Planta Piloto de FermentacionesDepartamento de Biotecnología

Regulación alostérica

Sergio Huerta OchoaUAM-Iztapalapa

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Consideraciones generales en la regulación de enzimas

1. Control genético:A este nivel de regulación la cantidad de enzima cambia en respuesta a las condiciones ambientales

.Por ejemplo, en respuesta a la abundancia de glucosa, la producción de

enzimas metabólicas que rompen grandes polisacáridos se detiene. En el caso de un represor lac, esta regulación está a nivel de transcripción.

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2. Control de la actividad enzimática:A este nivel la cantidad de una enzima no varía, más bien, la actividad de la enzima es regulada.

A. Para S ↔ P, como la cantidad de producto aumenta la reacción reversa se vuelve más pronunciada, hasta que se alcanza el equilibrio, donde no hay un cambio neto en las cantidades de producto y substrato.

B. Las tasas enzimáticas pueden ser moduladas por la cantidad disponible de substrato y su valores de KM.

C. La modification covalente puede alterar la afinidad de la enzima por el substrato (alterar KM).

Fosforilación y defosforilación son ejemplos de estos sistemas de control.

(Edmond Fischer y Edwin Krebs ganaron el Premio Nobel por este descubrimiento)

D. Los efectores alostéricos son moléculas que alteran la afinidad de una enzima por un substrato. Estas son modificaciones no-covalentes.

Consideraciones generales en la regulación de enzimas

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Regulación de la actividad enzimática por fosforilación

La fosforilación puede ocurrir sobre residuos de serina, treonina, o tirosina.

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Multisitios de enlace de sustrato

Sitios de enlace no cooperativos

[ ] [ ]

[ ] n

S

n

SS

max

K

S

K

S

K

S

V

v

+

+

=

−

1

1

1

[ ][ ]SK

S

V

v

Smax+

=

Si todos los sitios de enlace son equivalentes, n moléculas de enzima de un sitio sencillo de enlace, producen la misma curva de velocidad de una molécula de n sitios de enlace

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[S]0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

v

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

Enzimas alostéricas

Comparación de curvas de velocidad. (a) Respuesta hiperbólica, (b) respuesta sigmoidal

(a)

(b)

Enzima alostérica

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Enzimas alostéricas

[ ][ ]n

n

SK

S

V

v

+=

5.0max

Si la cooperatividad de los sitios en el enlace del sustrato es muy marcada

Ecuación simplificada para enzimas alostéricas(Ecuación de Hill, 1910)

n = número de sitios de enlace de sustrato por molécula de enzima

K0.5 = Constante que involucra los factores de interacción y a la constantede disociación intrínseca

Donde:

Archibald Vivian Hill

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Enzimas alostéricasSitios de enlace cooperativos

(Modelo de interacción simple: Adair-Pauling, 1925)

E + S ES E + P

+S

+S

SE + S SES SE + P

ES + P

P + E

KS

αααα KS

KS

kp

kpkp

αααα KS

Ejemplo: Enzima con dos sitios de enlaceGilbert Smithson Adair Linus Carl Pauling

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[ ] [ ] [ ] [ ]

[ ] [ ] [ ] [ ]423

4

32

3

2

2

423

4

32

3

2

2

4641

33

SSSS

SSSS

max

cKba

S

bKa

S

aK

S

K

S

cKba

S

bKa

S

aK

S

K

S

V

v

++++

+++=

Consideración de equilibrio rápido

Vmax = 4 kcat [E]tdonde:

Ejemplo: Enzima con cuatro sitios de enlace

Enzimas alostéricasSitios de enlace cooperativos

(Modelo de interacción simple: Adair-Pauling, 1925)

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Modelos alostéricos• Las interacciones alostéricas afectan la actividad de una enzima por enlace a un sitio distinto del sitio activo (allos = diferente; stereo = lugar o sólido).• Los efectores alostéricos pueden ser el(los) substrato(s); esto es un efecto homotrópico.• Los efectores pueden ser distintos de las moléculas de substrato(s); esto es un efecto heterotrópico.• Un efector alostérico puede ser positivo (incremente la actividad enzimática) o negativo (decrese la actividad enzimática). Frecuentemente se encuentran ambos efectos para una enzima dada.

Por ejemplo, en el sistema hemoglobina: El O2 es un efector positivo homotrópico (incrementa la afinidad para el oxígeno en el sitio de enlace del oxígeno) El CO2 es un efector negativo heterotrópico (decrese la afinidad por oxígeno).

En general, los efectos alostéricos resultan de las interacciones entre subunidades de proteínas oligoméricas.Es posible, sin embargo, que proteínas con una-subunidad puedan exhibir efectos alostéricos si hay múltiples sitios de enlace para substratos.

