8/8/2019 Spider Venom Research Article

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P r o c . N a t i . A c a d . S c i . USAV o l . 8 4 , p p . 3 5 0 6 - 3 5 1 0 , May 1 9 8 7N e u r o b i o l o g y

I d e n t i f i c a t i o n a n d p u r i f i c a t i o n o f a n i r r e v e r s i b l e p r e s y n a p t i cn e u r o t o x i n f r o m t h e venom o f t h e s p i d e r H o l o l e n a c u r t a( n e u r o n a l c h a n n e l s / c a l c i u m c h a n n e l s / D r o s o p h i l a / n e u r o m u s c u l a r t r a n s m i s s i o n )

CHAUNCEY W. B O W E R S * , H E I D I S . P H I L L I P S , PAMELA L E E , Y UH NUNG J A N , AND L I L Y Y . J A NH o w a r d H u g h e s M e d i c a l I n s t i t u t e L a b o r a t o r y a n d D e p a r t m e n t o f P h y s i o l o g y , U n i v e r s i t y o f C a l i f o r n i a , S a n F r a n c i s c o , C A 9 4 1 4 3C o m m u n i c a t e d b y S e y m o u r B e n z e r , J a n u a r y 2 8 , 1 9 8 7ABSTRACT A s e a r c h f o r p o t e n t t o x i n s t h a t i n h i b i t n e u -r o n a l c a l c i u m c h a h n e l s i n D r o s o p h i l a m e l a n o g a s t e r h a s r e s u l t e di n t h e i d e n t i f i c a t i o n o f a p r e s y n a p t i c n e u r o t o x i n f r o m t h ev e n o m o f t h e h u n t i n g s p i d e r H o l o l e n a c u r i a . U s i n g D r o s o p h i l an e u r o m u s c u l a r j u n c t i o n a s a n a s s a y , p r e s y n a p t i c I n h i b i t o r ya c t i v i t y w a s p u r i f i e d u s i n g g e l f i l t r a t i o n a n d r e v e r s e - p h a s eHPLC. D a t a f r o m g e l e l e c t r o p h o r e s i s i n d i c a t e t h a t t h e t o x i n i sc o m p o s e d o f t w o d i f f e r e n t s u b u n i t s o f Mr 7 0 0 0 a n d 9 0 0 0 . A tn a n o m o l a r c o n c e n t r a t i o n s t h e t o x i n p r o d u c e d a c o m p l e t e a n dl o n g - l a s t i n g i n h i b i t i o n o f s y n a p t i c t r a n s m i s s i o n a t t h e D r o s o p h -i l a l a r v a l n e u r o m u s c u l a r j u n c t i o n w i t h o u t a f f e c t i n g t h e a m p l i -t u d e s o f t h e s p o n t a n e o u s l y o c c u r r i n g m i n i a t u r e j u n c t i o n p o t e n -t i a l s . T h e b l o c k o f t r a n s m i s s i o n p r o d u c e d b y t h e t o x i n w a so b s e r v e d e v e n d u r i n g t h e d i r e c t d e p o l a r i z a t i o n o f t h e m o t o rn e r v e t e r m i n a l . T h e s e p h y s i o l o g i c a l r e s u l t s i n d i c a t e t h a t t h et e r m i n a l i s t h e s i t e o f a c t i o n f o r t h e t o x i n . I n d i r e c t e v i d e n c eu s i n g a b n o r m a l l y e x c i t a b l e D r o s o p h i l a m u t a n t s s u g g e s t s t h a tt h e t o x i n i s i n h i b i t i n g t r a n s m i t t e r r e l e a s e b y a l t e r i n g t h ee l e c t r i c a l p r o p e r t i e s o f t h e n e r v e t e r m i n a l r a t h e r t h a n b yi n t e r f e r i n g w i t h n o n e l e c t r i c a l e v e n t s t h a t may o c c u r s u