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Desarrollo de dientes en embriones de pollo después de un

trasplante de cresta neural de ratón

Thimios A. Mitsiadis*†‡, Yvonnick Che´ raud§, Paul Sharpe*‡, and Josiane Fontaine-Pe´ rus§

*Departamento de Desarrollo Craneofacial, Guy, King, e Instituto Dental Santo Tomás, del Kings College de Londres, Piso

28 Torre de Guy, Hospital Guy, Londres SE1 9RT, Reino Unido; §Centre National de la Recherche Scientifique Unite' Mixte

de Recherche 6018, Faculte' de las Ciencias y des Técniqhes, Universite' de Nantes, 2 Rue de la Houssinie` re, BP

92208, 44322 Nantes Cedex 3, Francia; y † Laboratorio de Biología Mole' culaire et Cellulaire, Unite' Mixte de Recherche

5665, Centro Nacional de Investigación Científica, Ecole Normale Supe' rieure de Lyon, 46 Alle' e d'Italie, 69364 Lyon

Cedex 07, Francia

Editado por NM Le Douarin, Institut d'Embryologie Cellulaire et Mole' culaire du Centre Nationale de la Recherche

Scientifique, Nogent-sur-Marne Cedex, Francia, se aprobó el 01 de abril del 2003 (recibido para revisión el 21 de

noviembre 2002)

Las aves perdieron los dientes hace 70-80 millones

de años. Actualmente se piensa que es la

mesénquima derivada de la cresta neural craneal la

que ha perdido la capacidad odontogénica mientras

que el epitelio oral conserva las propiedades de

señalización necesarias para inducir la

odontogénesis. Para investigar la capacidad

odontogénica de ectomesénquima hemos utilizado

trasplantes del tubo neural de ratones en embriones

de pollo para reemplazar la población celular de la

cresta neural de pollo por células de la cresta neural

de ratón. Las quimeras de ratón y de pollo obtenidas

mostraron evidencia de formación de dientes que

demuestran que el epitelio oral aviar es capaz de

inducir un programa de desarrollo no aviar células

mesenquimales derivadas de la cresta neural de

ratones.

El desarrollo de la dentadura, en común con la formación

de muchos otros órganos de vertebrados, implica series

recíprocas de interacciones epitelio mesenquimales (1).

Estas interacciones inductivas son mediadas por factores

difusibles entre el epitelio oral y el mesénquima derivado

de la cresta neural (2, 3). En el embrión de ratón, el

período de inicio del desarrollo de los dientes se extiende

desde el día embrionario (E) 8, cuando las células de lacresta emergen de los pliegues neurales craneales, a E11,

cuando ocurre el engrosamientos local del epitelio oral (4

- 6). El epitelio se invagina hacia el mesénquima

subyacente para formar el germen dentario (E12.5-13).

Experimentos de recombinación de tejidos clásicos y

análisis molecular más recientes han identificado que el

epitelio oral proporciona información instructiva para la

iniciación del desarrollo de los dientes en ratones. El

epitelio dental presuntivo E9 -11 puede provocar

formación de los dientes incluso en mesénquima derivada

de la cresta neural que normalmente no forma dientes,

pero no es capaz de inducir la formación de los dientes en

un mesénquima derivada de la cresta no neural, tales

como el mesénquima de las extremidades (4, 7). Por E12,

cambian los potenciales odontogénicos al mesénquima,

que puede instruir a cualquier tipo de epitelio para

formar estructuras de dientes específicas (7-9). Estos

experimentos apuntan a la importancia de las señales

epiteliales en la iniciación de la formación de los dientes

en ratón.

Las aves perdieron su dentición hace casi 70 -80 millones

de años, pero un número de genes que inician la

odontogénesis se siguen expresando en sus arcadas (10,

11). Durante el desarrollo embrionario aviar, estructuras

rudimentarias que constan de engrosamientos locales

epiteliales se forman transitoriamente en el arco

mandibular (12, 13), y estos engrosamientos se parecen

mucho a los engrosamientos dentales murinos. Aunque

estas invaginaciones epiteliales comparten similitudes en

la organización y la morfología con primordios de dientes

de ratón, los mecanismos moleculares que regulan su

crecimiento parecen ser distintas, porque su desarrollo sedetiene en esta etapa, lo que puede ser debido al origen

de las células de la cresta neural y las diferencias

regionales o en el epitelio oral. Varios estudios in vitro

han sugerido que un número de genes implicados en la

formación de los dientes, y que permanecen silenciados

en las aves modernas, se pueden reactivar mediante una

señalización apropiada (8, 14). Epitelio de pollo islado

cultivado en combinación con mesénquima dental de

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ratón produjo estructuras dentales, lo que sugiere que es

el mesénquima derivado de la cresta neural craneal de

 Aves modernas el cual ha perdido la capacidad

odontogénica, mientras que el epitelio oral conserva las

propiedades de señalización para inducir la

odontogénesis en el mesénquima competente (8 , 14, 15).

