Revista Mexicana de Ciencias Agrícolas Vol.6 Núm.3 01 de abril - 15 de mayo, 2015 p. 495-507
Retos y oportunidades en la selección asistida de frijol resistente a BCMV y BCMNV en México. II. Oportunidades para la selección asistida*
Challenges and opportunities in assisted selection of resistant bean to BCMVand BCMNV in Mexico. II. Opportunities for assisted selection
José Luis Anaya-López1, Fulgencio Espejel2, Víctor Montero-Tavera1, Jorge Alberto Acosta-Gallegos1 y Laura Silva-Rosales2§
1Campo Experimental Bajío-INIFAP. Carretera Celaya-San Miguel de Allende, km 6.5. A. P. 112, C. P. 38110, Celaya, Guanajuato, México. ([email protected]; [email protected]; [email protected]). 2Laboratorio de Interacciones Planta-Virus, Departamento de Ingeniería Genética, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN, Cinvesta Irapuato, México. ([email protected]). §Autora para correspondencia: [email protected].
* Recibido: octubre de 2014
Aceptado: febrero de 2015
Resumen
Considerando información reciente, el objetivo fue revisar
el conocimiento de los mecanismos de resistencia a BCMV
y BCMNV, describir el uso de marcadores de ADN para la
selección asistida de variedades de frijol resistentes a ambos
virus y señalar la necesidad de diseñar y generar marcadores
moleculares más eficientes. La forma más económica y
eficiente para prevenir los daños causados por ambos virus
es sembrar variedades resistentes obtenidas mediante la
piramidación de genes, en la que se combine una resistencia
de amplio espectro contra los patogrupos de BCMV y
BCMNV. Desde hace más de 30 años se conoce la función
del gen dominante I, que confiere resistencia a cepas no
necróticas, y de los genes recesivos bc, que incluyen bc-u,
bc-1, bc-12, bc-2, bc-22, y bc-3, que confieren resistencia
específica a algunos patogrupos de BCMV y BCMNV.
Sin embargo, a excepción del gen bc-3 que corresponde
al gen PveIF4E, se desconoce la identidad de todos ellos.
En relación al gen bc3 se han identificado al menos tres
alelos, bc31, bc32 y bc33, de los cuales solo el alelo bc32,
en combinación con el gen I, confiere inmunidad a la cepa
NL3 de BCMNV. Hasta el presente, los dos marcadores
moleculares más utilizados para monitorear resistencia a
BCMV: ROC11 y SW13 no han sido consistentes a través de
germoplasma diverso. Por esta razón es necesario desarrollar
Abstract
Considering recent information, the objective was to review
the knowledge on the mechanisms of resistance to BCMV
and BCMNV, describe the use of DNA markers for assisted
selection of bean varieties resistant to both viruses and point
out the need to design and generate more efficient molecular
markers. The most economical and efficient way to prevent
damage caused by both viruses is to plant resistant varieties
obtained by gene pyramiding, in which a broad-spectrum
resistance against pathogroups of BCMV and BCMNV are
combined. For over 30 years the role of the dominant I gene
are known, which confers resistance to non-necrotic strains,
and bc recessive genes, including c-u, bc-1, bc-12, bc-2,
bc-22, and bc-3, which confer resistance to some specific
pathogroups of BCMV and BCMNV. However, except for
bc-3 gene which corresponds to PveIF4E gene, their identity
is unknown. Regarding to bc3 gene has been identified at
least three alleles, bc31, bc32 and bc33, of which only the bc32
allele in combination with I gene, confers immunity to strain
of NL3 from BCMNV. To date, the two most used molecular
markers to monitor BCMV resistance: ROC11 and SW13
have not been consistent through diverse germplasm. It is
therefore necessary to develop new or additional resistance
markers based on knowledge of the biological function of
the corresponding genes.
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nuevos o marcadores de resistencia adicionales basados
en el conocimiento de la función biológica de los genes
correspondientes.
Palabras clave: BCMV, BCMNV, marcadores moleculares,
SAMM, bc3, eIF4E.
Introducción
El BCMV y BCMNV son dos especies del género Potyvirus
estrechamente relacionados con el frijol que producen las
enfermedades conocidas como mosaico común y raíz negra.
Se han identificado y caracterizado al menos 19 cepas
diferentes de BCMV y cuatro de BCMNV: TN-1, NL-3,
NL-5 y NL-8 (Larsen et al., 2005), todas pueden transmitirse
mecánicamente, y aunque se ha reportado la transmisión
de esto virus a través del polen, este mecanismo es de
poca relevancia pues el frijol es un planta autógama. Por el
contrario, la alta incidencia de infección del embrión por estos
potyvirus, hace de la semilla el medio de diseminación más
importante, ya que su transmisibilidad por semilla puede ser de
hasta 80% dependiendo del genotipo de frijol, las condiciones
ambientales y la cepa del virus (Morales y Castaño, 1987).
Una vez transmitidos por la semilla, estos virus pueden
transmitirse secundariamente por varias especies de áfidos
dentro y fuera del cultivo, perpetuando al agente etiológico
y dando lugar a un nuevo ciclo de la enfermedad (Morales y
Castaño, 2008), por lo que el mosaico común es la enfermedad
viral más difundida a nivel mundial en este cultivo.
Recientemente en México se ha detectado una alta
incidencia de BCMV y BCMNV (Flores-Esteves et al.,
2003; Lepe-Soltero et al., 2012) que podría incrementar
debido a las condiciones climáticas que se anticipan y
a las prácticas agrícolas intrínsecas con los sistemas de
producción de frijol en nuestro país, ya que como el mosaico
común no afecta el llenado, el número de granos por vaina,
ni la apariencia de la semilla el agricultor utiliza el grano
infectado como semilla para el siguiente ciclo de cultivo
favoreciendo la dispersión del virus.
Una alternativa para contribuir a la solución de este problema
es la incorporación de resistencia genética en nueva variedades
de frijol adaptadas a las localidades específicas de cada región
e impulsar el uso de semilla certificada libre de enfermedades.
De ambas, la estrategia más económica es el uso de variedades
Keywords: BCMV, BCMNV, molecular markers, SAMM,
bc3, eIF4E.
