BIOLOGICAL SAMPLE COLLECTION AND

PROCESSING FOR MOLECULAR EPIDEMIOLOGICAL STUDIES

Holland N., Smith M., Eskenazi B. y Bastaki M.School of Public Health, University of California, USA.

Mutation Research 543 (2003) 217-234.

BIOBANCO DE TEJIDOS Y FLUÍDOS DE LA

UNIVERSIDAD DE CHILE

Introducción

Epidemiología

+ Biología

Molecular

Epidemiología Molecular

• Métodos de la epidemiologia tradicional.

• Conocimiento de eventos moleculares que se

desarrollan en la enfermedad.Biomarcadores Describen los eventos moleculares característicos de varios

estadios entre la exposición al agente patogénico y el desarrollo de la enfermedad.

Susceptibilidad FACTORES GENÉTICOS

FACTORES AMBIENTALES

Introducción ¿ QÚE AVANCES HA PERMITIDO EL

DESARROLLO DE LA EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR?

Conocimiento sobre mecanismos de toxicidad.

Evaluar causalidad entre riesgos específicos y efectos biológicos.

Evaluar con mayor precisión el riesgo de exposición a factores específicos.

Diferenciar entre grupos de alta y baja susceptibilidad.

Entregar soporte científico sólido en la implementación de estrategias de intervención.

Introducción Desarrollo continuo de nuevas herramientas

en el campo de la bioquímica y biología celular y molecular deben ser consideradas

en el diseño de estudios y sus procedimientos.

• Preparación de las muestras• Preservación de las muestras

•Almacenamiento de las muestras

Disposiciones a considerar en estudios epidemiológicos y de monitoreo

IMPORTANCIA DE LA CREACIÓN DE COLECCIONES BIOLÓGICAS Y BIOBANCOS.

Propósito Discutir los cambios y potenciales obstáculos de la colección de

muestras, procesamiento y creación de Biobancos.

Discutir los factores que afectan la calidad de las muestras.

Discutir el potencial uso de las muestras biológicas a largo plazo.

Discutir consideraciones durante la colección, procesamiento y Almacenamiento de las muestras.

Desafíos de la Epidemiología Molecular

Figura 1: Esquema de la estructura de estudios de epidemiología molecular o de biomarcadores, 2 definiciones utilizadas como sinónimos.

Desafíos de la Epidemiología Molecular

Obtener una gran cantidad de información de un número de

muestras limitado.

Tener consideraciones para la evaluación de futuros biomarcadores.

Maximizar la información que puede ser obtenida de las muestras almacenadas con el objetivo de

minimizar los costos de investigaciones.

Diseño del estudio Identificar el tipo de muestra que es necesario colectar

dependiendo de la herramienta molecular que se desea implementar.

Los nuevos avances moleculares requieren de colecciones de

muestras y procesamientos de éstas más estrictos. Ejemplo: Para estudiar la exposición a formaldehido por inhalación se debe colectar células exfoliadas

de la nariz o boca.

Diseño del estudio

Definir biomarcadores a estudiar.

Dependiendo de los biomarcadores potenciales a estudiar se definirá :

• Tipo de muestra a colectar y almacenar.• Condición de toma de muestra.

• Tiempo y condiciones de almacenamiento.• Transporte de las muestras.

• Procesamiento de las muestras.

Consentimiento Informado • Normas éticas y legales.

•Informar a donantes sobre el futuro uso de las muestras. • Entrenamiento y certificación.

Colección de muestra Interacción entre los sujetos estudiados, personal a cargo y

los investigadores.Comunicación clara (Creación de protocolos).

Personal apropiado para colecciones de muestras especiales.

Reducción de dificultades prácticas en colección de muestras.

Campañas de información a sujetos.

Colección de muestra Métodos no invasivos para colección de la

muestra

Evaluar cuál es el método de colección menos invasivo para cumplir el objetivo deseado.

Minimizar la cantidad de muestra necesaria.

