MEMOIRE DE MAGISTER - univ-oran1.dz · 2015-05-05 · immunofluorescence is considered for that. In...

MEMOIRE DE MAGISTER

Spécialité : phytopharmacie

Détection de Pseudomonas savastanoi, agent causal de la tuberculose de l’olivier

Evaluation et comparaison d’une technique d’isolement sur milieux de cultures et d’une

technique sérologique (immunofluorescence)

me

Soutenu le : 23 / 05 / 2013, devant le jury composé de :

Mer

HADADJI. Miloud……………. Professeur : ….…Université d’Oran…………..Président.

Mer

GUESSAS Bettach … …….. … . Professeur : …… Université d’Oran ………...Examinateur.

Mme

BENMECHERNANE ZINEB… Professeur : ……..Université d’Oran ……..….Examinateur.

Mer

BABA HAMED Bey…………... Professeur : …… Université d’Oran ….……..Rapporteur.

Mer

TENDJAOUI Bakhti………. ….. Directeur : ……..SRPV ORAN.……………..Membre invité.

Année universitaire : 2012-2013

Présentée par : M SERDOUN BEKRI Naoual

Remerciements

Ce travail de magister à été réalisé à la station régionale de la protection des végétaux de

Misserghin- Oran (laboratoire de bactériologie).

Après les louanges à Dieu l’unique, l’éternel je tiens à exprimé mes sincères remerciements aux

personnes qui m’ont apporté leur aides et qui ont contribuées à l’élaboration de ce mémoire.

Je remercie le tout puissant de m’avoir donné le courage et la force de réaliser mon rêve et celui de

mes chers parents.

Mes remerciements s’adressent à Mer

HADADJI. Miloud, professeur a l’université d’Oran d’avoir

accepté de présider le jury de soutenance.

J’exprime ma gratitude à Mer

GUESSAS Bettach, d’avoir accepté d’examiner ce travail.

Je remercie très chaleureusement Madame BenMechernene Zineb, qui a accepté d’examiner mon

travail.

Je tiens tous particulièrement à exprimé ma gratitude envers mon encadreur Mer

BABA HAMED

Bey, professeur à l’université d’Oran au département de biotechnologie ; pour sa disponibilité, pour le

temps et la patience qu’il m’a accordé tout au long de ce travail et pour son appui qui ma permis de réaliser

cette étude.

Je remercie particulièrement Mer

TANDJAOUI Bakhti, directeur de la station régionale de la

protection des végétaux, qu’il trouve ici l’expression de ma profonde reconnaissance et gratitude pour

m’avoir guidé dans mon travail.

J’adresse un très grand merci à toute l’équipe du département de bio statistique à l’INESM d’ Oran,

plus particulièrement à docteur RAYEH, Madame LARBI, et Melle

CHENNI, qui m’ont accueilli et m’ont

apporté leurs concours pour développer mes connaissances en statistiques.

Un grand merci à ma collègue Melle

TOUATI Karima pour l’amour et le soutien qu’elle m’a

témoigné lors de la rédaction de cette thèse et à Samya SEDDAR YAGOUB pour ces conseils sa

gentillesse et sa bonne humeur ainsi qu’a Madame SEBANE Rym pour ses précieux conseils.

En fin, je remercie toute l’équipe de la SRPV d’Oran.

Naouel BEKRI

Dédicaces

Je dédie ce modeste travail :

- Aux prunelles de mes yeux, mes très chers parents qui m’ont apprit que

le succès à pour l’unité la sueur et que ça se gagne et n’est jamais offert.

A mon marie, mes frères, ma sœur, et mes belles-sœurs qui m’ont

toujours soutenu et encouragé au cours de la réalisation de cette thèse.

A mes adorables petits anges : Mes enfants Ryhem et Rayane.

Résumé :

Pseudomonas savastanoi, pathovar savastanoi, organisme de quarantaine, est l’agent causal du

chancre bactérien de l’olivier. Découverte au 4ème

siècle par le grec Theophrastus, cette bactérie est

considérée comme le seul pathogène responsable de la formation des nécroses bactériennes appelées

communément tuberculose de l’olivier. Cette maladie est considérée comme un problème majeur par

son effet néfaste sur la croissance, le rendement et surtout la qualité de l’huile d’olive.

Aucun moyen de lutte curatif n’existe à ce jour contre la nécrose bactérienne. Seul des

techniques préventives permettent de contenir la maladie. L’un des points clés de cette lutte est la

production de matériel de multiplication (bois et plants d’oliviers) indemne de cette bactérie afin

d’éviter sa dispersion.

Pour cela, des méthodes analytiques de détection de Pseudomonas savastanoi doivent être

développées et adaptées à un travail de routine. La mise en œuvre d’une technique d’isolement sur

milieux de cultures et d’une technique sérologique « immunofluorescence », est envisageable dans ce

but.

Dans la présente étude, les protocoles existants relatifs à ces deux techniques ont été évalués sur

des macérâts contaminés.

La méthode d’ensemencement sur milieux de cultures présente l’avantage d’une grande facilité

de mise en œuvre. Cependant sa sensibilité, d’environ 105

ufc.ml-1

reste assez faible. C’est pourquoi

l’utilisation de la méthode d’immunofluorescence, dont la sensibilité est beaucoup plus fine, environ 103

ufc.ml-1

, peut être envisagée afin de confirmer ou d’infirmer les résultats relatifs aux échantillons

apparaissant négatifs à l’isolement sur milieux gélosés.

Il faut noter qu’il s’agit d’un pathogène particulièrement virulent des oliveraies et qui se propage

facilement, il nécessite donc pour sa détection une téchnique très sensible et à moindre coût.

Mots clés : Pseudomonas savastanoi – Tuberculose – Macérât – Bactérie de quarantaine –

olivier – Détection – Colonie bactérienne – Milieux de cultures – Isolement – Immunofluorescence.

Abstract

Pseudomonas savastanoi, pathovar savastanoi is the quarantine organism that causes bacterial

chancre of olive. Discovered in fourth century by the Greek Theopharus, this bacterium is the one

pathogen responsible of formation of the bacterial necrosis commonly called olive tuberculosis. This

disease is a hull problem with its harmful effect on the growth, the yield and the quality of olive oil.

There is no means curative treatment of bacterial necrosis just found until now. Only preventives

techniques can be used for this disease. One of the means of control is the production of multiplication

material (branch, plant) without contamination of Pseudomonas savastanoi, pathovar savastanoi.

In this case, analytical methods of detection of Pseudomonas savastanoi must be developed and

adapted with habit work. The use of technique of isolation on artificial medium and technique

immunofluorescence is considered for that.

In this study, the protocols of the two kinds of technique have been evaluated on macerates

infected.

The method of culture on artificial medium has an advantage of high easiness. However its

sensibility, ~105ufc.ml

-1 stays no important. That is why the use of the immunofluorescence, whose

sensibility is so weak, ~103ufc.ml

-1, can be considered for confirmation or not the results about the

samples which appear negatives at the isolation on medium.

It is important to know that we have a pathogen particularly virulent of olive’s plantation and its

propagation is so easy, it needs for its detection a real technique and not more expensive.

Lexique

� Détection : Isolement et identification d’une bactérie

� Bactérie : Micro-organisme procaryote (sans noyau), le plus petit capable de croitre, se nourrir et

de se reproduire de façon autonome.

� OEPP : sigle Anglais pour European and Mediterranean Plant Protecti Organisation ; sigle français

pour Organisation Européenne et Méditerranéenne pour la protection des plantes.

� Nécrose : mort d’une cellule ou d’un tissu à l’intérieur d’un organisme vivant.

� Organisme de quarantaine : organisme nuisible qui présente une menace économique potentielle

pour la zone menacée. Soit il n’y est pas encore présent, auquel cas on lutte contre son entrée ; soit

et est présent de façon restreinte, auquel cas il fait l’objet d’une lutte visant à son éradication.

� Phytopathogène : agent pathogène pour les végétaux.

� Ufc : sigle pour unité formant colonie (en Anglais cfu : colony forming unity) ; bactérie isolée à

partir de laquelle se forme une colonie par division mitotique.

� Analyse : c’est l’ensemble des opérations aboutissant à un résultat, pour un pathogène, à l’aide

d’une méthode.

� Antisérum : liquide se séparant du caillot après coagulation du sang extrait d’un animal immunisé

contre un antigène. L’antisérum contient des anticorps. L’antisérum est utilisé dans les analyses

sérologiques pour détecter les antigènes présents dans l’échantillon.

� Diagnostic : ensemble des techniques permettant l’identification d’un agent pathogène précis sur

un végétal dépourvu de symptôme.

� Sensibilité : aptitude pour une méthode d’analyse à détecter des quantités plus moins faible de

bactéries.

� Spécificité : aptitude pour une méthode d’analyse à mettre en évidence un agent pathogène

spécifique.

– SOMMAIRE :

� Sommaire :

I. Introduction

II. Présentation de la SRPV 2

2.1 Présentation générale

2.2 Cadre juridique

2.3 Organisation de la SRPV

1.3.1 Place de la SRPV d’Oran dans l’organigramme de l’INPV.

2.4 Missions

2.4.1 De la SRPV D’Oran

2.4.2 Les Missions du laboratoire de bactériologie de la SRPV d’Oran.

2.4.3 Le processus de travail du laboratoire de bactériologie.

2.4.4 Les bactéries phyto-pathogènes les plus contrôlés dans le laboratoire de

Bactériologie.

III. Etudes bibliographiques sur la production des oliviers en Algérie :

1. Systématique de l’olivier.

2. Répartition de l’olivier dans le monde.

3. Répartition de l’olivier dans la région du Maghreb.

4. Position des oliviers en Algérie.

5. intérêt de l’olivier.

6. Variété Algérienne de l’olivier.

7. Etude bibliographique sur le groupe des Pseudomonas.

a- Historique.

b- Définition.

c- Caractéristiques des Pseudomonas.

8. Les principales maladies de l’olivier.

1. Tavelure.

2. Verticilliose

3. Le Chancre bactérien.

IV. Choix des méthodes d’analyses pour la détection de Pseudomonas savastanoi.

V. Matériels et Méthodes

VI. Résultats et Discussion

I. Essai d’isolement des macérâts contaminés sur milieu de culture.

1. Observation macroscopique :

– SOMMAIRE :

a. Caractéristiques morphologiques des bactéries.

b. Caractéristiques phénotypiques des colonies sur trois milieux.

2. Observation microscopique :

a. Coloration de Gram.

b. Tests biochimiques.

c. Démembrement sur milieu BK.

d. Démembrement sur milieu Levane.

e. Démembrement sur milieu LPGA.

II. Estimation des concentrations des solutions mères après croissance sur les milieux

de cultures.

1. Sur milieu LPGA.

2. Sur milieu BK.

3. Sur milieu Levane.

III. Tableau des analyses des variances.

1. Comparaison des moyens

IV. Les tests biochimiques :

V. Conclusion

–INTRODUCTION:

1

I. Introduction :

Les plantes constituent la majorité des ressources énergétiques dont dépendent les hommes et

les animaux. Malheureusement, lorsqu’une plante est atteinte d’une maladie, sa croissance, sa fertilité

et sa productivité sont affectées. Des symptômes se développent et tout ou une partie de l’organisme

peut mourir. Les agents responsables des maladies de plantes sont très similaires à ceux rencontrés

chez l’homme et les animaux. Ils peuvent être biologiques ou physiques (Benizri et al. 2001).

Les maladies des plantes sont parfois regroupées par types de symptômes, par types d’organes,

qu’elles affectent et par type de plantes, mais le critère le plus utile reste la classification selon le

pathogène responsable de la maladie (Benjama, 2003).

Les oliviers sont parmi les plus anciens arbres fruitiers cultivés dans le bassin méditerranéen y

compris l’Algérie (Benjama, 2003).Ces dernières occupent toutefois une part très importante dans

l’économie agricole de certains pays méditerranéens (source FAO, 2009).

L’oliveraie en Algérie occupe une superficie de 250 000 d’hectares, elle présente 3% de la

production mondiale distribués essentiellement dans les zones montagneuses (Bartolini & Petrucelli,

2002).

L’Algérie (via le ministère de l’agriculture) a lancé un vaste programme (2009-2014) de

plantation d’environ un million 1 000 000 d’hectares à travers une quinzaine de wilayas. Il s’agit, en

fait, d’un programme très ambitieux dont l’objectif principal est de hisser la filière oléicole algérienne

au rang des pays producteurs d’olives.