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Regulación alostérica y actividad enzimática

NH2

C

O OPO 32-

+

CH2

C

+H3N COO -

H

C

O O-

Carbamoyl phosphate Aspartic acid

aspartate transcarbamoylase

CH2

C

N H

COO -

C

O O-

C

O

NH2 + H2PO4-

N-Carbamoyl aspartate

H

• Como sucede en la hemoglobina, algunas enzimas muestran regulación alostérica. El enlace

de pequeñas moléculas regula la actividad catalítica de estas enzimas mediante la alteración

de la afinidad de enlace del substrato

Aspartato transcarbamoilasa (ATCasa)(como un sistema modelo de control alostérico)

• ATCasa cataliza la formación de N-carbamoilaspartato de

carbamoil fosfato y ácido aspártico

• Esta reacción es la primera única etapa en la biosíntesis de

pirimidinas

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Regulación alostérica y actividad enzimática

Altas concentraciones de

CTP causan una reducción

en la tasa de síntesis de

CTP

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ATCasa es alostéricamente inhibida por CTP y es alostéricamente activada por ATP

Regulación alostérica y actividad enzimática

CTP

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Regulación alostérica y actividad enzimática• ATCasa tiene dos estados conformacionales, T y R

• CTP se enlaza al estado T de baja afinidad mientras ATP se enlaza al estado R de alta afinidad

• El enlazamiento de los substratos induce un cambio conformacional en la estructura

cuaternaria induciendo un cambio de T a R https://www.youtube.com/watch?v=5aW0C3-IHVo

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El modelo alostérico de Monod, Wyman y Changeux

Considere una proteina que puede asumir dos estados. El estado “tirante” enlaza al substrato muy pobremente, mientras el estado “relajado” tiene una alta afinidad por el substrato. El subíndice 0 denota una proteina no enlazada, y estos dos estados existen en equilibrio, tal que:

R0 ↔ T0

Además asuma que el equilibrio de R0 y T0 tiende substancialmente hacia la derecha, tal que en la ausencia de substrato hay mucha más forma “tirante” que “relajado”. Si L es la constante de equilibrio,

L = [T0] / [R0], y L es grande.

Si KR es la constante de disociación de substrato de la forma “relajada”, y KT es la constante de disociación de substrato de la forma “tirante”, entonces por las condiciones señaladas KR

<< KT, y el caso extremo es KR / KT = 0. Esto significa que no hay afinidad de T0 para el substrato.

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El modelo alostérico de Monod, Wyman y Changeux, (modelo simétrico)

R0 ↔ T0

Si substrato es adicionado a este sistema, el equilibrio es perturbado. R0 enlaza el substrato y no es más cambiado con T0. Ahora la reacción va hacia la izquierda, más R0 es hecho, y, en turno, más substrato es enlazado por R0, y así sucesivamente. Esto es un efecto positivo homotrópico.

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El modelo alostérico de Monod, Wyman y Changeux; enlace coperativo

c = KR / KT ; L = [T 0] / [R0]; n = número de sitios de enlace de substrato; Y = [sitios de enlace de substrato ocupados] / [número total de sitios de enlace de substrato].

Este comportamiento de enlace de substrato es coperativo. El llenado de los sitios de enlace alteraLa afinidad aparente global por el substrato. Todos los sitios de enlace, sin embargo, son equivalentes.

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El modelo alostérico de Monod, Wyman y Changeux; efecto positivo heterotrópico

• Si cada subunidad tiene un sitio alostérico y un sitio de enlace de substrato, y A (activador) está presente, entonces la reacción R0 ↔ T0 va hacia la izquierda, y hay más sitios de enlace de substrato disponibles.• Este incremento de afinidad aparente por el substrato (a una concentración fija de activador). Globalmente, sin embargo, la coperatividad del enlace del substrato decrece, porque hay más sitios de enlace de substrato disponible. El activador tiene el mismo efecto que una constante de equilibrio L más baja.

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El modelo alostérico de Monod, Wyman, y Changeux; efecto negativo heterotrópico

• En la presencia de inhibidor, el equilibrio R0 ↔ T0 va hacia la derecha. Esto reduce el número de sitios de enlace de substrato disponible, y baja la afinidad aparente por el substrato.• En la presencia de una concentración fija de inhibidor, una titulación del substrato podría mostrar un incremento en la coperatividad del enlace.

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El modelo alostérico de Monod, Wyman y Changeux; efecto heterotrópico

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Las ecuaciones para observar el comportamiento alostérico son:

( )( )n

obs

n

LY

ααα

+++=

−

1

1 1

donde:

[ ]RK

S=α( )( )n

n

obs LLγβ

++=

1

1

[ ]IK

I=β[ ]

AK

A=γ