Proc. Natl. Acad. Sci. U S A Vol. 8 3 , p p . 5889-5893, August 1986 Biochemistry Affinity purification o f sequence-specific D N A binding proteins (DNA-agarose affinity chromatography/competitor DNA/transcription factor Spl/synthetic oligodeoxynucleotides) JAMES T. KADONAGA A ND ROBERT TJIAN Department of Biochemistry, University of California, Berkeley, C A 94720 Communicated b y Bruce M . Alberts, April 3 0 , 1986 ABSTRACT We describe a method f o r affinity purifica- tion of sequence-specific DN A binding proteins that is fast a n d effective. Complementary chemically synthesized oligodeoxy- nucleotides that contain a recognition site f o r a sequence- specific DN A binding protein a r e annealed a n d ligated t o give oligomers. This DN A i s then covalently coupled t o Sepharose CL-2B with cyanogen bromide t o yield t h e affinity resin. A partially purified protein fraction i s combined with competitor DN A a n d subsequently passed through t h e DNA-Sepharose resin. Th e desired sequence-specific DN A binding protein i s purified because i t preferentially binds t o th e recognition sites i n t h e affinity resin rather than t o t h e nonspecific competitor DN i n solution. Fo r example, a protein fraction that i s enriched f o r transcription factor S p l can be further purified 500- t o 1000-fold b y t w o sequential affinity chromatography steps t o give S p l o f an estimated 9 0 % homogeneity with 30 % yield. In addition, the use o f tandem affinity columns contain- different protein binding sites allows t h e simultaneous purification o f multiple DN A binding proteins from t h e same extract. This method provides a means f o r t h e purification o f rare sequence-specific DN A binding proteins, such a s S p l a n d CAAT-binding transcription factor. Many important cellular processes, such a s transcription, replication, a n d recombination, involve t h e action o f DNA binding proteins. F o r example, sequence-specific DNA bind- i n g proteins ar e directly involved i n t h e regulation o f mRNA transcription initiation in higher organisms (for reviews, s ee refs. 1-3). T o study t h e biochemical properties of these transcription factors, i t i s necessary t o t h e proteins t o homogeneity. This would enable t h e factors t o b e character- ized, facilitate t h e o f antibodies, a n d ultimately provide a means f o r cloning t h e genes encoding these regulatory proteins. I t h a s generally been very difficult, however, t o obtain homogeneous preparations o f these transcription factors because they typically constitute only 0.001% o f th e total cellular protein ( M. R . Briggs, J.T.K., a n d R.T., unpublished data). It h a s long been predicted that sequence-specific DNA binding proteins c a n b e purified b y chromatography through affinity resins that contain t h e proper DNA sites attached t o an immobile support (4-7). Inthe past, a number o f DNA binding proteins, including various RN A an d DNA polymerases, hormone receptors, a n d repressors, havebeen purified b y nonspecific DNA-cellulose an d DNA-agarose affinity chromatography (4, 5 , 8 ) . However, sequence-spe- cific purification o f DNA binding proteins h a s been per- formed only i n a f e w cases ( 9 , 10), a n d o u r attempts t o purify eukaryotic promoter-specific transcription factors b y t h e published methods have n o t been successful. Inthe course of o u r studies o n t h e regulation o f mRNA synthesis b y RNA polymerase I I , w e have found that conventional chromatography a n d HPLC o f promoter-spe- cific transcription factors resulted i n preparations o f only 1-2% purity. We were therefore prompted to develop a n affinity chromatography method that could be successfully used for purification o f low abundance sequence-specific DNA binding proteins, such a s Spl, CAAT-binding tran- scription factor (CTF; f o r reviews, s e e refs. 1 an d 3 ) , a n d activator protein 1 (AP-1; AP-1 is a n RNA polymerase I I transcription factor similar to Sp l and CTF; W. Lee, P . Mitchell, a n d R.T., unpublished data). These proteins, which ar e typically derived from HeLa (human) cells, activate transcription b y RNA polymerase I I from a select group o f promoters, such a s t h e simian virus 40 (SV40) early a n d herpes simplex virus thymidine kinase promoters, that con- tain a t least on e properly positioned recognition site f or Spl, CTF, o r AP-1. Th e complete purification an d biochemical characterization o f Spl, CTF, a n d AP-1 will b e described elsewhere ( M . R . Briggs, J.T.K., a n d R.T., unpublished data; K. A. Jones, J.T.K., a n d R.T., unpublished data; W. Lee, P . Mitchell, a n d R.T., unpublished data). Here w e report a simple a n d effective DNA affinity chromatography method that h a s allowed u s t o purify these transcription factors to homogeneity. This technique should b e generally applicable fo r t h e purification of other sequence-specific D N A binding proteins. MATERIALS A N D METHODS Materials. Sepharose CL-2B a n d T 4 polynucleotide kinase were obtained from Pharmacia. T 4 DNA ligase w a s from either Ne w England Biolabs o r Promega Biotec (Madison, WI). Econo-Columns were t h e products of Bio-Rad (no. 731-1550). Cyanogen bromide (CNBr; 97%) was purchased from Aldrich. Oligodeoxynucleotides were prepared with a n Applied Biosystems 380A DNA synthesizer. Preparation o f DN A f o r Coupling t o Sepharose. A scheme f o r thepreparation o f a sequence-specific DNA affinity resin is shown i n Fig. 1 . First, chemically synthesized comple- mentary oligonucleotides, such as X a n d Y (see Fig. 2A), ar e annealed, 5'-phosphorylated, a n d ligated as follows. Gel- purified oligodeoxynucleotides (220 , u g o f each) ar e combined i n 67 mM Tris H C l buffer ( pH 7.6) containing 1 3 mM MgCl2, 6 . 7 M dithiothreitol, 1 . 3 mM spermidine, an d 1 . 3 mM EDTA i n a total volume o f 75 g l . This mixture i s incubated a t 880C f o r 2 min, 650C for 10 min, 370C fo r 1 0 min, an d room temperature f o r 5 min. A T P (2 0 mM ) containing A C i of [y32P]ATP ( pH 7 ; 1 5 ,ul; 1 C i = 3 7 GBq) and T 4 polynucle- otide kinase (100 units; 1 0 Ail) ar e then added t o give a final volume o f 1 0 0 A l , a n d th e resulting solution i s incubated a t 370C f o r 2 h r . This reaction i s stopped b y t h e addition o f 5 M NH4OAc, pH 5 . 5 (100 A0)1100 mM MgCl2 ( 2 5 ,ul)/TE buffer ( 2 5 1 l ; T E i s 1 0 mM Tris*HCl, pH 7.6/1 mM EDTA), a n d t h e mixture i s heated a t 650C o r 1 5 m i n t o inactivate t h e kinase. The DNA i s ethanol-precipitated; resuspended i n T E buffer (200 Al), 3 M NaOAc ( 2 5 /0), a n d 1 0 0 mM MgCl2 ( 2 5 Al); Abbreviations: CTF, CAAT-binding transcription factor; AP-1, activator protein 1 ; NFI, nuclear factor I ; SV40, simian virus 4 0 . 5889 T he publication costs o f this article were defrayed i n part b y pagecharge payment. This article must therefore b e hereby marked "advertisement" i n accordance with 1 8 U.S.C. §1734 solely t o indicate this fact.
Transcript
8/3/2019 Purificacion Por Afinidad de Proteinas de Union a Secuencias Especificas Del Adn
P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USAV o l . 8 3 , p p . 5 8 8 9 - 5 8 9 3 , A u g u s t 1 9 8 6B i o c h e m i s t r y
A f f i n i t y p u r i f i c a t i o n o f s e q u e n c e - s p e c i f i c DNA b i n d i n g p r o t e i n s( D N A - a g a r o s e a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y / c o m p e t i t o r D N A / t r a n s c r i p t i o n f a c t o r S p l / s y n t h e t i c o l i g o d e o x y n u c l e o t i d e s )
J A M E S T . KADONAGA AND R O B E R T T J I A N
D e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y , U n i v e r s i t y o f C a l i f o r n i a , B e r k e l e y , CA 9 4 7 2 0
C o m m u n i c a t e d b y B r u c e M . A l b e r t s , A p r i l 3 0 , 1 9 8 6
ABSTRACT We d e s c r i b e a m e t h o d f o r a f f i n i t y p u r i f i c a -t i o n o f s e q u e n c e - s p e c i f i c DNA b i n d i n g p r o t e i n s t h a t i s f a s t a n d
e f f e c t i v e . C o m p l e m e n t a r y c h e m i c a l l y s y n t h e s i z e d o l i g o d e o x y -n u c l e o t i d e s t h a t c o n t a i n a r e c o g n i t i o n s i t e f o r a s e q u e n c e -s p e c i f i c DNA b i n d i n g p r o t e i n a r e a n n e a l e d a n d l i g a t e d t o g i v eo l i g o m e r s . T h i s DNA i s t h e n c o v a l e n t l y c o u p l e d t o S e p h a r o s eC L - 2 B w i t h c y a n o g e n b r o m i d e t o y i e l d t h e a f f i n i t y r e s i n . Ap a r t i a l l y p u r i f i e d p r o t e i n f r a c t i o n i s c o m b i n e d w i t h c o m p e t i t o rDNA a n d s u b s e q u e n t l y p a s s e d t h r o u g h t h e D N A - S e p h a r o s er e s i n . T h e d e s i r e d s e q u e n c e - s p e c i f i c DNA b i n d i n g p r o t e i n i sp u r i f i e d b e c a u s e i t p r e f e r e n t i a l l y b i n d s t o t h e r e c o g n i t i o n s i t e s
i n t h e a f f i n i t y r e s i n r a t h e r t h a n t o t h e n o n s p e c i f i c c o m p e t i t o rDNA i n s o l u t i o n . F o r e x a m p l e , a p r o t e i n f r a c t i o n t h a t i se n r i c h e d f o r t r a n s c r i p t i o n f a c t o r S p l c a n b e f u r t h e r p u r i f i e d5 0 0 - t o 1 0 0 0 - f o l d b y t w o s e q u e n t i a l a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h ys t e p s t o g i v e S p l o f a n e s t i m a t e d 90% h o m o g e n e i t y w i t h 30%y i e l d . I n a d d i t i o n , t h e u s e o f t a n d e m a f f i n i t y c o l u m n s c o n t a i n -i n g d i f f e r e n t p r o t e i n b i n d i n g s i t e s a l l o w s t h e s i m u l t a n e o u sp u r i f i c a t i o n o f m u l t i p l e DNA b i n d i n g p r o t e i n s f r o m t h e s a m ee x t r a c t . T h i s m e t h o d p r o v i d e s a m e a n s f o r t h e p u r i f i c a t i o n o fr a r e s e q u e n c e - s p e c i f i c DNA b i n d i n g p r o t e i n s , s u c h a s S p l a n dC A A T - b i n d i n g t r a n s c r i p t i o n f a c t o r .