Cependant, l’intensification de l’oléiculture pose un certain nombre de problèmes comme par

exemple l’infection des arbres par des bactéries phythopathogène entre autre le genre Pseudomonas

qui forment un large groupe de bactéries colonisant le sol, les plantes et l’eau. Certaines peuvent

causer des infections mortelles chez l’humain (Mavrodi et al. 2001).

Suite aux résultats des diagnostics effectués au niveau du laboratoire de bactériologie de la

Station Régionale de la Protection des Végétaux sur des échantillons d’oliviers surtout jeunes plants

programme PNDA (2001-2004), il a été décelé la présence importante des symptômes de tuberculose

et notamment au niveau de la wilaya d’Oran et Ain-Temouchent.

L’importance économique de cette maladie est ponctuelle mais préoccupante. Elle peut

entrainer des chutes de récolte de 50 à 70%, et même le dépérissement.

–INTRODUCTION:

2

S’agissant d’un parasite de quarantaine dont la lutte est obligatoire et doit être prise en charge

sérieusement par les services de la protection des végétaux, et compte tenu de l’importance du

programme quinquennal 2010-2014 à mettre en place +25000 ha pour la Wilaya d’Oran et Ain-

Témouchent. Le laboratoire de bactériologie de la SRPV d’Oran s’est engagé à mener une enquête sur

le terrain qui a débuté le 26 juillet 2010 et qui a touché l’ensemble des wilayate de notre

circonscription.

En réponse aux souhaits des agriculteurs, et des demandes du ministère de l’agriculture et du

développement rurale ainsi que les contrôleurs phytosanitaires des services de la protection des

végétaux, plusieurs outils analytiques ont été testés ou développés par l’INPV , afin de détecter la

bactérie sur des échantillons d’oliviers. Ces outils reposent sur la mise en culture et l’isolement sur des

milieux nutritifs et sur une technique sérologique à savoir l’immunofluorescence. La plupart de ces

travaux n’ont menés jusqu'à ce jour qu’a titre expérimental.

Dans tout les cas, ces méthodes doivent être spécifiques, sensibles, rapides, rapides,

reproductibles et peu couteuses.

Le rôle de la SRPV d’Oran consiste maintenant à comparer les techniques disponibles, à

évaluer les protocoles existants, à les optimiser et à les valider en vue d’une utilisation pour la

détection de cette bactérie. Dans le cadre de cette étude, j’ai été chargé de mettre en œuvre et de

comparer deux tests, l’un isolement sur des milieux de cultures l’autre sérologique

(immunofluorescence), sans chercher à modifier les protocoles décrits.

– PRESENTATION de la SRPV D’ORAN :

3

II. Présentation de la SRPV d’Oran :

II. 1 – Présentation générale :

La SRPV d’Oran est l’une des 14 stations régionales de l’INPV central d’Alger. Elle a

été créée en 1976. Elle est située à 15 kilomètres à l’Ouest de la ville d’Oran, avec une superficie

de 4 hectares.

Elle regroupe une vingtaine d’employés, et une dizaine de pré-emplois, tous sous la

direction du Directeur Régional Mr TANDJAOUI Bakhti.

Elle dispose :

� Des laboratoires d’analyses et de diagnostics pour les besoins du contrôle

phytosanitaire et de dépistage des organismes prohibés.

� De terrains agricoles, pour la réalisation des protocoles d’essais expérimentaux

menant à des études bioécologiques, et les observations liées à l’élaboration des

situations phytosanitaires et la lutte contre les bio-agresseurs.


4

II. 2 – Cadre juridique :

La loi 87-17 du 1er

Août 1987 est le texte de base qui régit la protection des végétaux en

Algérie, cinq décrets ont été promulgués en application de cette loi :

� Décret exécutif n° 93-286 du 23 Novembre 1993.

Il porte sur le contrôle phytosanitaire aux frontières. Il définit les interdictions, les restrictions,

les points d’entrée, le transit, le certificat phytosanitaire, les dispositions particulières en matière

de semences ainsi que les listes des organismes nuisibles indésirables en Algérie.

� Décret exécutif n° 95-387 du 28 Novembre 1995.

Il porte sur la protection phytosanitaire à l’intérieur du territoire. Il établie deux listes

d’organismes nuisibles. Une liste A d’organismes nuisibles dont le dépistage et la lutte sont

obligatoires et permanents, et une liste B d’organismes nuisibles dont la lutte devient obligatoire

en cas de péril.

Les missions du Ministère de l’Agriculture et du développement rural en matière de protection

des végétaux sont assurées par l’INPV.

� Décret exécutif n° 95- 405 du 02 Décembre 1995.

Il réglemente la commercialisation des pesticides en Algérie. Il organise la Commission

Nationale des Pesticides à usage agricole qui s’appuie sur deux Comités techniques (le Comité

d’Etude Biologique et le Comité Toxicologique) pour statuer et proposer au Ministère de

l’Agriculture et da la Pêche, l’homologation ou le refus d’homologation des marques

commerciales des pesticides.

� Décret exécutif n° 93- 1439 du 14 Juin 1933.

Il réaménage Les statuts de l’INPV est de désigne Autorité Phytosanitaire Nationale.

� Décret exécutif n° 96- 270 du 3 Août 1996.


5

Il porte Statut particulier des personnels phytosanitaires de l’INPV et prévoit leur

assermentation et leur commissionnement. Il est complété par décret n° 98-308 du 26 Septembre

1988 qui fixe le régime indemnitaire spécifique de ces agents.

II. 3 – Organisation de la SRPV :

II. 3. 1. Place de la SRPV d’Oran dans l’organigramme de l’INPV :

Figure N° 01 : l’organigramme de l’INPV Misserghin.

MADR

INPV

d’ALGER

DIRECTION

CENTRALE

48 IPW

22 Postes

Frontaliers

48 DSA 4 Bases

acridienne

14 SRPV

13 SRPV

régionales des

autres Wilayate

SRPV d’Oran

Entomologie Malherbologie Nématologie Virologie Mycologie Bactériologie

Secrétariat Bureau

Technique

06 Laboratoires Bureau

administratif


6

II. 4 – Missions :

II. 4. 1- de la SRPA d’Oran :

La SRPAV d’Oran est l’artisan essentiel de la veille phytosanitaire au niveau de la Wilaya

d’Oran est Ain T’émouchent. Elle a pour mission :

� Le contrôle phytosanitaire des produits agricoles objets d’échanges commerciaux

internationaux, ainsi que les plants et semences produits localement.

� La surveillance et la lutte contre les fléaux agricoles auxquels les agriculteurs n’ont pas les

capacités d’intervenir.

� La veille de proximité en apportant aux agriculteurs l’information préventive sous forme

d’avertissement agricole.

� Le développement et la maîtrise des techniques de protection des cultures en privilégiant les

solutions non polluantes, dont la lutte biologique.

Elle dispose de six laboratoires de diagnostic et d’analyses spécialisés en protection

phytosanitaire :

� Nématologie

� Entomologie

� Malherbologie

� Virologie

� Mycologie

� Bactériologie


7

II. 4. 2- Les missions du laboratoire de Bactériologie de la SRPV D’Oran :

Le laboratoire de bactériologie de la SRPV d’Oran a pour mission de procéder à des analyses

bactériologiques réglementaires et de proximités pour les besoins du contrôle phytosanitaire aux

frontières et à l’intérieur du pays, en vue de dépistage des bactéries prohibés ou bactéries phyto-

pathogènes de quarantaines.

Les bactéries de quarantaine sont des bactéries nuisibles qui ont une importance potentielle

pour l’économie de la zone menacée et qui ne sont pas encore présents dans cette zone ou bien qui sont

présent mais n’y pas largement disséminés et font l’objet d’une lutte officielle.

II. 4. 3- Le processus de travail du laboratoire de bactériologie :

II. 4. 4 - Les bactéries phyto-pathogènes de quarantaine (liste A1 –A2) les plus

contrôlés dans le laboratoire de Bactériologie :

Ce sont des bactéries susceptibles d’infecter les végétaux et d’y déclencher des maladies :

• Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus sur pomme de terre.

• Ralstania solanacearum sur pomme de terre.

• Xanthomonas arboricola pv. pruni sur les rosacées à noyaux (genre prunus).

• Erwinia amylovora sur rosacées à pépins (poiriers, pommiers,..).

• Pseudomonas savastanoï sur l’olivier.

Demande

d’analyse par

les inspecteurs

phytosanitaires

de Wilaya ou de

frontières

(IPW- IPF)

Analyses par

le

laboratoire

de

bactériologie

Elaboration

d’un bulletin

d’analyse par

le laboratoire

Déclenchement

d’une alerte

générale en cas

de présence

d’une bactérie

de quarantaine

Information

des parties

concernées

- Etude bibliographique

8

III - Etude bibliographique sur la production des olives en Algérie

III. 1 – Systématique de l’olivier

L’olivier appartient : (Lazzeri Y., 2009)

o Règne : Plantae

o Sous-règne :Tracheobionta

o Division :Magnoliophyta

o Classe : Magnoliopsida

o Sous-classe : Asteridae

o Ordre : Scrophulariales

o Famille : Oléacées

o Genre : Olea

o Espèce : europaea

L’espèce Oléa europaea a longtemps été subdivisée en deux sous-espèces, Oléa europaea var.

Europaea pour l’olivier domestique, et Oléa europaea var sylvestris pour l’oléastre, ou olivier sauvage.

La famille des oléacées comporte environ 30 genres et 600 espèces. Les variétés cultivées ; se composent

souvent de spécimens se ressemblant d’un point de vue morphologiques, mais aux caractères génétiques

différent (Guignard δ Dupont, 2004 δ Tourte et al. ,2005)

Fig. N° 02 : Variétés d’olivier


9

III. 2- Répartition de l’olivier dans le monde :

Le patrimoine oléicole mondial est d’environ 830 millions d’oliviers, dont 180 millions en

Espagne. La production

Les principaux vergers d’olivier se situent en Espagne, Tunisie, Italie, Turquie, Grèce, Maroc,

Syrie et Portugal.

Les principaux pays producteur de l’olivier sont Espagne, Italie, Grèce, Turquie, Tunisie, Maroc,

Syrie et Portugal.

Pays Nombre des pieds

(millions) Pays

Nombre des pieds

(millions)

Espagne

Italie

Grèce

Turquie

Tunisie

Maroc

Portugal

Algérie

Syrie

Chine

180

140

130

80

64

52

50

48

30

20

Liban

Albanie

France

Argentine

Slovénie

Lybie

Jordanie

Etats-Unis

Egypte

Chypre

6

5

5

5

4

4

3

2

2

1

Tableau N° 01 : Les principaux pays producteur de l’olivier dans le monde.


10

Fig. N° 03 : La production mondiale de l’huile d’olive.

III. 3- Répartition de l’olivier dans la région du Maghreb :

Au Maghreb, l’olivier fait partie de l’identité du peuple Maghrébin, la culture de ce dernier est

largement dominé par le verger oléicole Tunisien.

En effet la Tunisie occupe la 5ème

place de la production mondiale avec plus de 64 millions de

pieds d’olivier sur 900 000 hectares de superficies cultivée, qui s’étale dans 3 régions centre, sud et nord

(Karray B et al. 2009).

Au Maroc, la culture de l’olivier est très importante, elle occupe la 8eme

place mondiale avec plus

de 25 milles de pieds d’olivier sur une superficie de 540000 hectares dont 200 milles hectares dans les

zones montagneuses et 220 milles hectares dans les zones irriguées,100 mille dans les zones de Bour

favorables et 40 milles dispersé à travers le pays (Ylldiz T et Khadari B.,2009).

Par contre l’Algérie occupe la 10ème

place avec plus de 20 millions de pieds d’olivier sur une

superficie de 195500 hectares, la surface est répartie dans trois régions : le centre, avec 54,3%, l’est avec

28,3% et l’ouest avec 17%, de la superficie totale. La plupart des oliveraies (80%) sont situées dans des

zones de montagne (dans les vallées de Soummam et de la Seybouse, d’El-Kantara à philippeville, à

Gastu et à Jemmapes, et dans les régions de la Galle,Batna Guelma et Tebessa), caractérisés par une

pluviométrie moyenne comprise entre 400 et 900mm/an et une altitude comprise entre 50 et 700 mètre.