Introduction
BCMV and BCMNV are two species of the genus Potyvirus
closely related to beans, producing diseases known as
common mosaic and black root. Have been identified and
characterized at least 19 different strains of BCMV and
four BCMNV: TN-1, NL-3, NL-5 and NL-8 (Larsen et al.,
2005), all can be transmitted mechanically, and although
it has been reported the transmission of this virus through
pollen, this mechanism is of little relevance, since bean is
a self-pollinating plant. Conversely, the high incidence of
embryo infection by these potyvirus, makes seed the most
important dissemination mean, since its transmissibility
through seed can be up to 80% depending on bean genotype,
environmental conditions and virus strain (Morales and
Castaño, 1987).
Once seed-borne, these viruses can be transmitted
secondarily by several species of aphids inside and outside
the crop, perpetuating the etiologic agent and giving place to
a new cycle of the disease (Morales and Castaño, 2008), so
that common mosaic is the most widely viral disease spread
worldwide in this crop.
Recently in Mexico has been detected a high incidence of
BCMV and BCMNV (Flores-Esteves et al., 2003; Lepe-
Soltero et al., 2012) which could increase due to anticipated
climatic conditions and the intrinsic agricultural practices
with bean production systems in our country, because
the common mosaic does not affect grain filling, number
of grains per pod, or the appearance of the seed nor the
farmer uses infected seed for the next crop cycle favoring
virus spread.
An alternative to contribute to the solution of this problem is
the incorporation of genetic resistance in new bean varieties
adapted to specific locations in each region and promote
the use of disease-free certified seed. In both, the cheapest
strategy is the use of resistant varieties, since planting virus-
free seed without the incorporation of resistance would also
be susceptible to infection mediated by insect vectors or the
introduction of seed from another country. The selection
process of resistant varieties can be accelerated by marker-
assisted selection (MAS). However, until now in Mexico,
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resistentes, pues la siembra de semilla libre de virus sin la
incorporación de resistencia sería también susceptible a la
infección mediada por los insectos vectores o a la introducción
de semilla procedente de otro país. El proceso de selección de
variedades resistentes puede acelerarse mediante selección
asistida por marcadores moleculares (SAMM). Sin embargo,
hasta ahora en México, sólo la variedad Dalia resistente a
BCMV generada por el INIFAP (Acosta-Gallegos et al.,
2012), se ha seleccionado mediante esta estrategia usando los
marcadores moleculares SW13 (Haley et al., 1994; Melotto
et al., 1996) y ROC11 (Johnson et al., 1997), por lo que
presumiblemente tiene los genes de resistencia I y bc3 que
les confieren resistencia a BCMV y BCMNV.
Sin embargo, esta variedad y otras líneas de frijol,
seleccionadas con estos mismos marcadores moleculares
por el programa de mejoramiento genético del INIFAP,
fueron susceptibles a la inoculación mecánica con la
cepa NL3 de BCMNV. Lo que indicó que los materiales
evaluados tienen el gen I, pero carecen del gen bc-3 que
les confiere resistencia a las cepas necróticas, por lo que
el marcador ROC11 no es consistente en la selección de
resistencia mediada por el gen bc3.
Genes de resistencia recesivos y dominantes a BCMV
y BCMNV
De acuerdo a criterios genéticos, los genes de resistencia
tienen una herencia dominante o recesiva que se relaciona
estrechamente con el mecanismo molecular subyacente a la
interacción del patogrupo viral con el genotipo de frijol. Los
genes dominantes típicamente desencadenan una respuesta
hipersensible y, aunque su mecanismo de acción no ha sido
perfectamente entendido, involucra el reconocimiento
de un componente específico del patógeno seguido por
una serie de eventos de señalización que culminan en el
establecimiento de la resistencia (Martin et al., 2003).
Se propone que los genes tipo R de resistencia a virus
funcionan de manera análoga a los de resistencia a hongos
y bacterias de acuerdo al modelo evolutivo de resistencia
tipo zig-zag propuesto por Jones y Dangl (2006), donde
los patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPS)
pueden ser proteínas virales estructurales como la CP,
de replicación como la helicasa del tobamovirus TMV
o inclusive, intermediarios de la replicación viral como
cadenas dobles de RNA. En este modelo de interacción
una única copia funcional del gen tipo R es suficiente para
establecer la resistencia al patógeno.
only Dalia variety resistant to BCMV generated by INIFAP
(Acosta-Gallegos et al., 2012), has been selected through this
strategy using molecular markers SW13 (Haley et al., 1994;
Melotto et al., 1996) and ROC11 (Johnson et al., 1997),
so presumably has I and bc3 genes that confers resistance
against BCMV and BCMNV.
However, this variety and other bean lines, selected with
these same molecular markers by the genetic breeding
program from INIFAP were susceptible to mechanical
inoculation with strain NL3 from BCMNV. Indicating that
evaluated materials have I gene but lack bc-3 gene which
confers them resistance to necrotic strains, so ROC11
marker is not consistent in selection for resistance mediated
through bc3 gene.
Recessive and dominant genes for resistance to BCMV
and BCMNV
According to genetic criteria, the resistance genes have a
dominant or recessive inheritance that is closely related with
the underlying molecular mechanism to the viral pathogroup
interaction with bean genotype. The dominant genes
typically trigger a hypersensitive response, although its
mechanism of action has not been fully understood, involves
the recognition of a specific component of the pathogen
followed by a series of signaling events that culminate in
the establishment of resistance (Martin et al., 2003). It is
proposed that type R gene of virus resistance functions
similar to resistance of fungi and bacteria according to the
zigzag model for co-evolution resistance proposed by Jones
and Dangl (2006), where the pathogen-associated molecular
patterns (PAMPS) may be structural viral proteins such as
CP, of replication as helicase from tobamovirus TMV or
even, intermediaries of viral replication as RNA duplexes.
In this interaction model a single functional copy of the type
R gene is sufficient to establish resistance to the pathogen.
The I gene from P. vulgaris, which is believed to encode for a
protein R type controls the resistance to BCMV and has been
widely used in breeding programs worldwide. Although
its resistance was initially characterized as a dominant
monogenic trait (Ali, 1950) actually has an incomplete
dominance (Whitmer-Collmer et al., 2000). Drijfhout et
al. (1978a) reported that I gene confers resistance to some
BCMV in a dependent manner from temperature, but plants
develop systemic necrosis at any temperature when infecting
them with BCMNV pathogroups.