Many i m p o r t a n t c e l l u l a r p r o c e s s e s , s u c h a s t r a n s c r i p t i o n ,r e p l i c a t i o n , a n d r e c o m b i n a t i o n , i n v o l v e t h e a c t i o n o f DNAb i n d i n g p r o t e i n s . F o r e x a m p l e , s e q u e n c e - s p e c i f i c DNA b i n d -
i n g p r o t e i n s a r e d i r e c t l y i n v o l v e d i n t h e r e g u l a t i o n o f mRNAt r a n s c r i p t i o n i n i t i a t i o n i n h i g h e r o r g a n i s m s ( f o r r e v i e w s , s e er e f s . 1 - 3 ) . T o s t u d y t h e b i o c h e m i c a l p r o p e r t i e s o f t h e s et r a n s c r i p t i o n f a c t o r s , i t i s n e c e s s a r y t o p u r i f y t h e p r o t e i n s t oh o m o g e n e i t y . T h i s w o u l d e n a b l e t h e f a c t o r s t o b e c h a r a c t e r -i z e d , f a c i l i t a t e t h e r a i s i n g o f a n t i b o d i e s , a n d u l t i m a t e l yp r o v i d e a m e a n s f o r c l o n i n g t h e g e n e s e n c o d i n g t h e s er e g u l a t o r y p r o t e i n s . I t h a s g e n e r a l l y b e e n v e r y d i f f i c u l t ,h o w e v e r , t o o b t a i n h o m o g e n e o u s p r e p a r a t i o n s o f t h e s et r a n s c r i p t i o n f a c t o r s b e c a u s e t h e y t y p i c a l l y c o n s t i t u t e o n l y0 . 0 0 1 % o f t h e t o t a l c e l l u l a r p r o t e i n ( M . R . B r i g g s , J . T . K . , a n dR . T . , u n p u b l i s h e d d a t a ) .
I t h a s l o n g b e e n p r e d i c t e d t h a t s e q u e n c e - s p e c i f i c DNAb i n d i n g p r o t e i n s c a n b e p u r i f i e d b y c h r o m a t o g r a p h y t h r o u g h
a f f i n i t y r e s i n s t h a t c o n t a i n t h e p r o p e r DNA r e c o g n i t i o n s i t e sa t t a c h e d t o a n i m m o b i l e s u p p o r t ( 4 - 7 ) . I n t h e p a s t , a n u m b e r
o f DNA b i n d i n g p r o t e i n s , i n c l u d i n g v a r i o u s RNA a n d DNAp o l y m e r a s e s , h o r m o n e r e c e p t o r s , a n d r e p r e s s o r s , h a v e b e e np u r i f i e d b y n o n s p e c i f i c D N A - c e l l u l o s e a n d D N A - a g a r o s ea f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y ( 4 , 5 , 8 ) . H o w e v e r , s e q u e n c e - s p e -c i f i c p u r i f i c a t i o n o f DNA b i n d i n g p r o t e i n s h a s b e e n p e r -f o r m e d o n l y i n a f e w c a s e s ( 9 , 1 0 ) , a n d o u r a t t e m p t s t o p u r i f ye u k a r y o t i c p r o m o t e r - s p e c i f i c t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s b y t h ep u b l i s h e d m e t h o d s h a v e n o t b e e n s u c c e s s f u l .
I n t h e c o u r s e o f o u r s t u d i e s o n t h e r e g u l a t i o n o f mRNAs y n t h e s i s b y RNA p o l y m e r a s e I I , we h a v e f o u n d t h a tc o n v e n t i o n a l c h r o m a t o g r a p h y a n d HPLC o f p r o m o t e r - s p e -
c i f i c t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s r e s u l t e d i n p r e p a r a t i o n s o f o n l y1 - 2 % p u r i t y . We w e r e t h e r e f o r e p r o m p t e d t o d e v e l o p a n
a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y m e t h o d t h a t c o u l d b e s u c c e s s f u l l yu s e d f o r p u r i f i c a t i o n o f l o w a b u n d a n c e s e q u e n c e - s p e c i f i cDNA b i n d i n g p r o t e i n s , s u c h a s S p l , C A A T - b i n d i n g t r a n -s c r i p t i o n f a c t o r ( C T F ; f o r r e v i e w s , s e e r e f s . 1 a n d 3 ) , a n da c t i v a t o r p r o t e i n 1 ( A P - 1 ; A P - 1 i s a n RNA p o l y m e r a s e I It r a n s c r i p t i o n f a c t o r s i m i l a r t o S p l a n d C T F ; W. L e e , P .M i t c h e l l , a n d R . T . , u n p u b l i s h e d d a t a ) . T h e s e p r o t e i n s , w h i c ha r e t y p i c a l l y d e r i v e d f r o m HeLa ( h u m a n ) c e l l s , a c t i v a t et r a n s c r i p t i o n b y RNA p o l y m e r a s e I I f r o m a s e l e c t g r o u p o f
p r o m o t e r s , s u c h a s t h e s i m i a n v i r u s 4 0 ( SV 4 0 ) e a r l y a n dh e r p e s s i m p l e x v i r u s t h y m i d i n e k i n a se p r o m o t e r s , t h a t c o n -
t a i n a t l e a s t o n e p r o p e r l y p o s i t i o n e d r e c o g n i t i o n s i t e f o r S p l ,C T F , o r A P - 1 . T h e c o m p l e t e p u r i f i c a t i o n a n d b i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i z a t i o n o f S p l , C T F , a n d A P - 1 w i l l b e d e s c r i b e d
e l s e w h e r e ( M . R . B r i g g s , J . T . K . , a n d R . T . , u n p u b l i s h e dd a t a ; K . A . J o n e s , J . T . K . , a n d R . T . , u n p u b l i s h e d d a t a ; W.L e e , P . M i t c h e l l , a n d R . T . , u n p u b l i s h e d d a t a ) . H e r e wer e p o r t a s i m p l e a n d e f f e c t i v e DNA a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h ym e t h o d t h a t h a s a l l o w e d u s t o p u r i f y t h e s e t r a n s c r i p t i o nf a c t o r s t o h o m o g e n e i t y . T h i s t e c h n i q u e s h o u l d b e g e n e r a l l ya p p l i c a b l e f o r t h e p u r i f i c a t i o n o f o t h e r s e q u e n c e - s p e c i f i cDNA b i n d i n g p r o t e i n s .
