55
Seminario Toxicología 1 Óscar Santos – Columnas y Consumibles 4 de Octubre de 2011
Seminario Toxicología
1
Óscar Santos – Columnas y Consumibles
4 de Octubre de 2011
Problemas de muestras complejas
Objetivo de la preparación de muestras
Técnicas de preparación y materiales
Ventajas
Aplicaciones
Problemas de muestras complejas
•Generan cromatogramas pobres
•Problemas mecánicos (bloqueos)
•Disminución de la vida de la columna
•Carry Over (quedan restos en analitos en la columna)
•Supresión iónica (enmascaramiento de analitos)
•Pérdida de sensibilidad
•Incremento de coste por pichazo
Ojetivo de la preparación de muestras
Purificación: para eliminar matriz que nos puede causar
interferencias en el análisis
Pre-separación: para mejorar la separación de un
componente concreto de una manera más selectiva
Pre-concentración: para incrementar las posibilidades de
detección
Técnicas y materiales para la preparación de
muestras
Técnicas
Solid Phase Extraction
Quechers
Líquido / Líquido
Filtración
Materiales
Silice Empaquetada
Polímeros Empaquetados
Tierra de diatomeas
Características
• Métodos simples
• Efectivos para amplio rango de analitos y matrices
• Altamente reproducible
• Altas recuperaciones
• Fácil manejo
• Bajo coste
• No se producen agregados
• No pérdidas de muestra
Comparación de métodos extracción
7
Aplicaciones Productos de Preparación de Muestras
8
Productos de Preparación de Muestras:
Silice empaquetada
Bond Elut, SPE para la preparación de muestras
Aplicaciones de los materiales para Preparación de
Muestras
Porqué elegimos sorbentes con base de sílice
Fácil de definir el tamaño de partícula
Podemos controlar eltamaño de poro
Gran area superficial(500 m2 /g)
Alta rigidez ante fuerzas mecánicas
Compatible con los solventes polares y no polares más
comunes
Fácil de funcionalizar
Muy estable químicamente
Teoría Básica de Cromatografía
Si el analito tiene mayor afinidad por la fase móvil que
por la estacionaria, el analito interaccionará debilemente
o no interaccionará con la fase estacionaria y migrará
rápidamente (no hay retención)
Si el analito tiene mayor afinidad por la fase estacionaria,
este migrará más lentamente a través del cartucho o se
adsorberá a la misma (habrá retención).
Mecanismos de interacción
• Hidrofóbico
• Polar
• Intercambio Iónico
• Combinación de dos o más mecanismos de los
anteriormente expuestos (método mixto o multimétodo)
Fases Disponibles
NON-POLAR PHASES
C18 Octadecyl C2 Ethyl CH Cyclohexyl PH Phenyl
POLAR PHASES
CN Cyanopropyl 2OH Diol NH2 Aminopropyl SI Silica
ION-EXCHANGE PHASES
SCX Strong cation exchanger CBA Weak cation exchanger SAX Strong anion exchanger
Weak anion exchanger
SPECIAL PHASES
PBA CERTIFY ENVIRELUT ACCUCAT
Incre
asin
g p
ola
rity
PCB PSA
Solvent Strength
SORBENT Increasing elution strength
Silica Hexane Methanol AcCN
Water
Styrene
Divinyl
Benzene Water Ethyl Hexane
Bonded
silica Water/ Methanol, AcCN
Retención Lavado Elución
Muestra Lavado Elución
Qué pasa en la superficie de las partículas?