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El gen I de P. vulgaris, que se cree codifica para una proteína
tipo R, controla la resistencia a BCMV y se ha usado
ampliamente en los programas de mejoramiento genético en
el mundo. Aunque su resistencia se caracterizó inicialmente
como un rasgo monogénico dominante (Ali, 1950), en
realidad tiene una dominancia incompleta (Whitmer-
Collmer et al., 2000). Drijfhout et al. (1978a) señalaron
que el gen I confiere resistencia a algunos BCMV de
manera dependiente de la temperatura, pero que las plantas
desarrollan necrosis sistémica en cualquier temperatura al
infectarlas con patogrupos de BCMNV.
Adicionalmente, la resistencia conferida por el gen I depende
del fondo genético: a 23 °C las plantas homocigotas I/I
muestran resistencia extrema o inmunidad, mientras que
los heterocigotos I/i, y los homocigotos i/i una reacción
hipersensible y mosaico sistémico, respectivamente. Sin
embargo, cuando se incrementa la temperatura a 34 °C
se induce una respuesta hipersensible, así como necrosis
sistémica en la mitad de los homocigotos I/I y en todos los
heterocigotos (Whitmer-Collmer et al., 2000). A la fecha
permanece la duda de si el locus I tiene un sólo gen con
amplio espectro de resistencia, o si representa un grupo de
genes de resistencia con recombinación suprimida.
Drijfhout et al. (1978a, 1978b) dedujeron la existencia de
seis genes recesivos bc localizados en cuatro loci, de los
cuales bc-1, bc-12, bc-2, bc-22, y bc-3 son genes específicos
de resistencia a algún patogrupo, a diferencia del gen bc-u
que parece ser necesario para la expresión de los otros genes
bc, a menos que el gen I este presente (Drijfhout, 1978a).
Los genes bc muestran distintas respuestas en función del
patogrupo del virus y la combinación entre ellos y el gen I.
En presencia del gen I los genes bc-1, bc-12 y bc-3 confieren
resistencia aún en ausencia de bc-u (Silbernagel, 1995,
Miklas et al., 2000a). Por su parte, bc-12 es dominante a bc-1
en conferir resistencia a la necrosis apical en presencia del
gen I (Miklas et al., 2000a).
Cuando los genotipos I + bc-12 se inoculan con los patogrupos
NL-8 y NL-3 de BCMNV, exhiben únicamente lesiones
localizadas y necrosis de las venas de las hojas inoculadas,
pero si se inoculan con el patogrupo NL-5 expresan necrosis
apical, aunque con un desarrollo de síntomas retardado
(Miklas et al., 2000a). La combinación de los genes I + bc-u
+ bc-22 confrontada con patogrupos de BCMNV resulta
sólo en lesiones locales en la hoja inoculada (Kelly, 1997);
sin embargo, no se identifican lesiones o respuesta en las
hojas inoculadas con patogrupos de BCMV o BCMNV si los
Additionally, the resistance conferred by I gene depends on
the genetic background: at 23 °C homozygous plants I/I show
extreme resistance or immunity, whereas heterozygous I/i,
and homozygous i/i a hypersensitive reaction and systemic
mosaic respectively. However, when temperature increases
to 34 °C a hypersensitive response thus a systemic necrosis
in half homozygous I/I and in all heterozygotes is induced
(Whitmer-Collmer et al., 2000). To date remains the question
of whether I locus has a single gene with broad-spectrum
resistance, or if it represents a group of resistance genes with
suppressed recombination.
Drijfhout et al. (1978a, 1978b) deduced the existence of six
bc recessive genes located in four loci, of which bc-1, bc-12,
bc-2, bc-22 and bc-3 are specific genes of resistance to some
pathogroups, unlike the bc-u gene that seems to be required
for the expression of other bc genes unless that I gene is
present (Drijfhout, 1978a). bc genes show different responses
depending on the virus from the phatogroup and combination
between them and I gene. In the presence of I gene, genes
bc1, bc-12 and bc-3 confer resistance even in absence of bc-u
(Silbernagel, 1995, Miklas et al., 2000a). Meanwhile, bc-12
is dominant to bc-1 in conferring resistance to apical necrosis
in the presence of I gene (Miklas et al., 2000a).
When I + bc-12 genotypes are inoculated with NL-8 and
NL-3 pathogroups from BCMNV, exhibit only localized
lesions and necrosis of the veins from inoculated leaves, but
if inoculated with NL-5 phatogroups express apical necrosis,
although with delayed symptom development (Miklas et
al., 2000a). The combination of I + bc-u + bc-22 genes
confronted with pathogroups from BCMNV turns only in
local lesions in the inoculated leaf (Kelly, 1997); however, no
lesions or response were identify on inoculated leaves with
pathogroups from BCMNV or BCMV if bc-u + bc-3 genes
are present, regardless of the presence or absence of I gene
(Drijfhout et al., 1978a). Currently the protein nature from I
gene is unknown, even when proposed that it could be a type
R gene involved in the guardian theory of viral resistance.
Identity of recessive resistance genes to potyvirus: factors
translation initiation
Although recessive genes against plant virus have been
recognized for over 30 years (Drijfhout et al., 1978a, 1978b),
it was not until recently that its molecular nature began to
be elucidated. RNA genomes of BCMNV and BCMV are
recognized and processed in the plant as if they were RNA
messenger and therefore use the initiation of translation
499Retos y oportunidades en la selección asistida de frijol resistente a BCMV y BCMNV en México. II. Oportunidades para la selección asistida
genes bc-u + bc-3 están presentes, independientemente de la
presencia o ausencia del gen I (Drijfhout et al. 1978a). En la
actualidad la naturaleza proteica del gen I se desconoce, aun
cuando se propone que pueda ser un gen tipo R involucrado
en la teoría guardiana de resistencia viral.
Identidad de los genes recesivos de resistencia a
potyvirus: factores del inicio de la traducción
Aunque los genes recesivos contra los virus de plantas se
han reconocido desde hace más de 30 años (Drijfhout et al.,
1978a, 1978b), no fue sino hasta hace poco que su naturaleza
molecular comenzó a dilucidarse. Los genomas de RNA de
BCMV y de BCMNV son reconocidos y procesados en la
planta como si fueran RNA mensajeros y usan, por lo tanto
factores de inicio de la traducción de la célula que infectan
para favorecer la traducción de su genoma viral. Cuando hay
cambios en esos factores de tal manera que no pueden ser
usados por el virus, se da la resistencia viral en la planta pues
el genoma viral no puede traducirse (Ruffel et al., 2004).