MATERIALS AND METHODS
M a t e r i a l s . S e p h a r o s e C L - 2 B a n d T 4 p o l y n u c l e o t i d e k i n a s ew e r e o b t a i n e d f r o m P h a r m a c i a . T 4 DNA l i g a s e w a s f r o me i t h e r New E n g l a n d B i o l a b s o r P r o m e g a B i o t e c ( M a d i s o n ,
W I ) . E c o n o - C o l u m n s w e r e t h e p r o d u c t s o f B i o - R a d ( n o .7 3 1 - 1 5 5 0 ) . C y a n o g e n b r o m i d e ( C N B r ; 9 7 % ) w a s p u r c h a s e df r o m A l d r i c h . O l i g o d e o x y n u c l e o t i d e s w e r e p r e p a r e d w i t h a n
A p p l i e d B i o s y s t e m s 3 8 0 A DNA s y n t h e s i z e r .P r e p a r a t i o n o f DNA f o r C o u p l i n g t o S e p h a r o s e . A s c h e m e
f o r t h e p r e p a r a t i o n o f a s e q u e n c e - s p e c i f i c DNA a f f i n i t y r e s i ni s s h o w n i n F i g . 1 . F i r s t , c h e m i c a l l y s y n t h e s i z e d c o m p l e -m e n t a r y o l i g o n u c l e o t i d e s , s u c h a s X a n d Y ( s e e F i g . 2 A ) , a r ea n n e a l e d , 5 ' - p h o s p h o r y l a t e d , a n d l i g a t e d a s f o l l o w s . G e l -p u r i f i e d o l i g o d e o x y n u c l e o t i d e s ( 2 2 0 , u g o f e a c h ) a r e c o m b i n e di n 6 7 mM T r i s H C l b u f f e r ( p H 7 . 6 ) c o n t a i n i n g 1 3 mM M g C l 2 ,6 . 7 mM d i t h i o t h r e i t o l , 1 . 3 mM s p e r m i d i n e , a n d 1 . 3 mM
EDTA i n a t o t a l v o l u m e o f 7 5 g l . T h i s m i x t u r e i s i n c u b a t e da t 8 8 0 C f o r 2 m i n , 6 5 0 C f o r 1 0 m i n , 3 7 0 C f o r 1 0 m i n , a n d r o o mt e m p e r a t u r e f o r 5 m i n . ATP ( 2 0 mM ) c o n t a i n i n g 5 A C i o f[ y 3 2 P ] A T P ( p H 7 ; 1 5 , u l ; 1 C i = 3 7 G B q ) a n d T 4 p o l y n u c l e -o t i d e k i n a s e ( 1 0 0 u n i t s ; 1 0 A i l ) a r e t h e n a d d e d t o g i v e a f i n a lv o l u m e o f 1 0 0 A l , a n d t h e r e s u l t i n g s o l u t i o n i s i n c u b a t e d a t3 7 0 C f o r 2 h r . T h i s r e a c t i o n i s s t o p p e d b y t h e a d d i t i o n o f 5 MN H 4 O A c , pH 5 . 5 ( 1 0 0 A 0 ) 1 1 0 0 mM M g C l 2 ( 2 5 , u l ) / T E b u f f e r( 2 5 1 l ; TE i s 1 0 mM T r i s * H C l , pH 7 . 6 / 1 mM E D T A ) , a n d t h em i x t u r e i s h e a t e d a t 6 5 0 C f o r 1 5 m i n t o i n a c t i v a t e t h e k i n a s e .T h e DNA i s e t h a n o l - p r e c i p i t a t e d ; r e s u s p e n d e d i n TE b u f f e r( 2 0 0 A l ) , 3 M NaOAc ( 2 5 / 0 ) , a n d 1 0 0 mM M g C l 2 ( 2 5 A l ) ;
A b b r e v i a t i o n s : C T F , C A A T - b i n d i n g t r a n s c r i p t i o n f a c t o r ; A P - 1 ,a c t i v a t o r p r o t e i n 1 ; N F I , n u c l e a r f a c t o r I ; S V 4 0 , s i m i a n v i r u s 4 0 .
5 8 8 9
T h e p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e r e d e f r a y e d i n p a r t b y p a g e c h a r ge
p a y m e n t . T h i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e h e r e b y m a r k e d " a d v e r t i s e m e n t "i n a c c o r d a n c e w i t h 1 8 U . S . C . § 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t e t h i s f a c t .
8/3/2019 Purificacion Por Afinidad de Proteinas de Union a Secuencias Especificas Del Adn
5 8 9 0 B i o c h e m i s t r y : K a d o n a g a a n d T j i a n
r e p r e c i p i t a t e d w i t h e t h a n o l ; w a s h e d w i t h 7 0 % e t h a n o l ; a n dd r i e d i n v a c u o . T h e DNA i s t h e n d i s s o l v e d i n 8 8 mMT r i s * H C l , pH 7 . 5 / 1 3 . 3 mM M g C l 2 / 2 0 mM d i t h i o t h r e i t o l / 1 . 3mM s p e r m i d i n e ( 7 5 p 1 ) , a n d t h e l i g a t i o n r e a c t i o n i s i n i t i a t e db y t h e a d d i t i o n o f 2 0 p l o f 2 0 mM ATP ( p H 7 ) a n d 5 A l o f T 4DNA l i g a s e ( 1 0 - 3 0 W e i s s u n i t s ) t o g i v e a f i n a l v o l u m e o f 1 0 0
A . l . T h i s m i x t u r e i s i n c u b a t e d a t 1 6 T C f o r 4 h r ( d e p e n d i n g o nt h e s e q u e n c e a n d t h e l e n g t h o f t h e o l i g o d e o x y n u c l e o t i d e s , t h eo p t i m a l t e m p e r a t u r e f o r l i g a t i o n m a y v a r y f r o m 4 T C t o 1 6 0 C ) ,a n d t h e DNA i s t h e n p h e n o l - e x t r a c t e d , p r e c i p i t a t e d w i t he t h a n o l , d r i e d i n v a c u o , a n d d i s s o l v e d i n w a t e r ( 1 0 0 1 . l ) .( N o t e : d o n o t d i s s o l v e t h e DNA i n TE b u f f e r - i t w i l l i n t e r f e r ew i t h t h e c o u p l i n g r e a c t i o n . ) A n a l y s i s o f t h e r e s u l t i n g DNA b ya g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s t y p i c a l l y s h o w s o l i g o m e r s o f t h eb a s i c o l i g o d e o x y n u c l e o t i d e u n i t r a n g i n g f r o m 3 - m e r s t o7 5 - m e r s ( F i g . 2 B ) .
C o u p l i n g o f DNA t o S e p h a r o s e . T h e DNA o l i g o m e r s a r ec o v a l e n t l y a t t a c h e d t o S e p h a r o s e C L - 2 B b y s l i g h t m o d i f i c a -t i o n o f t h e m e t h o d o f A r n d t - J o v i n e t a l . ( 8 ) . S e p h a r o s e C L - 2 B( s e t t l e d v o l u m e , 1 0 m l ) i s e x t e n s i v e l y w a s h e d w i t h 2 5 0 m l o fw a t e r , s u s p e n d e d i n w a t e r t o g i v e a 2 0 - m l s l u r r y , a n d t h e ne q u i l i b r a t e d t o 1 5 ° C i n a w a t e r b a t h . CNBr ( 1 . 1 g ; 1 0 m m o l )i s d i s s o l v e d i n N , N - d i m e t h y l f o r m a m i d e ( 2 m l ) a n d a d d e dd r o p w i s e o v e r 1 m i n t o t h e S e p h a r o s e , w h i c h i s m i x e d b y
m a g n e t i c s t i r r i n g . T h e n , 5 M NaOH ( 1 . 8 m l ; 9 m m o l ) i s s l o w l ya d d e d d r o p w i s e t o t h e r e s i n o v e r 1 0 m i n . T h e pH o f t h er e a c t i o n , w h i c h g e n e r a t e s HBr a s a b y - p r o d u c t , s h o u l d n o t
e x c e e d pH 1 0 . T h e r e a c t i o n i s s t o p p e d b y t h e a d d i t i o n o fi c e - c o l d w a t e r ( 1 0 0 m l ) f o l l o w e d b y g e n t l e s u c t i o n f i l t r a t i o n o ft h e r e s i n o n a c o a r s e s i n t e r e d - g l a s s f u n n e l . I t i s v e r y i m p o r -t a n t t h a t t h e a c t i v a t e d S e p h a r o s e i s ' n o t s u c t i o n - f i l t e r e d i n t oa d r y c a k e . T h e C N B r - d e r i v a t i z e d r e s i n i s t h e n e x t e n s i v e l yw a s h e d w i t h i c e - c o l d w a t e r ( 3 0 0 m l ) a n d 1 0 mM p o t a s s i u mp h o s p h a t e ( p H 8 . 0 ; 1 0 0 m l ) .
T h e a c t i v a t e d S e p h a r o s e i s i m m e d i at e ly u se d f o r c o u p l i n gt o DNA a s f o l l o w s . T h e r e s i n i s t r a n s f e r r e d t o a 1 5 - m lp o l y p r o p y l e n e s c r e w - c a p t u b e , a n d 1 0 mM p o t a s s i u m p h o s -p h a t e ( p H 8 . 0 , 4 m l ) i s a d d e d t o g i v e a t h i c k s l u r r y . T h e l i g a t e dDNA ( 1 0 0 , u l i n w a t e r ) i s t h e n a d d e d t o t h i s m i x t u r e , a n d t h e
c o u p l i n g r e a c t i o n i s c a r r i e d o u t a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 1 6 h ro n a r o t a r y s h a k e r . T h e r e s i n i s c o l l e c t e d o n a s i n t e r e d - g l a s sf u n n e l , w a s h e d w i t h w a t e r ( 2 0 0 m l ) a n d 1 M e t h a n o l -a m i n e H C I ( p H 8 . 0 ; 1 0 0 m l ) , a n d s u s p e n d e d i n 1 M e t h a n o l -a m i n e H C l ( p H 8 ) t o g i v e a f i n a l v o l u m e o f 1 4 m l . T h i si n a c t i v a t i o n o f u n r e a c t e d C N B r - d e r i v a t i z e d S e p h a r o s e b ye t h a n o l a m i n e i s c a r r i e d o u t a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 4 - 6 h r o n
a r o t a r y s h a k e r . T h e r e s i n i s c o l l e c t e d o n a s i n t e r e d - g l a s sf u n n e l a n d w a s h e d w i t h 1 0 mM p o t a s s i u m p h o s p h a t e ( p H 8 . 0 ;1 0 0 m l ) , 1 M p o t a s si u m p h o s p h a t e ( p H 8 . 0 , 1 0 0 m l ) , 1 M K C l( 1 0 0 m l ) , w a t e r ( 1 0 0 m l ) , a n d 1 0 mM T r i s - H C l ( p H 7 . 6 )c o n t a i n i n g 0 . 3 M N a C l , 1 mM E D T A , a n d 0 . 0 2 % ( w t / v o l )NaN3 ( 1 0 0 m l ) . T h e r e s i n i s s t o r e d a t 4 ° C i n 1 0 mM T r i s H C l( p H 7 . 6 ) c o n t a i n i n g 0 . 3 M N a C l , 1 mM E D T A , a n d 0 . 0 2 %( w t / v o l ) N a N 3 .
