DEMl¡~i¡ FARMACÉUTICASTrabajo científico

Evaluación de la actividad antimicrobiana delextracto etanólico

Evaluation of antimicrobial activity of ethanol extract ofCestrumbuxifolium Kunth

Diana C. Corzo Barragán

Jardín Botánico José Celestino Mutis

ResumenSe evaluó la actividad antimicrobiana de los diferentes órganos de la especie Cestrum buxifolium Kunt, frente a Eschericha coli,Pseudamana aeruginasa, Sthaphylacoccus aureus, par la técnica de difusión en disco; el extracto etanólico de los frutos y hojasde C. buxifalium inhiben el crecimiento de E. coli en concentraciones de 30 mg/ml, los extractos etanólicos de frutos y tallosinhiben el crecimientofrente a Pseudomona aeruginoso, en la misma concentración, con respecto al control positivo; ningunode los extractos evaluados presentó inhibición frente Sthaphylacoccus aureus.

AbstractWe evaluated the antimicrobial activity of different plant argans of the species Cestrum buxifalium Kunt, far Escherichia coli,Pseudamanas aeruginasa, Staphylacoccus aureus, through the disk diffusion method, the ethanol extract of the fruits andleavesof C. buxifalium inhibitthe growth of E.coli at a concentration of 30 mg/ml, the ethanol extracts offruits and stems inhibitthe growth front of Pseudamanas aeruginasa in the same concentra tia n with respect to the positive control, none of theextracts were evaluated far inhibition versus Staphylacoccus aureus.

Palabras clave: Actividad antimicrobiana, Cestrumbuxifalium, extracto etanólico.

Correspondencia:Diana Carolina Corzo BarragánJardín Botánico José Ceiestino Mutis. Av. caiie 63 n" 68-95Bogotá- Coiombia.Caiie 72' n" 87-75 Int 5 Apto 301Te!.: (57) 3114466699e-mail: dianacorbarral@gmail.com

Key words: antimicrobial activity, Cestrum buxifalium,ethanol extraer.

Fecha de recepción: 21 de abril de 2012Fecha de recepción de modificaciones: 18 de julio de 2012Fecha de aceptación: 25 de julio de 2012

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Introducción

L1 prollferad ón de enfermedades causada pormicroorganismos patógenos es una preocupacíon ge neralizada,que const jtuye un factor de riesgo para la salud pública, es poresto que se buscan fuentes naturales que Inhiban el crecimientobacteriano: descubriendo en las plantas compuestos btoacnvospara tal fin.E horrbre a través del tiempo ha encontrado en los recur sosnaturales la solucí ón a diferentes problemáticas. empleando lasplantas a nivel alírrenncío. Industrial y nedtctnal.convirtiéndose de esta manera. en materias primas de vitalímpcetancta para el avance de la humanidad.Es ast como los productos naturales han desempe ñado un papeltmpotante en el desarrollo de fármacos. los m ales han sido labase de las primeras rredtctnas permitien do el descubrtmíentode diferentes productos , entre e llos los anu -bacrer tanos.! en losnmmos aftas mas de la mitad de los productos farmacéut icosusados son derivados de fuentes naturales.2

Por lo anterior se puede afirmar que los productos naturales sehan convert ido en fuente de hallazgos de numerosas drogasdesde el siglo XIX hasta la actualidad. como es el caso de lamorfina a partir de opio, rdennñ cándola como el compuestoresponsab le de la accíon de dicha planta.Actualmente existen alcaloides rrn y conocidos , como lacafeína, la codeína, la atropina y la papaverma. otros ejemp losde fármacos extraídos de la naturaleza son la gramlcina, primerantibiót ico obtenido de bacterias del suelo; la Insulina ,purificada de extractos pancreáticos animales; y el ácidosaltctüco. analgésico extraído por primera vez de la corteza delsauce , y antecesor de la aspirina (ácido acett lsaltcflíco]."Los productos naturales han hecho enormes contribuciones a lasalud humana a través de la utilización de compuestos como losmencionados anteriorment e; sin ermargo se evidencia lanecesidad de seguir encontrando nuevos compuestos quepermitan dar solución a diferentes enfermedades.Colanilla posee un territorio con una alta riqueza en recur sosvegetales. A nivel mundi al, se encuentra clasificado dentro delos países megadíversos del mmdo.'En la reglón andina encontramos especies nativas con diversa spotencialidad es de uso , las males han sido poco estudiadas, poréste motivo el Jardín Botánico de Bogotá OBB), adelantaestudios e Investigaciones sccre el aprovechamiento Integral ysostenible de es pecies presentes en el ecos istema alto andino yde páramo ,

Una de estas es pecies es el ti nto o tarror én llamado uvltomorado Cestrum bUXifoJium Kunt. (FIgura 1) .