Fraser (1986) propuso que debido a que los virus de plantas
sintetizan pocas proteínas y reclutan muchos componentes
moleculares del hospedero para desarrollar su ciclo infectivo,
los genes de resistencia podrían corresponder a cambios por
pérdidas o disminución de función de esos componentes
requeridos en un paso del ciclo de vida del virus. Estos
cambios podrían estar dados por mutaciones no sinónimas,
de tal manera que se interrumpe el reconocimiento entre
estas proteínas del hospedero y las virales.
Esta hipótesis se confirmó recientemente por evidencias
que señalan que la mutación en la secuencia de aminoácidos
de algunos componentes del inicio de la traducción son los
responsables de la resistencia a virus de ARN. En efecto,
a la fecha todos los genes recesivos involucrados en las
interacciones planta-potyvirus, grupo al que pertenecen
BCMV y BCMNV, se han caracterizado como factores
del inicio de la traducción, principalmente eIF4E, eIF4G o
sus isoformas (Wang et al., 2011). Estos incluyen 14 genes
de resistencia recesivos, de los cuales 12 son eIF4E o su
isoforma y dos eIF4G o su isoforma (Albar et al., 2006; Lee et
al., 2010). Por lo tanto, la familia de proteínas eIF4E y eIF4G
son particularmente importantes, pues son esenciales tanto
para la susceptibilidad como la resistencia a las infecciones
por algunos virus de ARN (Potyvirus, Cucumovirus,
Carmovirus y Bymovirus) en plantas como Arabidopsis,
Capsicum spp., Lactuca spp., Lycopersicon spp., Cucumis
melo, y Hordeum vulgare (Robaglia y Caranta, 2006).
factors that infect the cell to facilitate the translation of the
viral genome. When there are changes in these factors so
that they cannot be used by the virus, viral resistance occurs
in the plant because the viral genome cannot be translated
(Ruffel et al., 2004).
Fraser (1986) proposed that due to plant viruses synthesized
few proteins and recruit many molecular components of the
host to develop its infective cycle, resistance genes may
correspond to changes through loss or function reduction of
those components required in a step of the life cycle of the
virus. These changes could be given by non-synonymous
mutations, so that recognition between these proteins from
the host and virus is interrupted.
This hypothesis was recently confirmed by evidence
indicating that the mutations in the amino acid sequence of
some components from the initiation of translation are the
responsible for resistance to RNA virus. Indeed, to date all
recessive genes involved in plant-potyvirus interactions,
group to which BCMV and BCMNV belong, it have been
characterized as factors in the initiation of translation,
mainly eIF4E, eIF4G or its isoforms (Wang et al., 2011).
These include 14 recessive resistance genes, of which 12
are eIF4E or its isoform and two eIF4G or its soform (Albar
et al., 2006; Lee et al., 2010). Therefore, the protein family
eIF4E and eIF4G are particularly important because they are
essential for both susceptibility and resistance to infection
by some RNA virus (Potyvirus, Cucumovirus, Carmovirus
and bymovirus) in plants such as Arabidopsis, Capsicum
spp., Lactuca spp., Lycopersicon spp., Cucumis melo, and
Hordeum vulgare (Robaglia and Caranta, 2006).
eIF4E proteins are part of a complex of initiation of the
translation of eIF4F (Marcotrigiano et al., 1999). There
is a second complex of isoforms called eIF (iso) 4F with
corresponding eIF (iso) 4E and eIF (iso) 4G (Browning,
2004). These two complexes essentially perform the same
task in translation, but have different affinities for certain
classes of mRNAs and are probably involved in different
cellular events (Gallie and Browning, 2001). It has been
proven that virus can selectively use isoforms from both
complexes of translation to successfully complete its cycle
of infection (Sato et al., 2005). For example, Duprat et al.
(2002) found resistance to TuMV and LMV in mutant lines
of Arabidopsis thaliana that did not express the eIF (iso)
4E gene, but these lines were not resistant to nepovirus
TBRV or cucumovirus CMV. While Nicaise et al. (2007)
found resistance to TuMV in A. thaliana line with double
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Las proteínas eIF4E forman parte de un complejo de inicio
de la traducción eIF4F (Marcotrigiano et al., 1999). Existe
un segundo complejo de isoformas llamado eIF (iso) 4F con
sus correspondientes eIF (iso) 4E y eIF (iso) 4G (Browning,
2004). Estos dos complejos realizan esencialmente la misma
tarea en traducción, pero tienen diferentes afinidades para
ciertas clases de ARN mensajeros y están probablemente
involucrados en diferentes eventos celulares (Gallie y
Browning, 2001). Se ha demostrado que los virus pueden
usar selectivamente las isoformas de ambos complejos
de traducción para completar exitosamente su ciclo de
infección (Sato et al., 2005). Por ejemplo, Duprat et al.
(2002) encontraron resistencia al TuMV y el LMV en líneas
mutantes de Arabidopsis thaliana que no expresaban el gen
eIF(iso)4E, pero estas mismas líneas no fueron resistentes
al nepovirus TBRV ni al cucumovirus CMV. Mientras que
Nicaise et al. (2007) encontraron resistencia al TuMV en
una línea de A. thaliana con doble mutación insercional que
eliminaba la expresión de los genes eIF(iso) 4G1 y eIF(iso)
4G2, sugiriendo así la necesidad de dichos factores en el
proceso de infección del virus. Además, la preferencia por
una forma específica de eIF4E puede cambiar con el tipo de
hospedero (Duprat et al., 2002).
Con respecto al BCMV Naderpour et al. (2010) demostraron
que la resistencia atribuida al gen bc-3 se relaciona con
mutaciones puntuales en cuatro nucleótidos posicionados en
los sitios159, 194, 227 y 332 de la secuencia del gen eIF4E de
P. vulgaris (PveIF4E), y que la resistencia a BCMV requiere
el estado homocigótico de estas mutaciones, por lo que el
gen bc-3 muy probablemente corresponde al gen PveIF4E.