b s e q u e n tt o c a l c i u m i f i f l u x . A l l o f t h e a c t i o n s o f t h e H o l o l e n a t o x i n c a nb e e x p l a i n e d b y a s p e c i f i c a n d d i r e c t e f f e c t o n p r e s y n a p t i cc a l c i u m c h a n n e l s i n D r o s o p h i l a m o t o r n e u r o n s .T h e u t i l i t y o f t h e g e n e t i c s a n d m o l e c u l a r b i o l o g y o f D r o s o p h -i l a m e l a n o g a s t e r f o r t h e u n d e r s t a n d i n g o f c o m p l e x b i o l o g i c a lp r o c e s s e s h a s b e e n e v i d e n t f o r many y e a r s ( 1 ) . T h e a b i l i t y t oc h a r a c t e r i z e m u t a n t s b y u s i n g r o u t i n e e l e c t r o p h y s i o l o g i c a lt e c h n i q u e s , a s w e l l a s b y u s i n g new i m m u n o c y t o c h e m i c a lm a r k e r s f o r i n s e c t n e u r o n s , h a s f u r t h e r i n c r e a s e d t h e k i n d s o fn e u r o p h y s i o l o g i c a l q u e s t i o n s t h a t c a n b e s u c c e s s f u l l y a p -p r o a c h e d i n D r o s o p h i l a ( 2 , 3 ) . H o w e v e r , t h e a p p l i c a t i o n o fs p e c i f i c , h i g h - a f f i n i t y l i g a n d s ( e . g . , a - b u n g a r o t o x i n ) t o s t u d ym o l e c u l e s t h a t a r e i m p o r t a n t i n n e u r a l f u n c t i o n h a s g e n e r a l l yb e e n m o r e p r o d u c t i v e i n v e r t e b r a t e t h a n i n i n s e c t p r e p a r a -t i o n s . T h i s h a s b e e n d u e p a r t l y t o a r e l a t i v e p a u c i t y o f s u c hl i g a n d s t h a t a r e a c t i v e i n i n s e c t s . R e c e n t l y , f o r e x a m p l e , at o x i n i s o l a t e d f r o m t h e venom o f t h e f i s h - h u n t i n g s e a s n a i l ,C o n u s g e o g r a p h u s , was s h o w n t o i r r e v e r s i b l y b l o c k c a l c i u mc u r r e n t s i n t h e n e u r o n s o f c e r t a i n v e r t e b r a t e s ( 4 , 5 ) b u t t h et o x i n i s a p p a r e n t l y w i t h o u t e f f e c t i n D r o s o p h i l a ( D .Y o s h i k a m i , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) . B e c a u s e i n s e c t s a r et h e n a t u r a l p r e y o f many s p e c i e s o f s p i d e r s , t h e v e n o m s o fa r a c h n i d s a r e a n a t u r a l s o u r c e o f t o x i n s t h a t d i s r u p t s y n a p t i ct r a n s m i s s i o n i n i n s e c t s ( 6 ) . I n p a r t i c u l a r , t h e venom o f t h es p i d e r H o l o l e n a c u r t a h a s r e c e n t l y b e e n s h o w n t o c o n t a i np o t e n t p o s t s y n a p t i c t o x i n s t h a t a p p e a r t o i r r e v e r s i b l y b l o c ke x c i t a t o r y g l u t a m a t e r e c e p t o r s i n c e r t a i n i n s e c t s a n d b i r d s ( 6 ,7 ) . W e r e p o r t h e r e t h e i s o l a t i o n o f a n e u r o t o x i n f r o m t h evenom o f t h e s p i d e r , H . c u r t a , t h a t p r o d u c e s a c h r o n i cb l o c k a d e o f n e u r o m u s c u l a r t r a n s m i s s i o n i n t h e l a r v a e o f D .

