FERNANDO RODES LLORET (1), FRANCISCA COLOM VALIENTE (2),JAIME CHIARRI RODRIGO (1), BLAS CLOQUELL RODRIGO (1),JUAN BAUTISTA MARTÍ LLORET (1).(1) Laboratorio de Antropología. Cátedra de Medicina Legal y Toxicología.Facultad de Medicina. Universidad de Alicante.(2) Departamento de Genética y Microbiología. Facultad de Medicina.Universidad de Alicante.

RESUMENSe estudian cuatro unidades de enterramiento del Tossal de Manises (Alicante), una de las cuales presenta

una intensa coloración azul en los huesos y dientes. ausente en las tres restantes. Ante la sospecha de coloni·zación postmortem por hongos se realiza un estudio micológico de fragmentos de hueso de coloración azuly detierra procedente de los cuatro enterramientos, aislándose un total de 38 cepas de hongos filamentosos, siendotodos ellos flora habitual en suelos.

Los aislamientos obtenidos del fragmento de hueso muestran una alta colonización del mismo, obteniéndoseflora micológica igual a la de la tierra analizada y que no incluye ningún agente causal de micosis.

PALABRAS CLAVE: Paleopatología, tafonomía, hongos, contaminación micológica.

ABSTRACTFour burial units of the Tossal de Manises (Alicante) are studied, one of which shows an intense blue colouring

on the bones and teeth which is not present in the other three. In view of the suspicion of a postmortem funguscolonization a mycological study of fragments of bone with blue colouring and of earth from the four places ofburialis carried out, isolating a total of 38 types of filamentous fungi all of which were normal in earth.

The isolates obtained from the fragment of bone show a high colonization of the fungi, and the mycologicalflora obtained was the same as that of the earth analysed and no agent causing mycosis was included.

KEY WORDS: Paleopathology, taphonomy, fungi, mycological contamination.

INTRODUCCIÓNPresentamos el estudio micológico realizado sobre unos restos óseos, con la finalidad de

determinar la causa de la coloración azul que los mismos presentaban al extraerlos del yaci­miento.

Recibimos en el laboratorio los restos esqueléticos de cuatro unidades de enterramientohalladas en el Tossal de Manises (Alicante), tres de ellos islámicos y el cuarto posiblementetardorromano, destacando la coloración azul anteriormente mencionada de los huesos deuno de los esqueletos islámicos (fig 1) la cual se extendía incluso a las piezas dentarias.

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Figura 1. Fémur con coloración azul.

Esta coloración no aparecía en los tres restantes esqueletos recibidos, e iba atenuándosede forma progresiva en poco tiempo, lo que motivó el estudio micológico ante la sospechade una colonización por hongos postmortem.

Otras posibilidades barajadas fueron:- que procediera de la vestimenta del cuerpo,- que procediera del ajuar,- que revelara una intoxicación causante del fallecimiento,- que el sujeto hubiera padecido una enfermedad infecciosa de tipo micológico.

El objetivo principal que se planteó en el presente trabajo fue el esclarecer la posibilidadde que el esqueleto objeto de estudio se encontrara invadido por uno o más hongosfilamentosos.

Para obtener conclusiones válidas, creímos necesario e imprescindible analizar, asímismo,la flora de la tierra adyacente a los huesos de coloración azul, para compararla con la que seencontrara en el fragmento óseo estudiado.

Asímismo, se analizó la tierra de las otras tres unidades de enterramiento recibidas.