B e c a u s e t h e DNA i s l a b e l e d w i t h 3 2 p , t h e e f f i c i e n c y o fDNA a t t a c h m e n t t o t h e S e p h a r o s e c a n b e c r u d e l y e s t i m a t e db y c o m p a r i n g t h e a m o u n t o f r a d i o a c t i v i t y t h a t i s r e t a i n e d o nt h e r e s i n w i t h t h e a m o u n t o f r a d i o a c t i v i t y t h a t r e m a i n s i ns o l u t i o n a f t e r t h e c o u p l i n g r e a c t i o n . T h e e f f i c i e n c y o f DNAi n c o r p o r a t i o n i n t o t h e r e s i n i s u s u a l l y 4 0 - 7 0 % . T h u s , t h ec o n c e n t r a t i o n o f c o v a l e n t l y b o u n d DNA i n t h e a f f i n i t y r e s i ni s 2 0 - 3 0 j i g o f DNA p e r m l o f r e s i n .DNA A f f i n i t y C h r o m a t o g r a p h y . T h i s p r o c e d u r e , w h i c h i s
d e s c r i b e d h e r e f o r ' t h e p u r i f i c a t i o n o f S p l , s h o u l d w o r k , w i t ho n l y m i n o r m o d i f i c a t i o n , f o r a n y h i g h - a f f i n i t y s e q u e n c e -s p e c i f i c DNA b i n d i n g p r o t e i n . I n o n e a f f i n i t y c h r o m a t o g r a -
p h y s t e p , t h e r e c o v e r y o f S p l , a s m e a s u r e d b y a D N a s e If o o t p r i n t a s s a y , i s t y p i c a l l y 5 0 - 6 0 % . A l l o p e r a t i o n s a r ep e r f o r m e d a t 4 9 C . S p l DNA a f f i n i t y r e s i n ( 1 m l ) i s e q u i l i -b r a t e d i n a B i o - R a d E c o n o - C o l u m n w i t h b u f f e r Z c o n t a i n i n g
0 . 1 M K C I [ 2 0 m l ; b u f f e r Z i s 2 5 mM H e p e s ( K + ) , pH 7 . 8 / 1 2 . 5mM M g C l 2 / 1 mM d i t h i o t h r e i t o l / 2 0 % ( v o l / v o l ) g l y c e r o l / 0 . 1 %( v o l / v o l ) N o n i d e t P - 4 0 ] . A c r u d e f r a c t i o n o f S p l ( t o t a lp r o t e i n , 5 - 1 0 m g , d e r i v e d f r o m 5 0 g o f HeLa c e l l s ; - 0 . 1 %S p l ; 2 5 m l ) i n b u f f e r Z c o n t a i n i n g 0 . 1 M K C l i s c o m b i n e d w i t hs o n i c a t e d c a l f t h y m u s DNA ( 4 4 0 g g ; 2 0 0 1 . d o f a 2 . 2 m g / m ls o l u t i o n i n T E ) a n d a l l o w e d t o s t a n d f o r 1 0 m i n . T h ep r o t e i n - D N A m i x t u r e i s p a s s e d t h r o u g h t h e a f f i n i t y r e s i n b yg r a v i t y f l o w ( - 1 5 m l / h r ) , a n d t h e r e s i n i s w a s h e d f o u r t i m e sw i t h 2 m l o f b u f f e r Z c o n t a i n i n g 0 . 1 M K C l . T h e p a s s a g e o fb u f f e r t h r o u g h t h e c o l u m n i s s t o p p e d , b u f f e r Z c o n t a i n i n g 1 . 0M K C l ( 1 . 2 m l ) - i s a d d e d t o t h e c o l u m n , a n d t h e r e s i n i s
t h o r o u g h l y m i x e d w i t h t h e b u f f e r b y u s i n g a n a r r o w s i l i c o n -i z e d g l a s s r o d . T h e r e s i n i s a l l o w e d t o s t a n d f o r 1 0 m i n , a n dt h e p r o t e i n i s e l u t e d t o g i v e t h e m a j o r S p l e l u a t e ( - 1 . 2 m l ) .T h e c o l u m n i s t h e n w a s h e d w i t h b u f f e r Z c o n t a i n i n g 0 . 5 MK C l ( 1 . 2 m l ) t o g i v e t h e m i n o r S p l e l u a t e ( = 1 . 2 m l ) .A l t e r n a t i v e l y , S p i c o u l d b e r e c o v e r e d b y u s i n g a 0 . 1 M t o 1 . 0M K C l g r a d i e n t , w h e r e t h e p r o t e i n t y p i c a l l y e l u t e s f r o m t h er e s i n f r o m 0 . 4 M t o 0 . 6 M K C l . A l s o , i f f u r t h e r p u r i f i c a t i o ni s d e s i r e d , t h e S p l f r a c t i o n s c a n b e d i l u t e d t o 0 . 1 M K C l w i t hb u f f e r Z w i t h o u t K C l , m i x e d w i t h c o m p e t i t o r D N A , a n d
r e a p p l i e d t o t h e a f f i n i t y r e s i n .T h e a f f i n i t y c o l u m n s a r e r e g e n e r a t e d b y w a s h i n g w i t h 5
mM T r i s H C I , pH 7 . 6 / 2 . 5 M N a C l / 0 . 5 mM EDTA ( 2 5 m l ) ,a n d 1 0 mM T r i s H C l , pH 7 . 6 / 0 . 3 M N a C l / 1 mME D T A / 0 . 0 2 % ( w t / v o l ) N a N 3 ( 1 0 m l ) . T h e c o l u m n s a r e t h e n
s t o r e d a t 4 0 C i n 1 0 mM T r i s H C l , pH 7 . 6 / 0 . 3 M N a C I / 1 mME D T A / 0 . 0 2 % ( w t / v o l ) N a N 3 .
O t h e r M e t h o d s . T h e p a r t i a l p u r i f i c a t i o n o f S p l h a s b e e nd e s c r i b e d ( 1 1 , 1 2 ) . T h e c o m p l e t e p u r i f i c a t i o n o f S p l t o
h o m o g e n e i t y a s w e l l a s b i o c h e m i c a l i d e n t i f i c a t i o n a n d c h a r -a c t e r i z a t i o n o f t h e p r o t e i n w i l l b e d e s c r i b e d e l s e w h e r e ( M . R .
B r i g g s , J . T . K . , a n d R . T . , u n p u b l i s h e d d a t a ) . O l i g o d e o x y n u -c l e o t i d e s w e r e s y n t h e s i z e d , s e p a r a t e d f r o m c o n t a m i n a n t s b ye l e c t r o p h o r e s i s o n a d e n a t u r i n g 2 0 % p o l y a c r y l a m i d e g e l , a n dt h e n r e c o v e r e d b y e t h a n o l p r e c i p i t a t i o n . T h e A 2 6 W n m a n d
A 2 8 0 n m o f e a c h o l i g o d e o x y n u c l e o t i d e wa s m e a s u r e d , a n d t h ec o n c e n t r a t i o n o f e a c h s a m p l e was e s t i m a t e d b y a s s u m i n g t h a t
1 A 2 6 0 n m a b s o r b a n c e u n i t c o r r e s p o n d s t o 4 0 t u g o f DNA p e rm l . D N a s e I f o o t p r i n t i n g was c a r r i e d o u t a s d e s c r i b e d b yG a l a s a n d S c h m i t z ( 1 3 ) a n d D y n a n a n d T j i a n ( 1 2 ) . R e c o n s t i -t u t e d i n v i v o t r a n s c r i p t i o n r e a c t i o n s i n t h e p r e s e n c e o r
a b s e n c e o f S p l w e r e p e r f o r m e d a s d e s c r i b e d ( 1 1 ) . DNAt e c h n i q u e s w e r e c a r r i e d o u t a s r e c o m m e n d e d b y M a n i a t i s e t
a l . ( 1 4 ) . P o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s o f p r o t e i n s i n t h ep r e s e n c e o f N a D o d S O 4 w a s d o n e a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d o fL a e m m l i ( 1 5 ) .