Métodos menos invasivos incrementa el número de individuos dispuestos a ser donantes.

Considerar en caso de dificultades geográficas.

Colección de muestra Selección de tiempo optimo para colección de

muestra Variaciones en niveles de biomarcadores• Variación durante el día

Ej.: Variación de metabolitos en orina.

• Múltiples tomas de muestraEj.: Evaluación de niveles de mercurio en

mujeres.

• Seleccionar el momento preciso de la toma de muestra.

Ej.: Enfermedades en que la variación del biomarcador es en un lapso de tiempo corto y otras en que la toma de muestra debe ser con

mucha antelación.

Colección de muestra Estabilidad de las muestras

Factores que afectan la estabilidad• Anticoagulantes : Seleccionar dependiendo del

propósito analítico de la muestra.

Ej.: EDTA óptimo para ensayos con ADN Citrato sódico alto rendimiento en cultivo linfocitario,

ADN y ARN.Heparina altera la proliferación linfocitaria y se une a

proteínas.

• Agentes estabilizantes: Muchos biomarcadores son lábiles y será necesario seleccionar el agente

estabilizante indicado que no interfiera en análisis posteriores.

Ej.: EDTA y ácido ascórbico son estabilizadores para folatos en sangre.

Colección de muestra Estabilidad de las muestras

Factores que afectan la estabilidad• Tiempo pre-procesamiento: Dependiente de el

componente de la muestra que nos interese mantener estable.

Ej.: Alta viabilidad celular dentro de 24-48 horas de sangre, células bucales y orina.

Hay biomarcadores que pese a la presencia de agentes estabilizantes son afectados en tiempos largos (24

horas).

Necesario considerar en algunos casos el tiempo de transporte ya que hay biomarcadores que debiesen ser

excluidos.

Colección de muestra Estabilidad de las muestras

Factores que afectan la estabilidad• Temperatura: Puede afectar la estabilidad en el

tiempo entre la toma de muestra y procesamiento y durante cortos o largos tiempos de almacenamiento.

La temperatura depende del biomarcador estudiado.

Idealmente la muestra debe ser separada en sus componentes para almacenar bajo condiciones

indicadas.

Se debe controlar la temperatura en cada punto del flujograma.

Evitar ciclos de congelamiento y descongelamiento no necesarios.

Colección de muestra Estabilidad de las muestras

Factores que afectan la estabilidad• Esterilidad: Esencial para extracción de ADN, ARN y

cultivo celular.

Contaminación puede introducir nuevos productos y metabólitos en las muestras.

• Degradación: Degradación enzimática puede afectar a biomarcadores (Proteínas, ADN, ARN…).

Sustancias y condiciones que permiten evitar procesos de degradación.

Colección de muestra Contenedores/equipamiento

El tamaño y característica del recipiente depende de:

Tipo de muestra Volumen a colectar

Medio de transporte a laboratorio Costo

Condiciones de almacenamiento Eficiencia

Tipo de análisis La característica del contenedor de

almacenamiento final tiene gran importancia.

Colección de muestra Seguridad

Tejidos humanos son potencialmente infecciosos y generalmente no se realizan perfiles patogénicos para evaluar el riesgo de cada muestra colectada.

Entrenamiento para personal encargado de procesamiento, transporte, colecta,

almacenamiento… Protección a personal para evitar su contaminación

y la de las muestras colectadas.

Colección de muestra Envío

Debe existir conciencia del riesgo potencial durante el transporte de material biológico no solo

para el personal sino que para el publico en general.

Regulación sobre el empaque, etiquetas y documentación asociada al envío de

material biológico. Entrenamiento a personal a cargo sugerido

cada dos años.

Colección de muestra Manejo de documentos

Documento debe contener:Detalles de la colecta

FechaNúmero de muestra

Tipo de muestraVolumen

Información de envío/transporteInformación sobre la cadena de frioInformación de personal a cargo

Regulación de confidencialidad.Sistema de código de barras/ sistemas de bases de

datos electrónicas. Almacenamiento seguro de documentos.

