Rädler SS08 Biophysik der Zelle 1
Microscopy in Cell Biophysics
• Light Microscopy (200 nm)– Brightfield– Phasekontrast– Fluorescence– Advanced
• Electron Microscopy (1 nm)– Scanning– Transmission
• Scanning Probe Microscopy (AFM, STM)
• Contrast • Spatial and temporal resolution• Environmental conditions
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1901W. C. Röntgen (Germany, 1845-1923)Discovery of X rays
1953F. Zernike (Netherlands)Phase-Contrast Microscopy
1986Ernst Ruska (Germany, 1906 - 1988)Gerd Binnig (Germany)Heinrich Rohrer (Switzerland)Electron microscope and raster tunnel microscope, respectively
2003 Paul C. Lauterbur (USA)Sir Peter Mansfield (United Kingdom)for their discoveries concerning magnetic resonance imaging
Nobel prizes directly related to „bioimaging“
phasencontrast (Zernike)
bright field
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Grundlagen: optisches Mikroskop
Δ: Tubuslänge
Vergrößerung des Sehwinkels
Optisches Mikroskop
OkularObjektiv
2-100x10-20x
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Immunhistochemie
Anfärbung durch „Elektroadsorption“Schichtdicken ca. 10µm
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bright field phase contrast
Normaski DIC dark field
Phase Contrast Microscopy
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Abbesche Abbildungstheorie
Entstehung einesFourierbildes in derBrennebene einer Linse
Darstellung der Hin-und Rücktransformationdurch Anordnung zweierLinsen
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OptischeDatenverarbeitungim Fourier-Raum
Originalbild
Bild mit Rasterpunkten
Entfernung der periodischenRasterpunkten durch Blendeim Fourierbild
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Das Phasenkontrastmikroskop
Kondensor
Ringblende
Probe
Objektiv
ungebeugtes Lichtgebeugtes Licht
Phasenring
Der Phasenring verschiebt dasungebeugte Licht um 90 Grad.Zusätzlich wird das ungebeugte Lichtauch noch abgeschwächt, damit dieIntensitäten der beideninterferierenden Komponentenähnlich sind.
90 Grad verschoben
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http://micro.magnet.fsu.edu/primer/java/darkfield/cardioid/index.html
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Fluoreszenz
495 nm 520 nm
Stokes Shift is 25 nmFluorescein
Fluo
resc
nece
Inte
nsity
Wavelength
Chromophore (Farbstoffe) enthalten große delokalisierte π-Elektronensysteme. Oft sind dies aromatische Ringe.
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Fluoreszenz
ENER
GY
S0
S1
S2
T2
T1ABS FL I.C.
ABS - Absorbance S 0.1.2 - Singlet Electronic Energy LevelsFL - Fluorescence T 1,2 - Corresponding Triplet StatesI.C.- Nonradiative Internal Conversion IsC - Intersystem Crossing PH - Phosphorescence
IsC
IsCPH
[Vibrational sublevels]
Jablonski Termschema
Vibrational energy levelsRotational energy levelsElectronic energy levels
Singlet States Triplet States
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Dichroitischer Spiegel
Objektiv
Bogenlampe
Emissionsfilter
Anregungsblende
Okular
Anregungsfilter
EPI-Beleuchtung
Fluoreszenzmikroskop
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!D
D
!" #= 22,1min
Lage des ersten Beugungsminimums
Beugung an einer kreisrunden Öffnung
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Auflösungsbegrenzung durch Beugung:
Für zwei selbstleuchtende Objekte istder kleinste auflösbare Abstand Δx :
!
"
sin
61.0min
#
#=$n
x
Wobei λ die Wellenlänge undn sinα die numerische Apertur ist.(α: Öffnungswinkel der Linse)
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Objective
n=1.52
n = 1.52
n = 1.52
Specimen
Coverslip
Oil
n=1.33
n = 1.52
n = 1.0
n = 1.5
Water
Air
Ölimmersion erhöht die numerische Apertur
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Wellencharakter massiver Teilchen:
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Elektronen Mikroskop
vm
h
p
h==!
(de Broglie Beziehung)
em
Ue !=2
v
Uem !=2
2
1vElektronenbeschleunigung
!
" nm[ ] =h
2mee #U
=1.23
U V[ ]
z.B. 100keV λ~3pm
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Transmission electron microscopy (TEM)
• Operates in vacuum• Specimen usually fixed, embedded, sectioned, and stained with
an electron-dense material• typical specimen thickness 50nm
Special techniques:• Metal shadowing: visualize surface structures, cell components• Cryoelectron: visualize unfixed, unstained samples• Freeze fracture, freeze etch: visualize membrane interior• Freeze etch: visualize cell interior
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Transmission Electron Microscope (TEM)
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Scanning Electron Microscopy (SEM)• Can visualize surfaces of tissues, cells, isolated cell parts• Specimen is fixed and coated with thin layer of heavy metal• Images secondary electrons, resolution = 10 nm
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STEM
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A) REMB) opt. Mic. C) TEM
Drei Bildgebende Techniken im Vergleich
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Negative staining and freeze fracture
actin filaments
Myosin molecules
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Helium-Ion Microscope
The helium ion beam has a DeBrogliewavelength that is approximately 300times smaller than an electron beamresulting in much less diffraction.
See low-Z materials, like carbonnanotubes, with resolution andsurface information unavailablefrom a typical SEM.Orion He-Ion Microscope (Zeiss)
Quelle: Zeiss
He++: ion beam energie : meV
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TEM Bilder sind Projektionen !
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A deconvolution algorithm subtractsout-of plane image information usingstacks of image data
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DasKonfokaleMikroskop
Objektiv
Laser
Emissionsblende
Anregungsblende
PMT
Emissions-filter
Anregunsfilter
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KonfokalKonventionellesFluoreszenzmikroskop
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Two-Photon Excitation
<P> ≈ mW P > MW => ps Pulse
Virtuallevel
Point-spreadfunction!
1.5µm
Single-photonexcitation(488 nm)
Two-photonexcitation(900 nm)
Because simultaneousabsorption of two photonsis required for excitation,the emission depends onthe square of the intensity,rather than being linearlyproportional.
Significant excitation occursonly in the focal volume(at “normal” imagingintensities - mW range).
F
Ix
Femtosecond pulsetrain @ 80 MHz
Two photon excitation is spatially localized
0 5 10 15 20 25
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STED-Mikroskopie schlägt das BeugungslimitSTED:Stimulated Emission Depletion
Der Anregungsfokus wird „maßgeschneidert“.
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Electron tomographyof vitrified cells is a noninvasive three-dimensional imaging technique that opensup new vistas for exploring the supramolecular organization of the cytoplasm.
Further reading:Macromolecular Architecture in Eukaryotic CellsVisualized by Cryoelectron TomographySCIENCE VOL 298 (2002) p.1209
W. Baumeister (MPI Biochemie)
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Purification of cells and organells by flowcytometry
Requires fluorescent tag for desired cell
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Purification of cell parts
• Understanding the roles of each each cell component depends on methodsto break open (lyse) cells and separate cell components for analysis
• Cell lysis is accomplished by various techniques:blender, sonication, tissue homogenizer, hypotonic solution
• Separation of cell components generally involves centrifugation
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Cell fractionation by differential centrifugation
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Organelle separation by equilibriumdensity-gradient centrifugation