RESULTS
P r e p a r a t i o n o f t h e DNA A f f i n i t y R e s i n . A s c h e m e f o r t h ep r e p a r a t i o n o f a n a f f i n i t y r e s i n f o r t h e p u r i f i c a t i o n o f s e -
q u e n c e - s p e c i f i c DNA b i n d i n g p r o t e i n s i s s h o w n i n F i g . 1 . T h eDNA a f f i n i t y r e s i n w a s d e s i g n e d t o h a v e t h e f o l l o w i n gp r o p e r t i e s . F i r s t , t o m a x i m i z e t h e r e c o v e r y o f t h e d e s i r e dp r o t e i n a n d t o m i n i m i z e c o n ta m i n at i o n b y o t h e r p r o t e i n s , t h eDNA t h a t i s a t t a c h e d t o t h e r e s i n c o n s i s t s o n l y o f t a n d e m
r e p e a t s o f a s t r o n g b i n d i n g s i t e f o r t h e d e s i r e d p r o t e i n . Weh a v e f o u n d t h a t i t i s b e s t t o s u r v e y d i f f e r e n t r e c o g n i t i o ns e q u e n c e s t o d e t e r m i n e a h i g h - a f f i n i t y b i n d i n g s i t e . S e c o n d ,t o e n s u r e t h a t t h e DNA i s a c c e s s i b l e t o p r o t e i n a n d s t a b l yb o u n d t o t h e r e s i n , e a c h DNA m o l e c u l e i s a t t a c h e d t o a n
a g a r o s e b e a d b y a n a v e r a g e o f o n e c o v a l e n t b o n d . T h e s e a i m s
w e r e r e a l i z e d b y t h e u s e o f c h e m i c a l l y s y n t h e s i z e d o l i g o d e -o x y n u c l e o t i d e s , w h i c h c a n b e q u i c k l y a n d e a s i l y p r e p a r e d i nm i c r o m o l e q u a n t i t i e s . C o m p l e m e n t a r y o l i g o d e o x y n u c l e o -t i d e s [ s u c h a s X a n d Y ( F i g . 2 A ) , w h i c h , w h e n a n n e a l e d ,p o s s e s s c o m p l e m e n t a r y 5 ' - p r o t r u d i n g e n d s ] a r e a n n e a l e d ,5 ' - p h o s p h o r y l a t e d , a n d l i g a t e d t o g i v e o l i g o m e r s o f t h e b a s i c
P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 3 ( 1 9 8 6 )
8/3/2019 Purificacion Por Afinidad de Proteinas de Union a Secuencias Especificas Del Adn
P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 3 ( 1 9 8 6 ) 5 8 9 1
AS e p h a r o s e C L - 2 B
4aH ( a t
_ b H
1PO
VA='
bP
C N B r - A c t i v a t e d
S e p h a r o s e C L - 2 B
S e q u e n c e - S p e c i f i c D N A - S e p h a r o s e R e s i n
F I G . 1 . P r e p a r a t i o n o f a s e q u e n c e - s p e c i f i c D N A - S e p h a r o s e r e s -
i n . S o l i d b l a c k r e c t a n g l e s r e p r e s e n t t h e r e c o g n i t i o n s i t e o f a s e -
q u e n c e - s p e c i f i c DNA b i n d i n g p r o t e i n . ( a ) A n n e a l i n g o f c o m p l e m e n -t a r y o l i g o d e o x y n u c l e o t i d e s ; ( b ) p h o s p h o r y l a t i o n o f 5 ' p r o t r u d i n ge n d s w i t h T 4 p o l y n u c l e o t i d e k i n a s e a n d A T P ; ( c ) p o l y m e r i z a t i o n o ft h e c o m p l e m e n t a r y o l i g o d e o x y n u c l e o t i d e s w i t h T 4 DNA l i g a s e a n dA T P ; ( d ) a c t i v a t i o n o f S e p h a r o s e C L - 2 B w i t h C N B r ; ( e ) c o u p l i n g o f
t h e l i g a t e d DNA t o t h e a c t i v a t e d S e p h a r o s e t o g i v e t h e a f f i n i t y r e s i n .I t i s a s s u m e d t h a t t h e DNA i s c o v a l e n t l y b o u n d t o t h e r e s i n b y t h eprimary ami no groups o f t h e r e s i d u e s i n t h e 5 ' p r o t r u d i n g e n d s ;h o w e v e r , t h e e x a c t p o s i t i o n ( s ) w h e r e t h e DNA i s a t t a c h e d t o t h er e s i n i s n o t k n o w n .
o l i g o d e o x y n u c l e o t i d e u n i t t h a t range f r o m 3 - m e r s t o 7 5 - m e r s
( F i g . 2 B ) . T h e l i g a t e d DNA i s t h e n c o v a l e n t l y c o u p l e d t o
S e p h a r o s e C L - 2 B w i t h C N B r . T h e e f f i c i e n c y o f c o u p l i n g o ft h e DNA t o t h e S e p h a r o s e i s u s u a l l y b e t w e e n 40% a n d 7 0 % ,a n d most o f t h e DNA m o l e c u l e s are p r o b a b l y a t t a c h e d t o t h er e s i n b y a s i n g l e c o v a l e n t b o n d ( 8 ) . We h a v e s u c c e s s f u l l yu s e d o l i g o d e o x y n u c l e o t i d e s t h a t r a n ge i n l e n g t h f r o m 1 4 t o 5 0
n u c l e o t i d e s . T h e c o n c e n t r a t i o n o f DNA b o u n d t o t h e S e p h -
arose i s t y p i c a l l y 2 0 - 3 0 , u g / m l , w h i c h c o r r e s p o n d s t o a
t h e o r e t i c a l p r o t e i n b i n d i n g c a p a c i t y o f 2 - 3 n m o l / m l i f t h e r e i son e r e c o g n i t i o n s i t e pe r 1 5 b a s e p a i r s . We h a v e a l s o o b s e r v e dt h a t t h e resin i s s t a b l e f o r a t l e a s t 1 y ea r a n d ca n b e r e u s e d>30 t i m e s w i t h o u t a n y d e t e c t a b l e l o s s o f p r o t e i n b i n d i n gc a p a c i t y .DNA A f f t m i t y C h r o m a t o g r a p h y . We h a v e p u r i f i e d t r a n -
s c r i p t i o n f a c t o r S p l t o a n e s t i m a t e d 90% h o m o g e n e i t y b yusing a n y o f t h r e e a f f i n i t y r e s i n s t h a t c o n t a i n d i f f e r e n t S p lb i n d i n g s i t e s as w e l l as d i f f e r e n t f l a n k i n g o l i g o d e o x y n u c l e o -t i d e sequences. S i m i l a r l y , we h a v e p u r i f i e d CTF ( 1 6 ) a n dA P - 1 t o n ea r h o m o g e n e i t y ( K . A . J o n e s , J . T . K . , a n d R . T . ,
u n p u b l i s h e d d a t a ; W. L e e , P . M i t c h e l l , a n d R . T . , u n p u b -l i s h e d d a t a ) .
T h e r e s u l t s o f a t y p i c a l a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y e x p e r i -ment w i t h S p l a s a m o d e l p r o t e i n are p r e s e n t e d i n F i g . 3 . Ap a r t i a l l y p u r i f i e d p r e p a r a t i o n o f S p l ( t o t a l p r o t e i n , 5 - 1 0 mg,
X 5 ' - G A ( G G G G C G G G G C - Y7 C C C C G C C C C G C T A G - 5 ' Y
B
1 0 4 0 - .7 7 0 -5 3 0 -400-2 4 0 -
- s o - m e r-25-mer
-- 1 O - m e r
1 2 3
F I G . 2 . P o l y m e r i z a t i o n o f c o m p l e m e n t a r y 5 ' - p h o s p h o r y l a t e do l i g o d e o x y n u c l e o t i d e s . ( A ) DNA s e q u e n c e o f c o m p l e m e n t a r yo l i g o d e o x y n u c l e o t i d e s , X a n d Y . When a n n e a l e d , o l i g o d e o x y n u c l e -o t i d e s X a n d Y c r e a t e t h e h i g h - a f f i n i t y S p l b i n d i n g s i t e , 5 ' -
G G G G C G G G G C - 3 ' ( 1 , 3 ) . ( B ) A n a l y s i s o f t h e l i g a t e d DNA b y 2%a g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s . T h e DNA w a s v i s u a l i z e d b y e t h i d i u mb r o m i d e s t a i n i n g a n d u l t r a v i o l e t l i g h t f l u o r e s c e n c e . L a n e s : 1 , l i n e a rd o u b l e - s t r a n d e d DNA m o l e c u l a r s i z e m a r k e r s ( s i z e s o f s e l e c t e df r a g m e n t s a r e g i v e n i n b a s e p a i r s ) ; 2 , o l i g o d e o x y n u c l e o t i d e s X a n d Yb e f o r e 5 ' - p h o s p h o r y l a t i o n a n d l i g a t i o n ( 1 p g ) ; 3 , o l i g o d e o x y n u c l e o -t i d e s X a n d Y a f t e r 5 ' - p h o s p h o r y l a t i o n a n d l i g a t i o n ( 2 j i g ) . T h ee s t i m a t e d m i g r a t i o n o f m u l t i m e r s i s i n d i c a t e d b y a r r o w s .
d e r i v e d f r o m 5 0 g o f HeLa c e l l s ; - 0 . 1 % p u r i t y ; s e e M a t e r i a l s
a n d M e t h o d s ) i s c o m b i n e d w i t h s o n i c a t e d c a l f t h y m u s c o m -
p e t i t o r DNA, a l l o w e d t o s t a n d f o r 1 0 m i n , a n d t h e n a p p l i e dt o a n S p l a f f i n i t y r e s i n . T h e p r o t e i n - D N A m i x t u r e i s p a s s e dt h r o u g h t h e r e s i n b y g r a v i t y f l o w , t h e c o l u m n i s w a s h e d w i t h
b u f f e r , a n d t h e S p l i s e l u t e d w i t h 0 . 5 M K C l . T h e S p l DNA
b i n d i n g a c t i v i t y was m o n i t o r e d b y DNase I f o o t p r i n t i n g o f t h e
2 1 - b a s e - p a i r r e p e a t s e q u e n c e s i n S V 4 0 ( 1 2 ) . A s d i s p l a y e d i nF i g . 3 A , <20% o f t h e i n i t i a l S p l a c t i v i t y i s i n t h e f l o w t h r o u g hf r a c t i o n , a n d t h e r e c o v e r y o f S p l i s 5 0 - 6 0 % . F i g . 3 B i s a
s i l v e r - s t a i n e d N a D o d S O 4 / p o l y a c r y l a m i d e g e l t h a t s h o w s S p lb e f o r e a f f i n i t y p u r i f i c a t i o n a n d a f t e r o n e a n d t w o a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y s t e p s , a n d F i g . 3 C s h o w s a c t i v a t i o n o ft r a n s c r i p t i o n f r o m t h e S V 4 0 e a r l y p r o m o t e r b y p u r i f i e d S p li n a r e c o n s t i t u t e d i n v i t r o t r a n s c r i p t i o n a s s a y . S p l i s p u r i f i e d5 0 0 - t o 1 0 0 0 - f o l d w i t h 3 0 % y i e l d t o a n e s t i m a t e d 9 0 %h o m o g e n e i t y b y t w o s e q u e n t i a l a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h ys t e p s .
