Wereng batang coklat (WBC)
•Penusuk pengisap batang padi (& rumput Leersia hexandra)
•Menularkan 2 penyakit oleh
Gejala hopperburn
virus
•Dimorfisme sayap
•Kromosom diploid=30
(28 autosom, XY dan XX)
•Ukuran genom: 1,2 Gbp
Imago makroptera Imago brakiptera
Grassy stunt Ragged stunt
• Pengendalian paling praktis adalah dengan penanaman varietas tahan
• Adaptasi tinggi untuk makan dan bereproduksi pada varietas tahan
Wereng batang coklat
varietas tahan
• Pengelompokan biotipe 1, 2, dan 3 berdasarkan spektrum virulensi pada varietas differensial (IRRI)
Varietas Gen ketahanan Biotipe
1 2 3 4
TN1, Pelita I/1 Tidak ada R R R R
Mudgo, IR26 Bph1 T R T R
ASD7, IR42 bph2 T T R R
Rathu Heenati, IR72, IR74 Bph3 T T T T
Babawee Bph4 T T T T
ARC10550 Bph5 R R R T
Swarnalata Bph6 R R R TSwarnalata Bph6 R R R T
T12 bph7 R R R T
Chin Saba Bph8 T T T ‐
Balamawee Bph9 R R R R
O. latifolia Bph12 ‐ T ‐ ‐
O. australiensis Bph18 T T T T
O. officinalis Bph6+Bph13 T T T T
O. minuta Bph20+Bph21 T ‐ ‐ ‐
T= tahan; R= rentan Sumber: Heong & Hardy (2009)
• Biotipe (1, 2, 3): – perbedaan morfologi dan kimiawi sangat kecil antar biotipe;
– tidak ada penghalang untuk kawin antar biotipe
Wereng batang coklat
p g g p
– virulensi dikendalikan secara poligenik
• RAPD – studi keragaman WBC padi & L. hexandra
• DNA mitokondria – studi migrasi WBC di Cina
• SSR belum pernah dilakukan
Studi keragaman genetik WBCberdasarkan marka molekuler
• SSR – belum pernah dilakukan
Marka SSR
Genomic SSR (g‐SSR) EST‐SSR (e‐SSR)
Teknik pengembangannya
skrining sejumlah klon dari pustaka genom dengan probeberulang
in silico dari database sekuen genom
Polimorfisme Lebih tinggi Lebih rendah, karenaberkorespondensi denganp gcoding region, sehingga cocok untuk comparative mapping
Transferability antar spesies/genus
Lebih rendah Lebih tinggi
Asosiasi dengan gen Erat, dapat menjadi marka gen
Tujuan penelitian
• Mengidentifikasi e‐SSR dari database sekuen EST
• Menggunakan e‐SSR utk analisis keragaman genetik biotipe WBCgenetik biotipe WBC
• Mempelajari transferability e‐SSR pada N. muri asal L. hexandra
Populasi WBC
• WBC dipelihara di insectary– Biotipe 1 – var. TN1 (tanpa gen ketahanan)
– Biotipe 2 – var. Mudgo (Bph1)
Biotipe 3 var ASD7 (bph2)– Biotipe 3 – var. ASD7 (bph2)
– Biotipe Y – berasal dari biotipe 1 yang dipelihara selama 2 tahun (33 generasi) pada var. YHY15 (gen tahan Bph15)
• N. muri dikoleksi dari lapangan dan dipelihara pada L. hexandra
Eksplorasi dan pengembangan marka eSSR
Parameter:Panjang min. 10 bpUnit pengulangan 2-6 bp
Downloading >37.000 sekuen EST WBC http://bphest.dna.affrc.go.jp
SSR discovery – program SSRIT http://www.gramene.org/db/markers/ssrtool
Hasil pencarian SSRTotal EST yang diperiksa: 12,303 Tinggi dibandingkan dg tanaman & sp. hewan lainnya
Parameter:- Panjang primer 18-24 basa (opt. 20)- Min. panjang pengulangan SSR=12 bp- Produk PCR 100-300 bp- Ta opt. 55oC- Kandungan GC 35-65% (opt. 50%)
Disain primer SSR – program Primer 3.0 http://frodo.wi.mit.edu/
Total EST mengandung SSR: 1519 (12,4%)Total SSR teridentifikasi: 1969
Total panjang EST yang diskrining: 7689,38 kbKepadatan SSR: 1 per 3,91 kb
Skrining SSRSSR dg pjg min. 12 bp: 502 dalam 482 klaster EST
Pada aphid 1 SSR pd 3,0 kb
Tipe pengulangan tri-nucleotida paling banyak (1327 [67,4%])
Frekuensi & distribusi SSR dalam EST WBC
•Motif AT > CG•Motif AAT, AAG > CCG•Pada hewan lain motif AG dan AAT juga dominan
Ekstraksi DNA dan genotyping WBC
Skrining 502 primer e-SSRDNA pool dari 4 biotipe WBC, DNA pool dari N. muiri
