Real Time PCR

SEKVENCIRANJE

PCR - Polymerase Chain Reaction(lančana reakcije polimeraze)

PCR - Polymerase Chain Reaction(lančana reakcije polimeraze)

“Tradicionalni” PCR

Amplifikacija DNK molekula (standardizovana i danas široko zastupljena metoda amplifikacije DNK molekula)

Teoretski: samo jedan DNK molekul je dovoljan da bi se dobilo 109 kopija

Revolucionarni metod koji je osmislio Kary Mullis (1983.) - 1993. Nobelova nagrada

Metoda je zasnovana na osobini DNK polimeraze da ugrađuje pojedinačne nukleotide na 3’-OH kraj rastućeg polinukleotidnog lanca i time sintetiše komplementaran lanac na postojeću matricu (DNK). Da bi DNK započela sintezu (ugradnju pojedinačnih nukleotida) potreban je PRIMER – oligonukleotid sa slobodnom 3’-OH grupom. Primer je neophodan za započinjanje reakcije polimerizacije, ali i da bi se omogućila amplifikacija specifičnog regiona (regiona od interesa).

PCR podrazumeva smenjivanje ciklusa, gde se svaki ciklus sastoji iz određenih faza.

*in vivo(ćelijska

replikacija) in vitro(PCR reakcija)

target ceo genomdeo genoma/specifična

sekvenca

mesto in vivo in vitro

enzimi nekoliko samo polimeraza (Taq)

odmotavanje DNK hekikaza (enzim) toplota (denaturacija)

početak reakcijena nekoliko mesta u

genomu od sintetičkog prajmera

prajmersintetiše enzim

Primazadizajniran za specifičan

region

svrha repilkacija genomaamplifikacija ciljnih

delova

* Replikacija in vivo & PCR reakcija in vitro

“Tradicionalni” PCR

Reakciona smeša za PCR reakciju sadrži :

- termostabilna DNK polimerazu (Taq polimeraza (Thermis aquaticus), Pfu DNK polimeraza (Pyrococcus furiosus) )

- dNTP- par prajmera (forward & reverse) - oligonukleotidi oligonukleotidi

komplementarni krajevima sekvenci koja se kopirakomplementarni krajevima sekvenci koja se kopira- Mg2+

- pufer

- *DNK templat/DNK matrica/ genomska DNK

30-35 ciklusa (denaturacija, annealing, elongacija)

** End point reakcija

** PCR amplifikacije proverava se elektroforezom na agaroznom gelu

30-35 ciklusa - 109 kopija**30. ciklus= 1.073.741.824 kopija

inicijalna denaturacija: 95Cdenaturacija: 95C

annealing (hibridizacija prajmera): 50-65Celongacija (ekstenzija): 72C

finalna elongacija: 72C

DNK

PCR reakciona smeša

Provera PCR amplifikacijeelektroforezom na agaroznom gelu

Gel elektroforeza je metoda koja se koristi za razdvajanje i analizu makromolekula kao što su DNK, RNK i proteini, na osnovu njihove veličine i naelektrisanja.

*Agaroza – polisaharid koji se dobija iz morskih algi.-ima osobinu da polimerizuje-veoma često se koristi u molekularnoj biologiji za razdvajanje makromolekula (DNK)- 0.7-2.0% gelovi

Elektroforeza

Vrste PCR

- medicina- genetičko testiranje (nasledna oboljenja)

(prisustvo mutacija koja dovode do oboljenja)- preimplantaciona i prenatalna dijagnostika

- forenzika- identifikacija osoba pomoću DNK profila

(“genetic fingerprinting”)- određivanje srodstva (očinstvo, majčinstvo,)

- infektivne bolesti, mikrobiologija, virusologija- naučna istraživanja

Alel-specifični PCR Asimetrični PCR: Multipleks PCR “Nested” PCRKvantitativni PCR (qPCR)“Reverse Transcription” PCR (RT-PCR)+++++