Principio
Proceso
PASO 1: Acondicionamiento Preparación del cartucho de SPE para facilitar la interacción con muestra Sorbente no acondicionado Sorbente Acondicionado
Proceso
PASO 2: Adición de la muestra Los analitos de interés y algunas interferencias se absorben sobre la superficie del sorbente
Proceso
PASO 3: Lavado
Eliminación de los compuestos no deseados que puedan quedar
retenidos en la superficie del sorbente
Proceso
PASO 4: Elución
Desorción selectiva de los analitos de interés
Proceso
Carga muestra Retención Lavado Elución
Verde = Azul + amarillo
Azul menos polar que el amarillo
Azul es retenido
Ventajas
Reducción del tiempo de la preparación
Minimizamos el gasto de solventes
Mejores resultados
Mayor Fator de concentración
Mayor Selectividad
Mayor pureza del extracto
Se reduce la dependencia del técnico
Se reducen los costes operacionales
Fácilmente automatizable
Aplicaciones
SPE de THC, THC-COOH y 11-OH-THC en sangre
Bond Elut Certify II SPE cartridge 200mg
Acondicioamiento
Añadir 2 mL MeOH.
Después 2 mL 0.1M sodio acetato buffer, pH 6.0 con 5% MeOH.
No dejar secar el cartucho
Añadir muestra 1-2 mL/min.
Lavados
2 mL sodio acetato buffer, pH 6.0.
Secar la columna en vacío a la máxima potencia 5 min.
Lavar con 1 mL hexano
Elución
Eluir THC con 2 mL 95:5 hexane:ethyl acetate
Lavar cartucho con 5 mL 1:1 MeOH:DI agua
Secar la columna en vacío a la máxima potencia 5 min
Lavar con 1 mL hexano
Eluir en otro tubo THC-COOH y 11-OH-THC with 2 mL 1% ácido acético en
75:25 hexano:ethyl acetato
Derivatización
Añadir 500 μL solvente de elución a la muestra, vortex y pasar a vial para GC. Evaporar con N2 < 40˚C
Añadir 35 μL BSTFA con 1% TMCS y 35 μL ethyl acetato. calentar 20 minutos a 70˚C
Aplicaciones
SPE de THC, THC-COOH y 11-OH-THC en sangre
Column: DB-5ms UI 30Mx0.25mmx0.25 μm
Inlet temperature: 250˚C
Mode: Pulsed Pressure injection
Injection volume 2 μL
Initial oven temperature: 120˚C Hold 1 min
15˚C/min to 300˚C Hold 0
30˚C/min to 310˚C Hold 5.57 min
Aplicaciones
GC esteroides anabolizantes androgénicos en orina
Bond Elut C18, 200 mg
Preparación de muestra
2 ml de orina se le añade 17ª-,ethyltestosterona como patrón interno y los otros 13 compuestos a
concentraciones de 2,5ng/ml. Se tampona a pH6 se le añade ß-glucuronidase y se incuba a 55ºC
durante 1h.
Acondicioamiento
Añadir 2 mL MeOH y después 2ml de H2O
Añadir muestra 1-2 mL/min.
Lavado
Metanol 10% en H2O/Hexano
Elución
Eluir con metilterbutileter
Evaporar
Derivatización
Añadir 50ul of MSTFA/NH4I/ditioeritritol a 60ºC durante 20min.
Aplicaciones
GC Androgenic Anabolic Steroids in Urine
Aplicaciones
Screening general de drogas en orina o plasma
Bond Elut CERTIFY
Preparación de la muestra
A 2 mL de orina o plasma añadir 6 mL de 0.1 M tampón phosphato (pH 6.0). Agitar (vortex)
Acondicionamiento
2 mL CH3OH, 2 mL 100 mM tampón phosphato (pH 6.0) No dejar secar el cartucho
Cargar muestra 1-2 mL/min.
Lavado
1 mL DI H2O, 0.5 mL 0.01 M ácido acético. Secar cartucho (4 min at 15 inHg).
50 uL CH3OH.
Dry column (1 min at 15 inHg).
Elución drogas acidas y neutras (Fraction A)
4 mL acetona/chloroformo (50:50) a baja fuerza de vacío
Elución de drogas básicas (Fraction B)
2 veces X 2 mL EtOAc/NH4OH (98:2)
Añadir 100 uL a 200 ug/mL prazepam solution (internal standard). Mix/vortex.
