasi -AMOVA (Arlequin)

nA, He, Ho, PIC (PowerMarker)

PCoA(GenAlEX 6.3)y

coefficient (NTSYS 2.1)

Analisis klaster UPGMA - dendrogram

(NTSYS 2.1)

Uji korelasi (r) antara kesamaan genetik dengan matriks

Mantel test

AMOVA=analysis of molecular variancenA=jumlah alelHe=expected heterozygosityHo=observed heterozygosityPIC=polymorphic information contentPCoA=principle coordinate analysisUPGMA=unweighted pair group method averaging

Polimorfisme 351 marka e‐SSR pada 4 biotipe WBC

• Tingkat polimorfisme serupa antar biotipe (~30%)

Keragaan genetik WBCBiotipe WBC (var, gen tahan)

Rata‐rata (dan kisaran)

Jumlah alel

Expected heterozygosity

Observed heterozygosity 

Rata‐rata PIC

1 (TN1, tidak ada) 2,3 (1‐5) 0,35 0,43 0,30 (0‐0,681)

2 (Mudgo, Bph1) 3,5 (2‐9) 0,51 0,53 0,45 (0,086‐0,756)

3 (ASD7, bph2) 2,8 (1‐7) 0,42 0,44 0,37 (0‐0,728)

Y (YHY15 Bph15) 4 5 (2 9) 0 57 0 52 0 52 (0 130 0 827)Y (YHY15, Bph15) 4,5 (2‐9) 0,57 0,52 0,52 (0,130‐0,827)

• Keragaan genetik WBC lebih tinggi pada populasi yang dipelihara padavarietas tahan (lihat jumlah alel dan heterosigositas)• Keragaan biotipe Y paling tinggi, biotipe 1 paling rendah • Konsisten dengan tingkat ketahanan varietas padi (ketahanan var. YHY15

(Bph15) > Mudgo (Bph1) > ASD7 (bph2) > TN1 (tidak ada gen tahan)• PIC mengukur variasi alelik dari marka. Nilai PIC pada biotipe 1 & 3

lebih rendah karena ada 10 marka monomorfik (biotipe 1) & 7 (biotipe 3)

Biotipe 1 (tingkat kemiripan antar individu (57%) > biotipe lain)

Biotipe 3

Hubungan kekerabatan antar biotipe WBC

Biotipe 2

Biotipe Y

Mantel test r = 0,94 (good fit)

Principal coordinate analysis (PCoA)

PCoA melihat lebih jauh perbedaan genetik antar genotipe :k b h

Biotipe 1

Varietas rentan (TN1)

Varietas tahan(ASD7, Mudgo, YHY15)

Biotipe 3

Biotipe 2

• Aksis 1: biotipe 1 terpisah jauh dari biotipe yang lain (32,5% dari total variasi genetik)

• Aksis 2: biotipe Y terpisah dari biotipe (21,9% dari total variasi genetik)

Biotipe Y

Analysis of Molecular Variance (AMOVA)

• AMOVA untuk mendeteksi struktur genetik populasi– Keragaan genetik antar individu dalam populasi (biotipe) tinggi

(74,5% dari total ragam) – artinya ada variasi virulensi yang tinggi dalam satu biotipe, sehingga ada potensi dalam satu populasi biotipe untuk mengatasi mekanisme ketahanan padi yang akan dihadapi di lapangan

Penutup

• Anggapan konvensional bahwa bottleneck populasi dapat menyebabkan kehilangan variasi genetik secara masif tidak berlaku utk WBC– Biotipe Y mempunyai keragaan genetik lebih tinggi daripada biotipe 

asalnya (biotipe 1) setelah dipaksa makan pada var. tahan selama 33 generasi (>2 tahun)

– Ketahanan varietas padi mengerahkan tekanan pada populasi WBC awal sehingga timbul individu‐individu dengan alel beragam yang dapat beradaptasi pada varietas spesifik

• Perlu studi lanjut mengenai asal muasal dan evolusi populasi virulen