MATERIAL Y MÉTODO1. PROCESADO DE MUESTRAS PARA ANÁLISIS MICOLÓGICO

Para el análisis micológico se manejaron dos tipos de muestra: Fragmentos óseos y tierrade los cuatro enterramientos referidos. Para la identificación de los hongos que colonizan elhueso y que están presentes en la tierra se prepararon convenientemente dichas muestras yse sembraron en medios de cultivo adecuados que favorecen el desarrollo de los hongos.Los medios de cultivo empleados fueron: agar de Sabouraud, agar extracto de malta y agarmarzo

1.1. Procesado de fragmentos óseos: Se utilizaron dos técnicas distintas. Por una parte, serealizó un rascado de las superficies pigmentadas y las pequeñas esquirlas obtenidas sedepositaron en la superficie de los diferentes medios de cultivo sólidos. Se dejaron enincubación a temperatura ambiente y se fueron observando cada 2-3 días con objeto de de­tectar el desarrollo fúngico. Por otra parte, se separaron fragmentos de aproximadamente 1x 0,5 cm, estos se trituraron en mortero y, posteriormente, se lavaron con solución salinaestéril. Tras agitar vigorosamente los tubos en los que se realizó la suspensión, se dejaronreposar con objeto de que las partículas más pesadas se separaran de estructuras más ligeras(esporas u otros propágulos fúngicos); posteriormente, se tomaron muestras de 0,1 mI de lasfracciones superficial, media y fondo de la suspensión. Estas fracciones fueron observadasal microscopio óptico y sembradas en los mismos medios de cultivo sólidos, dejándose in­cubar a temperatura ambiente.

1.2. Procesado de muestras de tierra: La tierra procedente de los cuatro enterramientos se

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sembró en la superficie de los mismos medios de cultivo, extendiendo las partículas me­diante una espátula de cristal estéril. Las placas con medio de cultivo así sembradas se deja­ron incubar, igualmente, a temperatura ambiente y se observaron periodicamente junto conlas correspondientes al hueso.II. AISLAMIENTO DE HONGOS FILAMENTOSOS

A los 7-10 días de incubación comenzó a aparecer crecimiento fúngico en los medios decultivo utilizados y se procedió al aislamiento de los hongos que crecieron en los mismos.En cada una de las placas con medio de cultivo sólido aparecieron numerosas colonias co­rrespondientes a distintos tipos de hongos. Para el estudio detallado de cada uno de ellos, sesepararon o aislaron transfiriendo un fragmento de cada colonia a una nueva placa conmedio de cultivo estéril. Estas volvieron a incubarse y tras el desarrollo de las colonias aisla­das se procedió a la identificación de los hongos.III. IDENTIFICACIÓN DE LOS HONGOS AISLADOS

Para la identificación fúngica el primer paso es el estudio detallado de la morfologíamacroscópica de las colonias aisladas; El aspecto macroscópico se observó durante variosdías anotando detalles como forma, tamaño, textura y aparición de pigmentos tanto en elanverso como en el reverso de cada una de las colonias desarrolladas. Posteriormente, serealizó el estudio microscópico de las mismas; para ello se extrajo un fragmento de cadacolonia y se estudió en microscopio óptico con tinción de azul de lactofenal. La observaciónde estructuras microscópicas, fundamentalmente de estructuras de reproducción, permitióla identificación de la mayoría de los hongos filamentosos aislados. Para aquellos hongosque no pudieron identificarse mediante estudio microscópico de fragmentos disociados dela colonia, se procedió al montaje de microcultivos en porta, que permiten observar el desa­rrollo fúngico sin manipular la colonia.Resultados y Discusión

Tras las siembras de fragmentos óseos y de la suspensión de partículas del mismo, seobtuvo el desarrollo de 29 colonias fúngicas, correspondiendo a 13 hongos filamentososdiferentes y una levadura (Rhodotorula rubra). En cuanto a las muestras de tierra obtuvi­mos 9 colonias fúngicas que correspondieron a 7 hongos filamentosos distintos, 3 se aislaronde la muestra correspondiente al esqueleto en estudio y las restantes a los otros tresenterramientos (Tabla 1).