Espagne40%

Italie22%

Grèce 13%

Syrie1%

Turquie5%

Tunisie5%Autres 4%

Maroc3% Algérie 3% Jordanie1% portugal 3%


11

En Kabylie l’olivier se rencontre jusqu'à 1000 mètre d’altitude sur quelques verseaux montagneux

tournés vers la mère. Le reste des oliviers (20%) sont situées dans les pleines occidentales du pays

(Masera-Sig-Relizane), ou la pluviométrie moyenne annuelle est de 300-400 mm (Lazzeri Y., 2009).

Pays Position mondial Nombre de pied (million) Superficie (Hectares) Variétés

Tunisie 5ème

64 + 900000 - Chetoui

- Chemllel

Maroc 8ème

52 + 540000 - Picholine

- Meslala

Algérie 9ème

48 + 389000

- Sigoise

- Sévillane

- Rougette

- Chemllel

Tableau N° 02 : Les différentes variétés d’oliviers produits par les pays du Maghreb.

(Ylldiz T et Khadari B., 2009 ; Karray B et al.2009 ; Lazzeri Y., 2009).

III. 4- Position des oliviers en Algérie :

L’oliveraie Algérienne est répartie sur trois zones oléicoles importantes :

• La zone de la région ouest :

Représentant 31400 hectares réparties entre 5 wilayas à savoir Tlemcen,

Ain Temouchent, Mascara, Sidi Belabes et Relizane. Cette zone représente 16,40% du

verger oléicole National.

• La zone de la région centrale du pays :

C’est la plus importante, couvre une superficie de 110200 hectares répartis entre les wilayate

de : AinDefla,Blida, Boumerdes, Tizi-Ouzou, Bouira ,Bejaia. La Kabylie (Tizi-Ouzou,

Bouira, Bejaia) elle seule occupe pré de 44% de la superficie oléicoles national, il s’agit

surtout des vergers extensifs.


12

• La zone de la région est :

La superficie totale de cette région set de 49900 hectares, répartie sur plusieurs Wilayate à

savoir : Jijel, Skikda, Mila et Guelma.

III. 5- Intérêt de l’olivier :

L’olivier est cultivé pour ces fruits et particulièrement pour son huile, en effet l’huile représente

93% de la production mondiale.

Une trentaine de pays produisent l’huile d’olive, certain sont de gros producteur comme l’Espagne

et l’Italie produisant à eux seuls plus de 60% de production mondiale, ce pendant d’autres pays

producteurs important comme la Tunisie, la Turquie, la Syrie, le Maroc, L’Algérie, l’Argentine, le

Jordanie, produisent respectivement plus de 20000 tonnes d’huile d’olive pat an.

L’olivier constitue à l’échelle nationale une des principales essences fruitières .Le verger oléicole

occupe 240000ha et produit prés de 20.103 tonnes d’huile.

L’huile d’olive est utilisée traditionnellement en Méditerranée pour les soins de la peau et la

fabrication d’onguents ou de savons. Le savon d’Alep et le savon de Marseille, qui contiennent de l’huile

d’olive.

D’autre part, l’huile a des avantages sur la santé notamment sur le plan cardio-vasculaire, grâce à

sa teneur en vitamine A, vitamine E et en acides gras mono insaturés, les bienfaits liés aux vitamines sont

surtout observé lors de consommation d’huile froide, comme les salades.

III. 6- Variété Algérienne de l’olivier :

Parmi les principales variétés d’oliviers qui existent en Algérie sont :

La variété Chemllel : qui existe dans toute la Kabylie du littoral au sud de la vallée de la

Soummam, est considéré comme la meilleure productrice de l’huile de bonne qualité (Haas δ Défago,

2005).


13

Les variétés Limli, Azeradj et Bouchouk : se trouvent surtout dans la vallée de la Soummam

(Cottier,1999 ;Duffy et al,2003). Ces variétés représentent les trois quarts de la production oléicoles

nationale. Une autre variété est destinée à la consommation (olives de table) c’est la variété Sigoise

répartie au niveau de la région de Sig wilaya de Mascara. Les variété introduites durant l’époque

coloniale sont Cornicabra, la Lucque, la Frontoio et la leccino, d’origine Italienne ou Française et se sont

bien adaptées aux conditions climatiques de notre pays (Haas δ Défago, 2005).

III. 7- Etude bibliographique sur le groupe des Pseudomonas :

III. 7. a - Historique :

En raison de leur présence généralisée dans l’eau et des graines de plantes telles que les

dicotylédones, les Pseudomonas ont été observés au début de l’histoire de microbiologie. Le nom

générique Pseudomonas crée pour ces organismes a été défini en terme assez vague, en 1894 par Migula,

comme un genre de bactéries à gram- négatives, en forme de tige et possédant des flagelles polaires. Peu

de temps après, les Pseudomonas ont été isolées de nombreuses niches naturelles et un grand nombre de

noms d’espèces a été initialement attribuée au genre. Selon la deuxième édition du « Bergey’s Manual of

Systématique Bactériology, 1986 ».

III. 7. b. Définition :

Les Pseudomonas appartiennent aux Gramma-Protéobactéries. Ce groupe englobe la majorité des

espèces de bactéries phytopatogènes.

Le genre Pseudomonas appartient à la famille des Pseudomonaceae, il contient une soixantaine

d’espèces. Plusieurs études ont souligné le haut degré de diversité au sein de Pseudomonas fluorescens,

ce qui a mené à la subdivision de cette espèce en différentes biovars. Le groupe de Pseudomonas se

compose de bactéries sous forme de bâtonnets, Gram négatifs, mobiles par ciliature polaire, non sporulant

elles sont organotrophes, peu exigeantes, et incapable de fermenter le glucose, se caractérisent par la

pluralité des substances hydrocarbonées utilisées comme source de carbone et d’énergie, produisant des

pigments, la plupart étant saprophytes et pouvant coloniser les cellules corticales mortes des racines

(Cook et al.,1996 δ Frey et al.,2006).


14

Avant la fin 2006, sur la base de caractères phénotypiques et sur les bases génétiques.

Pseudomonas syringae a été retrouvé presque partout, avec une large diversité interspécifique, dont

génétique dans ceux des vergers de poirier, cerisier doux, cerisier acide et prunier qui ont été étudiés dans

les régions belges de Gembloux et de Gorsem (Bossis et al., 2000 δ Iacobellis,2001).

III. 7. c. Caractéristique des Pseudomonas :

Selon Schroth et al. Les espèces de Pseudomonas sont reconnues selon différents critères :

• Les caractères biochimiques :

- Les possibilités d’assimilation de substrats carbonés.

- Les besoins en facteurs de croissance.

III. 8- Les principales maladies de l’olivier :

III. 8- 1- Tavelure de l’olivier :

C’est la maladie la plus connue de l’olivier. Elle existe, en plus de payes méditerranéennes. En

Afrique du Sud, en Erythrée, aux Etat Unis et au Chili. C’est un parasite quasi exclusif d’Olea europaea,

quoique certains auteurs aient rapporté des attaques d’une souche du parasite sur les genres Phyllirea et

Ligustrum.

Elle est connue sous les noms vulgaires de repilo en espagnol ; olho de pavao en portugais ;

occhio di pavone en italien ; tavelure de l’olivier en français et olive leaf spot en anglais.

- Description de l’agent causal :

L’agent causal de la maladie est le champignon Spilocaea oleagina (Castagne) Hughes. Il s’agit

d’un phycomycète qui se développe et forme des colonies sous la cuticule supérieure des feuilles. Ces

colonies évaluent parallèlement à la surface foliaire et leur appareil végétatif est composé par des hyphes

très fines, hyalines, ramifiées et cloisonnées d’une manière intermittente.

Le mycélium croît en se dirigeant vers la superficie des lésions et acquiert la forme typique des anneaux

concentriques.


15

A partir des hyphes, émergent des conidiospores, courts, peu différenciés et dans la majorité des

cas, unicellulaires. De ceux-ci sortent successivement des conidies pouvant aller jusqu’à 8 par

conidiophore. Sur les feuilles chutées des arbres, se forme un corps végétatif étendu sur lequel on peut

observer des masses stomatiques denses.

- Biologie :

La biologie du champignon est très variable selon les régions et les années. Son développement

dépend de plusieurs facteurs comme l’humidité, la température, la pluie et les techniques culturales.

- Dégâts :

Comme conséquence des lésions produites par Spilocea oleagina, une importante chute de feuilles

se produit, ce qui se manifeste clairement sur les branches inférieures qui peuvent perdre toutes leurs

feuilles. Cette situation entraîne un affaiblissement de l’arbre d’autant plus grand que l’attaque est

importante. Ceci se manifeste par des partes de production et des bourgeons axillaires, ce qui donne lieu à

un développement très lent de l’arbre et compromet la formation des jeunes arbres.

Les pédoncules et les fruits peuvent également être affectés. Dans le premier cas, l’olivier tombe

prématurément sur le sol, produisant des pertes de récolte et affectant la qualité de l’huile selon la période

e chute (avant ou après la récolte). Dans le cas ou il affecte le fruit, l’infection retarde la maturité et

diminue la qualité et la quantité de l’huile produite.

- Facteurs qui affectent la maladie :

Les facteurs qui affectent la maladie en grande mesure le développement du champignon. Il a un

développement normal entre les limites thermiques qui correspondent à un climat tempéré, avec des

valeurs moyennes de 10 à 20 °C. Son optimum est situé autour de 9 à 18 °C.

L’agressivité de l’attaque du champignon dépend de la quantité et de la fréquence des pluies. Les

zones dans lesquelles le printemps et automne sont pluvieux et doux sont plus à des infections élevées du

pathogène. De la même manière, ceci peut avoir lieu dans les zones ou l’hiver et doux et l’été est peu

chaud. Dans ces cas, l’activité du champignon est ininterrompue et les infections se chevauchent.

L’humidité élevée est nécessaire pour le développement du champignon. Pour cette raison. La

pluie, la rosée et les humidités relatives élevées sont des facteurs importants pour que la maladie évolue

favorablement. D’autres facteurs influent indirectement en favorisant la présence de l’humidité sur l’arbre

notamment le manque d’ensoleillement, des arbres mal aérés, des zones basses ou s’accumule l’humidité,


16

etc. Pour la germination des conidies, il est nécessaire d’avoir une humidité suffisante qui peut provenir

indifféremment de l’eau de pluie ou de la rosée. Les conidiophores perdent la capacité de produire des

conidies après 7 jours dans un environnement sec ou à une température de 18 °C.

La durée de la période d’humectation de la feuille est d’une grande importance pour que se

produise d’infection. Il a été observé, dans le cadre d’expériences réalisées à température contrôlée que

cette période est de 48 heures à 16 °C , de 24 heures à 20 °C et de 36 heures à 24 °C.

En général, dans les pays riverains de méditerranée, on considère deux époques typiques

d’infection : le printemps et l’automne. Durant l’été et l’hiver, la propagation est limitée par les

conditions climatiques défavorables : le pathogène reste à l’état latent ou son activité est très réduite.

Les pratiques culturales telles que des irrigations excessives, une taille insuffisante ou la

proximité de rivières favorisent le développement du pathogène, car l’olivier reste pendant une large

période de temps a des humidités élevées. L’excès de flétrissement azoté et le manque de calcium

prédisposent la plante à la maladie.

L’âge des feuilles influe sur l’infection de Spilocaea oleagina. Il y a quelques années, on pensant

que les feuilles plus âgées et plus développées étaient plus réceptives que les feuilles jeunes qui étaient

protégées par leurs poils. Dans les études réalisées récemment, il a été vérifié que l’attaque du

champignon est plus grande sur les jeunes feuilles. (Manuel Civantos Lopez- Villalta. 1999)

Figure N° 04 : Tavelure sur l’olivier.


17

III. 8- 2- Verticilliose de l’olivier :

Ce pathogène est très répandu puisqu’il attaque un grand nombre d’espèce, aussi bien ligneuses

qu’herbacées. Sur l’olivier, il a été décrit pour la première fois en Italie en 1946 et a été observé dans

différents pays du bassin méditerranéen, notamment en Espagne, en France, en Grèce et en Turquie, amis

également en Asie mineure, en Syrie et aux Etats-Unis (Californie).