A s s h o w n i n F i g . 4 , t h e a d d i t i o n o f c o m p e t i t o r DNA t o t h ec r u d e p r o t e i n f r a c t i o n c a n b e c r i t i c a l f o r s u c c e s s f u l a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y . I n a t y p i c a l e x p e r i m e n t w i t h a 1 - m l a f f i n i t yc o l u m n t h a t c o n t a i n s = 2 0 A g o f c o v a l e n t l y b o u n d DNA, 4 4 0
t k g o f s o n i c a t e d c a l f t h y m u s DNA, w h i c h i s g r e a t e r t h a n a2 0 - f o l d e x c e s s o v e r t h e s y n t h e t i c DNA b o u n d t o t h e r e s i n , i sa d d e d t o t h e c r u d e p r o t e i n f r a c t i o n b e f o r e c h r o m a t o g r a p h y .T h u s , e a c h p a s s a g e t h r o u gh t h e a f f i n i t y r e s i n c a n g i v e u p t oa 2 0 - f o l d e n r i c h m e n t o f S p l r e l a t i v e t o o t h e r DNA b i n d i n gp r o t e i n s a s w e l l a s s e p a r a t i o n f r o m p r o t e i n s t h a t d o n o t b i n d
t o DNA. I n t h e a b s e n c e o f s u f f i c i e n t c o m p e t i t o r DNA,n o n s p e c i f i c p r o t e i n s w i l l b i n d t o t h e r e s i n a n d s u b s e q u e n t l yc o n t a m i n a t e t h e S p l . On t h e o t h e r h a n d , a l a r g e e x c e s s o fc o m p e t i t o r DNA c a n r e s u l t i n a l o w r e c o v e r y o f S p l ,p r e s u m a b l y d u e t o w e a k b i n d i n g o f t h e p r o t e i n t o t h ec o m p e t i t o r DNA ( d a t a n o t s h o w n ) . I n t e r e s t i n g l y , t h e u s e o fc o m p e t i t o r DNA i s i m p o r t a n t f o r a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y o f
S p l f r o m c r u d e e x t r a c t s o f - 0 . 1% p u r i t y ( F i g . 4 A ) b u t n o t f o ri s o l a t i o n o f S p l f r o m p r o t e i n f r a c t i o n s o f 11% p u r i t y ( F i g .4 B ) . I n t h e p u r i f i c a t i o n o f a n e w p r o t e i n , t h e c o m p o s i t i o n a n d
B i o c h e m i s t r y : K a d o n a g a a n d T j i a n
8/3/2019 Purificacion Por Afinidad de Proteinas de Union a Secuencias Especificas Del Adn
F I G . 3 . S e q u e n c e - s p e c i f i c DNA a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y o f t r a n -s c r i p t i o n f a c t o r S p l . ( A ) D N a s e I f o o t p r i n t a s s a y o f S p l b i n d i n g t o
t h e S V 4 0 2 1 - b a s e - p a i r r e p e a t sequences. T h e d e g e n e r a t e 2 1 - b a s e -p a i r r e p e a t s i n t h e S V 4 0 genome c o n t a i n s i x t a n d e m S p l b i n d i n g s i t e s( 1 2 , 1 7 , 1 8 ) . L a n e s 1 a n d 1 0 , c o n t r o l D N a s e I d i g e s t i o n i n t h e a b s e n c eo f p r o t e i n . L a n e 2 , c r u d e p r o t e i n f r a c t i o n b e f o r e c h r o m a t o g r a p h y ( 2 5
1 l . o f 6 - m l f r a c t i o n ) . L a n e 3 , a f f i n i t y r e s i n f l o w t h r o u g h ( 2 5 / U l o f 6 - m l
f r a c t i o n ) . L a n e 4 , f i r s t c o l u m n w a s h ( 2 5 u l o f 2 - m l f r a c t i o n ) . L a n e 5 ,
s e c o n d c o l u m n w a s h ( 2 5 1 u l o f 2 - m l f r a c t i o n ) . L a n e 6 , t h i r d c o l u m nw a s h ( 2 5 A . l o f 2 - m l f r a c t i o n ) . L a n e 7 , f o u r t h c o l u m n w a s h ( 2 5 , u 1 o f2 - m l f r a c t i o n ) . L a n e 8 , m a j o r S p l e l u a t e ( 1 0 A . l o f 1 - m l f r a c t i o n ) . L a n e9 , m i n o r S p l e l u a t e ( 1 0 u l o f 0 . 6 - m l f r a c t i o n ) . T h e r e g i o n o f DNA
p r o t e c t e d f r o m DNase I d i g e s t i o n b y S p l i s i n d i c a t e d b y a b r a c k e t .( B ) N a D o d S O 4 / p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s o f a f f i n i t y p u r i -f i e d S p l . P r o t e i n s a m p l e s we r e p r e c i p i t a t e d w i t h t r i c h l o r o a c e t i c a c i d ,s u b j e c t e d t o e l e c t r o p h o r e s i s on a N a D o d S O 4 / 7 % p o l y a c r y l a m i d eg e l , a n d s t a i n e d w i t h s i l v e r . L a n e s : 1 , p r o t e i n m o l e c u l a r s i z em a r k e r s ; 2 , c r u d e S p l f r a c t i o n ( 1 5 / . k g t o t a l p r o t e i n ) ; 3 , S p l f r a c t i o na f t e r on e a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y s t e p ( 1 . 5 A i g t o t a l p r o t e i n ) ; 4 , S p la f t e r two s e q u e n t i a l a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y s t e p s ( 0 . 3 A u g t o t a lp r o t e i n ) . T h e p r o t e i n s a m p l e s a p p l i e d t o l a n e s 3 a n d 4 c o n t a i n e d
r o u g h l y 1 0 t i m e s t h e S p l DNA b i n d i n g a c t i v i t y a s t h e p r o t e i n s a m p l ea p p l i e d t o l a n e 2 . T h e two p o l y p e p t i d e s o f 9 5 a n d 1 0 5 k D a , w h i c h ar e
i n d i c a t e d b y arrows, h a v e b e e n s h o w n t o b e S p l ( M . R. B r i g g s ,J . T . K . , a n d R . T . , u n p u b l i s h e d d a t a ) . T h e s i z e o f e a c h o f t h e p r o t e i n
m a r k e r s i s a l s o g i v e n i n k D a . ( C ) A c t i v a t i o n o f i n v i t r o t r a n s c r i p t i o nf r o m t h e S V 4 0 e a r l y p r o m o t e r b y a f f i n i t y - p u r i f i e d S p l . RNA s y n -
t h e s i s w a s m e a s u r e d b y a primer e x t e n s i o n a s s a y , a n d t h e arrows
i n d i c a t e t h e cDNA s t r a n d s t h a t d e r i v e f r o m t r a n s c r i p t s g e n e r a t e d i nv i t r o . T h e s y m b o l s + a n d - i n d i c a t e t h e presence or a b s e n c e o f
a f f i n i t y - p u r i f i e d S p l .
amount o f c o m p e t i t o r DNA m u s t b e c a r e f u l l y d e t e r m i n e d
b e c a u s e t h e a f f i n i t y o f a t e s t p r o t e i n f o r d i f f e r e n t DNAs w i l lvary. We h a v e s u c c e s s f u l l y u s e d b o t h s o n i c a t e d c a l f t h y m u sDNA a n d p o l y d e o x y i n o s i n i c / p o l y d e o x y c y t i d y l i c a c i d as
c o m p e t i t o r DNAs.
I n a d d i t i o n t o v a r i a t i o n o f t h e c o m p e t i t o r DNAs, t h e
c o m p o s i t i o n o f t h e b u f f e r i s c r i t i c a l f o r s u c c e s s f u l DNA
a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y . T h e m o s t o b v i o u s c o n s t i t u e n t s t o
v a r y a re t h e c o n c e n tr a t i o n o f mono- a n d d i v a l e n t m e t a l
c a t i o n s , s u c h as s o d i u m , p o t a s s i u m , a n d m a g n e s i u m i o n s , as
w e l l as t h e b u f f e r i t s e l f a n d t h e p H . I f n u c l e a s e s are p r e s e n t
i n t h e c r u d e p r o t e i n f r a c t i o n , t h e n d i v a l e n t m e t a l c a t i o n ss h o u l d b e o m i t t e d a n d EDTA s h o u l d b e a d d e d t o p r o t e c t t h e
r e s i n . A l s o , s p e c i f i c l i g a n d s t h a t a f f e c t t h e DNA b i n d i n gp r o p e r t i e s o f a p r o t e i n c o u l d b e u s e d i n some s i t u a t i o n s .
