Molecular Biology Seminary

Maria Alejandra López LoperaÉrika Marcela Martínez Pardo

Medicine students3° semester

U.P.B

A Novel PTEN/Mutant p53/c-Myc/Bcl-XL Axis Mediates

Context-Dependent OncogenicEffects of PTEN with

Implications for CancerPrognosis and Therapy

Xiaoping Huang, Ying Zhang,Yaqiong Tang, Napoleon Butler,Jungeun Kim, Fadila Guessous,

David Schiff, James Mandelland Roger Abounader.

INTRODUCTIONINTRODUCTIONINTRODUCTIONINTRODUCTION

INTRODUCTIONINTRODUCTIONGene mutationGene mutation

Altered protein expression Altered protein expression

Disturbances in the cell division

Disturbances in the cell division

Reduction of apoptosis

Reduction of apoptosis

CANCERCANCER

INTRODUCTIONINTRODUCTIONGENES RESPONSIBLE FOR

CANCERGENES RESPONSIBLE FOR

CANCER

INTRODUCTIONINTRODUCTION

Oncogenic effects on glioblastoma

cells

Oncogenic effects on glioblastoma

cells

p53 MUTATIONp53 MUTATION PTEN(Phosphatase and tensin homolog)

PTEN(Phosphatase and tensin homolog)

INTRODUCTIONINTRODUCTION

p53p53 Tumor suppresor Tumor suppresor Stop the cell

cycle in the G1/S checkpoint

Stop the cell cycle in the G1/S

checkpointApoptosisApoptosis

INTRODUCTIONINTRODUCTION

INTRODUCTIONINTRODUCTION

INTRODUCTIONINTRODUCTION

MATERIALES Y MATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS

MATERIALES Y MATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS

MATERIALES Y MATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS

Células Células

Células glioblastomas

Células glioblastomas

U373SNB19

U87LNZ308

293TGBM6

Muestras de tumoresMuestras de tumores

Pacientes con glioblastomasPacientes con glioblastomas

Infectadas con p53

MATERIALES Y MATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS

Silenciamiento de gen con lentivirus shRNA

Silenciamiento de gen con lentivirus shRNA

LentivirusLentivirus

Virus con periodos de incubación

muy altos.

Permiten el paso de ARN a ADN integrándolo al genoma

huésped y replicándolo junto con él.

shRNAshRNA

Horquilla corta de RNA

Inhibición estable o transitoria del

gen diana

MATERIALES Y MATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS

Plásmido

Células 293T

FuGene6

Selección con

puromicina

Traducción

MATERIALES Y MATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS

Adenovirus e infecciónAdenovirus e infección

AdenovirusAdenovirus

Virus que tienen ADN como material

genético.

Se utilizan como vehículos para

administrar genes en el tratamiento

del cáncer

Adenovirus mut-p53 (R273H)Adenovirus mut-p53 (R273H)

MOI:10

Verificación de la expresión de PTEN y mut-p53

Verificación de la expresión de PTEN y mut-p53

Análisis con inmunoblot

MATERIALES Y MATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS

Análisis inmunoblotAnálisis inmunoblot

Primer paso Separación de proteínas mediante electroforesis en gel

Segundo paso Transferencia de proteínas a una membrana adsorbente.

Tercer paso Detección de la unión antígeno anticuerpo con fluorescencia.

MATERIALES Y MATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS

Ensayo de proliferación celularEnsayo de proliferación celular

Con MTSCon MTS Complejo de sal de tetrazolio, ensayo colorimétrico, medición actividad enzimática

Cálculo de célulasCálculo de células

Con CellTiter96 AQ, kit de proliferación celular

Hemocitómetro

MATERIALES Y MATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOSEnsayo de apoptosisEnsayo de apoptosis

Medición citoplasmática de histona asociada

a fragmentos del ADN

Kit Elisa

Degradación de internucleosomas

Detección de histonas por anticuerpos

acoplados a enzimas

Liberación al medio de nucleosomas por células

en apoptosis.