Il est connu sous le nom vulgaire verticilosis del olivo en espagnol, Verticillium wilt en anglais,

verticilliose de l’olivier en français et tracheoverticillosi en italien.

- Description de l’agent causal :

La maladie est produite par le champignon Verticillium dahliae Kleb.

C’est un champignon qui développe un mycélium hyalin, sur lequel apparaissent les conidiophores

qui se caractérisent par trois verticelles avec 3 à 4 fialides, sur le sommet desquels sont disposées les

conidies.

- Dégâts :

Il s’agit d’une maladie qui présente un grand potentiel de développement. Elle affecte

actuellement de vastes zones oléicoles, surtout les nouvelles plantations qui sont réalisées dans les pays

ou la culture est en expansion ou bien dans les régions ou des plantes de restructuration de l’olivier

traditionnel sont en cours, en générale, elle affecte les oliveraies irriguées plus ou moins intensivement

et localisées dans les zones irriguées complantées d’espèces sensibles à la maladie.

Les dégâts se manifestent par un dessèchement des branches secondaires, des branches principales

et parfois même de l’arbre complet.

En Grèce, les pertes occasionnées par la maladie ont été évaluées à 2 à 3 % sur les 14 Millions

d’arbres testés affectées. Un pour cent de ces arbres affectes ont été complètement détruits. En

Andalousie, sur 122 exploitations inspectées avec un total de 350.000 arbres, 38,5 % des arbres étaient

affectés avec une incidence moyenne de la maladie qui oscille entre 10 et 90 % des arbres affectés.

- Facteurs influençant la maladie :

L’humidité du sol et la température extérieure méritent une attention particulière. L’incidence de

la maladie est plus grande dans les oliveraies irriguées. En ce qui concerne la température, la sévérité de

l’infection est favorisée au printemps par des températures de l’air durant la journée qui n’excèdent pas

20 à 25 °. Pendant l’été, les moyennes maximales diumes ne doivent pas être supérieures à 30 – 35 °C


18

pour favoriser la maladie. Dans des conditions expérimentales, avec une humidité optimale du sol, les

conditions de développement maximal de la maladie se produisent à des températures comprises entre 21

et 27 °C, avec un maximum à 24 °C.

En découvrant la zone vasculaire, on observe sur le bois, une couleur brune, symptôme de la

maladie. (Manuel Civantos Lopez- Villalta. 1999).

Fig. N° 05: Verticilliose de l’olivier.

III. 8- 3- Le chancre bactérien de l’olivier :

C’est une maladie infectieuse causée par une bactérie P.savastanoi qui a été signalée au 4éme

siècle

par le grec, Theophrastus. Le pathogène semble avoir été disséminé avec des plantes d’olivier (Olea

europaea subsp. Europaea) puis étendus et propagés dans beaucoup de régions dans le monde. Cette

bactérie, a été isolée par Luigi savastanoi (Bradbury, 1986).

Le nom actuel est Pseudomonas syringae pv. savastanoi (Gardan et al. 1992). Cette bactérie est

considérée comme le seul pathogène responsable de la formation des nœuds (nécroses) bactériennes es

olives (Philippe, 2007). En Italie, la maladie est appelée « rogne » de l’olivier, en Espagne « verrue » ou

« Tuberculose » de l’olivier, en France et en Afrique du Nord on lui donne le nom de Tuberculose ou le

chancre bactérien de l’olivier.

La maladie agit sur la croissance des repousses et elle affecte les organes reproducteurs, et

s’attaque même à d’autres plantes comme le laurier rose, le frêne, le troène, le jasmin,…ect.

La maladie peut tuer les arbres si les infections se produisent sur la ceinture et les troncs de jeunes

arbres pour cause de blessure de taille.


19

Cette maladie est considérée comme un problème majeur par effets néfaste sur la croissance, le

rendement et surtout la qualité de l’huile d’olive (Guido., 2005).

Cette maladie très contagieuse sur certaines variétés, peut être également transmise par les

techniques de multiplications (greffage et bouturage) à partir de rameaux provenant d’arbres contaminés.

Cette maladie est parmi celles qui produisent le plus de dommages sur la culture de l’olivier, affectant

même la qualité des fruits et donnant naissance à des odeurs indésirable. (Hall et al., 2004 δ Quesada et

al., 2008). Suivant le décret exécutif : 93-286 23/11/1993 Pseudomonas savastanoi est considéré comme

un parasite de quarantaine.

Figure N° 06 : Le chancre bactérien de l’olivier

Site à Ain Témouchent


20

- Les symptômes de la maladie et description des galles :

Elle se manifeste par des tumeurs parenchymateuses à forme irrégulière de couleur vertes au début

et à surface lisses. Le nœud d’olive apparait comme galle bruts ou gonflement d’environ 0,5 à 2 cm de

diamètre sur les rameaux, branches troncs principal, racines, feuilles abimées, tiges fruits les jeunes

pousses. Après quelques mois les galles acquièrent un aspect spongieux et irrégulier, devenant dur et brun

sur les petites pousses. Ces galles apparaissent isolément ou rapprochées sur toute la partie de la plante.

Les galles peuvent endommager la structure de la tige et déformer l’échafaud de l’arbre si l’infection est

sévère durant les premiers stades du développement des arbres (Icobelli, 2001 δ Philippe, 2007).

Selon Nielsen (1990), l’impact de la maladie se traduit sous divers aspect :

• Perte de feuilles du fait de l’étranglement mettant hors circuit l’alimentation des feuilles en

aval ;

• Dessèchement du bois par suite d’une photosynthèse défaillante ;

• Réduction de production ;

• Dans une phase ultérieure, réduction même de la taille des arbres par suite d’une végétation

désordonnée.


21

Figure N°7 : Tumeurs dues au Pseudomonas savastanoi sur les branches et les rameaux (A), les

feuilles (B) et le tronc (C), d’un arbre d’olivier.

A : dégâts sur rameaux

B : dégâts sur feuilles

C: dégâts sur tronc


22

- Origine de la maladie :

Pseudomonas savastanoi est l’agent causal de la tuberculose de l’olivier, observé pour la première

fois par Savastanoi en 1870 puis au début du vingtième siècle par Smith et Rorer 1904 (Guido M., 2005).

- Principaux caractères bactériologiques :

Se sont des bactéries bâtonnets (0.4-0.8 x1.0-3.0), Gram négatives, catalase positive, mobiles avec

1 ou plusieurs flagelles polaires, une croissance plutôt lente, les colonies sont blanche grise ou crème,

lisses plates, scintillantes, produisant une réaction d’hypersensibilité sur tabac, métabolisme respiratoire,

n’hydrolyse pas la gélatine et l’amidon, assimile plusieurs sucre : sucrose, L-arabinose, gluconate,

caprylate (Bergey., 2003).

Figure N° 08 : Bactérie Pseudomonas savastanoi.

- Systématique de la bactérie :

Le Genre Pseudomonas est classé dans la famille des Pseudomonadaceae (ordre des

Pseudomonadales, classe des Gammaproteobacteria, division ou phylum des « Proteobacteria »,

domaine ou empire des « Bacteria »).


23

- Classification de Pseudomonas savastanoi :

Règne Bacteria

Division Proteobacteria

Classe Gammaproteobacteria

Ordre Pseudomonadales

Genre Pseudomonas

- Les espèces de la bactérie :

La bactérie a été isolée pendant plusieurs années à partir de la famille des oléacées, d’où on peut

trouver des espèces qui produisent ou nom de levane a partir de saccharose. Ces espèces ont été devisées

en 05 pathovars :

� Pseudomonas Savastanoi pathovar Savastanoi qui cause la galle, ou bien la tumeur dans la famille

des oléacées.

� P.Savastanoi pathovar Glycinea cause de la rouille bactérienne du soja.

� P.Savastanoi pathovar phasealicola cause la rouille de halo de l’haricot.

� P.Savastanoi pathovar fraxini .

� P.Savastanoi pathovar nerri.

Le nom de Pseudomonas savastanoi a été mis pour la première fois par Stevens en 1913, mais la

bactérie a té inclus dans la liste des pathovars des espèces de Pseudomonas syringae (Young J et al.,

1996 ; Bergey.,2003).


24

- Pouvoir pathogène :

Jusqu’à présent la seule information présente dans la littérature sur le pouvoir pathogène de P.

savastanoi est sa capacité d’induire la formation des Gall (tumeurs), par la stimulation des

phytohormones l’acide indole-acétique et le cytokinine (Penyalver R., 2005 ; Moretti C., 2008). Et cela

est du à un plasmide qu’on l’appelle « Ti » (tumeur induisant) qui est transféré dans les tissu végétaux, et

qui s’intègre dans le génome de la cellule hôte pour être transcrit, le nouveau ADN formé déclenche une

production autonome des phytohormones : l’acide indole-acétique (AIA) qui joue un rôle dans

l’élargissement des cellules et le cytokinine qui favorise la division cellulaire (Carol C., 2008).

De nombreux auteurs utilisent la protéine reporteur d’auto fluorescence combiné à la technologie

GFP (green fluorescent protéine) afin de déterminer les interactions entre bactérie-plante (Luis R et al.,

2009).

D’autre part, GFP en combinaison avec des techniques de microscopie d’epifluorescence a été

employé largement pour la visualisation des cellules de Pseudomonas dans la rhizosphère (Boldt et al.

2004) et sur des surfaces de la feuille (Wang et al. 2007) et dans les tissus infectés. (Wang et al., 2007).

- Cycle de la maladie :

Bien que la bactérie puisse être présente tout au long d’un verger, il ne peut inciter à la maladie

qu’après l’entrée passive de l’hôte par des blessures ou des cicatrices foliaires (Savastanoi, 1987).La

transmission de la maladie est liée à la pluie événement qui stimule la croissance de la population

bactérienne et facilite la circulation de l’agent pathogène. Les pluies de printemps sont particulièrement

propices au développement de la maladie parce qu’un grand nombre de feuilles tombe en mai et juin,

laissant des cicatrices foliaires sensibles aux agents pathogènes. Les cicatrices foliaires sont plus sensibles

à l’infection dans les deux jours après une pluie, mais peuvent rester sensibles pendant sept jours après la

pluie. Une fois la bactérie infecte la plante, elle produit des hormones de croissance des végétaux

(l’auxine et cytokinines) qui stimulent la prolifération des tissus résultant en une galle ou nœud (Surico,

1989 δ Smidt δKosuge, 2000). Des études récentes montrent que la bactérie peut être transportée dans la

plante par les vaisseaux du xylène, ce qui provoque des nœuds « secondaire » le long de la tige. Cette

nouvelle information souligne l’importance de la prévention des infections initiales de la gestion des

populations de l’agent pathogène à l’extérieur de l’arbre (Young δTriggs, 1994).


25

Figure N° 10 : Coupe transversale d’une galle bactérienne évolutive sur un rameau d’olivier

(Lavermicocca et al. 1999).

Impact de la maladie :

Il se traduit sous divers aspect, perte de feuilles, desséchement de bois suite d’une photosynthèse

défaillante, réduction de production, dans une phase ultérieure, il est montré réduction même de la taille

des arbres suivi d’une végétation désordonnée.

Figure N° 11 : Dégâts sur fruits.


26

Gestion de la maladie :

Sachant que, la tuberculose de l’olivier est considérée comme un parasite de quarantaine suivant le

décret exécutif : 93-286 23/11/1933.

Il n’ya malheureusement, à ce jour, aucun remède connu et efficace contre cette maladie. Il faut

cependant suivre quelques recommandations afin de limiter la propagation de cette bactérie dans les

vergers oléicoles :

� La principale est de désinfecter soigneusement tous les outils de taille.

� Toutes les parties atteintes seront arrachées sectionnées et incinérées par le feu.

� Eviter les excès d’irrigation de l’arbre.

� Eviter les blessures au moment de la taille.

� Selon les conseils locaux de la société centrale d’agriculture de Nice et des Alpes – Maritimes

(SCAH) il faut appliquer des produits cupriques au printemps et à la fin de l’automne tel que la

bouillie bordelaise à 1% afin de désinfecter et cicatriser les plaies de taille.

Des travaux ont montré que les pulvérisations supplémentaires au printemps ainsi que l’application

après la récolte habituelle permettront d’améliorer sensiblement le contrôle des maladies (Botelho δ

Leda, 2006).