Evaporar cada fracción hasta 100 uL a 40 ºC en corriente de N2. Pinchar 1-2 ul de cada fracción
Aplicaciones
Screening general de drogas en orina o plasma
27
Productos de Preparación de Muestras:
Partículas Poliméricas empaquetados
Bond Elut PLEXA
Aplicaciones de los materiales para Preparación de
Muestras
Plexa – Una nueva clase de Polímero
28
Los analitos
polares y no
polares enlazan
con la parte
hidrofóbica del
final del poro en la
estructura de
SDVB
Hay un ligando hidroxilado en la superficie de y en
las zonas superficiales de los poros. En el interior
de los poros hay material hidrofóbico.
Proteínas excluidas La frecuencia de los
grupos OH se reduce
Grupos OH Hidrofílicos
DVB Hidrofóbico
Cambio en polaridad
Como funciona
Bond Elut Plexa
29
Aplicación de Muestra Lavado
Largas Proteínas
endógenas no pueden
acceder a los poros
Los analitos permanecen
enlazados fuertemente
con el núcleo
hidrofóbico del polímero
La estructura del poro
está diseñada especialmente
para permitir un elución excelente
El analito es
transferido
dentro
del polímero
con una
cinética
excelente
Componente hidrofílico
del polímero
permitiendo una
excelente transferencia
de fase
Las Proteínas
endógenas
son eliminadas
Se obtiene
un extracto limpio
Elución
Porqué elegimos sorbentes con base
polimérica
• Mayor capacidad de carga que la sílica
• > Tolerancia al secado
• > Tolerancia pHs extremos
• Mejores recuperaciones
• Estas son más limpias
• Actua como C.E. para proteínas de alto P.M.
•Simplifica los métodos
•Bajos volúmenes de elución
Bases
Acondicionamiento: 500 μL MeOH
500 μL water
Aplicación muestra: 100 μL plasma
dil 1:3 w/ 2% phosphoric
acid
Lavado Ácido: 500 µL 2% aqueous formic
acid
Lavado Neutro: 500 µL MeOH:ACN (1:1 v/v)
Elución: 500 µL MeOH:ACN (1:1 v/v)
+ 5% NH3 (28-30%).
Bond Elut Plexa PCX
31
Bases/Neutros
Acondicionamiento: 500 μL MeOH
Aplicación muestra: 100 μL plasma
dil 1:3 w/ 2% NH4OH
Lavado: 500 μL 5% MeOH
Elución: 500 μL MeOH
Acidos
Acondicionamiento: 500 μL MeOH
Aplicación muestra: 100 μL plasma
dil 1:3 w/ 1% formic acid
Lavado: 500 μL 5% MeOH
Elución: 500 μL MeOH
Métodos para 10 mg Plexa en placa de 96 pocillos
Bond Elut Plexa
Metodología Plexa sencilla
Aplicaciones Método general para extracción de drogas de abuso en Orina y/o saliva
Bond Elut PLEXA PCX 30mg/ml
Preparación de la muestra
Diluir la muestra de orina o saliva 1:3 con ácido fosfórico al 2%
Acondicionamiento
1ml MeOH y 1 de agua (0.1HCL)
Cargar muestra 1-2 mL/min.
Lavado
1 mL 0.1 mol/l ácido hidroclórico, seguido de un 1 ml 60:40 de metanol/0.1 mol/L ácido hidroclórico
Elución
150ul de metanol/acetonitrilo 50:50 seguido de 2 alícuotas de 150ul de metanol/acetonitrilo/agua 50/50/2
Evaporar la muestra y reconstituir con metanol/agua
Aplicaciones Recuperaciones en orina
Aplicaciones Recuperaciones en saliva
Aplicaciones Extracción de drogas polares básicas de plasma
Bond Elut Plexa 10 mg 96 well plate
Preparación de la muestra
Diluir 100ul de plasma 1:3 con ácido fosfórico al 2%
Acondicionamiento
500ul MeOH y 500 μL DI H2O (0.1HCL)
Cargar muestra 1 mL/min.