MATERIALES Y MATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS

Ensayo de invasión celularEnsayo de invasión celular

células puestas en cámara superior con

recubierta de membrana de colágeno

IV.

10 porciento de FBS fue colocado en cámara

baja Incubación toda la noche.

Células que migraron a la parte inferior fijadas teñidas y contadas bajo

un microscopio.

MATERIALES Y MATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS

Colágeno tipo IV

Componente de la membrana basal

Afectada en carcinomas invasivosPrimer paso de la

invasión tumoral

Primer paso de la invasión tumoral

Pérdida de la membrana

basal

• Descenso de la síntesis• Ensamblaje disminuido

de la componente.• Aumentos de la

destrucción por proteasas producidas por el tumor.

Marcador sello de la invasión

Clones de la células fijados y teñidos

MATERIALES Y MATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS

Ensayo de formación de coloniasEnsayo de formación de colonias

Sembrado de células en 10% FBS

Tres semanasTres semanas

Sln 0.5% violeta cristal y 25% de

metanol

MATERIALES Y MATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS

Análisis inmunoblotAnálisis inmunoblot

Lisis celular

Determinación de la concentración de proteínas

por el reactivo de ensayo Coomassie Plus

Análisis inmunoblot

Manchas seleccionadas sometidas a

densitometría

MATERIALES Y MATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS

Precipitación inmunológicaPrecipitación inmunológica

Células lisadas fueron encubadas con anticuerpo

primario seguido de incubación con Proteína A

agarosa.

Sometidas a altas temperaturas con tampón de

sodio duodecil sulfato

Transferencia a nitrocelulosa

Incubación con anticuerpo secundario HRP

Señales detectadas con quimioluminiscencia

MATERIALES Y MATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS

InmunodepresiónInmunodepresión

(Para remover molécula de una muestra)

Inmunodepresión de proteínas con anticuerpos

anti-p53/anti-NFYA

Inmunoprecipitación de sobrenadantes con

anticuerpo anti-NFYA/anti-p53.

Análisis de inmunoblot con anticuerpo anti-CBP.

MATERIALES Y MATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS

Detección de complejo de proteínas con análisis Native PAGE

Detección de complejo de proteínas con análisis Native PAGE

Células U373 infectadas con adenovirus PTEN codificado (ad-PTEN).

2-3 días2-3 días

Células lisadas preparadas en una muestra tampón sin SDS

Puestas en PAGE en tampón Tris-glicina sin SDS.

Transferencia de proteínas del PAGE a membranas nitrocelulosa con

anticuerpo primario.

Análisis Western blot

MATERIALES Y MATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS

IP cromatinaIP cromatina

Lisis del complejo DNA/proteína y puesto en vórtex para liberación de DNA

Corte de ADN a 37°C con mezcla de enzimas provistas por un kit

Centrifugación de lisados

Complejo proteína-DNA recogido con granos de proteína A o G agarosa y entrecruzado por calentamiento a 65°C.

Una nocheUna noche

Purificación de DNA con kit

QIAQuick

Análisis de reacción en cadena de polimerasa con primers específicos para la región

promotora de c-Myc

MATERIALES Y MATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS

Inmunohistoquimica e inmunofluorescenciaInmunohistoquimica e inmunofluorescencia

(Determina los niveles de PTEN en tejidos humanos)

Localización de mut-p53, CBP o NFYA determinado por inmunofluorescencia.

Incubación de células con anticuerpos relevantes.

Incubación con isotiocianato de fluoresceína o anticuerpos secundarios conjugados.

MATERIALES Y MATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS

Secuencia de exones p53Secuencia de exones p53

Análisis de las mutaciones de p53 mediante secuencia de DNA

Extracción de ADN

Amplificación de los exones de p53 por reacción en cadena de polimerasa.