F i n a l l y , t h e a f f i n i t y r e s i n s c a n a s s i s t i n t h e i d e n t i f i c a t i o n o f
s e q u e n c e - s p e c i f i c DNA b i n d i n g p r o t e i n s . F o r e x a m p l e , a n y
p r o t e i n t h a t i s e n r i c h e d b y c h r o m a t o g r a p h y t h r o u g h a n
a f f i n i t y r e s i n t h a t c o n t a i n s S p l r e c o g n i t i o n s i t e s i s l i k e l y t o b ee i t h e r S p l or a p r o t e i n t h a t i s c l o s e l y a s s o c i a t e d w i t h S p l . Toe l i m i n a t e t h e p o s s i b i l i t y t h a t s u c h p r o t e i n s are n o t s p e c i e st h a t f o r t u i t o u s l y b i n d e i t h e r t o DNA sequences o t h e r t h a n t h e
S p l b i n d i n g s i t e s or t o t h e S e p h a r o s e CL-2B s u p p o r t ,
f r a c t i o n s c o n t a i n i n g S p l c a n b e p a s s e d t h r o u g h DNA-
20 5
11 69 7 4 - X
66
4 5
2 9 -
1 2 3456
os
205 N I . .
1 1 6 f i9 7 4 X
6 6 - e -
4 5
29-1 2 3 4 5 6
F I G . 4 . E f f e c t s o f c o m p e t i t o r DNA a n d b i n d i n g s i t e s o n t h ea f f i n i t y p u r i f i c a t i o n o f S p l . P r o t e i n s a m p l e s w e r e p r e c i p i t a t e d w i t ht r i c h l o r o a c e t i c a c i d , s u b j e c t e d t o e l e c t r o p h o r e s i s o n a N a D o d S O 4 /8% p o l y a c r y l a m i d e g e l , a n d s t a i n e d w i t h s i l v e r . S p l i s i n d i c a t e d b ya r r o w s , a n d t h e s i z e o f e a c h o f t h e p r o t e i n m a r k e r s i s g i v e n i n k D a .( A ) A f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y o f c r u d e p r o t e i n f r a c t i o n c o n t a i n i n g0 . 0 5 - 0 . 1 % S p l . L a n e s : 1 , p r o t e i n m o l e c u l a r s i z e m a r k e r s ; 2 , c r u d ep r o t e i n f r a c t i o n b e f o r e c h r o m a t o g r a p h y ; 3 a n d 4 , S p l f r a c t i o n s a f t e ro n e a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y s t e p ; 5 a n d 6 , S p l f r a c t i o n s a f t e r t w oa f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y s t e p s . T h e s y m b o l s + a n d - i n d i c a t e t h ep r e s e n c e o r a b s e n c e o f c a l f t h y m u s c o m p e t i t o r DNA i n t h e p r o t e i nf r a c t i o n s b e f o r e c h r o m a t o g r a p h y . ( B ) A f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y o f
p r o t e i n f r a c t i o n c o n t a i n i n g -1% S p l . L a n e s : 1 , p r o t e i n m o l e c u l a rs i z e m a r k e r s ; 2 , p r o t e i n f r a c t i o n b e f o r e c h r o m a t o g r a p h y ; 3 - 5 , e l u a t ef r a c t i o n s f r o m o n e p a ss ag e t h r o ug h S p l a f f i n i t y r e s i n s ; 6 , e l u a t ef r a c t i o n f r o m o n e p a s sa ge t h r o ug h a n a f f i n i t y r e s i n t h a t d o e s n o tc o n t a i n S p l b i n d i n g s i t e s . T h e r e l a t i v e a m o u n t s o f c a l f t h y m u sc o m p e t i t o r DNA u s e d i n t h e a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y e x p e r i m e n t ss h o w n i n l a n e s 3 , 4 , 5 , a n d 6 a r e 0 , 0 . 2 , 1 , a n d 1 , r e s p e c t i v e l y . T h et w o b an d s t h a t m i g r a t e b e t w e e n t h e 4 5 - a n d 6 6 - k D a s i z e m a r k e r sd e r i v e f r o m 2 - m e r c a p t o e t h a n o l i n t h e e l e c t r o p h o r e s i s s a m p l e b u f f e r .
S e p h a r o s e r e s i n s t h a t d o o r d o n o t p o s s e s s S p l r e c o g n i t i o ns e q u e n c e s . A s s h o w n i n F i g . 4 B , t w o p o l y p e p t i d e s o f 1 0 5 a n d
9 5 k D a , w h i c h h a v e s u b s e q u e n t l y b e e n s h o w n t o b e S p l( M . R . B r i g g s , J . T . K . , a n d R . T . , u n p u b l i s h e d d a t a ) , a r ep u r i f i e d b y a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y t h r o u g h a r e s i n t h a tc o n t a i n s S p l r e c o g n i t i o n s e q u e n c e s b u t a r e n o t e n r i c h e d b y
p a s s a g e t h r o u g h a s i m i l a r r e s i n t h a t d o e s n o t p o s s e s s S p lb i n d i n g s i t e s .
DISCUSSION
I n t h i s p a p e r , we d e s c r i b e a m e t h o d f o r a f f i n i t y p u r i f i c a t i o no f s e q u e n c e - s p e c i f i c DNA b i n d i n g p r o t e i n s t h a t i s f a s t a n d
e f f e c t i v e . T h i s t e c h n i q u e p r o v i d e s a m e a n s f o r t h e p u r i f i c a -t i o n o f l o w a b u n d a n c e m a m m a l i a n t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s , s u c h
a s S p l , C T F , a n d A P - 1 . I n a d d i t i o n , m u l t i p l e s e q u e n c e -s p e c i f i c DNA b i n d i n g f a c t o r s c a n b e s i m u l t a n e o u s l y p u r i f i e df r o m a s i n g l e p r o t e i n f r a c t i o n w i t h t h e u s e o f t a n d e m a f f i n i t yc o l u m n s t h a t c o n t a i n t h e a p p r o p r i a t e b i n d i n g s i t e s .A g e n e r a l s t r a t e g y f o r t h e p u r i f i c a t i o n o f s e q u e n c e - s p e c i f i c
DNA b i n d i n g p r o t e i n s c a n now b e o u t l i n e d . ( i ) F i r s t , i t i si m p o r t a n t t h a t t h e p r o t e i n i s p a r t i a l l y p u r i f i e d b y c o n v e n t i o n -
a l c h r o m a t o g r a p h y t o r e m o v e n u c l e a s e s a n d o t h e r c o n ta m i -n a t i n g a c t i v i t i e s t h a t m i g h t a d v e r s e l y a f f e c t t h e a f f i n i t yc o l u m n . ( i i ) N e x t , t h e r e c o g n i t i o n s e q u e n c e s h o u l d b e i d e n -t i f i e d b y v a r i o u s m e t h o d s , s u c h a s DNase I f o o t p r i n t i n g ( 1 3 ) ,m e t h i d i u m p r o p y l - E D T A - F e ( I I ) f o o t p r i n t i n g ( 1 9 ) , a n d d i m e t h -
y l s u l f a t e m e t h y l a t i o n p r o t e c t i o n ( 2 0 ) . ( i i i ) I f m o r e t h a n o n e
b i n d i n g s i t e i s k n o w n , t h e h i g h e s t a f f i n i t y s i t e f o r t h e p r o t e i ns h o u l d b e d e t e r m i n e d b e c a u s e l o w - a f f i n i t y r e c o g n i t i o n s e -q u e n c e s may n o t b e u s e f u l f o r t h e p u r i f i c a t i o n o f p r o t e i n s( u n p u b l i s h e d d a t a ) . ( i v ) To a s s i s t i n t h e i d e n t i f i c a t i o n o f t h ed e s i r e d p r o t e i n , t w o o r m o r e D N A - S e p h a r o s e r e s i n s c o u l d b e
p r e p a r e d t h a t c o n t a i n t h e h i g h e s t a f f i n i t y r e c o g n i t i o n s i t e w i t h
d i f f e r e n t f l a n k i n g o l i g o d e o x y n u c l e o t i d e s e q u e n c e s i n a d d i -t i o n t o a c o n t r o l r e s i n t h a t d o e s n o t p o s s e s s a n y r e c o g n i t i o ns i t e s . I f a p r o t e i n i s p u r i f i e d b y p a s s a g e t h r o u g h t w o d i f f e r e n t
P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 3 ( 1 9 8 6 )
8/3/2019 Purificacion Por Afinidad de Proteinas de Union a Secuencias Especificas Del Adn
P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A 8 3 ( 1 9 8 6 ) 5 8 9 3
a f f i n i t y r e s i n s , t h e n c o n t a m i n a t i o n b y p r o t e i n s t h a t b i n df o r t u i t o u s l y t o f l a n k i n g o l i g o d e o x y n u c l e o t i d e s e q u e n c e s i sm i n i m i z e d . T h e c o n t r o l r e s i n i s u s e d t o i d e n t i f y p r o t e i n s t h a tb i n d n o n s p e c i f i c a l l y t o D N A - S e p h a r o s e . ( v ) L a s t , t h e c o n -d i t i o n s f o r s u c c e s s f u l a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y s h o u l d b ee s t a b l i s h e d b y v a r i a t i o n o f s u c h f a c t o r s a s c o m p e t i t o r DNAs,p H , m e t a l i o n c o n c e n t r a t i o n s , l i g a n d s , r e c o g n i t i o n s e -q u e n c e s , a n d t h e p u r i t y a n d q u a n t i t y o f t h e c r u d e p r o t e i nf r a c t i o n .
R e c e n t l y , a f f i n i t y p u r i f i c a t i o n o f n u c l e a r f a c t o r I ( N F I ) , as e q u e n c e - s p e c i f i c DNA b i n d i n g p r o t e i n f r o m HeLa c e l l s t h a ts t i m u l a t e s a d e n o v i r u s DNA r e p l i c a t i o n , h a s b e e n d e s c r i b e d( 9 ) . T h e NFI a f f i n i t y r e s i n c o n s i s t e d o f p l a s m i d DNA c o n -t a i n i n g 8 8 c o p i e s o f t h e NFI b i n d i n g s i t e a d s o r b e d o n t oc e l l u l o s e b y t h e m e t h o d o f A l b e r t s a n d H e r r i c k ( 5 ) . H i g h l yp u r i f i e d NFI w a s o b t a i n e d f r o m a c r u d e p r o t e i n f r a c t i o n b yc h r o m a t o g r a p h y o n a n o n s p e c i f i c E s c h e r i c h i a c o l i DNA-c e l l u l o s e c o l u m n f o l l o w e d b y t w o p a s s a g e s t h r o u g h t h es e q u e n c e - s p e c i f i c D N A - c e l l u l o s e r e s i n i n t h e a b s e n c e o f a n yc o m p e t i t o r DNA.