S’agissant d’un parasite de quarantaine dont la lutte est obligatoire et eu égard à la gravité de la

maladie et de sa propagation rapide il est nécessaire que ce problème phytosanitaire doit être prise en

charge sérieusement par les services de la protection des végétaux, et cela compte tenu de l’importance

du programme quinquennal 2004-2014 à mettre en place + d’un million d’hectares d’olivier à l’échelle

nationale.


27

VI. Choix des méthodes d’analyse pour la détection de Pseudomonas savastanoi :

VI. 1- Avantages et inconvénients des différentes méthodes d’analyses envisageables :

Les contrôles visant à détecter des végétaux porteurs de la bactérie sans qu’il y ait de symptômes

sont importants. Pour cela, de nombreuses recherches sont faites pour diminuer les seuils des procédures

de détection et pour augmenter leur spécificité. Chaque méthode présente des avantages et des

inconvénients.

II. 2- L’isolement sur milieux sélectifs :

L’isolement consiste à mettre en culture une bactérie recherchée à partir d’un échantillon végétal.

On peut utiliser pour cela des milieux de cultures semi-sélectifs limitant le développement des

microorganismes saprophytes (bactéries, champignons). On sélectionne ensuite les colonies afin de les

purifier et d’obtenir des souches pures. La lecture est basée sur les caractéristiques macroscopiques des

colonies formées (taille, forme, couleur, aspect) sur un milieu donné dans un temps donné.

VI. 3 - Les critères de sélection des milieux semi-sélectifs sont basées sur :

a- Les critères qualitatifs :

Une observation visuelle des caractéristiques morphologiques sur les 03 milieux gélosés, ensuite

une comparaison de la structure des colonies est réalisée à savoir : la taille, le diamètre et l’aspect

muqueux ainsi que la durée de la croissance de la bactérie.

b- Les critères quantitatifs :

Cette technique est basée sur le dénombrement des colonies existantes et la comparaison de la

vitesse de développement sur les 03 milieux de cultures.

Le Laboratoire National de la Protection des Végétaux, a choisi les milieux de cultures de la

bactérie, Pseudomonas savastanoi, sur la base d’un protocole OEPP.


28

VI. 4 - Les milieux de cultures :

Il s’agit de 3 milieux de cultures coulés en boites de pétri après autoclavage :

� Le milieu King-B.

� Le milieu LPGA.

� Le milieu Levane.

VI. 5- Les tests biochimiques :

Ces tests réalisables après isolement, reposent sur la constitution et le métabolisme cellulaire des

bactéries. La réalisation d’une galerie de tests permet de mettre en évidence diverse propriétés

biochimiques spécifiques d’une espèce bactérienne et son identification.

Les tests biochimiques donnent des résultats très fiables qui peuvent venir confirmer ou infirmer

les résultats d’autres méthodes moins sensibles ou moins spécifiques.

Cependant la réalisation des tests biochimiques implique un isolement préalable.

Certains tests biochimiques sont relativement longs à mettre en œuvre (1 à 2 semaine).De plus ces

tests ne sont pas adaptés au traitement de grandes quantités d’échantillons.

VI. 6- Les analyses sérologiques :

L’immunofluorescence (IF) :

Cette technique fait intervenir une réaction immunologique (liaison anticorps- antigène). La

bactérie possède des antigènes, intégrés dans sa paroi, qui lui est spécifique. Cela déclenche chez les

vertébrés, la synthèse d’anticorps spécifiques. On recherche alors la présence de la bactérie Pseudomonas

savastanoi, en additionnant à l’échantillon analysé les anticorps anti-Pseudomonas savastanoi. Les

complexes Ag-Ac sont mis en évidence grâce à un second anticorps, conjugué à un fluorochrome.

Celui-ci se fixe spécifiquement sur l’Ac anticorps, Pseudomonas savastanoi et fluoresce lorsqu’il

est soumis à des rayons UV. Cette technique consiste à préparer directement la solution bactérienne avec

les anticorps fluorescents. Les bactéries de Pseudomonas savastanoi apparaissent fluorescentes sous la

lumière ultra violette, la sensibilité de cette technique est assez bonne du faite qu’elle permet de détecter

l’agent pathogène, mais la méthode du comptage est un peu difficile à réaliser car la concentration

bactérienne est très importante par lame.

– MATERIELS & METHODES :

29

I. MATERIEL BIOLOGIQUE :

I. 1. Souches bactériennes :

Les isolats de Pseudomonas savastanoi utilisées dans cette étude proviennent du matériel

végétal contaminé (rameaux infectés) d’origine de la Wilaya d’Oran et d’Ain Temouchent.

Les souches de bactéries sont maintenues par repiquage de colonies tous les 3 à 4 jours. Les

isolats de Pseudomonas savastanoi sont cultivés sur milieu King-B. toutes les boites sont misent en

incubation à 260C.

I. 2. Purification des souches bactériennes :

Une suspension bactérienne réalisée dans de l’eau stérile est étalée sur boites de milieu King-B

à différentes dilutions et incubée à 260C (Lelliot R.et Stead G., 1987). Après une croissance de 24 h à

72h. Une lecture des boites se fait par observation visuelle, précisant les caractères phénotypiques de la

bactérie, et celles possédant les caractéristiques morphologiques de Pseudomonas savastanoi sont

étalés par épuisement sur une nouvelle boite de milieu BK et remise à incuber.

Apres une croissance suffisante ; les cultures sont soumises à un ensemble de tests

biochimiques, décrit par Schaad et Stall (1988). Ce test est utilisé pour confirmer la détermination de

l’espèce bactérienne et d’effectuer un diagnostic sur des colonies de Pseudomonas savastanoi

prélevées à partir du milieu King-B.

I. 3. Gamme de dilutions bactériennes :

Des suspensions bactériennes ont été réalisées à partir de 48h à 72h dans de l’eau stérile. Un

prélèvement initial ajusté à 108cfu /ml a été soumis à des dilutions en cascade de 0 en 10, de façon à

obtenir une gamme de dilution bactérienne.

A partir du tube n prélever 1mL de la nouvelle solution mère. Réaliser des dilutions successives au 1/10


30

Fig.12 : Gamme de dilution de la souche bactérienne.

Etaler les suspensions de D3 à D6 sur les milieux de cultures, à raison de3 boites par dilution.

Incuber les boites de pétri à 260C pendant la durée recommandé.

Dénombrer les bactéries sur les trois boites à la dilution la plus lisible, en faire la moyenne pour

déterminer la concentration du tube D0 puis des tubes 1à6.

I. 4. L’isolement sur les 3 milieux de cultures :

L’isolement de souches bactériennes est une étape indispensable pour caractériser avec

certitude une espèce bactérienne.

Une dose de 100ul de chaque concentration est étalée sur les trois milieux de cultures : King-B,

Levane, LPGA, pour dénombrer les bactéries après une croissance de 3 jours à 260C.

Selon (Guido M., 2005) Levane peut être utilisé comme un milieu de culture.

Le dénombrement sert à déterminer la concentration exacte de la suspension bactérienne.

1000µL

D1 D2 D3 D4 D5 D6


31

I. 5. Coloration de Gram :

La coloration de Gram est utilisée pour différencier les bactéries Gram positif des bactéries

Gram négatif. Cette coloration différentielle repose sur l’aptitude ou non de la paroi bactérienne à

s’opposer à la coloration par éthanol. Les bactéries dites Gram positif possèdent une paroi épaisse,

composée de peptidoglycane en leur donnant une imperméabilité à l’éthanol, tandis que les bactéries

Gram négatif ne contiennent qu’une fine couche de peptidoglycane et surtout de lipide en quantité

importante et c’est ce qui va rendre la décoloration effective.

A l’aide d’une anse à ensemencement on prélève une colonie qu’on dépose sur une lame.

Une goutte d’eau distillée est déposée sur le frotti qui sera séché puis fixé à la flamme bleue.

La lame est colorée au violet de gentiane pendant 1min puis rincée abondamment à l’eau

distillée. On fait agir le Lugol pendant 20 secondes en vu de consolider la fixation du premier colorant

sur la paroi. Apres rinçage à l’eau distillée, la violet de gentiane est éliminé par lavage à l’éthanol

jusqu’à décoloration totale. Une seconde coloration à la fuchsine est réalisée pendant 1min. on lave

doucement à l’eau distillée. Apres séchage au bec bunsen, la lame est observée au microscope en

ajoutant une goutte de l’huile d’immersion.

II. Tests biochimiques :

- Les tests biochimiques constituent une approche classique pour l’identification de l’espèce

bactérienne.

- Tous les tests biochimiques sont effectuées sur des souches âgées de 24h, en effet, les

colonies isolées sont repiquées sur milieu solide King B et incubés pendant 24 h à 26 °C.

a. Le test Catalase :

Ce test est important pour la première orientation dans l’identification de l’espèce bactérienne.

Il permet de mettre en évidence la présence ou l’absence de l’enzyme catalase.

Sur une lame, on dépose à l’aide d’une ance, une goute d’eau oxygénée et une colonie

bactérienne cultivée sur milieu King B solide. La lecture se fait après quelques secondes.


32

b. Hugh et Leifson :

Le milieu de Hugh et Leifson permet de déterminer la voie métabolique, oxydative, ou

fermentative empruntée par la bactérie étudiée.

On ensemence une colonie bactérienne qui provient du King B solide dans deux tubes

contenant le milieu Hugh et Leifson. Apres homogénéisation, l’un des tubes est recouvert d’huile de

vaseline en vue de conditions d’anaérobiose. Les tubes sont fermés et laissés à température ambiante.

La lecture se fait après 24 h.

Le milieu Hugh et Leifson est composé pour un litre d’eau distillée de 2 g de bacto peptone,

5 g NaCl, 0,3g Kh2Po4, 10g Glucose, 0.03g Bleu de Bromothymol (BBM).

c. Péctinase :

Le test péctinase permet de déterminer la présence ou l’absence de l’enzyme péctinase.

Dans notre étude nous utilisons comme substrat des rondelles de pomme de terre. Ce tubercule

étant riche en pectine et son hydrolyse en présence de péctinase se traduit par l’apparition de nécrose.

Des tranches de pomme de terre sont stérilisées à l’éthanol 700 puis lavées à l’eau distillée

stérile et séchées. Dans une boite de pétri contenant du papier filtre mouillé, les tranches sont

déposées, et inoculées de colonies bactériennes fraichement prélevées. L’ensemble et recouvert de para

film et laissé à incubé à 270C. La lecture se fait après 4jours.

d. Le test d’hyper sensibilité sur feuille de tabac :

Le test d’hypersensibilité sur feuille de tabac sert à mettre en évidence le pouvoir

phytopatogènes des Pseudomonas fluorescentes (Schaad N. et al ., 2001). Et ce par dessèchement des

zones d’inoculation sur les feuilles de tabac.

A l’aide d’une seringue on injecte la suspension bactérienne provenant du milieu King B

liquide dans la nervure principale de la feuille de tabac. Après 24 heures à température ambiante on

fait la lecture.


33

III. L’immunofluorescence (IF) :

Cette technique fait intervenir une réaction immunologique (liaison anticorps- antigène).

Les anticorps spécifiques de Pseudomonas savastanoi contenus dans l’antisérum se fixent sur

les antigènes de la bactérie. Des anticorps conjugués sont alors dirigés contre les premiers anticorps

fixés. Ces anticorps conjugués sont marqués par un fluorochrome qui émet une fluorescence sous

lumière ultraviolette. Le complexe bactérie- anticorps conjugués est alors observable par microscope

optique.

Un dépôt de 40ul de la suspension bactérienne est réalisé sur des lames IF, mettre en incubation

pendant 20mn et fixer les lames à l’éthanol 900. Un témoin positif a été utilisé comme estimateur de la

sensibilité de la méthode.

Dépôt de 40uL de SM-D1-D2-….-D6 sur chaque lame IF

Fig.13 : dépôt de la suspension bactérienne sur lames (IF).

Macérat 3 Macérat 2 Macérat 1

40uL


34

Fig.14 : Gamme de dilution et ensemencement sur boites de milieux de cultures.

50µL

50µL

50µL

50µL

50µL

50µL

Dans 900 µL d’eau 100µ

100µ

Dans 900 µL d’eau





100µ

100µ

100µ

100µ

1 dépôt de 40 µL de chaque tube

sur lame IF

Dépôt de 50 µL sur

BK- LPGA- Levane

1 ml de la Solution

Bactérienne


35

Echantillons

Macération avec tampon antioxydant

Lame IF Isolement direct

LPGA KB Levane

Tests biochimiques

Les techniques expérimentales utilisées pour la détection de Pseudomonas savastanoi

Suivant le protocole OEPP.