Identificación y comparación de las secuencias resultantes con las secuencias en wt-p53

RESULTADORESULTADOSS

RESULTADORESULTADOSS

CrecimientoInvasión

CrecimientoInvasión

R273HU373 SNB19

ApoptosisApoptosis

MEDIACION DE PTEN POR MEDIACION DE PTEN POR mutP53mutP53

MEDIACION DE PTEN POR MEDIACION DE PTEN POR mutP53mutP53

mut-P53 y adPTEN:mut-P53 y adPTEN:mut-P53 y adPTEN:mut-P53 y adPTEN: Sh-mutP53 y adPTENSh-mutP53 y adPTENSh-mutP53 y adPTENSh-mutP53 y adPTENSh-RNASh-RNA

INVERSO

Mut-P53 regula Mut-P53 regula los efectos los efectos

oncogénicos de oncogénicos de PTENPTEN

Mut-P53 regula Mut-P53 regula los efectos los efectos

oncogénicos de oncogénicos de PTENPTEN

CONCLUSIÓNCONCLUSIÓNCONCLUSIÓNCONCLUSIÓN

SNB19

U373

Ad-PTENAd-PTEN

INFLUENCIA DE PTEN EN C-Myc y Bcl-XLINFLUENCIA DE PTEN EN C-Myc y Bcl-XLINFLUENCIA DE PTEN EN C-Myc y Bcl-XLINFLUENCIA DE PTEN EN C-Myc y Bcl-XL