Upotreba

’’Mane’’ PCR

- End point..- Isti end point za razlicitu kolicinu

pocetnog materijala- Nije automatizovan- Etidijum bromid- Kiterijum: razlikovanje samo na

osnovu velicine (molekulske mase)- Rezultati su kvalitativni, ne

kvantitativni

Prednosti:

-Visoka senzitivnost – minimalna količina materijala – DNK iz samo jedne ćelije-Visoka specifičnost – određena selektivnom hibridizacijom prajmera-Jednostavnost, brzina, niska cena

http://www.youtube.com/watch?v=DkT6XHWne6E

http://www.youtube.com/watch?v=2KoLnIwoZKU

Video…

Linkovi:

http://www.youtube.com/watch?v=DkT6XHWne6E

RealTime PCR

RealTime PCR je modifkovni PCR koji omogućuje praćenje amplifikacije (akumulacije amplifikata) u „realnom vremenu“, tj. u/kroz svaki ciklus.

- Reakciona smeša za PCR reakciju sadrži :- DNK polimerazu - dNTP- par prajmera (forward &

reverse)- Mg2+, pufer

- Reakciona smeša za RealTime PCR reakciju sadrži :

- DNK polimerazu - dNTP- par prajmera (forward &

reverse)- Mg2+, pufer- PROBA

*************

Fluorescentne probe...

1. interkalirajuće fluorescentne boje koje se nespecifično vezuju za dvolančani DNK molekul - SYBR®Green.

RealTime PCR

2. Fluorescentne probe koje su sekvencno-specificne. Takve fluorescentne probe sadrže oligonukleotid obeležen reporterskim molekulom na 5’-kraju koji emituje fluorescentni signal, i „quencher“, na drugom 3’-kraju, koji prigušuje (suprimira) fluorescentni signal. (*Taq Man probe )

RealTime PCR

RealTime PCR

Amplifikacijska kriva

Osnovni elementi:

amplifikacijska kriva,

treshold,

Ct vrednost (engl. Cycle threshold)

Ct vrednost definiše broj ciklusa kada amplifikacijska kriva preseče threshold.

RealTime PCR

Što je polazna količina matrice (DNK) veća, to se ranije dostiže Ct. Zbog toga što je moguće pratiti amplifikaciju polazne količine target sekvence u svakom ciklusu, za ovu reakciju se kaže da se odigrava u realnom vremenu.

RealTime PCR

ng – nano: 10-9)pg – (pico: 10-12)fg – (femto: 10-15)

RealTime PCR

Upotreba:

Kvantifikacija

relaivna kvantifikacija (poređenje dva uzorka jedan u odnosu na drugi: npr - pre i posle tretmana lekovima ili tretirano lekvima i kontrola (nije tretirana))

apsolutna kavtifikacija (konstruiše se standardna kriva na osnovu poznatih koncentracija. Ispitivan uzorak/nepoznatak koncentracija se određuje interpolacijom)

Genotipizacija (alelska diskriminacija)detekcija različitih alelskih varijanti

End-point+/- rezultat

Detekcija patogena

Primer: genotipizacija 96 uzorka

Genotipizacija (Alelska diskriminacija)

Primer: genotipizacija 96 uzorka

Recesivni homozigot(mut, mut)Npr: TT

HeterozigotNpr: CT

wt homozigotNpr: CC

Sekvenciranje DNK

Sekvenciranje podrazumeva utvrđivanje redosleda nukeotida u DNK molekulu.

Postoji nekoliko metoda sekvenciranja; većina je zasnovana na Sangerovoj (Frederik Sanger) metodi.

Sangerova metoda je poznata kao metoda Terminacije sinteze lanaca, ili kao „dideoksi“ metoda.

„Dideoksi“ metoda - jednolančani DNK molekuli koji se razlikuju u dužini za samo jedan nukleotid, mogu razdvojiti elektrforezom u denaturišućem poliakrilnom gelu.