Adicionalmente, la combinación del gen I con un heterocigoto
de bc-3, o con un homocigoto que carezca de estas mutaciones,
resulta en el desarrollo de necrosis apical o mosaicos severos
cuando se inocula con el patogrupo NL-3 del BCMNV (Hart
y Griffiths, 2012). Es por esto que en función a la presencia
o ausencia de estas mutaciones, el gen recesivo bc-3 podría
clasificarse en bc-31, bc-32 y bc-33 (Naderpour et al., 2010;
Hart y Griffiths, 2012), de los cuales sólo bc-32 confiere
resistencia a la cepa NL-3 de BCMNV, cuando se encuentra
en estado homocigótico (Hart y Griffiths, 2012).
Además de eIF4E existen otros factores del inicio de
la traducción, como proteínas reclutadoras, helicasas,
proteínas de unión a colas de poli A, y proteínas que facilitan
el reclutamiento a sitios de entrada directa al ribosoma
(IRES), que se requieren en diversas etapas de la traducción
(Cheng y Gallie, 2006; Huang et al., 2010; Parsyan et al.,
2011). Aparentemente el reclutamiento de eIF4E/iso4E
insertional mutation that eliminated the expression of eIF
(iso) 4G1 and eIF (iso) 4G2 genes, suggesting the need
for such factors in the process of infection of the virus.
Furthermore, the preference for a specific form of eIF4E can
change with the type of host (Duprat et al., 2002).
Regarding to BCMV, Naderpour et al. (2010) demonstrated
that resistance attributed to bc-3 gene is associated with
located mutations in four nucleotides positioned in sites159,
194, 227 and 332 of eIF4E gene sequence from P. vulgaris
(PveIF4E), and that resistance to BCMV requires the
homozygous state of these mutations, so bc-3 gene is likely to
correspond to PveIF4E gene. Additionally, the combination
of I gene with a heterozygote bc-3, or a homozygous lacking
these mutations, results in the development of apical necrosis
or severe mosaic when inoculated with NL-3 pathogroup of
BCMNV (Hart and Griffiths, 2012). That is why, in function
of the presence or absence of these mutations, the recessive
bc-3 gene could be classified into bc-31 bc-32 and bc-33
(Naderpour et al, 2010; Hart and Griffiths, 2012), of which
only bc-32 confers resistance to NL-3 strain of BCMNV,
when it is in homozygous state (Hart and Griffiths, 2012).
Besides eIF4E there are other factors from initiation of
translation, as recruiter proteins, helicases, binding proteins
to poly A tails, and proteins that facilitate the recruitment
to internal ribosome entry site (IRES), which are required
at various stages of translation (Cheng and Gallie, 2006;
Huang et al., 2010; Parsyan et al., 2011). Apparently the
recruitment of eIF4E/iso4E by virus including BCMV in
bean is through direct interaction with the binding protein
to the viral genome or VPg (Figure 1).
The physical interaction of VPg and eIF4E/iso4E correlates
with compatible infections in many plant-potyvirus
interactions (Gao et al., 2004; Charron et al., 2008). Therefore,
in some amino acid mutations within the sequence of eIF4E
gene, for example in pvr-1 or pvr-2 gene from pepper,
eliminates the interaction with VPg from PVY establishing
virus resistance (Charron et al., 2008). In contrast, variations
in VPg can counteract the resistance conferred by encoding
genes of modified forms of eIF4E/iso4E.
In many potyvirus isolations that break recessive gene
resistance the virulence factor is VPg (Duprat et al., 2002;
Charron et al., 2008; Gallois et al., 2010), and it is known
that many of VPg mutations are located in the central region
involved in the interaction with eIF4E (Roudet-Tavert et al.,
2007). This puts the interaction between VPg and eIF4E as
501Retos y oportunidades en la selección asistida de frijol resistente a BCMV y BCMNV en México. II. Oportunidades para la selección asistida
por el virus, incluido el BCMV en frijol, es a través de la
interacción directa con la proteína de unión al genoma viral
o VPg (Figura 1).
La interacción física de VPg y eIF4E/iso4E correlaciona
con infecciones compatibles en muchas interacciones
planta-potyvirus (Gao et al., 2004; Charron et al., 2008).
Por ello, mutaciones en algunos aminoácidos dentro de la
secuencia del gen eIF4E, por ejemplo en el gen pvr-1 o pvr-
2 de pimiento, eliminan la interacción con la VPg del PVY
estableciendo la resistencia al virus (Charron et al., 2008). En
contraparte, las variaciones en la VPg pueden contrarrestar
la resistencia conferida por los genes codificantes de formas
modificadas de eIF4E/iso4E.
En muchos aislamientos potyvirales que rompen la
resistencia de genes recesivos el determinante de virulencia
es la VPg (Duprat et al., 2002; Charron, et al., 2008; Gallois,
et al., 2010), y se sabe que muchas de las mutaciones de la
VPg están localizadas en la región central involucrada en la
interacción con eIF4E (Roudet-Tavert et al., 2007). Esto pone
a la interacción entre la VPg y el eIF4E como un determinante
clave de la virulencia o avirulencia en muchas, pero no en
todas, las infecciones por potyvirus, ya que hay diversos casos
reportados donde no encuentran interacción de la VPg con el
eIF4E o su isoforma, aún en plantas susceptibles. Un ejemplo
es en chícharo con el gen sbm1 en su forma susceptible y el
virus PSbMV (Gao et al., 2004), así como otros patosistemas
entre eIF4Es y diversas VPg reconocidas como virulentas o
aviruentas (Gallois et al., 2010).
Existen otros factores del complejo de traducción que
interactúan con la VPg, como son la proteína de unión a
cola de poli-A en A. thaliana (PABP2), donde se cree que
la interacción entre VPg, eIF4E y PABP2 puede promover
la circularización del RNA viral para facilitar la traducción
(Léonard et al., 2004). Como ya se había mencionado antes,
la VPg, también interactúa con eIF4G formando un complejo
trimolecular a través del intermediario eIF4E, que se piensa
favorece la traducción viral disminuyendo la afinidad por
los ARN mensajeros de la planta (Michon et al., 2006). Por
otra parte, la proteína tipo helicasa de RNA de A. thaliana
AtRH8 (la cual se relaciona con eIF4A), es necesaria para
la replicación de los potyvirus y es un interactor más de la
VPg como lo demostró Huang et al. (2010).