Tanto los aislamientos procedentes de la muestra de hueso como los correspondientes ala tierra del mismo enterramiento, mostraron una presencia mayoritara del género Penicilliumal cual correspondieron 14 de las colonias aisladas (43,75%). Es de destacar en este sentidoque una misma especie Penicillium chrysogenum (fig. 2) se recuperó de todas las placassembradas con fragmentos óseos y de dos de las fracciones de la suspensión preparada conel triturado de la misma muestra. En cuanto a las muestras de tierra en general, la flora

Figura 2. Microfotografía del conidióforo dePenicillium chrysogenum aislado de hueso

del esqueleto islámico. (X400)

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Tabla 1.- Resultados obtenidos en el estudio de flora fúngica presente en muestras de hueso delesqueleto islámico y tierra de este y otros enterramientos de la misma zona.

Esqueleto islámico

muestra procesado hongos aislados géneros especies No identificados

Hueso. raspado 21 Fusarium (4) F. equiseti (1) 5Aspergillus(5) A. lIiger(3)

Penicillium (6) A.ochraceus(2)

Rhodotorula (1)P. dlrysogellum(5)

Rll. Rubra (1)

Suspensión 8 Penicillium (5) 2triturado

Fusarium (1) P. chrysogellum(5)

Tierrá SiembraDirecta

3 Penicilliulll (3) P. chrysogellum (2)

P. ocllraceum (1)

muestra procesado

Tierra de otros enterramientos

hongos aislados géneros especies No identificados

TierraSiembradirecta

6 Penicillium (3)Fusarium (1)Aspergi/lus (1) A. niger (1)

fúngica encontrada corresponde a hongos habitualmente descritos en este medio y puededecirse que, llama la atención la presencia tan marcada del género Penicillium en el enterra­miento del esqueleto estudiado. En la tabla 1 se muestra la variedad de población fúngicaaislada de otros suelos junto con la encontrada en el hueso y tierra del esqueleto en estudio.Podría decirse que, por alguna causa, en este suelo se encontraba desplazado el equilibriode poblaciones fúngicas de forma que hay un género claramente predominante. No obstan­te, también se detectan otros géneros y especies característicos de tierra aunque en muchamenor proporción. El factor o factores ambientales que han podido propiciar este desplaza­miento de flora en el suelo, indudablemente ha favorecido también la colonización delesqueleto por parte de los mismos hongos entre los que sigue siendo mayoritario el géneroPenicillium y en concreto Penicillium chrysogenun.. Teniendo en cuenta que se trata dehongos filamentosos que producen gran cantidad de pigmentos, parece razonable concluirque el responsable de la pigmentación del esqueleto en estudio, fuera la especie más fre­cuentemente encontrada en las muestras de hueso y que por supuesto también aparece en latierra asociada al mismo. Penicillium chrysogenum, presenta pigmentación intensa que co­mienza siendo de tonalidades amarillas y, posteriormente, va tornando las colonias acoloraciones amarillo-verdosas. Otras especies de Penicillium también encontradas en lasmuestras, presentan pigmentos verde-azulados, grisáceos y marrón rojizo, aunque éstas seaislaron en menor proporción.

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Los hongos pertenecientes al género Penicillium no se consideran patógenos para el serhumano. Su presencia es muy importante en medios naturales (suelos, aire, vegetales, pol­vo, aguas, ) y únicamente se ven implicados en patología humana como alergenos y, aunasí, con baja trascendencia. Por otra parte, hay que comentar aquí que no encontramos entrelos aislamientos procedentes de las muestras de hueso, ningún hongo patógeno que pudie··ra considerarse agente causal de una micosis generalizada y que pudiera invadir el esquele­to confiriéndole la pigmentación encontrada.

Por todo lo expuesto, concluimos que el esqueleto estudiado se encontraba invadido porvarios hongos filamentosos procedentes del suelo adyacente. En este suelo la flora fúngicase encuentra desplazada por las poblaciones correspondientes al género Penicillium los cualestambién invaden mayoritariamente el esqueleto y muy probablemente son los responsablesde la pigmentación que presenta. Entre los hongos de este género encontrados destaca laespecie P. chrysogenum por su elevada frecuencia de aislamiento en las muestras estudia­das.

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