Especie perteneciente a la familia Solanaceae , que se dísríbryea una alntud entre los 2750 y 3800 m;5 en el Distrito Capitalcrece de manera silvestre .

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Figura 1. Planta de Cesmim buxifolium Kunt.Foto : Mau ric io Guñé rrez

Estos arbustos se caracterizan por ser altamente tóxicos ; todaslas partes de la planta causan gastroenteritis severa poríngesñón.sLos frutos son una baya Jugosa y carnosa:" a escala Industrialson empleados comínmente para teñir telas de color morado.Análisis ñtoquímí cos preliminares evidenciaron la presencía dealcaloides, saponínas, esteroídes. trtterpenos.sEsta Investigación permlt e validar Información etnobot ánlcareportada por las corrn nidades locales , o proponer alternati vasde uso de las especie vegetales presentes en nuestro ecos istema;trabajos anteriores sobre está especie han reportado su uso enmedicina popular, donde se informa sobre el uso de los tallos ylas hoj as en decoccton. como desinfectantes en las ulceras yotras enfermedades epidér micas: así mismo se emplea esta paralavados rectales en casos de fiebres mfeccíosas,"Estudios etnobot ánlcos realizados en zona rural de la localidadde Cjudad Bolívar en el Drsrjto Capital colorrotano reportaronque la especie es conocida por tener aplicacionesmágico-religiosas. por el potencial tintóreo de sus frutos ycomo planta medldnal.lO

DEMl¡~i¡ FARMACÉUTICAS

De igual manera Habballah et al., mencionan los potencialesefectos farmacológicos del género, como anticonvulsivante,antitumoral, antiinflamatoria, analgésica y actividad contraLctshmanía.'! Investigaciones realizadas con el extracto acuosode C. buxttolium demuestran que posee un importante efectoanalgésico y antiínflamatorío.V

Además otras especies del género Cestrum, poseen actividadantiinílamatoria e inhibidora de la agregación plaquetaría.P Delmismo modo especies como C. nocturnum son reconocidas porsu potencial antibacteriano frente a Staphylococcus aureus,Listerie monocytogenes, Basillus subtilis, Pseudomonasaeruginosa, Escherichia colt,14 de igual manera el aceiteesencial de la especie del Cestrwn diurnum (L.) presentó unafuerte actividad in vitro frente a Pseudomonas aerugínosa ySthaphylococcus eureus.tiEl objetlvo del presente trabajo fue evaluar la actlvldadantibacteriana de los extractos etanólicos de los frutos, tallos yhojas de la especIe vegetal C. buxifolium Kunt. frente amicroorganismos patógenos y determinar la concentraciónmínima inhibitoria (CMI) de los extractos que presentaroninhibición. De esta manera realizar aportes en cuanto a laspotencialidades de uso de la especie como agenteantibacteriano.

Material y método

actividad antibacteriana y así evidenciar la inhibición delextracto. Para la activación de los microorganismos se aislaronlas bacterias en agar nutritivo marca Difco™, preparado segúnespecificaciones de la casa matriz y esterilizados en autoclave a121°C y 1 atmosfera durante 20 mín, El procedImIento serealizó por la técnica de agotamiento de la muestra por estría, encajas de Petri servidas con un espesor de agar de 25 a 30 mL18 eIncubadas por un tlempo de 18-24 h. a 37°C. Después deltiempo de incubación, con ayuda de un escobillón estéril setomaron 2 a 5 colonias morfológicamente similares y sesuspendieron las bacterias en solución salina NaCl al 0.85 %hasta alcanzar la turbidez comparable con el patrón 0.5 deMcfarland, de manera cualitativa; para el ensayo de actividadantibacterial se empleo agar Muller- Hilton marca Scharlaupreparado según especificaciones de la casa matriz yesterl1lzado en autoclave a 121°C y 1 atmosfera durante 20mino servido en cajas de petri con un espesor de agar de 25 a 30mL, las cuales fueron impregnadas con 100 ul/caja con lasuspensión ajustada de cada bacteria indicadora, se emplearondiscos estériles de 6 mm de diámetro los cuales fueronimpregnados con 10 ¡.¡.l de extracto diluido, como controlpositivo se uso c1oranfenicol en concentración de 100 ~g/ml(lO

ul/disco) y como control negativo se empleo DMSO enproporción de 10 ¡.¡.l, Seguidamente las cajas de petri seincubaron a 36°C por 24 horas.l? los ensayos se realizaron portriplicado,

El porcentaje de inhibición se cálculo mediante la fórmula 1,20

teniendo como referencia la medición del diámetro de la zonade inhibición del control positivo y la medición del halo de losextractos testeados.