Igualmente, el factor de elongación 1 alfa (eEF-1A),
interacciona con la PVg y la RdRp viral (RNA polimerasa
dependiente de RNA viral) (Thivierge et al., 2008), por
a key determinant of virulence or avirulance in many, but
not in all, potyvirus infection, since there are many reported
cases where there is no interaction of VPg with eIF4E or its
isoform, even in susceptible plants. One example is in pea with
sbm1gene in its susceptible form and PSbMV virus (Gao et al.,
2004) thus other PathoSystems between eIF4Es and various
VPg recognized as virulent or avirulent (Gallois et al., 2010).
There are other factors from translation complex interacting
with VPg, such as protein binding of poly-A tail in A. thaliana
(PABP2), where it is believed that the interaction between
VPg, eIF4E and PABP2 can promote the circularization of
viral RNA to facilitate translation (Leonard et al., 2004). As
already mentioned, VPg, also interacts with eIF4G forming
Figura 1. Estrategia para el diseño de marcadores moleculares
tipo CAPS. A) Formación de complejos de traducción
viral con la participación del genoma viral, su
proteína VPg y las proteínas vegetales de inicio de la
traducción (4E y 4G) al interior de una célula vegetal;
B) Amplificación del complejo de traducción; C)
Diferencias en la secuencia de la proteína y el gen del
eIF4E entre una planta susceptible y una resistente;
D) Diseño de oligonucleótidos que se usan para la
generación de marcadores tipo CAPS; y E) Patrón
de digestión de los fragmentos amplificados de eIF4E
resistente y susceptible.
Figure 1. Strategy for the design of molecular markers CAPS
type; A) Formation of viral translation complexes with
the participation of viral genome, its VPg protein and
vegetable protein of initiation of translation (4E and
4G) into a plant cell; B) Amplification of translation
complex; C) Differences in protein sequence and
eIF4E gene between a susceptible and resistant plant;
D) Design of oligonucleotides used to generate CAPS
markers; and E) Digestion pattern of the amplified
fragments of eIF4E resistant and susceptible.
502 Rev. Mex. Cienc. Agríc. Vol.6 Núm.3 01 de abril - 15 de mayo, 2015 José Luis Anaya-López et al.
lo que podría estar implicada también en la replicación del
genoma viral. Pero la VPg no sólo interacciona con proteínas
del complejo de la traducción, se sabe que también puede
interactuar con una proteína rica en cisteína de A. thaliana
designada como PVIP e implicada en el movimiento del
virus en la planta. Esta interacción se da cerca de la región
N-terminal de la VPg, que es distinta de la región asociada
con el eIF4E (Dunoyer et al., 2004). Otra proteína que se sabe
interacciona con VPg es la proteína nucleolar Fibrillarina, la
cual se demostró que también se requiere para el movimiento
a larga distancia en las plantas hospederas (Rajamaki et
al., 2009). Paradójicamente la proteína eIF (iso) 4E de A.
thaliana también se ha involucrado en el movimiento a larga
distancia del TEV (Contreras-Paredes et al., 2013). Esto, si
bien interesante, hace más compleja la participación de los
factores de inicio de la traducción de la célula hospedera.
Puesto que durante el proceso de replicación el ARN de los
potyvirus requiere circularizarse por yuxtaposición de sus
extremos 3’ y 5’ de manera similar a los ARNm celulares,
la proteína de unión al extremo 3´no traducible que se une
al segmento de poli A o PABP y en consecuencia, su gene
codificante, es un potencial de resistencia recesivos a los
potyvirus y merece ser investigado (Thivierge et al., 2005).
Oportunidades para la selección asistida de frijol
resistente a BCMV y BCMNV
El gen I se localiza en el cromosoma B2 (Kelly et al., 2003)
y es independiente de la resistencia recesiva condicionada
principalmente por tres diferentes genes bc: bc-3, bc-12y
bc-22. El gen bc-3 se localiza en B6 (Mukeshimana et al.,
2005), mientras que bc-12 (Miklas et al., 2000a) y el alelo
no específico bc-u, necesario para la resistencia de bc-22, se
encuentran en B3 (Strausbaugh et al., 1999). La combinación
de genes dominantes y recesivos, con diferentes mecanismos
de resistencia, ofrece una mayor durabilidad que cuando se
usa un solo gen; además, debido a que algunos de estos genes
residen en distintos grupos de ligamiento, su piramidación
es una estrategia aplicable a los programas de mejoramiento
genético de frijol (Kelly et al., 2003).
La resistencia conferida únicamente por el gen I se rompe
al confrontarse con todas las cepas necróticas (TN-1, NL-3,
NL-5 y NL-8) y con las cepas NL2 y NL6 de BCMV (Morales
y Castaño, 2008). Sin embargo, la respuesta hipersensible se
disminuye o elimina al piramidarse con los genes recesivos,
principalmente con bc-3. Cuando se trata de incorporar el gen
bc-3 en un genotipo con el gen I mediante selección directa
a trimolecular complex via the intermediary eIF4E, thought
promotes viral translation, decreasing the affinity of plant
mRNAs (Michon et al., 2006). Moreover, RNA helicase
from A. thaliana AtRH8 (which relates with eIF4A), is
required for the replication of potyvirus and is a VPg
interactor as demonstrated by Huang et al. (2010).
Similarly, the elongation factor 1 alpha (eEF-1A), interacts
with PVg and RdRp (RNA polymerase dependent of
viral RNA) (Thivierge et al., 2008), which might be also
involved in the replication of viral genome. But VPg not
only interacts with proteins from the translation complex,
it is known that can interact with cysteine-rich protein
of A. thaliana designated as PVIP and involved in the
movement of the virus in the plant. This interaction occurs
near the N-terminal region of VPg, which is different from
the region associated with eIF4E (Dunoyer et al., 2004).
Another protein known to interact with VPg is the nucleolar
protein fibrillarin, which was proven to be also required
for long distance movement in host plants (Rajamaki et al.,
2009). Paradoxically, eIF (iso) 4E protein of A. thaliana
has also been involved in long distance movement of TEV
(Contreras-Paredes et al., 2013). This, although interesting,
makes more complicate the factors involved in initiation
of translation of the host cell.
During RNA replication process of potyvirus requires to
circularize by juxtaposing their 3 'and 5' ends in a similar
manner to cellular mRNA, the binding protein to 3' end
no translatable that binds to poly A or PABP segment and
therefore its encoding gene, is a potential recessive resistance
to potyvirus and deserves to be investigated (Thivierge et
al., 2005).