Lavado
500ul ácido fórmico 2%, seguido de un 500ul 50:50 de metanol/actonitrilo
Elución
500 ul de 5% NH3 metanol/acetonitrilo
Evaporar la muestra y reconstituir con 100ul 80:20 0.1% agua ácido fórmico/metanol
Aplicaciones Extracción de drogas polares básicas de plasma
Bond Elut Plexa 10 mg 96 well plate
1 2 3 4
Aplicaciones Extracción de drogas no polares básicas de plasma
Bond Elut Plexa 10 mg 96 well plate
Preparación de la muestra
Diluir 100ul de plasma 1:3 con ácido fosfórico al 2%
Acondicionamiento
500ul MeOH y 500 μL DI H2O (0.1HCL)
Cargar muestra 1 mL/min.
Lavado
500ul ácido fórmico 2%, seguido de 500ul 50:50 de metanol/actonitrilo
Elución
500 ul de 5% NH3 metanol/acetonitrilo
Evaporar la muestra y reconstituir con 100ul 80:20 0.1% agua ácido fórmico/metanol
Aplicaciones Extracción de drogas no polares básicas de plasma
Bond Elut Plexa 10 mg 96 well plate
Aplicaciones Fraccionamiento de drogas ácidas, neutrales y básicas
Bond Elut Plexa 10 mg 96 well plate
Preparación de la muestra
Diluir 100ul de plasma 1:3 con ácido fosfórico al 2%
Acondicionamiento
500ul MeOH y 500 μL DI H2O (0.1HCL)
Cargar muestra 1 mL/min.
Lavado
500ul ácido fórmico 2%, seguido de 500ul 50:50 de metanol/actonitrilo
Elución
500 ul de 5% NH3 metanol/acetonitrilo
Evaporar la muestra y reconstituir con 100ul 80:20 0.1% agua ácido fórmico/metanol
Aplicaciones Fractionamiento de drogas ácidas
Bond Elut Plexa 10 mg 96 well plate
Aplicaciones Fractionamiento de drogas neutrales
Bond Elut Plexa 10 mg 96 well plate
Aplicaciones Fractionamiento de drogas básicas
Bond Elut Plexa 10 mg 96 well plate
Agilent SampliQ
QuEChERS Kits
¿Qué es QuEChERS? • Quick, Easy, Cheap, Effective, Robust and Safe , QuEChERS
(Rápido, Fácil,Barato,Efectivo, Robusto y Seguro, RaFaBERS)
•Desarrollado conjuntamente por la USDA (2003) y por las Agencias Reguladoras de
Alimentos Europeas (método prEn 15662: 2007)
• Metodología para una extracción simplificada de un gran número de pesticidas (>250) en
frutas y vegetales
•QuEChERS es un método de preparación de muestra rápido para hacer screening de analitos
de interés, no para concentrar muestra.
•QuEChERS está todavía en los comienzos, y se está adoptando en todo el mundo.
Page 44
Catalogo QuEChERS : Publicación #5990-3562EN
Método Luke o SPE tradicional QuEChERS Beneficio
Tiempo estimado para
procesar 6 muestras (min)
120 30 4x más rápido
Solvente usado (mL) 90 mL 10mL 9 x menos solvente
Desechos clorados (mL) 30 mL Ninguno Más seguro, más
ecológico, menos costo
Equipo especializado, material
de vidrio
Embudo, baño de agua,
contenedores de 200mL ,
evaporador, etc.
Ninguno No se necesitan
consumibles adicionales
Primer Paso- Extracción
Page 45
Representación Gráfica de los pasos QuEchERS
El uso de Sulfato
Magnésico en el
paso de extracción
ayuda a mejorar
las recuperaciones
al facilitar la
partición de los
pesticidas en la
capa orgánica,
gracias a que
retiene el agua.