Determinación de la concentración mínima inhibitoria(CM!)La concentración mínima inhibitoria se evaluó solo a losextractos que evidenciaron inhibición frente a las bacterias dereferencia. Se realizó por el método de dilución en agar, en dondese incorporó el producto a evaluar en el medio con agar, elproducto fue añadido cuando el medio estaba aún estabalíquído.zt la técnica fue realizada en microplacas de fondo planode 24 pozos, en las cuales se dispusieron diferentes volúmenes desolución de los extractos en cada pozo y se realizaron dilucionescon el medio de cultivo. Las concentraciones probadas fueron30¡.¡.l/mL, 15¡.¡.l/mL, 7,5¡.¡.l/mL, 3,75¡.¡.l/mL, 1,875 pl/mL y0,9375 pllmL. En cada pozo se sembraron 21'1 de solución

%lnhibición~--------------(<t> halo extracto- <t> halo blanco)

x lOO(<t> halo control positivo- <t> blanco)

Fórmula 1.

Evaluación de actividad antimicrobianaSe probaron los extractos etanólicos frente a bacterias Gramnegativas y Gram positivas Eschericha colt, Pseudomonaaeruginosa, Sthaphylococcus aureus procedentes de cepas dereferencia, las cepas se mantuvieron en medio líquido atemperatura de refrigeración.Se empleó el método de difusión en discos basada en el trabajode Kirby y Bauer para la determinación preliminar de la

Recolección de material vegetal y obtención de extractosSe recolectaron hojas, tallos y frutos sanos de C. buxitoliumKunt. en el Páramo de Cruz verde, zona rural de la ciudad deBogotá, Colombia; un espécimen reposa en el Herbario delJardín BotánIco de Bogotá José Celestlno Mutís,Posteriormente se seco a temperatura ambiente por 8 días, parareducir el tamaño de forma mecánica hasta obtener partículasfinas y someter a maceración en frío usando etanol al 96% enrecipientes ámbar por 3 días, seguidamente se filtró y el extractoetanólico resultante se concentro sucesivamente a presiónreducida, en roto evaporador (marca Heidolp), hasta eliminar eletanol.l" El extracto se almaceno hasta su uso en cabina deextracción de gases LEX C-4, Se pesaron 0,03 g del extractocrudo y se solubl1lzo con 1 mL de Dlmetl1sulfóxldo (DMSO) degrado analítico para lograr una concentración de 30 mg/ml.;'?

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bacteriana (P aeruginosa y E. coli) a una concentración de1.5xlCJ6 UFClmL, comprables al tubo 0,5 en la escala deturbidez de Macfarland. Se empleo como control negativoDMSO y como control positivo cloranfenicol en concentraciónde 100 f-Lg/mL. Después de 24 horas de incubación a 36°C lasmtcroplacas, se examinaron visualmente.El punto final (Concentración Mínima Inhibitoria) se considerala menor concentración de compuesto frente a la mal elmicroorganismo ensayado no presenta desarrollo vtstble.é

Resultados y discusión

35%

25%

15%

Tallos Frutes HojasC. buxilium C. buxiliLm C. buxilium

. % de inhibici on de losextractos eta nolicos dee buxifoli Lm frente aLc al i

Evaluación de la actividad antibacterianaEn la tabla 1, se evidencia con positivo (+) la inhibición de losextracto frente a las bacterias seleccionadas, mientras que lasque no presentaron actividad se marcaron como negativo (-).