Opportunities for assisted selection of resistant bean to
BCMV and BCMNV
I gene is located in chromosome B2 (Kelly et al., 2003) and
is independent of recessive resistance mainly conditioned
by three different bc genes: bc-3, bc-12 and bc-22; bc-3
gene is located in B6 (Mukeshimana et al., 2005), whereas
bc-12 (Miklas et al., 2000a) and non-specific allele bc-u,
necessary for resistance of bc-22, is in B3 (Strausbaugh et al.,
1999). The combination of dominant and recessive genes,
with different mechanisms of resistance, provides greater
durability than when a single gene is used; also because
some of these genes reside on different linkage groups,
its pyramiding is a strategy applicable to bean breeding
programs (Kelly et al., 2003).
503Retos y oportunidades en la selección asistida de frijol resistente a BCMV y BCMNV en México. II. Oportunidades para la selección asistida
por confrontación con el virus, se corre el riesgo de perder
este último, debido a que la acción del gen bc-3 enmascara la
del gen I (Miklas et al., 2006). En este sentido la aplicación
de los marcadores moleculares ofrece la oportunidad para
mantener y seguir utilizando el potencial del gen I como un
gen de resistencia en futuras variedades de frijol.
Hasta hace muy poco todos los marcadores moleculares
de resistencia a BCMV y BCMNV, correspondían a
marcadores que no permitían determinar el carácter
homocigótico del gen. Esta es una limitante importante
debido a que los marcadores ligados pueden seleccionar
individuos con el marcador pero sin la resistencia, debido
en parte a que el gen bc-3 no se encuentra en forma
homocigótica, una característica que ha demostrado
ser necesaria en la selección de resistencia efectiva
(Naderpour et al., 2010; Hart y Griffiths, 2012). Además,
en comparación con un marcador codominante diseñado
sobre la secuencia de un gen específico, la confirmación
requiere más tiempo.
El Programa de Mejoramiento de Frijol del INIFAP ha
usado los marcadores exitentes SW13 para el gen I (Haley
et al., 1994; Melotto et al., 1996), y ROC11 para bc-3
(Johnson et al., 1997). En el caso del marcador SW13,
que se encuentra a ~5 cM del gen I, se pueden obtener
recombinantes que poseen el marcador pero carecen del
gen. Sin embargo, la coincidencia entre la presencia del
amplicón del gen I y la resistencia fue 92.4% (Vandemark y
Miklas, 2005), valor aceptable cuando se estudian grandes
poblaciones, el restante 7.6% pudo deberse a la ausencia
del gen o al efecto de la dominancia parcial. Por lo tanto,
este marcador es una excelente herramienta para trabajar
en condiciones de campo con cientos o miles de plantas, en
donde la confrontación con el virus se produce de manera
natural.
Por su parte, los marcadores codominantes que se encuentran
dentro de la secuencia del gen son capaces de distinguir
desde la primera generación filial (F1), e incrementan la
eficiencia de la SAMM, ya que pueden distinguir el estado
homocigótico del gen (Miklas et al., 2006). Actualmente
sólo existe un marcador codominante que probablemente
corresponde al gen bc-3 (Naderpour et al., 2010), el cual
se diseñó una vez que se identificó molecularmente al gen
responsable de la resistencia que codifica para eIF4E. Sin
embargo, este marcador identifica los alelos bc-32 y bc-33
y por ser de tipo CAPS requiere el corte de restricción del
producto de PCR con la enzima RsaI.
The resistance conferred only by I gene breaks when
confronted with all necrotic strains (TN-1, NL-3, NL-5 and
NL-8) and with NL2 and NL6 strains of BCMV (Morales
and Castaño, 2008). However, the hypersensitive response
is reduced or eliminated when pyramiding with recessive
genes, mainly with bc-3. When it comes to incorporating
the bc-3 gene in a genotype with I gene through direct
selection by confrontation with the virus, there is the risk of
losing the latter, because the action of bc-3 gene masks the
I gene (Miklas et al., 2006). In this sense the application of
molecular markers provides the opportunity to maintain and
continue to use the potential of I gene as a resistance gene
in future bean varieties.
Until very recently all molecular markers of resistance to
BCMV and BCMNV corresponded to markers that did not
allow determining the homozygous nature of the gene. This
is an important limitation because linkage marker can select
individuals with markers but without resistance, in part due
to the bc-3 gene is not in homozygous form, a characteristic
that has proven necessary in the selection of effective
resistance (Naderpour et al., 2010; Hart and Griffiths,
2012). Furthermore, compared with a codominant marker
designed on the sequence of a specific gene, confirmation
requires more time.
The Bean Breeding Program from INIFAP has used the
existing SW13 markers for I gene (Haley et al., 1994;
Melotto et al., 1996) and ROC11 for bc-3 (Johnson et al.,
1997). In the case of SW13, which is located at ~ 5 cM
from I gene, can be obtained recombinants that possess
the marker but lack the gene. However, the coincidence
between the presence of the amplicon from I gene and
resistance was 92.4% (Vandemark and Miklas, 2005),
acceptable value when large populations are studied, the
remaining 7.6% could be due to the absence of the gene or
to the effect of partial dominance. Therefore, this marker
is an excellent tool to work under field conditions with
hundreds or thousands of plants, where the confrontation
with the virus occurs naturally.
Meanwhile, codominant markers found within gene
sequence are able to distinguish from the first filial generation
(F1), and increase the efficiency of MAS, since they can
distinguish the homozygous state of the gene (Miklas et
al., 2006). Currently there is only a codominant marker that
probably corresponds to bc-3 gene (Naderpour et al., 2010),
which was designed once the gene responsible of resistance
that encodes for eIF4E was molecularly identified. However,
504 Rev. Mex. Cienc. Agríc. Vol.6 Núm.3 01 de abril - 15 de mayo, 2015 José Luis Anaya-López et al.
Adicionalmente, el uso de tecnologías como High
Resolution Melting (HRM), para amplificar y monitorear
en tiempo real cambios puntuales alrededor de los sitios de
restricción enzimática, podría hacer más rápida la detección
de individuos homocigotos posibilitando el análisis de
poblaciones mayores. Por lo tanto el desarrollo de marcadores
a partir del conocimiento de genes de resistencia es una
opción viable en los programas de fitomejoramiento. En este
sentido, tecnologías de reciente desarrollo como las ómicas,
la genotipificación por SNPs o HRM, la secuenciación
masiva del genoma y el transcriptoma, así como el análisis
de expresión genética por qPCR, contribuirán a acelerar el
proceso de identificación de nuevos marcadores ligados a un
fenotipo específico de resistencia, ya sea que se encuentren
adyacentes al gen o dentro de su secuencia. Desde luego, el
conocimiento de las interacciones de las proteínas virales
con las hospederas es el factor determinante en la propuesta
de genes candidatos de resistencia viral. Este conocimiento
aunado a la implementación de estas tecnologías podría
crear programas de producción de semillas libres de virus en
todas las regiones productoras, con el uso de metodologías
rápidas, precisas y de costo accesible.