Desafortunadamente, estos enfoques carecen de

recombinación que se realiza in vitro, y por otra parte, es

difícil eliminar completamente la contaminación del

mesénquima de ratón con epitelio residual. Para

determinar si los dientes se pueden formar en las

mandíbulas en desarrollo de embriones de aves in ovo,

injertamos injertados cresta neural craneal de ratón en

pollos.

Materiales y métodos

Preparación de quimeras de pollo y de ratón Para la

microcirugía se utilizaron embriones de pollo JA657 de 1día de incubación (siete somitas) y embriones de ratones

suizos en E8 (cuatro a seis somitas). Se realizaron

intercambios recíprocos de las regiones definidas con

precisión del el tubo neural entre embriones de pollo y

ratón como se describió previamente (16). La región

cefálica a ser injertada fue delimitada en el ratón donante

 y el huésped polluelo, luego se retiró desde el huésped y

fue sustituida por el injerto del donante (Fig. 1 superior).

Quimera embriones se incubaron in ovo durante

diferentes períodos (1-18 días).

Visualización de la migración celular de la cresta neural .Las quimeras muertas 1-2 días después de la cirugía se

prepararon para un montaje completo de hibridación in

situ con sondas de ratón para comprobar la migración

celular de la cresta neural a los territorios faciales de los

embriones de pollo huéspedes. Las cabecillas de las

quimeras más antiguas se prepararon en secciones para

el examen histológico e hibridación in situ. Para

determinar la presencia de tejido del donante en los

huéspedes, varias secciones de cada quimera se tiñeron

con bis-benzimida (tinción de Hoechst), como se describe

(16). La distribución de las células de la cresta neural de

ratón en la cabeza de las quimeras se visualizó mediante

una repartición de ADN que difiere entre los núcleos de

ratón y de pollo. (Las células de ratón tenían un aspecto

más brillante después de la tinción de Hoechst.)

Hibridación in situ e inmunohistoquímica en cortes de

tejido. Para la hibridación in situ, ribosondas específicas

marcadas de ratón (MMK, mMsx1, mPax9, mBarx1,

cPitx2, cFGF8, cBMP4, cShh) fueron utilizados. Todo el

montaje in situ de la hibridación y la hibridación in situ

en las secciones fueron realizados según Wilkinson (17).

Para la inmunohistoquímica, se usaron anticuerpos

purificados por afinidad contra varias proteínas

(sialoproteína de dentina, nestina). Se realizó tinción coninmunoperoxidasa (ABC Kit, Vector Laboratorios) como

se ha descrito previamente (18, 19). La tinción positiva

con peroxidasa produce color rojo en el microscopio de

luz.

Resultados y discusión

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Varias moléculas son bien conocidas por estar implicadas

en la iniciación de la formación de los dientes en murinos.

Pitx2 es un gen homeobox que se expresa inicialmente en

todo el epitelio oral del ratón y progresivamente se

restringe al epitelio dental (20). La proteína

morfogenética ósea 4 (BMP4), factor de crecimiento de

fibroblastos-8 (FGF8), y sonic hedgehog (Shh) están

involucrados en la determinación de los sitios de

formación de los dientes en ratones y la determinación

por etapas de la ectomesénquima en la papila dental (21-

25). Se ha documentado la expresión de BMP4 y FGF8

en el epitelio oral de polluelos en grandes dominios

durante el desarrollo embrionario (10). Aunque Shh se

expresa en las zonas de epitelio facial durante el

desarrollo del pollo, no se expresa en (ST21) el epitelio

dental temprano (11, 26). La expresión restringida de

estas moléculas a placodas dentales en el epitelio oral

durante el desarrollo del ratón es, pues, una indicación dela inducción de la odontogénesis.