– Résultat et discussion :

36

I. Résultat et discussion :

Les expériences dont a fait l’objet cette étude avaient pour but de tester et comparer la sensibilité

des méthodes de dépistage de Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi sur échantillons symptomatiques,

proposées par l’OEPP. Ces techniques sont donc censées pouvoir déceler de faibles concentrations de la

population de Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi existantes chez les plantes hôtes.

1- Essai d’isolement des macérâts contaminés sur milieu de culture :

La technique d’isolement bactériologique sur milieux de culture répond à une démarche de

diagnostic classique, en repérant les colonies ayant des caractéristiques phénotypiques de Pseudomonas

savastanoi pv. savastanoi. (Voir le tableau de dénombrement).

2- Observation macroscopique :

Après 24 h d’incubation à 26°C les bactéries ont poussées sur les milieux King B et LPGA, par

contre sur le milieu Levane la bactérie nécessite 3 à 5 jours pour se développées.

a- Caractéristiques morphologiques des bactéries :

Cette caractérisation est basée sur le critère de l’impact des colonies, sur les trois milieux :

• Sur le milieu King B, la condensation des colonies est forte donc on peut dire que

l’impact est fort, ce qui explique la formation d’une crème bactérienne.

• Par contre le milieu LPGA, la condensation des colonies est moyenne donc l’impact est

moyen, les colonies sont un peu dispersé avec un nombre moyen.

• En fin le milieu Levane, la condensation des colonies est faible donc l’impact est faible,

avec un nombre des colonies très faible.

b- Caractères phénotypiques des colonies sur les trois milieux :

Sur milieu LPGA, la figure 15 on voit les colonies de couleur crème, de forme circulaire, un

diamètre de 2.5 mm à 3.5 mm, convexe, translucide, lisse, brillante identique à celle décrite par (Bergey,

2003).

Par contre sur le milieu Levane, dans la figure 15 on voit des colonies de couleur blanc gris avec

un aspect visqueux, une forme circulaire, convexe, translucide, diamètre 2.5 mm à 3.5 mm, identique à

celle décrite par (Guido M et al.2005).


37

En fin sur le milieu King B, la figure 15 montre les mêmes caractéristiques observées dans le

milieu LPGA.

Les colonies bactériennes de Pseudomonas savastanoi ensemencées sur milieu King-B, donnent un aspect

fluorescent et prennent une couleur vert-jaune fluorescente, cela est du à la présence du pigment fluorescéine.

(Balestra J. et al. 2009).

Milieu Levane Milieu LPGA

Milieu BK

Figure N° 15 : Isolement Pseudomonas savastanoi.


38

3- Observation microscopique :

a- Coloration de Gram :

La figure N°16 montre des bacilles de Pseudomonas savastanoi « Gram négatif », identique

à celle décrite dans le manuel Bergy (2003).

Figure N° 16 : Observation microscopique à l’immersion de Pseudomonas savastanoi

après coloration de Gram (grossissement 1000)

b. Tests biochimiques :

Les tests biochimiques constituent une approche pour l’identification des bactéries, ils ne sont pas

particulièrement utiles pour la détermination de certaines espèces et sous- espèces de bactéries.

Touts les tests biochimiques sont effectués sur des colonies âgées de 16 à 24 h.


39

b. 1- Catalase :

Le résultat de ce test nous montre la formation des bulles d’oxygène, du à la présence de

l’enzyme catalase, donc Pseudomonas savastanoi est catalase positif.

Figure N° 17 : Test de Catalase.

b. 2. Levane :

Les colonies de la bactérie Pseudomonas savastanoi sur milieu levane sont visqueuse entouré par

une marge luisante du à la dégradation du sucrose en levane par la bactérie, en effet selon (Guido M et

al.2005) les Pseudomonas savastanoi sont de levane positif.

Figure N° 18 : aspect d’une crème bactérienne de Pseudomonas savastanoi sur milieu levane


40

b. 3. Hugh et Leifson :

Sur le test Hugh et Leifson on observe le virage de la couleur du vert au jaune pour le tube qui ne

contient pas de l’huile, ceci est du à la dégradation de glucose par la bactérie.

Figure N°19 : test de Hugh et Leifson.

b. 4. Péctinase :

Pour le test Péctinase, on observe l’absence de zone de lyse, selon (Guido M et al.2005) les

Pseudomonas savastanoi ne dégrade pas les pectines.

Figure N° 20 : Test de Péctinase.

A B


41

b. 5. Arginine déshydrolase :

Le milieu arginine apparait en couleur jaune, selon (Guido M et al.2005) les Pseudomonas

savastanoi sont arginine négatif.

Figure N° 21 : test d’Arginine déshydrolase.

b. 7. Le test d’hyper sensibilité sur feuille de tabac :

Le test d’hypersensibilité sur feuille de tabac sert à mettre en évidence le pouvoir phytopatogènes

des Pseudomonas fluorescentes (Schaad N. et al ., 2001). Et ce par dessèchement des zones d’inoculation

sur les feuilles de tabac.

A l’aide d’une seringue on injecte la suspension bactérienne provenant du milieu King B liquide

dans la nervure principale de la feuille de tabac. Après 24 heures à température ambiante on fait la

lecture.

Figure N° 22 : hypersensibilité de feuille de tabac après inoculation bactérienne.


42

c. Dénombrement sur milieu BK :

• Ensemencement du macérât contaminé N°1 :

Dénombrement D0 D1 D2 D3 D4 D5

Boite 1 25

Boite 2 29

Boite 3 2700000 270000 27000 2700 270 27

Concentration D0 (ufc/ml = 2,7. 106)



Boite 1 29

Boite 2 31

Boite 3 3000000 300000 30000 3000 300 30

Concentration D0 (ufc/ml = 3,0. 106)



Boite 1 11

Boite 2 13

Boite 3 1200000 120000 12000 1200 120 12

Concentration D0 (ufc/ml = 1,2. 106

ufc/ml)

d. Dénombrement sur milieu levane :



Boite 1 25

Boite 2 23

Boite 3 2400000 240000 24000 2400 240 24

Concentration D0 (ufc/ml = 2,4. 106 ufc/ml)


43



Boite 1 25

Boite 2 23

Boite 3 3000000 300000 30000 3000 300 30

• Concentration D0 (ufc/ml = 3. 106 ufc/ml)



Boite 1 30

Boite 2 25

Boite 3 3200000 320000 32000 3200 320 32

• Concentration D0 (ufc/ml = 3.2. 106 ufc/ml)

e. Dénombrement sur milieu LPGA :



Boite 1 29

Boite 2 27

Boite 3 2800000 280000 28000 2800 280 28




Boite 1 37

Boite 2 35

Boite 3 3600000 360000 36000 3600 360 36



44



Boite 1 11

Boite 2 09

Boite 3 1000000 100000 10000 1000 100 10


Les étalements correspondants aux dilutions D4 - D5 et D6 sont plus faciles à dénombrer. A ce

stade de dilution, les colonies apparaissent de couleur jaune pâle légèrement bombées, circulaires à bord

lisse ; brillantes et muqueuses.

Dans cet essai le but est de tester le développement de la bactérie sur les trois milieux de culture

sur un échantillon de trois souches pures de Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi.

Les résultats sont donnés en pourcentages de récupération des bactéries ensemencées ayant formé

une colonie, et ceci pour chaque prélèvement et pour chaque spot ensemencé.

Le calcul des pourcentages de récupération est expliqué dans les tableaux suivants :

Trois macérâts contaminés de Pseudomonas savastanoi pv. Savastanoi différents ont fait l’objet

d’expérimentation afin de constituer trois répétitions et calculer une moyenne et un écart type.

SM solution mère. D1 la 1ère

dilution (10 -1

). D1 la 2ème

dilution (10 -2

).

D3 la 3ème

dilution (10 -3

). D4 la 4ème

dilution (10 -4

).

D5 la 5ème

dilution (10 -5

).

Le dénombrement a été effectué on comptant les colonies de la dilution D5 (10 -5

), les autres dilutions sont

calculées par extrapolation.

Ceci nous a conduits à faire une étude statistique.


45

II. Estimation des concentrations des solutions mères après croissance sur milieux de

cultures :

II. 1- Sur milieu LPGA :

Souches Concentration

estimé

Concentration

initiale

Pourcentage de

récupération Seuil sensibilité

M1 2 ,8 . 106 2,7. 10

6 103% 2,6. 10²

M2 3,6. 106 3,0. 10

6 120% 3,0. 10²

M 3 1,02. 106 1,2. 10

6 85% 1,05. 0²

Moyenne 102% 2,21

Ecart type 17,50 1,02

II. 2 - Sur milieu BK, milieu de référence :


estimé

Concentration

initiale

Pourcentage de


M1 2 ,7 . 106 2,7. 10

6 100% 2,4. 10²

M2 3. 106 3. 10

6 100% 2,0. 10²

M 3 1, 2. 106 1,2. 10

6 100% 1,05. 10²

Moyenne 100% 2

Ecart type 00 0,86

II. 3 - Sur milieu Levane :


estimé

Concentration

initiale

Pourcentage de


M1 2 ,4 . 106 2,7. 10

6 88% 2,1. 10²

M2 3. 106 2.6 10

6 86% 2,3. 10²

M 3 3.2. 106 3,2. 10

6 100% 1,10. 10²

Moyenne 91,33% 1,8

Ecart type 7,57 0,7


46

Les résultats obtenus permettent de calculer les pourcentages de récupération des milieux, c’est-à-

dire de nombre de bactéries ayant poussé, par rapport au nombre de bactéries déposées sur le milieu.

La sensibilité du milieu LPGA permet de trouver une quantité de 2,8. 106 ufc /ml

Sachant que le King-B est un milieu de référence.

Le taux de récupération des bactéries dans le milieu Levane est 91, 3 % qui représentent un faible

pourcentage en comparant avec le milieu BK et LPGA, cela montre que la bactérie a un développement

moyen sur milieu Levane qui représente une sensibilité très faible.

III. Tableau analyses des variances

S.C.E DDL C .M TEST F PROBA E.T C.V

VAR TOTALE 48423,55 8 6052,944

VARFACTEUR 1 44677,55 2 22338,78 35,78021 0,00072

VAR

RESIDUELLE 1 3746 6 624,3333 24,9866627 12,44%

III. 1 - COMPARAISONS DE MOYENNES :

Le coefficient de variance qui représente 12.44 %, montre qu’il y a une différence faiblement

significative entre les milieux. On y retrouve, le classement croissant des moyennes de récupération pour

une souche par milieu, ainsi que leur répartition dans des groupes homogènes.

Le test statistique permet de dégager un groupe homogène d’un milieu que l’on peut considérer

comme le plus adapté à la culture avec un seuil de sensibilité important.

F1 LIBELLES POURCENTAGE

DES MOYENNES GROUPES HOMOGENES

2 LPGA 102 % A

1 BK 100 % A

3 Levane 91.33% B


47

Figure N° 23 : Secteur de Pourcentage des Colonies dans les trois milieux

(King B, LPGA, Levane)

La comparaison des concentrations estimées nous révèle se qui suit :

Figure N° 24 : Variation de la sensibilité en fonction des milieux (LPGA-BK-Levane)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

D3 D4 D5 D6

Levane

BK

LPGA

Les milieux Concentration estimé

King B 1.2 x 106

LPGA 1.02 x 106

Levane 3.2 x 106

Levane 91,33%

King B 100%

LPGA 102%

Concentration bactérienne en ufc/ml dans les trois milieux (BK, Levane, LPGA)

Rap

po

rt d

es c

on

cen

trat

ion

s es

tim

ées


48

III. 2 - Discussion :

Le travail sur souches de macérât contaminés permet d’évaluer les critères suivants :

- Croissance de Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi: vitesse et taux de récupération obtenus par

dénombrement des colonies à différentes dilutions et pour les différents milieux.

- Aspect phénotypique permettant une reconnaissance rapide de Pseudomonas savastanoi pv.

savastanoi.

Le taux de récupération des bactéries, correspond au rapport de la concentration bactérienne

estimer à l’aide du dénombrement, sur la concentration initiale de la suspension bactérienne déterminée

pour le milieu de référence.