Glavnai element Sangerove metode je hemijska modifikacija 3’-deoksi nukleotid trifosfata (dNTP) u 2’,3’-dideoksi nukleotid trifosfata (ddNTP) tj, odsustvo 3’-OH grupe na dNTP (pored odsustva 2’-OH grupe).

Za odvijanje „dideoksi“ metode, potrebno je:

DNK templat: jednolančani fragment DNK čija se sekvenca određuje. Može da bude PCR amplifikat, genomska DNK ili klonirani fragment.Primer: jednolančani fragment koji se komplementarno vezuje za jedan kraj DNK templata.Dezoksinukleotidi (dNTP): gradivni elementi koji se dodaju na templat i formiraju novi komplementaran lanacDiDezoksinukleotidi (ddNTP): modifikovani dNTP čijom ugradnjom se sprečava produžavanje novog lanca.DNK polimeraza: vrši ugradnju dNTP i ddNTP u novi lanac.Pufer: sredina u kojoj se vrši reakcija, stabilizuje komponente i produkte u reakciji.

U reakcionoj smeši koja sadrži ddGTP svi fragmenti će se završavati sa G bazom, jer će njenom ugradnjom da dođe do terminacije sinteze novog lanca. Analogno se dešava u ostale tri reakcione smeše. Sadržaj iz svake reakcione smeše se nanosi u poseban bunarić na gelu i pušta se elektroforeza.

Čitanje gela/ sekvence je moguće, jer su prajmeri radioaktivno obeleženi. (Čitanje odozdo na gore, najmanji fragmenti najbrže putuju)

DNK je negativno naelektrisan molekul, kreće se ka pozitivnoj elektrodi. Kretanje DNK kroz gel je zavisno od veličine. Milione kopija iste veličine kretaće se istom brzinom i zauzeće određenu poziciju na gelu (traka na određenoj poziciji). Nakon završene elektroforeze, gel se vizuelizuje pomoću X zraka.

Sekvenca: G C G TC A A G C T A C

Automatsko sekvenciranje(Cycle Sequencing)

Automatizovana metoda sekvenciranja zasnovana na Sangerovoj metodi. Koristi fluorescentne probe.

Reakciona smeša: DNK templat, DNK polimeraza, DNK primer, dNTP (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) i ddNTP koji su obeleženi fluorescentnim bojama (svaki pojedinačno jednom bojom; zbog toga što su obeleženi različitim bojama mogu da se nalaze u istoj reakcionoj smeši).

...isti princip…

Zbog toga što se u reakcionoj smeši nalazi milijarde kopija, terminacija sinteze može biti prekinuta na bilo kojoj poziciji. Kao posledica, dobijaju se fragmeni različite dužine (obeleženi fluorescentnim bojama karakterističnim za svaki nukleotid) koji se razdvajaju na osnovu dužine. Najbrže putuju najkraći fragmenti, pa se njihova fluorescencija prva detektuje.

Maksam-Gilbert-ova metoda sekvenciranja(Metoda hemijske degradacije )

!!! Isti princip- druga “hemija”

-zasnovana na hemijskoj degradaciji DNK fragmenta koji se sekvencira. DNK matrica se parcijalno seče u 5 odvojenih hemijskih reakcija od kojih je svaka specifična za odeđenu bazu ili tip baza. Svih 5 hemijskih reakcija izvodi se simultano i svaka se sastoji iz dve faze.

Prva faza podrazumeva hemijsku modifikaciju specifične baze ili tipa baze korišćenjem određenih hemikalija.

Druga faza - nastale hemijski modifikovane se ukljanjaju sečenjem fosfodiestarskih veza sa 5’ i 3’ kraja u odnosu na modifikovanu bazu

Elektroforeza

Naučno – istraživački rad, dijagnostika, forenzika....

DNA Fingerprining

srodstvo

Video…

Hvala na

pažnji !