Ekstraksi DNA secara individual (bufer CTAB)
351 (70%)Pita jelas
120 (23,9%)Tidak ada amplikon
31 (6,2%)Amplifikasi lemah
N=21 per biotipe (16 ♀, 5 ♂)
155 (30,9%)polimorfik pada4 biotipe WBC
Genotyping WBCgel sekuensing poliakrilamid 6%
61 primer dipilih
324 (92,3%)dapat mengamplifikasi DNA
N.muiri,100 primer menghasilkan
ukuran pita yg sama dg yg ada pd N. lugens – sekuen
transcribed terkonservasi
196 (39%)monomorfik
Dibandingkan dengandatabase non-redundant
protein dari NCBI
109 klaster EST (31,1%) match dengan gen yang
fungsinya diketahui
Analisis dataSkor biner
(1=ada pita DNA, 0=tdk ada pita DNA)
Jaccard’s similarityStruktur populasi -AMOVA (Arlequin)
nA, He, Ho, PIC (PowerMarker)
PCoA(GenAlEX 6.3)y
coefficient (NTSYS 2.1)
Analisis klaster UPGMA - dendrogram
(NTSYS 2.1)
Uji korelasi (r) antara kesamaan genetik dengan matriks
Mantel test
AMOVA=analysis of molecular variancenA=jumlah alelHe=expected heterozygosityHo=observed heterozygosityPIC=polymorphic information contentPCoA=principle coordinate analysisUPGMA=unweighted pair group method averaging
Polimorfisme 351 marka e‐SSR pada 4 biotipe WBC
• Tingkat polimorfisme serupa antar biotipe (~30%)
Keragaan genetik WBCBiotipe WBC (var, gen tahan)
Rata‐rata (dan kisaran)
Jumlah alel
Expected heterozygosity
Observed heterozygosity
Rata‐rata PIC
1 (TN1, tidak ada) 2,3 (1‐5) 0,35 0,43 0,30 (0‐0,681)
2 (Mudgo, Bph1) 3,5 (2‐9) 0,51 0,53 0,45 (0,086‐0,756)
3 (ASD7, bph2) 2,8 (1‐7) 0,42 0,44 0,37 (0‐0,728)
Y (YHY15 Bph15) 4 5 (2 9) 0 57 0 52 0 52 (0 130 0 827)Y (YHY15, Bph15) 4,5 (2‐9) 0,57 0,52 0,52 (0,130‐0,827)
• Keragaan genetik WBC lebih tinggi pada populasi yang dipelihara padavarietas tahan (lihat jumlah alel dan heterosigositas)• Keragaan biotipe Y paling tinggi, biotipe 1 paling rendah • Konsisten dengan tingkat ketahanan varietas padi (ketahanan var. YHY15
(Bph15) > Mudgo (Bph1) > ASD7 (bph2) > TN1 (tidak ada gen tahan)• PIC mengukur variasi alelik dari marka. Nilai PIC pada biotipe 1 & 3
lebih rendah karena ada 10 marka monomorfik (biotipe 1) & 7 (biotipe 3)
Biotipe 1 (tingkat kemiripan antar individu (57%) > biotipe lain)
Biotipe 3
Hubungan kekerabatan antar biotipe WBC
Biotipe 2
Biotipe Y
Mantel test r = 0,94 (good fit)
Principal coordinate analysis (PCoA)
PCoA melihat lebih jauh perbedaan genetik antar genotipe :k b h
Biotipe 1
Varietas rentan (TN1)
Varietas tahan(ASD7, Mudgo, YHY15)
Biotipe 3
Biotipe 2
• Aksis 1: biotipe 1 terpisah jauh dari biotipe yang lain (32,5% dari total variasi genetik)
• Aksis 2: biotipe Y terpisah dari biotipe (21,9% dari total variasi genetik)
Biotipe Y
Analysis of Molecular Variance (AMOVA)
• AMOVA untuk mendeteksi struktur genetik populasi– Keragaan genetik antar individu dalam populasi (biotipe) tinggi
(74,5% dari total ragam) – artinya ada variasi virulensi yang tinggi dalam satu biotipe, sehingga ada potensi dalam satu populasi biotipe untuk mengatasi mekanisme ketahanan padi yang akan dihadapi di lapangan
Penutup
• Anggapan konvensional bahwa bottleneck populasi dapat menyebabkan kehilangan variasi genetik secara masif tidak berlaku utk WBC– Biotipe Y mempunyai keragaan genetik lebih tinggi daripada biotipe
asalnya (biotipe 1) setelah dipaksa makan pada var. tahan selama 33 generasi (>2 tahun)
– Ketahanan varietas padi mengerahkan tekanan pada populasi WBC awal sehingga timbul individu‐individu dengan alel beragam yang dapat beradaptasi pada varietas spesifik
• Perlu studi lanjut mengenai asal muasal dan evolusi populasi virulen