Le milieu King-B a été retenu come milieu de référence car c’est le milieu de plus principalement

utilisé pour la culture de Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi.

Le seuil de détection ou sensibilité de la méthode est déterminée par le niveau de concentration

bactérienne le plus faible permettant de considérer la présence de colonies typiques de Pseudomonas

savastanoi pv. savastanoi.

Une comparaison des trois milieux a pu être réalisé voir les tableaux de synthèses.

La quantité de colonies se développant sur chacun des 3 milieux est globalement équivalente. Le

milieu Levane laisse se développer une quantité de bactérie inférieure, par rapport aux autres milieux.

Le temps d’apparition des colonies est de 24 heures en moyenne pour Levane ainsi que BK et

48heures pour LPGA. La quantité d’ufc dénombrées sur milieu Levane est inférieure à celle des autres

milieux et le temps de croissance est généralement beaucoup plus long. Le milieu BK permet une bonne

culture du pathogène, certes plus au moins rapides, mais ce critères seul n’est pas d’une grande

importance. L’isolement du pathogène dépendra beaucoup plus de la sélectivité du milieu.


49

IV. Les tests biochimiques :

Ces tests ont été utilisés pour identifier les souches bactériennes de Pseudomonas savastanoi pv.

Savastanoi .observées sur les milieux.

IV. 1 - Les essais d’immunofluorescence sur macérât contaminés :

Les lames IF ont été visualisées au microscope et les bactéries fluorescentes de Pseudomonas

savastanoi pv. savastanoi.ont été dénombrées à une concentration favorable à la lecture malgré la

présence des saprophytes et les débris végétaux.

Figure N°25 : l’aspect fluorescent des bactéries sur lame IF.

Tableau 3 – concentration des bactéries sur lames IF

Dilution

Souches SM D1 D2 D3 D4 D5 D6

M1 + + + + + + + + + + + 0,62. 103

0,62. 10² 0,62. 101

M2 + + + + + + + + + + + 0,56. 103 0,56. 10² 0,56. 10

1

M 3 + + + + + + + + + + + 0,82. 103 0,82. 10² 0,82. 10

1

Les résultats de la lecture des lames IF au microscope se traduisent par la présence de cellules

fluorescentes dont la taille et la morphologie sont typiques à Pseudomonas savastanoi pv. Savastanoi.

Donc cette technique est validée et optimisée, car la sensibilité est généralement moyenne 10 3

ufc / ml.


50

Tableau 4 : Estimation des concentrations des solutions mères après coloration des lames IF

Souches SM estimée CI initiale Taux de récupération

M1 6,2. 103

2 ,7. 103 200%

M2 5,6. 103 3. 10

3 186%

M 3 8,2. 103 1,2. 10

3 600%

Ecart type = 235,08

Discussion :

Compte tenu des écarts types, il apparait que la méthode d’isolement IF donne un seuil de détection

de 103. Le pourcentage de récupération des résultats est très élevé car la méthode IF repère des bactéries

fluorescentes et les cellules mortes de Pseudomonas savastanoi pv. Savastanoi. Le plant expérimental

n’a pas pu mettre la vérification si ces méthodes donnent une détection au dessous de 103. Il aurait dû

intégrer deux dilutions supplémentaires (D7- D8).

En comparant cette technique à l’isolement sur milieux de cultures, on peut dire qu’elle est plus

irrégulière, mais elle permet quant même de détecter un grand nombre de bactéries, ce qui a certain

avantage, par rapport à d’autre techniques. Elle permet une meilleure sensibilité de détection.

Analyse de variance

S.CE DDL C.M TEST F PROBA E.T C.V

Var totale 1.791525 27 6,64 E-02

Var facteur 1 8,36 E-02 1 8 ,36E-02 1,325439 0,26019

Var facteur 2 0 ,1808035 1 0,1808035 2,866431 0,09979

Var Interf 1 2 1,33 E-02 1 1,33

E-02 0,210687 0,65439

Var residuelle 1 1,513829 24 6,31 E-02

0,25114974 83,02%

L’analyse de variance Stat Box nous révèle un coefficient de variance très élevé de 83,02%, donc

statistiquement la méthode IF est considérée comme la technique la plus optimisée pour la détection de

Pseudomonas savastanoi.


51

Statistiques de groupe

Milieu N Moyenne Ecart-type Erreur standard

moyenne

d1 bk 9 230000,00 84409,715 28136,572

levane 3 240000,00 10000,000 5773,503

d2 bk 9 23000,00 8440,972 2813,657

levane 3 24000,00 1000,000 577,350

d3 bk 9 2300,00 844,097 281,366

levane 3 2400,00 100,000 57,735

d4 bk 9 230,00 84,410 28,137

levane 3 240,00 10,000 5,774

d5 bk 9 23,00 8,441 2,814

levane 3 24,00 1,000 ,577

Test d'échantillons indépendants

Test de Levene

sur l'égalité des

variances

Test-t pour égalité des moyennes

F Sig. t ddl Sig.

(bilatérale)

Différence

moyenne

Différence

écart-type

Intervalle de confiance 95% de la

différence

Inférieure Supérieure

d1

Hypothèse de

variances égales 11,538 ,007 -,198 10 ,847 -10000,000 50420,454 -122343,773 102343,773

Hypothèse de

variances inégales

-,348 8,627 ,736 -10000,000 28722,813 -75406,661 55406,661

d2

Hypothèse de


Hypothèse de

variances inégales

-,348 8,627 ,736 -1000,000 2872,281 -7540,666 5540,666

d3

Hypothèse de


Hypothèse de

variances inégales

-,348 8,627 ,736 -100,000 287,228 -754,067 554,067

d4

Hypothèse de


Hypothèse de

variances inégales

-,348 8,627 ,736 -10,000 28,723 -75,407 55,407

d5

Hypothèse de


Hypothèse de

variances

inégales

-,348 8,627 ,736 -1,000 2,872 -7,541 5,541


52



moyenne

d1 bk 9 230000,00 84409,715 28136,572

lpga 9 246666,67 115650,335 38550,112

d2 bk 9 23000,00 8440,972 2813,657

lpga 9 24666,67 11565,034 3855,011

d3 bk 9 2300,00 844,097 281,366

lpga 9 2466,67 1156,503 385,501

d4 bk 9 230,00 84,410 28,137

lpga 9 246,67 115,650 38,550

d5 bk 9 23,00 8,441 2,814

lpga 9 24,67 11,565 3,855


Test de Levene

sur l'égalité des

variances


F Sig. t ddl Sig.

(bilatérale)

Différence

moyenne

Différence

écart-type

Intervalle de confiance 95% de

la différence


d1

Hypothèse de


Hypothèse de

variances inégales

-,349 14,639 ,732 -16666,667 47726,070 -118611,134 85277,801

d2

Hypothèse de


Hypothèse de

variances inégales

-,349 14,639 ,732 -1666,667 4772,607 -11861,113 8527,780

d3

Hypothèse de


Hypothèse de

variances inégales

-,349 14,639 ,732 -166,667 477,261 -1186,111 852,778

d4

Hypothèse de


Hypothèse de

variances inégales

-,349 14,639 ,732 -16,667 47,726 -118,611 85,278

d5

Hypothèse de


Hypothèse de

variances inégales

-,349 14,639 ,732 -1,667 4,773 -11,861 8,528


53


Milieu N Moyenne Ecart-type Erreur standard moyenne

d1 levane 3 240000,00 10000,000 5773,503

lpga 9 246666,67 115650,335 38550,112

d2 levane 3 24000,00 1000,000 577,350

lpga 9 24666,67 11565,034 3855,011

d3 levane 3 2400,00 100,000 57,735

lpga 9 2466,67 1156,503 385,501

d4 levane 3 240,00 10,000 5,774

lpga 9 246,67 115,650 38,550

d5 levane 3 24,00 1,000 ,577

lpga 9 24,67 11,565 3,855


Test de Levene

sur l'égalité des

variances


F Sig. t ddl Sig.

(bilatérale)

Différence

moyenne

Différence

écart-type

Intervalle de confiance 95%

de la différence


d1

Hypothèse de variances

égales 8,885 ,014 -,097 10 ,925 -6666,667 69024,955 -160463,851 147130,518


inégales

-,171 8,346 ,868 -6666,667 38980,052 -95910,103 82576,770

d2


égales 8,885 ,014 -,097 10 ,925 -666,667 6902,496 -16046,385 14713,052


inégales

-,171 8,346 ,868 -666,667 3898,005 -9591,010 8257,677

d3


égales 8,885 ,014 -,097 10 ,925 -66,667 690,250 -1604,639 1471,305


inégales

-,171 8,346 ,868 -66,667 389,801 -959,101 825,768

d4


égales 8,885 ,014 -,097 10 ,925 -6,667 69,025 -160,464 147,131


inégales

-,171 8,346 ,868 -6,667 38,980 -95,910 82,577

d5


égales 8,885 ,014 -,097 10 ,925 -,667 6,902 -16,046 14,713


inégales

-,171 8,346 ,868 -,667 3,898 -9,591 8,258


54



moyenne

d4 bk 9 230,00 84,410 28,137

if 3 666,67 136,137 78,599

d5 bk 9 23,00 8,441 2,814

if 3 66,67 13,614 7,860


Test de Levene

sur l'égalité des

variances


F Sig. t ddl Sig.

(bilatérale)

Différence

moyenne

Différence

écart-type

Intervalle de confiance

95% de la différence


d4

Hypothèse de

variances égales 1,311 ,279 -6,753 10 ,000 -436,667 64,659 -580,735 -292,598

Hypothèse de

variances inégales -5,231 2,535 ,020 -436,667 83,483 -732,161 -141,173

d5

Hypothèse de


Hypothèse de




d4

levane 3 240,00 10,000 5,774

if 3 666,67 136,137 78,599

d5 levane 3 24,00 1,000 ,577

if 3 66,67 13,614 7,860


55


Test de Levene

sur l'égalité des

variances


F Sig. t ddl Sig.

(bilatérale)

Différence

moyenne

Différen

ce écart-

type

Intervalle de confiance

95% de la différence


d4

Hypothèse de


Hypothèse de


d5

Hypothèse de


Hypothèse de




d4 lpga 9 246,67 115,650 38,550

if 3 666,67 136,137 78,599

d5 lpga 9 24,67 11,565 3,855

if 3 66,67 13,614 7,860


Test de Levene sur

l'égalité des variances Test-t pour égalité des moyennes

F Sig. t ddl

Sig.

(bilatérale)

Différence

moyenne

Différence

écart-type

Intervalle de confiance 95% de la

différence


d4 Hypothèse de

variances égales

,017 ,900 -5,249 10 ,000 -420,000 80,019 -598,292 -241,708

Hypothèse de

variances inégales

-4,798 3,034 ,017 -420,000 87,544 -696,841 -143,159

d5 Hypothèse de

variances égales

,017 ,900 -5,249 10 ,000 -42,000 8,002 -59,829 -24,171

Hypothèse de

variances inégales

-4,798 3,034 ,017 -42,000 8,754 -69,684 -14,316


56

Test Anova est utilisé pour comparer les moyennes en se basant sur des analyses de variances.

On a calculé les moyennes entre les 3 milieux de cultures ensuite, on a fait ressortir l’ecart type de

chaque milieu (BK- Levane- LPGA).

Le PN c’est le degré de signification.

Si le PNS qui figure sur le tableau est inferieur à 0.05 donc cela implique que la comparaison est

significative.

Suivant les résultats obtenus du test Anova concernant la comparaison entre les trois milieux de

cultures de la bactérie Pseudomonas savastanoi a savoir le BK, Levane et LPGA, aucune différence

significative n’a été constatée. Cela implique que le développement de la bactérie peut se faire dans les

différents milieux d’ensemencement, sachant que la différence des moyennes enregistrées sur le tableau

des statistiques de groupe résulte que le milieu BK reste toujours un milieu de référence.

La comparaison entre la technique d’isolement sur milieu de culture et la technique d’analyse

sérologique d’immunofluorescence est hautement significative du moment que le PN est inferieur à 10 - 4.

On comparant les moyennes enregistrées sur le tableau des statistiques de groupe, et le PN

bilatéral, la technique de détection de la bactérie Pseudomonas savastanoi d’immunofluorescence

permet d’avoir un taux de récupération des colonies de la bactérie important par rapport à la technique

d’isolement sur les milieux de cultures.