Para investigar la capacidad odontogénica de células

ectomesenquimales de murinos y también examinar si el

epitelio oral aviar puede sufrir desarrollo dental

completo, hemos realizado una serie de trasplantes

homotopicos interespecíficos del tubo neural. El aspecto

dorsoventral conjunto del tubo neural murino rostral,

antes de su cierre (cuando todavía contiene todas las

células de la cresta neural craneal premigratorias), fue

trasplantado en un huésped aviar a partir del cual los

tejidos equivalentes se habían extirpado quirúrgicamente

(Fig. 1 superior). Las células de la cresta neural del ratón

 ya habían invadido los procesos maxilares y mandibulares

del huésped de pollo a 1 a 2 días después de la cirugía

(Fig. 2A). Estas células contribuyen a la formación de

estructuras germinales de dientes en diferentes puntos de

tiempo después del injerto en los anfitriones de pollo

(Fig. 2 B-D y la Fig. 1 Baja). Los trasplantes de

prosencéfalo-mesencéfalo (serie B) y prosencéfalo-

mesencéfalo-rombencéfalo (serie C) contribuyeron a la

formación de estructuras de dientes en las quimeras de

pollo, mientras que no se obtuvieron estructuras dentales

de los trasplantes de prosencéfalo (serie A).

Se realizó un análisis molecular para examinar la

expresión de ambos marcadores tempranos y tardíos del

desarrollo dental en quimeras. Midquina (MK) es un

factor de diferenciación de crecimiento de unión a

heparina que se expresa en todas las células de la cresta

neural durante las primeras etapas del desarrollo

embrionario de ratón (18). Posteriormente, la expresión

de MK se regula en la gran mayoría de los tejidos y

órganos, pero su expresión persiste en los dientes en

murinos en desarrollo hasta E18 (estadio de campana

tardía) (19). En los embriones quiméricos, se encontró

que MK se expresa en una gran población de células de

la cresta neural de ratón que migran en los procesosmaxilar y mandibular del polluelo huésped (Fig. 3 A y C).

La expresión de la transcripción del homeodominio de

ratón que contiene factores de MSX1 y Pax9 fue mucho

más restringida, se producen específicamente en aquellas

poblaciones de células de los alrededores o en contacto

con el epitelio oral de pollo (Fig. 3 D-F). Estos hallazgos

sugieren que las células de la cresta neural que expresan

Pax9 y MSX1 con MK poseen potencial odontogénico,

porque la expresión de Pax9 y MSX1 se limita a

mesénquima dental desde las primeras etapas de la

odontogénesis murina (21, 22, 25). Llegamos a la

conclusión de que las interacciones de señalizaciónrecíprocas entre mesénquima derivada de la cresta neural

de ratón y regiones localizadas del epitelio oral de

polluelo son responsables de la posterior elaboración de

la forma específica y la estructura de los dientes descritos

anteriormente. La pérdida de dientes en Aves es, pues,

probablemente debido a la falta de moléculas derivadas

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de la cresta neural de señalización apropiadas implicadas

en las interacciones epitelio-mesenquimales.

Se había sugerido que la pérdida de BMP4 en rudimentos

de dientes '' vestigiales '' de pollos es responsable de la

falta de progreso en dientes (13). Para probar si la cresta

neural de los ratones contenía señales específicas que

pudieran inducir la expresión de BMP4 ectópico

localizado y la expresión de Shh en el epitelio oral del

polluelo, se realizó hibridación in situ en quimeras, de 2

a 4 días después de la cirugía. Aunque Pitx2 se expresó en

todo el epitelio oral (Fig. 4 F y L), la expresión de FGF8

ectópico en polluelo, Shh, y la expresión de BMP4 se

limitó a aquellas áreas que forman las placodas epiteliales

descritas anteriormente (Fig. 4 C-E, G, y I). Estas

regiones localizadas de expresión epitelial corresponden

a los sitios que cubren las células de la cresta neural del

ratón (Fig. 4 A, B, y K) que expresan MSX1, Barx1, y los

genes MK de los ratones (Fig. 4 H, J y M). Estos

resultados indican que, in vivo, las células de la cresta

neural pueden jugar un papel en la activación de la

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expresión de BMP4 y Shh en sitios de formación de

dientes en el epitelio oral murino.