Colección de muestra Estricta adherencia a protocolos

Procedimientos operativos estándar (POEs).

Figura 2: Representación esquemática de procesamiento de muestras de sangre coagulada y heparinizada .

Colección de muestra Estricta adherencia a protocolos

Figura 3: Representación esquemática del procesamiento de células exfoliativas de epitelio bucal y urinario.

Colección de muestra Estricta adherencia a protocolos

Figura 4: Procesamiento de extracción de ADN/ARN a partir de muestras de sangre .

Colección de muestra Estricta adherencia a protocolos

Procesamiento de muestrasDependiendo el origen de la muestra biológica

colectada el procesamiento puede permitir la obtención de una variedad de bioespecímenes.

Distintos tipos de procesamientos.

Procesamiento efectivo permite la obtención de :Extracción de gran cantidad de ADN

Almacenamiento de ARN de alta calidadADN de células bucales para genotipificación

Obtención de componente linfocitarioPreparación de placas metafásicas

Criopreservación de linfocitos para cultivo celularPreparación de frotis de células exfoliativas bucales y

urinarias

Procesamiento de muestrasEl tipo de muestra a almacenar determina el tipo de

buffer y condiciones de almacenamiento determinadas.Ej.: β - Mercaptoetanol para alícuotas de ARN

Determinar volumen de almacenamiento para evitar ciclos de congelación/descongelación.

Procesamiento de muestras Criopreservación de células aisladas

recientemente Sangre completa puede ser crio preservada en igual proporción de suero fetal bovino y DMSO.

Criopreservación de componente linfocitario en PBS/DMSO.

Almacenamiento en nitrógeno líquido (-196° C).

Procesamiento de muestras Preparación de células para análisis

citogenético

Células en interfase suelen ser necesarias la mayor parte

de las veces. Ej.: Análisis de Micronúcleos

Metafases son necesarias para la visualización de aberraciones cromosómicas, hibridación in situ, etc.

Cultivo Celular: Sangre completa o Linfocitos.Mitógenos: Concavalina, PHA, Interleuquinas, etc.

Inhibidores de la mitosis: Colcemid, Colchicina, etc.

Procesamiento de muestras Preparación de células exfoliativas de

epitelio bucal y urinario.

Las células pueden ser lavadas con buffer Tris-HCL/EDTA para realizar frotis celulares.

Frotis celulares pueden ser almacenados a -80 gradosCelsius y ser utilizados como recurso para la extracción de ADN.

Procesamiento de muestras ADN y ARN de alta calidad

Factores que afectan la calidad de la extracción de ácidos nucleicos: Calidad de la muestra original

Calidad de la extracción y el método usadoCondiciones de almacenamiento

Compromiso de la integridad celularObtención de múltiples alícuotas

La estabilidad del ADN es mucho mayor que la del ARN.Kit de extracción de ADN y ARN .

Método de extracción Fenol/Cloroformo de ADN .

Biobancos Existe una necesidad ya que hay millones de muestras

colectadas para estudios epidemiológicos almacenadas

que luego no son reutilizadas.

Se necesita realizar adecuados procesamientos, almacenamientos,

etiquetamiento y un sistema de manejo de información de muestras

y sujetos es esencial.

El sistema electrónico de manejo de datos debe estar apoyado por

un sistema de código de barras eficiente y adecuado.

Biobancos Características de un sistema de base de datos:

Flexibilidad ante diferentes protocolos de procesamientoApoyo a distintos niveles de usuarios de biobanco

Diseño amistoso para usuarios Código de barras para reconocimiento automático

Sistema de ingreso de datos rápido y a prueba de erroresImpresión de etiquetas automatizado

Generación de respaldos semanales de la base de datos

Análisis de muestras

Tabla 2: Distintos tipos de análisis que pueden ser realizado a partir de muestras especificas.

Dar valor a las muestras almacenadas disminuyendo la cantidad de muestra empleada por análisis y maximizando su uso.