INVERSOINVERSO

ad-PTEN

Mut-P53Mut-P53

ad-PTEN

Sh-mutP53Sh-mutP53

ad-PTEN

Mut-P53Mut-P53

ad-PTEN

Sh-mutP53Sh-mutP53

INFLUENCIA DE mut-P53 EN INFLUENCIA DE mut-P53 EN EFECTOS ONCOGÉNICOS DEL PTENEFECTOS ONCOGÉNICOS DEL PTEN

INFLUENCIA DE mut-P53 EN INFLUENCIA DE mut-P53 EN EFECTOS ONCOGÉNICOS DEL PTENEFECTOS ONCOGÉNICOS DEL PTEN

INFLUENCIA DE C-Myc SOBRE EFECTOS INFLUENCIA DE C-Myc SOBRE EFECTOS ONCOGÉNICOS DE PTENONCOGÉNICOS DE PTEN

INFLUENCIA DE C-Myc SOBRE EFECTOS INFLUENCIA DE C-Myc SOBRE EFECTOS ONCOGÉNICOS DE PTENONCOGÉNICOS DE PTEN

Ad-PTEN

Ad-cMycAd-cMycAd-cMycAd-cMyc

Sh-cMycSh-cMycSh-cMycSh-cMyc

CrecimientoInvasiónCrecimientoInvasión

ApoptosisApoptosis

Ad-PTEN

INVERSOINVERSO

RESULTADOSRESULTADOS

CONCLUSIÓNCONCLUSIÓNCONCLUSIÓNCONCLUSIÓN

C-Myc media C-Myc media parcialmente los parcialmente los

efectos efectos oncogénicos de oncogénicos de

PTENPTEN

C-Myc media C-Myc media parcialmente los parcialmente los

efectos efectos oncogénicos de oncogénicos de

PTENPTEN

INFLUENCIA DE Bcl-XL EN EL EFECTO INFLUENCIA DE Bcl-XL EN EL EFECTO ONCOGÉNICO DE PTENONCOGÉNICO DE PTEN

INFLUENCIA DE Bcl-XL EN EL EFECTO INFLUENCIA DE Bcl-XL EN EL EFECTO ONCOGÉNICO DE PTENONCOGÉNICO DE PTEN

PTEN

Ad-Bcl XLAd-Bcl XLAd-Bcl XLAd-Bcl XL

Sh-Bcl XLSh-Bcl XLSh-Bcl XLSh-Bcl XL

INVERSOINVERSO

ApoptosisApoptosis

Bcl-XL influye Bcl-XL influye parcialmente en parcialmente en

los efectos los efectos oncogénicos de oncogénicos de

PTENPTEN

Bcl-XL influye Bcl-XL influye parcialmente en parcialmente en

los efectos los efectos oncogénicos de oncogénicos de

PTENPTEN

C: Muestras de control

E: Muestras experimentales

FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN

SI HAY SI HAY COMPLEJO COMPLEJO

mut-P53/CBP/mut-P53/CBP/NFYANFYA

SI HAY SI HAY COMPLEJO COMPLEJO

mut-P53/CBP/mut-P53/CBP/NFYANFYA

INFLUENCIA DE PTEN EN EL INFLUENCIA DE PTEN EN EL COMPLEJO mut-P53/CBP/NFYACOMPLEJO mut-P53/CBP/NFYA

INFLUENCIA DE PTEN EN EL INFLUENCIA DE PTEN EN EL COMPLEJO mut-P53/CBP/NFYACOMPLEJO mut-P53/CBP/NFYA

Ad-PTENAd-PTENAd-PTENAd-PTEN Mut-P53/CBP/NFYA

RELACIÓN ENTRE LA SUPERVIVIENCIA DE RELACIÓN ENTRE LA SUPERVIVIENCIA DE PACIENTES CON GLIOBLASTOMA POR PACIENTES CON GLIOBLASTOMA POR

mut-P53 Y LA PRESENCIA DE PTENmut-P53 Y LA PRESENCIA DE PTEN

RELACIÓN ENTRE LA SUPERVIVIENCIA DE RELACIÓN ENTRE LA SUPERVIVIENCIA DE PACIENTES CON GLIOBLASTOMA POR PACIENTES CON GLIOBLASTOMA POR

mut-P53 Y LA PRESENCIA DE PTENmut-P53 Y LA PRESENCIA DE PTEN

PTENPTEN

SUPERVIVENCIASUPERVIVENCIA

GLIOBLASTOMA CON mut-P53

REACTIVACIÓN DE P53PRIMA1PRIMA1PRIMA1PRIMA1

P21P21: GEN

Mdm2: Mdm2: PROTEINA

TERAPIA FUTURA CONTRA CÁNCERTERAPIA FUTURA CONTRA CÁNCERTERAPIA FUTURA CONTRA CÁNCERTERAPIA FUTURA CONTRA CÁNCER

FASE G1

REGULADO POR P53

ESTRES

GEN REGULADO

POR P53

INFLUENCIA DEL PTEN EN INFLUENCIA DEL PTEN EN ACCIÓN DE PRIMA1ACCIÓN DE PRIMA1

INFLUENCIA DEL PTEN EN INFLUENCIA DEL PTEN EN ACCIÓN DE PRIMA1ACCIÓN DE PRIMA1

PTEN + PRIMA1PTEN + PRIMA1PTEN + PRIMA1PTEN + PRIMA1 SÍ TIENEN VALOR TERAPÉUTICO

DISCUSSIONDISCUSSIONDISCUSSIONDISCUSSION

PERSONAPERSONA IDEAIDEA SISI NONOJiang Z.Zheng X.Rich KM.

Inhibition of Bcl-XL induces apoptosis of glioblastoma cells

Meyer N.Penn LZ.Dang CV.Nilsson JA. Cleveland JL.

c-Myc is a key regulator of cellular outcomes in normal cells, and its dysregulation is associated with

cancer progression

Brosh RRotter V

A previous study found that gain-of-function mut-p53 increased the expression of c-Myc in cancer cells

Ghosh AK. Grigorieva I. Steele R.Hoover RG.Ray RB.

Although PTEN was reported to inhibit expression of c-Myc in

tumor cells

CONCLUSIONESCONCLUSIONESCONCLUSIONESCONCLUSIONES

Cells have components that monitor its cycle and prevent the spread of possible damage and mutations to daughter cells, however these components may be affected and this makes that its function is reversed, causing possible serious diseases.

Electrophoresis techniques are very important in this type of study because they allow us to safely show results

Inhiben

GRACIAS!!GRACIAS!!GRACIAS!!GRACIAS!!