Siete a nueve días después del injerto, el epitelio oral del

polluelo se había invaginado en el ectomesenquima

subyacente y había adquirido una configuración de brote

(Fig. 5 A y B). Al igual que durante la fase de capullo dedesarrollo de los dientes de ratón, las células

ectomesenquimales de ratón que rodearon las

invaginaciones epiteliales de pollo expresaron los genes

dentales específicos MSX1, PAX9, y Barx1 (Fig. 5 C, D,

 y G). Aunque cada uno de estos genes se expresa en

células distintas del mesénquima dental, células del

mesénquima dental son las únicas células en el embrión

que expresan los tres genes. La expresión de MK, que

inicialmente fue generalizada en las células de la cresta

neural que migraban, se restringió en todo el epitelio

quimeral invaginado (Fig. 5F). Fue evidente el origen

oral del epitelio a partir de la detección del gen Pitx2 de

pollo (Fig. 5E). El crecimiento diferencial y posterior

plegado del epitelio dental se cree que está dirigido por

un centro de señalización transitorio conocido como el

nudo del esmalte (2, 3, 26). La expresión de Shh ha sido

observada en el nudo del esmalte de los dientes en

desarrollo del ratón (27). Del mismo modo, se observó la

expresión ectópica de Shh de pollo en una población

restringida de las células epiteliales en los gérmenes

dentales en la quimera (Fig. 5G), indicando la presencia

de un regulador de dientes en forma de estas estructuras.

Catorce días después del injerto, fueron evidentes

múltiples invaginaciones del epitelio oral, y se asemejan

las estructuras mineralizadas a los gérmenes de los

dientes que se observan debajo del epitelio oral (Fig. 6 A

 y B). Estas estructuras en forma de dientes fueron

claramente distinguibles del hueso mineralizado

circundante. La deposición de la matriz mineral en las

estructuras en forma de dientes fue típica de la

deposición de la matriz de dentina observada en el

desarrollo de los dientes de embriones murinos, que

comienza en la punta de las cúspides, procede

apicalmente y sigue con la diferenciación de losodontoblastos. No se observaron túbulos dentinales,

porque estos dientes representan una etapa temprana de

la deposición mineral. Significativamente, la matriz del

esmalte derivada del epitelio estuvo ausente en estas

estructuras. La falta de formación del esmalte puede ser

debido a la terminación anticipada de la interacción entre

el epitelio y el mesénquima. Esta posibilidad puede ser

apoyada por el hecho de que la matriz de dentina no es

tan madura como en los dientes cuando la deposición del

esmalte se está produciendo en una capa más profunda

de la dentina. Se expresó Pitx2 en los pollos en el epitelio

de los gérmenes de los dientes en quimeras (Fig. 6 C y E)

 y en varias estructuras inusuales formadas en la parte

anterior del epitelio oral (Fig. 6D). No se expresó Pitx2en las células epiteliales de pollos en contacto con la

matriz mineralizada, que es una reminiscencia de una

baja regulación de Pitx2 en ameloblastos observados en

dientes de ratón. Se expresaron los genes MSX1 de ratón

(Fig. 6F) y los genes Shh de pollo (Fig. 6G),

respectivamente, en el mesénquima dental y el epitelio de

los dientes en la quimera. Sialoproteína de dentina, una

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proteína de la matriz extra-celular no colágena producida

por odontoblastos (28) y osteoblastos (29), se detectó en

las células ectomesenquimales y la matriz mineralizada

(Fig. 6H). La nestina, proteína de filamentos intermedios,

un marcador de neuronas, músculos (30) y la

diferenciación de los odontoblastos y osteoblastos

maduros (31), también se detectó en las células

productoras de matriz de dentina en los gérmenes

dentarios en la quimera (Fig. 6 I y J). La presencia de

estos dos marcadores juntos en la misma capa de células

proporciona una fuerte indicación de que estas células

son odontoblastos.

Estos resultados muestran que, aunque dentro de células

de la cresta neural craneal de una especie no parezcan ser

prepaternizadas con respecto a sus destinos esqueléticos,

contienen la información para interpretar señales

epiteliales genéricas y se comportan de una manera

específica en la especie.

Damos las gracias a W. Butler (Universidad de Texas,

Houston) para la dentina sialoproteína anticuerpo; U.

Lendahl (Instituto Karolinska, Estocolmo) para el

anticuerpo nestina; S. Artavanis-Tsakonas, N. Le

Douarin, P. Lemaire, M. Maroto, y O. Pourqui'e de

 valiosos comentarios; K. Dale para comentarios y

mejorar el manuscrito; y M. Zampieri para obtener ayuda

con la tinción de tricrómico de Masson. Este trabajo se

realizó en parte en el Instituto de la Biología du

D'eveloppement de Marsella, en el laborator a de C.

Goridis. La investigación fue apoyado por becas de la Asociación para la Investigación sur le Cáncer, la

 Asociación Francesa contra las Miopatías, Centre

National de la Recherche Scientifique, el Wellcome

Trust, el Consejo de Investigación Médica, y la

Universidad de Nantes.