– CONCLUSION :

57

Conclusion :

Dans cette étude, deux techniques, l’une isolement sur milieux de cultures, l’autre

sérologique (immunofluorescence), ont été mises en œuvre dans le cadre de la détection de

Pseudomonas savastanoi. Ces techniques ont été évaluées sur des échantillons symptomatiques,

sans chercher à modifier les protocoles décrits.

Le but de l’ensemble des manipulations était de comparer la sensibilité et la spécificité de

chaque méthode.

Lors de cette étude comparative, deux tests statistiques ont été réalisés le premier était le

test de Newman et Keuls à l’aide du logiciel Stat Box Pr, qui est une extension de Microsoft Excel

dédiée aux statistiques, le deuxième était le test Anova .

Donc on se contente de rapporter les moyennes et l’écart type des différents essais.

Après une étude comparative entre les trois milieux de cultures (King –B – Levane et

LPGA), les résultats statistiques ont montrés que le milieu King-B est considéré comme un milieu

de référence et le plus sensible pour le développement de Pseudomonas savastanoi. L’interprétation

des résultats est basée sur le pourcentage de récupération des bactéries ensemencées ayant formé

une colonie, et ceci pour chaque échantillons et pour chaque spot ensemencé.

Les résultats statistique mettent en évidence qu’il n’ya pas de différence significative pour

les trois milieux de cultures, bien que les moyennes permettent de donner un classement suivant le

seuil de détection.

L’isolement de la bactérie sur milieu levane permet un développement maximal et rapide

des colonies, ce qui peut nuire la lecture des résultats ainsi que la détection de Pseudomonas

savastanoi .

Par contre sur milieu King –B et LPGA la bactérie pousse plus nettement, et en quantité

moins importante, ce qui nous permet d’avoir une lecture plus lisible et ça nous aide à mieux

détecter la bactérie en cause. Il convient donc d’utiliser en priorité ces deux milieux de cultures

pour une meilleure identification de Pseudomonas savastanoi .

– CONCLUSION :

58

En comparant cette technique sérologique à la technique d’isolement sur milieux de cultures,

on peut dire que l’immunofluorescence est plus irrégulière car elle révèle la présence d’un grand

nombre de saprophytes et de débris végétaux en plus des cellules fluo-végétales qui gênent la

lecture, mais elle permet quant même de détecter un grand nombre de bactéries qui ont un aspect

fluorescent, ce qui est certain avantage, par rapport à d’autre techniques. Elle permet une meilleure

sensibilité de détection.

L’analyse de variance Stat Box nous révèle un coefficient de variance très élevé de 83,02%,

donc statistiquement la méthode IF est considérée comme la technique la plus optimisée pour la

détection de Pseudomonas savastanoi.

Cependant il s’avère que ce test est reproductible à ce jour pour la détection de Pseudomonas

savastanoi p. L’expérimentation du Protocol de coloration des lames IF devra également être

répété afin de pouvoir vérifier la sensibilité et spécificité de la méthode.

Suivant les résultats obtenus du test Anova concernant la comparaison entre les trois milieux de

cultures de la bactérie Pseudomonas savastanoi a savoir le BK, Levane et LPGA, aucune différence

significative n’a été constatée. Cela implique que le développement de la bactérie peut se faire dans

les différents milieux d’ensemencement, sachant que la différence des moyennes enregistrées sur le

tableau des statistiques de groupe résulte que le milieu BK reste toujours un milieu de référence.

La comparaison entre la technique d’isolement sur milieu de culture et la technique d’analyse

sérologique d’immunofluorescence est hautement significative du moment que le PN est inferieur à

10 - 4.

On comparant les moyennes enregistrées sur le tableau des statistiques de groupe, et le PN

bilatéral, la technique de détection de la bactérie Pseudomonas savastanoi d’immunofluorescence

permet d’avoir un taux de récupération des colonies de la bactérie important par rapport à la

technique d’isolement sur les milieux de cultures.

– REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES :

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38746-23.

Liste des Figures :

• Figure N° 01 : L’organigramme de l’INPV Misserghin.

• Figure N° 02 : Variété d’olivier.

• Figure N° 03 : La production mondiale de l’huile d’olive.

• Figure N° 04 : Tavelure sur l’olivier.

• Figure N° 05 : Verticilliose de l’olivier.

• Figure N° 06 : Le chancre bactérien de l’olivier.

• Figure N°07 : Tumeurs dues au Pseudomonas savastanoi sur le tronc, les feuilles, les branches et

rameaux d’un arbre d’olivier.

• Figure N° 08 : Bactérie Pseudomonas savastanoi.

• Figure N° 09 : Cycle de la maladie.

• Figure N°10 : Coupe transversale d’une galle bactérienne évolutive sur un rameaux d’olivier.

• Figure N°11 : Dégâts sur fruits.

• Figure N°12 : Gamme de dilution de la souche bactérienne.

• Figure N°13 : Dépôt de la suspension bactérienne sur lames IF.

• Figure N°14 : Gamme de dilution.

• Figure N°15 : Isolement de Pseudomonas savastanoi

• Figure N°16 : Observation microscopique à l’immersion de Pseudomonas savastanoi après

coloration de Gram (grossissement 1000).

• Figure N°17 : Test catalase.

• Figure N°18 : Aspect d’une crème bactérienne de Pseudomonas savastanoi sur le milieu Levane

• Figure N°19 : Test de Hugh et Liefson.

• Figure N°20 : Test Péctinase.

• Figure N°21 : Test d’Arginine déxhydrolase.

• Figure N°22 : Hypersensibilité des feuilles de Tabac après inoculation bactérienne.

• Figure N°23 : Secteur de pourcentage des colonies dans les trois milieux (King B, LPGA,

Levane).

• Figure N° 24 : Variation de la sensibilité en fonction des trois milieux (King B, LPGA, Levane).

• Figure N° 25 : l’aspect fluorescent des bactéries sur lame IF.

Liste des Tableaux :

• Tableau N° 01 : Les principaux pays producteurs de l’olivier dans le monde.

• Tableau N° 02 : Les différentes variétés d’oliviers produits par les pays du Maghreb .

• Tableau N° 03 : Concentration des bactéries sur lame IF.

• Tableau N° 04 : Estimation des concentrations des solutions mères après coloration des lames IF.

Technique Serologique : Immunofluorescence (IF) :

La base de ce test sérologique consiste en l’utilisation d’un anticorps spécifique à la bactérie

(antisérum), la visualisation des cellules bactérienne est rendue possible grâce à l’anticorps marqué à la

fluorescéine (IgG).

Méthode :

� Purification de la crème bactérienne : centrifugation à 1200tr/mn pendant 10 minutes (3

répétitions).

� Déposer 20µl de suspension purifiée/ puit (lames multi puits).

� Mettre la lame sur une boite de pétri en verre.

� Incubation à 50°c pendant 30 mn.

� Fixer à l’alcool.

� Sécher à l’air libre.

� Déposer 20µl d’antisérum.

� Incubation pendant 30 mn à température ambiante (à l’obscurité).

� Laver avec du PBS en utilisant une pissette.

� Sécher la lame à l’air libre.

� Appliquer 20µl de conjugué (IgG).

� Incubation pendant 30 mn à température ambiante (à l’obscurité).

� Laver avec du PBS en utilisant une pissette.

� Sécher la lame à l’air libre.

� Observation au microscope photonique à fluorescence à un grossissement 100.

Matériels et réactifs :

� Autoclave.

� Etuve réglable.

� Microscope à fluorescence (chambre noire).

� Centrifugeuse.

� Balance de précision

� Micropipettes de 1000,50, 20 et 10µl

� Lames pour IF

� Agitateur à tube.

� Agitateur magnétique.

� Anse de platine.

� Bec bunsen.

� Pinces.

� Scalpel

� Portoir.

� Flacons (pour la préparation des milieux).

� Boites de Pétri stériles en verre.

� Boites de Pétri en plastique

� Tubes à essai à vise.

� Tubes pour centrifugeuse.

� Barreau magnétique.

� Coton

� Huile de vaseline.

� Huile d’émersion.

� Solution KOH 3%

� Papier wattman.

� Alcool 90°.

� Ethanol 95°

� Ethanol70°

� Eau oxygénée

� N, N Diméthyle paraphénylène diamine dihydrochloride

� Plant de tabac

Composition des milieux cultures :

1- Milieux L.P.G.A. (Levure-Peptone-Glucose-Agar)

- Extrait de levure…………………………………………..05g

- Peptone……………………………………………………05g

- Gélose……………………………………………………..15g

- Glucose……………………………………………………10g

- Eau distillée………………………………………………..01l

2- Milieu de Hugh et Leifson : H & L

- Bacto peptone…………………………………………….02g

- NaCL………………………………………………………..05g

- KH2PO4………………………………………………….…0,3g

- Glucose…………………………………………………….10g

- Bleu de Bromothymol (BBM)………………………….0,03g

- Eau distillée………………………………………………...01l

3- Milieu Levane :

- Protéase peptone……………………………………………20g

- Glycérine bidistillé (Glycérol) ..………………..……….…..10g

- Potassium phosphate,dibasique K2HPO4……………….…1.5g

- Sulfate de magnésium MgSO4, 7 H2O………………..…….1.5g

- Agar bactériologique de type A ………………………..….15g

- Eau distillée……………………………………………..…...01l

4- Milieu King B

- Protéase peptone n°3 ………………………………….... 20g

- Glycérine bi distillé (Glycérol) ………………………….10à15 ml

- Sulfate de magnésium (MgSO4,7 H2O) ……….. ………1.5g

- Potassium phosphate dibasique (K2HPO4) ………….…1.5g

- Agar bactériologique ……………………………………15g

- Eau distillée………………………………………………...01l

5- PBS

- NaCL………………………………………………..…08g

- KH2PO4.......................................................................0,2g

- Na2HPO4……………………………………………..1,15g

- KCL……………………………………………………0,2g

- Na2HPO4, 12H2O………………………………………3g

- Eau distillée…………………………………………....01l

*Les milieux sont stérilisés à l’autoclave à 120° pendant 20mn.

Résumé

Pseudomonas savastanoi, pathovarsavastanoi, organisme de quarantaine, est l’agent causal du

chancre bactérien de l’olivier. Découverte au 4ème siècle par le grec Theophrastus, cette bactérie est

considérée comme le seul pathogène responsable de la formation des nécroses bactériennes appelées

communément tuberculose de l’olivier. Cette maladie est considérée comme un problème majeur par

son effet néfaste sur la croissance, le rendement et surtout la qualité de l’huile d’olive.

Aucun moyen de lutte curatif n’existe à ce jourcontre la nécrose bactérienne. Seul des techniques

préventives permettent de contenir la maladie. L’un des points clés de cette lutte est la production de

matériel de multiplication (bois et plants d’oliviers) indemne de cette bactérie afin d’éviter sa dispersion.

Pour cela, des méthodes analytiques de détection de Pseudomonas savastanoidoivent être

développées et adaptées à un travail de routine. La mise en œuvre d’une technique d’isolement sur

milieux de cultures et d’une technique sérologique « immunofluorescence », est envisageable dans ce

but.

Dans la présente étude, les protocoles existants relatifs à ces deux techniques ont été évalués sur

des macérâts contaminés.

La méthode d’ensemencement sur milieux de cultures présente l’avantage d’une grande facilité

de mise en œuvre. Cependant sa sensibilité, d’environ 105 ufc.ml-1 reste assez faible. C’est pourquoi

l’utilisation de la méthode d’immunofluorescence, dont la sensibilité est beaucoup plus fine, environ 103

ufc.ml-1, peut être envisagée afin de confirmer ou d’infirmer les résultats relatifs aux échantillons

apparaissant négatifs à l’isolement sur milieux gélosés.

Il faut noter qu’il s’agit d’un pathogène particulièrement virulent des oliveraies et qui se propage

facilement, il nécessite donc pour sa détection une téchnique très sensible et à moindre coût.

Mots clés :

Pseudomonas savastanoi; Tuberculose; Macérât; Bactérie de quarantaine; olivier; Détection; Colonie

bactérienne; Milieux de cultures; Isolement; Immunofluorescence.

Date post:	13-Mar-2020
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MEMOIRE DE MAGISTER - univ-oran1.dz · 2015-05-05 · immunofluorescence is considered for that. In...

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