Segundo Paso – SPE Dispersiva
Page 46
La SPE Dispersiva implica la mezcla
de la sal y los sorbentes con el
extracto en un tubo de centrífuga
para retener las interferencias de
matriz, pero no los analitos.
Representación Gráfica de los pasos QuEchERS
Qué hace únicos los kit Agilent SampliQ para
QuEChERS
•Los Kits SampliQ QuEChERS tienen fuertes ventajas:
– Fácil selección: ningún otro competidor describe cómo elegir productos
basados en el análisis, metodo regulatorio o tamaño de la muestra.
– Paquetes pre-pesados y certificados: suministrados en bolsas
anhidras para asegurar que el procedimiento se sigue correctamente,
dando lugar a datos más precisos
– Inmediata implementación en laboratorios acreditados
– Agilent focaliza en la educación: Agilent proporciona un video (12min)
(http://www.chem.agilent.com/en-US/products/consumables/samplepreparation/sampliqspe/sampliqquechers/video/Pages/default.aspx )
– Homogeneizadores cerámicos para los pasos de agitación
– Agilent suministra patrones para QuEChERS
– Compendio de Aplicaciones QuEChERS
para alimentos: 5990-4977EN
Page 47
Mejoras en la Extracción de las Muestras
• Homogeneizadores Cerámicos inertes SampliQ
• Reducen el tiempo de agitación de 1 minute a <20 segundos!
• Extracción Consistente de la muestra con las sales, rompe los
aglomerados de sales.
• Facilita la homogeinización con los angulos de corte
• Incrementa la recuperación de pesticidas de la muestra
• 3 tamaños diferentes: uno para el tubo de extracción de 50 mL y
dos para los tubos de dispersión de de 15 y 2 mL
Page 48
Extracción QuEChERS : Con y sin
Homogeinizadores Cerámicos
CH no CH CH no CH
Aplicaciones Determinación de antibióticos de quinolona en hígado bovino
SampliQ QuEChERS EN Extraction kit, p/n 5982-5650
SampliQ QuEChERS dispersive-SPE for Drug Residues in Meat, p/n 5982-4921
Aplicaciones Determinación deantibióticos de quinolona en hígado bovino
Aplicaciones Determinación de hormonas en langostino
SampliQ QuEChERS EN Extraction kit, p/n 5982-5650
SampliQ QuEChERS dispersive-SPE for Drug Residues in Meat, p/n 5982-4956
Extracción
Pesar 5g de muestra y centrifugar 30s.
Añadir 5ml de H2O y agitar 10s
Añadirl 10ml de Acetonitrilo y agitar 30s.
Añadir SampliQ quechers estraction mix y agitar por 1 min.
Centrifugar 5 min a 4ºC a 4000 rpm
Dispersión
De la fase de acetonitrilo coger 6ml y añadir al tubo de Quechers dispersive matrix y agitar durante 1 min.
Centrifugar durante 3min. A 4ºC y 13000 rpm
Tomar 4ml en otro tubo y secar mediante corriente de nitrógeno
Reconstituir en 2ml de Acetonitrilo:agua 1:4 y agitar
Sonicar durante 10min.
Filtrar por filtro de 0.22um celulosa acetato
Listo para pinchar
Aplicaciones Determinación de hormonas en langostino
Conclusión: Avances en QuEChERS
Page 54
La metodología QuEChERS es tan fácil como 1-2-3
La metodología de QuEChERS puede ser usada para otros residuos
además de pesticidas.
Gran cantidad de posibilidades, con una técnica de preparación de
muestra muy simple, “la preparación justa de muestra”
Técnica relativamente “ecológica” y de bajo costo comparada con
la Extracción Líquido-Líquido y la Extración en Fase Sólida (SPE), y con
altas recuperaciones
Muchas Gracias
Page 55
