Purificação e caracterização do
anticorpo anti-DRG11
Alunas:•Cristina Pinto•Diana Trigo
Sistema Nociceptivo
Injury
Peripheral Nerve
Dorsal Root
Ganglion Dorsal Horn
Lateral Thalamus
Somatosensory Cortex
percepção do estímulo
condução do estímulo
processamento da resposta
DRG11: papel na nocicepção• Identificação do local de
expressão da proteína DRG11 por hibridação com RNAm
• Observação do fenótipo de ratinhos knockout [Chen et al, 2001]
Importância da proteína DRG11
no desenvolvimento
do sistema nociceptivo
Gentilmente cedido pela Prof. Sandra Rebelo
DRG11, factor de transcrição com 30 DRG11, factor de transcrição com 30 kDa da família das proteínas kDa da família das proteínas homeodomainhomeodomain
11 263263HomeodomainHomeodomain
DNA bindingDNA binding
OAROAR
Interacção Proteína-proteínaInteracção Proteína-proteína
Anti-drg11Anti-drg11
OAROAR
Interacção Proteína-proteínaInteracção Proteína-proteína
Anti-drg11Anti-drg11
Glutationa S-transferaseGlutationa S-transferase
GSTGST
Proteína Recombinante (46kDa)Proteína Recombinante (46kDa)
103103
•Obtenção dos anticorpos anti DRG11
Proteína de fusão GST-DRG11 (C-terminal)
Soro
Purificação e caracterização do anticorpo:
SoroPurificação dos anticorpos por Cromatografia de Afinidade
Doseamento de IgG anti-DRG11
Imunoblotting
Imunofluorescência
Cromatografia de AfinidadeLavagens da resina desefarose + GST-DRG11
Incubação da resina com soro “overnight”
Separação do sobrenadante
Montagem da Coluna
Cromatografia de Afinidade
Eluição por adição de solução de Glicina a pH 2,3
Recolha de 10 amostras com bomba peristáltica
Neutralização com Tris a pH 8,5
Doseamento Proteico: Método de Bradford
• Princípio: o reagente de Bradford (corante de azul de Coomassie em àcido fosfórico) liga-se covalentemente às proteínas , numa reacção acompanhada de alteração da cor do reagente em meio ácido. [Bradford MM (1976)]
Doseamento Proteico:• Determinação da recta padrão:
– Prepararam-se 5 amostras com diferentes concentrações de “bovine serum albumin”(BSA) e reagente de Bradford
– Mediram-se as respectivas absorvâncias num espectrofotómetro a 595nm
– Traçou-se a curva de calibração
Recta Padrão
y = 33,895x - 14,067
R2 = 0,9846
05
10152025
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Absorvância
Qu
anti
dad
e B
SA
(u
g)
Gráfico 1
Doseamento Proteico:
• Preparar 10 eppendorfs com:– cada amostra do
anticorpo purificado– água– reagente de Bradford
• Medir as absorvâncias
• Determinar as concentrações das amostras a partir da equação da recta padrão
imunopurificação anti-drg11
0
200
400
600
800
1000
0 2 4 6 8 10 12
fracções
Qu
anti
dad
e (u
g)
Gráfico 2
Western Blotting:Montagem da cassete (sistema vertical)
Colocou-se 5µg de proteína de fusão em cada um dos poços
Electroforese
Montagem da cassete de blotting
Transferência das proteínas para a membrana de nitrocelulose
Revelação com Ponceau S
Cortou-se a membrana às tiras (1 tira para cada fracção)
kDa
97
5645
36
Imunoblotting Bloqueio em solução de leite em pó
Incubação com o anticorpo primário (anti-DRG11 de cada fracção )
Incubação com o anticorpo secundário conjugado com Fosfátase Alcalina (AP)
Revelação com NBT + BCIP (substratos da AP)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Conclusão:•Verificou-se a ligação do anticorpo à proteína de fusão através do aparecimento de um precipitado de cor azul, produto da actividade da AP.
•Nas fracções que possuíam uma maior quantidade de anticorpo verificou-se um sinal mais intenso.
imunopurificação anti-drg11
0
200
400
600
800
1000
0 2 4 6 8 10 12
fracções
Qu
anti
dad
e (u
g)
Gráfico 2
Imunoblotting
• Conclusão: O anticorpo encontrava-se funcional, apesar
de ter sido sujeito a condições agressivas aquando da sua purificação.
• O anticorpo revelou-se funcional para proteínas desnaturadas, contudo havia
necessidade de testar a sua actividade em relação a proteínas nativas in loco.
Imunofluorescência
Imunofluorescência
• Usaram-se cortes transversais da região do fígado de embriões de ratinhos com 18dias normais e “knockout”.
• Procedimento:– bloqueio com soro de cabra;– incubação com anti-DRG11 (1/200) da fracção 3;– incubação com anticorpo secundário (anti-rabbit)
conjugado com fluorocromo vermelho (Alexa 594);– observação dos locais de expressão da proteína
usando microscopia confocal;
Imunofluorescência• A proteína apresentou como locais
de expressão o corno dorsal da medula espinhal e gânglios raquidianos, estruturas envolvidas no processamento de estímulos nóxicos.
+/+ -/-
• Concluiu-se que os anticorpos estavam funcionais para futuros trabalhos de investigação.
NOTA: Os anticorpos já foram utilizados em experiências realizadas pelo orientador.
Bibliografia:
• Alberts B. et al., Molecular Biology of the Cell, 4th edition, Garland Science
• Bradford MM (1976).Anal Biochem. 72: 248-54. • Chen et al (2001).Neuron.31:59-53• http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/
protein.html• http://www.mpibpc.gwdg.dc/abtcilungcn/140/confo
cal/main.html• http://www.roche.appliedscience.com• www.bioscience.com• www4.amerishambioscience.com
Agradecimentos:
• Prof Doutor Carlos Reguenga• Serviço de Histologia e Embriologia
de Abel Salazar • Drª. Sandra Rebelo