Date post: | 07-Sep-2015 |
Category: |
Documents |
Upload: | anonymous-jdzvxe |
View: | 237 times |
Download: | 0 times |
PCR
PCR : Polymerase Chain ReactionDitemukan oleh Kary Mullis 1984Memperbanyak potongan DNABahan :DNA
Primer
Enzyme Taq Polimerese
4 macam deoxynucleoside triphosphate
Magnesium ion.
PCR terdiri atas beberapa proses:Pemanasan DNA untuk mendenaturasi DNA ( memisahkan 2 rantai DNA )
Dinginkan dan oliganucleotide primer menera panjang rantai DNA.
Terjadi polimerisasi karena adanya primer dan deoxynucleoside triphosphate serta enzyme.
Kemudian proses 1) diulang kembali ke tahap 2) dan tahap 3).
Proses tersebut diulang-ulang sampai 25-30 kali.PCR
(Polymerase Chain Reaction)
Keunggulan:
Dapat menganalisis DNA yang sangat sedikit.
Spesifik, sederhana
Dapat menganalisis banyak sample dengan cepat.
Mampu mendeteksi kelainan.
Kelemahan:
Optimasi perlu waktu, jika tidak optimum menyebabkan terjadinya kesalahan interprestasi.
Karena sangat sensitive menyebabkan problem kontaminasi sangat tinggi kesalahan.
Kebersihan, atau tanpa adanya kontaminasi dituntut sangat tinggi pada saat bekerja.
Agar berhasil dengan baik,Perlu
OPTIMASI
Konsentrasi:
EnzymesDNTPsMg. IonPrimerSuhu dan Waktu:
AnnealingsDematurasiPemanjangan / ExtensionOptimasi Amplifikasi DNA dengan PCR
Konsentrasi Enzyme
1 - 2,5 unit/ 100 l larutan reaksi Namun tergantung dari template target dan primerSetiap sample perlu dioptimasiKalau optimasi dianjurkan antara 0.5 5 unit/ 100 l[ Innis, et al 1990 ].0.5 unit/ 15 l larutan reaksi 30 cyclis.[ Ruiz et, 1997 ]0.067 / oD 260 =
= volume reaksi dalam l. = volume primer yang akan dipakai dalam loD 260 = optical density 260 nm.Komposisi basanya
Panjangnya
Konsentrasinya
Suhu annealing terbaik biasanya 5o C dibawah Tm nya.Biasanya suhu antara 5o 72o C akan menghasilkan produk yang bagus.Suhu terlalu tinggi menyebabkan penempelan primer tidak betul dan kesalahan perpanjangan pada ujung 3 primer. Sehingga suhu annealing sangat kritis lebih-lebih pada putaran-putaran permukaan.Biasanya, 95o C selama 30 detik atau 97o C selama 15 detik.
Namun, lebih tinggi mungkin lebih baik, terutama DNA yang kaya pasangan G-C (Innis, et al., 1990)
Jika dinaturasi tidak sempurna, mungkin DNA kembali berikatan ataupun tidak mampu (menerima primer yang akan menempel, sehingga sensitifitasnya turun produk turun.
Ini terjadi jika waktu denaturasi terlalu pendek.
Jika waktu terlalu lama enzyme Taq polimerase akan rusak. Beberapa protocol menganjurkan denaturasi mula-mula 94o C selama 1 10 menit (Ruiz, et al., 1997)
Ines et al (1990) menyebutkan waktu paro Taq Polymerase DNA kadang dari 2 jam 92.5 0C.40 menit suhu 950C5 menit suhu 97.50CRekomendasi putaran versus konsentrasi mula-mula:
Number of target molicules:3 x 105
1.5x 104
1 x 103
50
Number of cycles:25 to 30
30 to 35
35 to 40
40 to 45
PCR
PCR : Polymerese Chain ReactionDitemukan oleh Kary Mullis 1984Memperbanyak potongan DNABahan :DNA
Primer
Enzyme Taq Polimerese
4 macam deoxynucleoside triphosphate
Magnesium ion.
PCR terdiri atas beberapa proses:Pemanasan DNA untuk mendenaturasi DNA ( memisahkan 2 rantai DNA )
Dinginkan dan oliganucleotide primer menera panjang rantai DNA.
Terjadi polimerisasi karena adanya primer dan deoxynucleoside triphosphate serta enzyme.
Kemudian proses 1) diulang kembali ke tahap 2) dan tahap 3).
Proses tersebut diulang-ulang sampai 25-30 kali.SKEMA CARA KERJA PCR