Figura 3. Porcentaje de inhibiciónde los frutos y hojas frente a Ecoli

Tabla 1. Resultadosprueba actividad antimicrobiana

Figura 2. Porcentaje de inhihiciónfrente a Pseudomona aemginosa

l.Tallos 2. Frutos 3. Hojas de C. tuxnottum Kunth

El porcentaje de inhibición se cálculo con la fórmula 1, el mejorresultado de la prueba in vuro se logro con el extracto etanólicode los tallos de C. buxifolium frente a P aeruginosa los malesinhibieron en un 87,63%, mientras que los frutos lo hicieron enun 40.32% frente a la misma bacteria; en cuanto a E. cott elextracto etanólico de las hojas y frutos presentaron unporcentaje de inhibición del 25% y 32% respectivamente.Lo anterior sugiere que la especie tiene potencialanttmtcrobtano: la presencia de algunos metabolitossecundarios como los alcaloides, saponinas, esteroides,trlterpenos puede ser las responsables de este efecto.De acuerdo con lo reportado por Al-Reza et a1,23 yBhattacharjee 1 et a1;1 5 respectivamente especies del mismogénero como C. noctumum L y Cestrum diumum L. presentaactividad antibacteriana frente a Staphy1ococcus aureus, estopuede deberse a que los estudios se realizaron a los aceitesesenciales y no al extracto etanólico como en la presenteinvestigación.Según lo reportado por Tavares 2000,24 existen mecanismos deresistencia por parte de S. aureus que están relacionados con laactivación de una síntesis de la pared celular, conhiperproducción de proteínas ligadoras de penicilina.Éste puede ser uno de los factores que influye en la noinhibición de los extractos frente a este microorganismo.De otro modo Lizcano y Vergara 2007, reportaron que losmecanismos de resistencia de E. coli pueden presentarse comoalteración del blanco annmtcrobtano o disminución de lapermeabilidad de la pared por poseer una pequeña capa depeptidoglicano, la cual es más sensible.o por lo que se puedepensar que el extracto etanólico de los frutos y hojas de Cestrumbuxifolium presenta algún metabólitosecundarlo con la capacidadde contrarrestar los mecanismos de resistencia de la bacteria.

• % de inhibi dón de losextractos etarillicos de C.buxifoliLm fr ente P.aeruginosa

-Tallos Frutos Hojas

C. buxiliLm C. buxilium C. buxili Lm

90.00%

80.00%

70,00%

60.00%

50,00%

40.00%

30.00%

20.00%

10.00%

0.00%

Los frutos y hojas de C. buxifolium Kunth presentaroninhibición frente a E. cott. los tallos y frutos presentaroninhibición frente a P aeruginosa; ninguno de los extractosevaluados inhibió el crecimiento de S. aureus. En la figura 2 y 3se muestra de manera porcentual la inhibición de los tallos yfrutos frente a P aeruginosa y E. colt, respectivamentecalculado de acuerdo al halo de inhibición, teniendo comoreferencia el control positivo.

Bacteria Tallos (1) Frutos (2) Hojas (3)sctertcte coli () (+) (+)seudomona aem 'noee + +

Sthaphylococcus eureus () () ()

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Por otro lado, especies de la familia solanaceae, tales comosolanum americanum MI1l., reporta actividad antlbacterlanafrente a C.albicans.26

Por lo anterior se puede deducir que varias especies de lafamilia tienen efecto antlbacterlano.

Determinación de la CMIEl crecimiento bacteriano fue Interrumpido en un lapso de 24horas, correspondiente al tiempo de observación, donde sedetermino que para todos los casos la C/vII fue de 30 mg/mL. Enla figura 4, se observa que la mínima concentración de los tallosy frutos frente a P aeruginosa.

Figura 4. Resultado de la concentración mínima inhibitoria frentea Pseudomona aeruginosa.

Conclusiones

Actualmente, no se reportan estudios anttmtcrobtanosrealizados a la especie Cestrum buxifolium Kunt,convirtiéndose esté en el primer reporte de actividadantlbacterlal para la especie.El resultado de esta Investigación contribuye con ladeterminación de las potencialidades de uso para la industriafarmacéutica.Se sugiere realizar un ensayo btodtrtgtdo, realizando una seriede fraccionamientos con diferentes solventes para asídeterminar cuál es el compuesto responsable de la actividadannmtcrobtana.Es Importante obtener extractos de todas las partes de la plantapara realizar la evaluación antlbacterlana, puesto que como seevidencio en este estudio algunas partes Inhiben.

Agradecimientos

A la Microbióloga Andrea Martínez, por su ayuda en el montajede los ensayos, al Jardín Botánico José Celestino Mutis porbrindar el apoyo económico para llevar a cabo la Investigación.

"'¡¡~¡¡FARMACÉUTICAS

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