S e q u e n c e - s p e c i f i c DNA a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y h a s a l s ob e e n r e p o r t e d f o r S V 4 0 l a r g e t u m o r a n t i g e n ( T a n t i g e n ) ,p o l y o m a v i r u s l a r g e T a n t i g e n , a n d E . c o l i l a c r e p r e s s o r .S V 4 0 l a r g e T a n t i g e n w a s p u r i f i e d i n a s i m i l a r m a n n e r a s N F I
b y c h r o m a t o g r a p h y w i t h p l a s m i d D N A - c e l l u l o s e ( 1 0 ) , w h i l ea v a r i a t i o n o f t h e D N A - c e l l u l o s e m e t h o d w a s u s e d t o e n r i c hf o r p o l y o m a v i r u s l a r g e T a n t i g e n ( 2 1 ) . L a s t , t h e f e a s i b i l i t y o fs e q u e n c e - s p e c i f i c a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y o f E . c o l i l a cr e p r e s s o r w a s i n v e s t i g a t e d b y c o m p a r i s o n o f t h e s a l t c o n -c e n t r a t i o n s t h a t w e r e r e q u i r e d t o e l u t e t h e p r o t e i n f r o ms e q u e n c e - s p e c i f i c o r n o n s p e c i f i c p l a s m i d DNA r e s i n s ( 7 ) .
O u r p r e v i o u s a t t e m p t s t o p u r i f y S p l b y s e q u e n c e - s p e c i f i cD N A - c e l l u l o s e c h r o m a t o g r a p h y w i t h p l a s m i d DNA c o n t a i n -i n g m u l t i p l e c o p i e s o f a b i n d i n g s i t e f a i l e d t o e n r i c h f o r S p lr e l a t i v e t o o t h e r DNA b i n d i n g p r o t e i n s ( u n p u b l i s h e d d a t a ) .T h e r e a r e s o m e s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e p r e v i o u s -l y d e s c r i b e d a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y p r o c e d u r e s a n d t h em e t h o d we d e s c r i b e h e r e t h a t m a y a c c o u n t f o r t h e s u c c e s s o ft h e s y n t h e t i c D N A - S e p h a r o s e r e s i n s . F i r s t , t h e m o s t i m p o r -
t a n t d i s t i n c t i o n i s p r o b a b l y t h e a d d i t i o n o f c o m p e t i t o r DNAd i r e c t l y t o t h e c r u d e p r o t e i n f r a c t i o n b e f o r e p a s s a g e t h r o u g ht h e D N A - S e p h a r o s e r e s i n . T h e p r e s e n c e o f c o m p e t i t o r DNAi n s o l u t i o n m i n i m i z e s r e t e n t i o n o f n o n s p e c i f i c DNA b i n d i n gp r o t e i n s o n t h e a f f i n i t y r e s i n . S e c o n d , t h e u s e o f s y n t h e t i co l i g o d e o x y n u c l e o t i d e s m a x i m i z e s t h e s p e c i f i c i t y o f t h eD N A - S e p h a r o s e r e s i n s . T h e o l i g o d e o x y n u c l e o t i d e s a r e n o to n l y m o r e s e l e c t i v e t h a n p l a s m i d s c o n t a i n i n g m u l t i p l e b i n d -i n g s i t e s , b u t t h e y c a n a l s o b e q u i c k l y a n d e a s i l y p r e p a r e d .F i n a l l y , a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y h a s b e e n p r e v i o u s l y p e r -
f o r m e d w i t h D N A - c e l l u l o s e r e s i n s c o n s i s t i n g o f p l a s m i dDNA a d s o r b e d t o c e l l u l o s e , w h e r e a s , i n t h i s s t u d y , we h a v eu s e d D N A - S e p h a r o s e r e s i n s t h a t were p r e p a r e d b y c o v a l e n tc o u p l i n g o f s y n t h e t i c DNA t o an a g a r o s e s u p p o r t .
We a r e g r a t e f u l t o K a t h y J o n e s , M i k e B r i g g s , B i l l D y n a n , a n dM a r k B i g g i n f o r t h e i r h e l p f u l s u g g e s t i o n s . We a l s o t h a n k B r u c eM a l c o l m f o r s y n t h e s i z i n g t h e o l i g o d e o x y n u c l e o t i d e s t h a t w e r e u s e di n t h i s s t u d y . J . T . K . i s a F e l l o w o f t h e M i l l e r I n s t i t u t e f o r B a s i cR e s e a r c h i n S c i e n c e . T h i s w o r k w a s f u n d e d b y g r a n t s f r o m t h eN a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t h a n d b y p a r t i a l s u p p o r t f r o m a N a t i o n a lI n s t i t u t e f o r E n v i r o n m e n t a l H e a l t h S c i e n c e s g r a n t t o R . T .
1 . D y n a n , W. S . & T j i a n , R . ( 1 9 8 5 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 3 1 6 ,7 7 4 - 7 7 8 .
2 . S e r f l i n g , E . , J a s i n , M . & S c h a f f n e r , W. ( 1 9 8 5 ) T r e n d s G e n e t . 1 ,2 2 4 - 2 3 0 .
3 . K a d o n a g a , J . T . , J o n e s , K . A . & T j i a n , R . ( 1 9 8 6 ) T r e n d sB i o c h e m . 1 1 , 2 0 - 2 3 .
4 . A l b e r t s , B . M . , A m o d i o , F . J . , J e n k i n s , M . , G u t m a n n , E . D .& F e r r i s , F . L . ( 1 9 6 8 ) C o l d S p r i n g H a r b o r S y m p . Q u a n t . B i o l .3 3 , 2 8 9 - 3 0 5 .
5 . A l b e r t s , B . & H e r r i c k , G . ( 1 9 7 1 ) M e t h o d s E n z y m o l . 2 1 ,1 9 8 - 2 1 7 .
6 . A l b e r t s , B . M . ( 1 9 8 4 ) C o l d S p r i n g H a r b o r S y m p . Q u a n t . B i o l .4 8 , 1 - 1 2 .
7 . H e r r i c k , G . ( 1 9 8 0 ) N u c l e i c A c i d s R e s . 8 , 3 7 2 1 - 3 7 2 8 .8 . A r n d t - J o v i n , D . J . , J o v i n , T . M . , B a h r , W . , F r i s c h a u f , A . - M .
& M a r q u a r d t , M . ( 1 9 7 5 ) E u r . J . B i o c h e m . 5 4 , 4 1 1 - 4 1 8 .9 . R o s e n f e l d , P . J . & K e l l y , T . J . ( 1 9 8 6 ) J . B i o l . C h e m . 2 6 1 ,
1 3 9 8 - 1 4 0 8 .1 0 . O r e n , M . , W i n o c o u r , E . & P r i v e s , C . ( 1 9 8 0 ) P r o c . N a t l . A c a d .
S c i . USA 7 7 , 2 2 0 - 2 2 4 .1 1 . D y n a n , W. S . & T j i a n , R . ( 1 9 8 3 ) C e l l 3 2 , 6 6 9 - 6 8 0 .1 2 . D y n a n , W . S . & T j i a n , R . ( 1 9 8 3 ) C e l l 3 5 , 7 9 - 8 7 .1 3 . G a l a s , D . & S c h m i t z , A . ( 1 9 7 8 ) N u c l e i c A c i d s R e s . 5 ,
3 1 5 7 - 3 1 7 0 .1 4 . M a n i a t i s , T . , F r i t s c h , E . F . & S a m b r o o k , J . ( 1 9 8 2 ) M o l e c u l a r
C l o n i n g : A L a b o r a t o r y M a n u a l ( C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a -t o r y , C o l d S p r i n g H a r b o r , N Y ) .
1 5 . L a e m m l i , U . K . ( 1 9 7 0 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 2 2 7 , 6 8 0 - 6 8 5 .1 6 . J o n e s , K . A . , Y a m a m o t o , K . R . & T j i a n , R. ( 1 9 8 5 ) C e l l 4 2 ,
5 5 9 - 5 7 2 .1 7 . G i d o n i , D . , D y n a n , W . S . & T j i a n , R . ( 1 9 8 4 ) N a t u r e ( L o n d o n )
3 1 2 , 4 0 9 - 4 1 3 .
1 8 . G i d o n i , D . , K a d o n a g a , J . T . , B a r r e r a - S a l d a n a , H . , T a k a h a s h i ,K . , C h a m b o n , P . & T j i a n , R . ( 1 9 8 5 ) S c i e n c e 2 3 0 , 5 1 1 - 5 1 7 .
1 9 . V a n D y k e , M . W. & D e r v a n , P . B . ( 1 9 8 3 ) N uc l e i c A c i d s R e s .
1 1 , 5 5 5 5 - 5 5 6 7 .2 0 . S i e b e n l i s t , U . & G i l b e r t , W. ( 1 9 8 0 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA
7 7 , 1 2 2 - 1 2 6 .2 1 . G a u d r a y , P . , T y n d a l l , C . , K a m e n , R . & C u z i n , F . ( 1 9 8 1 )
N u c l e i c A c i d s R e s . 9 , 5 6 9 7 - 5 7 1 0 .
B i o c h e m i s t r y : K a d o n a g a a n d T j i a n