El uso de los marcadores disponibles, de manera paralela
al desarrollo de nuevos marcadores, es una estrategia que
puede acelerar y hacer más eficiente el fitomejoramiento. La
variedad de frijol Dalia se obtuvo a partir de líneas avanzadas,
y fue seleccionada para resistencia a BCMV mediante el uso
de los marcadores moleculares SW13 y ROC11 (Acosta-
Gallegos et al., 2012) en cuatro ciclos de cultivo.
Aunque el Programa de Mejoramiento de Frijol del INIFAP
es quizá el primero en utilizar técnicas biotecnológicas
para el mejoramiento de frijol en México, recientemente
ha estrechado su colaboración con instituciones de distintas
disciplinas como el CINVESTAV y el CIAT para la búsqueda
de genes candidatos de resistencia. Este tipo de interacciones
favorece la obtención de mayor número de productos de
investigación en forma de variedades mejoradas en un
corto tiempo, para incrementar la eficiencia en atención a
las principales demandas del país.
Conclusiones
Para enfrentar la problemática actual y futura del cultivo
de frijol en México se requiere usar tecnologías que hagan
más eficientes los programas de mejoramiento en uso.
this marker identifies the bc-32 and bc-33 alleles and for
being CAPS type requires the restriction cutting with RsaI
enzyme of the PCR product.
Additionally, the use of technologies such as High
Resolution Melting (HRM), to amplify and for real-time
monitoring specific changes around the restriction enzyme
sites could make the detection of homozygous individuals
faster, making possible to analyze larger populations.
Therefore the development of markers from knowledge of
resistance genes is a viable option in breeding programs.
In this sense, technologies recently developed as omics,
genotyping by SNPs or HRM, massive genome sequencing
and transcriptome, and analysis of gene expression by qPCR,
will contribute to accelerate the identification of new linkage
markers to a specific phenotype of resistance, whether they
are adjacent to the gene or within the sequence. Of course,
knowledge of the interactions of viral proteins with host is the
determining factor in the proposal of candidate genes for viral
resistance. This knowledge coupled with the implementation
of these technologies could create production programs of
virus free seed in all producing regions, with the use of fast,
accurate and affordable methodologies.
The use of available markers, in parallel to the development
of new markers way, is a strategy that can accelerate and
streamline breeding. Dalia bean variety was obtained from
advanced lines, and was selected for resistance to BCMV
using molecular markers SW13 and ROC11 (Acosta-
Gallegos et al., 2012) in four crop cycles.
Although Bean Breeding Program from INIFAP is perhaps
the first to use biotechnology techniques to improve beans
in Mexico, recently has strengthened its collaboration with
institutions from different disciplines such as CINVESTAV
and CIAT to search for candidate resistance genes. This
type of interaction favors the obtaining a greater number
of research products as improved varieties in a short time,
to increase efficiency in response to the main demands of
the country.
Conclusions
To address the current and future situation of bean cultivation
in Mexico is necessary to use technologies that streamline
breeding programs. To generate bean varieties resistant
to BCMV and BCMNV through MAS is required to
505Retos y oportunidades en la selección asistida de frijol resistente a BCMV y BCMNV en México. II. Oportunidades para la selección asistida
Para generar variedades de frijol con resistencia a BCMV
y BCMNV mediante SAMM se requiere desarrollar
marcadores moleculares más eficientes que permitan la
introducción de resistencia genética al mayor número de
patogrupos posible. En este sentido, el conocimiento de
los mecanismos de replicación viral y de la variedad de los
componentes de la célula hospedera necesarios para llevar
a cabo dicha replicación, permitirá determinar los genes
importantes para el desarrollo de marcadores moleculares de
interés en la resistencia a BCMV y BCMNV. La contraparte
viral a partir del conocimiento de la diversidad de demás
especies y patogrupos también será indispensable para
vislumbrar estrategias de resistencia de amplio espectro.
El estado actual del conocimiento científico, así como el
desarrollo de nuevas tecnologías para el estudio de ácidos
nucléicos y proteínas, se encuentra en un estado tal que ya
es posible llevar a cabo la identificación eficiente de genes
y marcadores a partir de germoplasma con características de
interés, en función a su resistencia a virus y aceptación por
el consumidor. Para esto es necesario conjuntar esfuerzos
de investigación en las áreas básica y aplicada de manera
interdisciplinaria e interinstitucional, aprovechando las
fortalezas de cada institución.
Agradecimientos
Al Fondo sectorial SAGARPA-CONACYT por apoyo
al proyecto (Folio SIFP: 11-2008-0593) “Desarrollo de
variedades de frijol de alto rendimiento, tolerantes a sequía,
resistentes a patógenos y con la calidad que demanda el
consumidor” (SAGARPA-2009-109621), y al proyecto
"Identificación de virus que afectan la producción de frijol
y desarrollo de marcadores moleculares para la selección
asistida de variedades resistentes" apoyado con recursos
fiscales y con número SIGI: 10242732533.
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develop more efficient molecular markers that allow the
introduction of genetic resistance to as many pathogroups
possible. In this sense, knowledge of the mechanisms of
viral replication and variety of the components of host cell
needed to carry out such replication will allow to determine
important genes for the development of molecular markers
of interest in resistance to BCMV and BCMNV. The viral
counterpart from knowledge of the diversity of other species
and pathogroups is also essential to envision strategies for
broad-spectrum resistance.
The current state of scientific knowledge and the development
of new technologies for the study of nucleic acids and proteins
is in such a state that it is possible to carry out an efficient
identification of genes and markers from germplasm
characteristics of interest, based on their resistance to viruses
and consumer acceptance. It is necessary to join efforts to
do research in basic and applied areas of interdisciplinary
and interagency to take advantage of the strengths of each
institution.
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