m e l a n o g a s t e r v i a a p r e s y n a p t i c m e c h a n i s m . A l l o f t h e d a t as u p p o r t t h e h y p o t h e s i s t h a t t h e H o l o l e n a t o x i n p r o d u c e s as p e c i f i c a n d p e r s i s t e n t b l o c k a d e o f p r e s y n a p t i c c a l c i u mc h a n n e l s i n t h i s p r e p a r a t i o n .MATERIALS AN D ME THODS

G e n e r a l E l e c t r o p h y s i o l o g y . T h e l a r v a e w e r e p r e p a r e d f o re l e c t r o p h y s i o l o g y a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 2 ) . B r i e f l y , l a t e -t h i r d i n s t a r l a r v a e w e r e p i n n e d t o a l a y e r o f S y l g a r d ( D o wC o r n i n g ) a n d o p e n e d b y a m i d l i n e d o r s a l i n c i s i o n . I n t e r n a lo r g a n s w e r e r e m o v e d , e x p o s i n g t h e l a r g e s t r i a t e d m u s c l e s o ft h e l a r v a l w a l l a n d t h e i r r e s p e c t i v e m o t o r n e r v e s . I n t r a c e l -l u l a r r e c o r d i n g s o f t h e l a r v a l m u s c l e c e l l s w e r e m a d e w i t hr e f e r e n c e t o a b a t h g r o u n d u s i n g 1 5 - 2 5 MO g l a s s e l e c t r o d e sf i l l e d w i t h 3 M K C l a n d a c h l o r i d i z e d s i l v e r w i r e i n t h e b a t h .S u c t i o n e l e c t r o d e s w i t h i n n e r - t i p d i a m e t e r s o f 1 0 - 2 0 Am w e r eu s e d f o r s t i m u l a t i o n o f t h e d i s t a l c u t e n d s o f t h e m o t o r n e r v e s .A l l r e c o r d i n g s w e r e d o n e a t r o o m t e m p e r a t u r e a n d , u n l e s so t h e r w i s e n o t e d , i n 2 . 0 m l o f p h y s i o l o g i c a l s a l i n e w i t h t h ef o l l o w i n g c o m p o s i t i o n : 1 0 8 . 5 mM N a C l / 4 . 2 mM K C l / 3 . 4 mMM g C l 2 / 0 . 4 2 mM C a C l 2 / 3 0 . 5 mM s u c r o s e / 1 9 mM H e p e s , pH7 . 1 .F o r r o u t i n e a s s a y o f venom f r a c t i o n s , m u s c l e c e l l s w e r er e q u i r e d t o h a v e a m e m b r a n e p o t e n t i a l o f a t l e a s t 3 0 mV, as t a b l e n e r v e - e v o k e d e x c i t a t o r y j u n c t i o n p o t e n t i a l ( E J P ) o f a tl e a s t 1 0 mV, a n d o b v i o u s s p o n t a n e o u s m i n i a t u r e E J P s( m E J P s ) . O n e u n i t o f a c t i v i t y w a s d e f i n e d a s t h e a m o u n t o ft o x i n r e q u i r e d t o p r o d u c e a c l e a r f a i l u r e o f t h e e v o k e d E J P i n5 m i n . D u e t o t h e r e l a t i v e i r r e v e r s i b i l i t y o f t h e t o x i n ' s a c t i o n ,t h i s t i m e - d e p e n d e n t a s s e s s m e n t o f a c t i v i t y w a s m o r e c o n v e -n i e n t t h a n t h e e v e n t u a l d e g r e e o f b l o c k . I n g e n e r a l , t h ea m o u n t o f a n a c t i v e f r a c t i o n t h a t p r o d u c e d 1 u n i t o f a c t i v i t yw a s d e t e r m i n e d f o r g r o s s c o m p a r i s o n s b e t w e e n f r a c t i o n s . A l ld r u g s , i n c l u d i n g venom f r a c t i o n s , w e r e a d d e d a s a b o l u s t ot h e s i d e o f t h e b a t h a n d m i x e d u s i n g a P a s t e u r p i p e t .F o r t h e t o x i n w a s h - o u t e x p e r i m e n t , c o n s t a n t p e r f u s i o n o ft h e d i s h w i t h t o x i n - f r e e s a l i n e s o l u t i o n w a s d o n e a t a r a t e o f3 m l ( 1 . 5 d i s h v o l u m e s ) p e r m i n . I n a d d i t i o n , t h e e n t i r e f l u i dc o n t e n t o f t h e d i s h was r a p i d l y ( < 1 5 s ) r e m o v e d a n d r e p l a c e dw i t h f r e s h t o x i n - f r e e s a l i n e u s i n g a P a s t e u r p i p e t t h r e e t i m e sa t t h e b e g i n n i n g o f t h e p e r f u s i o n a n d t w i c e e v e r y 2 0 m i nd u r i n g t h e 2 - h r p e r f u s i o n .T h e q u a n t a l c o n t e n t o f t h e e v o k e d s i g n a l w a s e s t i m a t e d b yd i v i d i n g t h e a v e r a g e a m p l i t u d e o f t h e e v o k e d E J P ( n 2 1 0 0 )b y t h e a v e r a g e a mp l i t u d e o f t h e s p o n t a n e o u s mEJP ( n . 5 0 ) .D i r e c t S t i m u l a t i o n o f N e r v e T e r m i n a l s . N e r v e t e r m i n a l sw e r e d e p o l a r i z e d d i r e c t l y i n t h e p r e s e n c e o f t e t r o d o t o x i n( T T X ) b y m o v i n g t h e t i p o f t h e s t i m u l a t i n g e l e c t r o d e c l o s e t ot h e m u s c l e a n d n o t i n g t h a t t h e E J P s w e r e n o w g r a d e d ( r a t h e rt h a n " a l l o r n o t h i n g " ) w i t h r e s p e c t t o s t i m u l u s i n t e n s i t y .A b b r e v i a t i o n s : E J P , e x c i t a t o r y j u n c t i o n p o t e n t i a l ; m E J P , m i n i a t u r ee x c i t a t o r y j u n c t i o n p o t e n t i a l ; C F 3 C O O H , t r i f l u o r o a c e t i c a c i d ; T T X ,t e t r o d o t o x i n ; TEMED, N , N , N ' , N ' - t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e .* T o whom r e p r i n t r e q u e s t s s h o u l d b e a d d r e s s e d .

3 5 0 6

T h e p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e r e d e f r a y e d i n p a r t b y p a g e c h a r g ep a y m e n t . T h i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e h e r e b y m a r k e d " a d v e r t i s e m e n t "i n a c c o r d a n c e w i t h 1 8 U . S . C . 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t e t h i s f a c t .

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3 5 0 8 N e u r o b i o l o g y : B o w e r s e t a l .0 . 0 4 -

0 . 0 3 -- 3 0

~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ 20 . 0 2 2 0 1

/ . 1l3.0100 -

0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0T i m e , m i n

F I G . 2 . E l u t i o n p r o f i l e f r o m C 1 8 r e v e r s e - p h a s e H P L C . T h e a c t i v ef r a c t i o n s f r o m t h e G - 5 0 s i z i n g c o l u m n w e r e a p p l i e d t o t h e H P L Cc o l u m n i n 0 . 1 % CF3COOH-18% a c e t o n i t r i l e a t t o . P e a k s w e r e e l u t e dw i t h a g r a d i e n t o f a c e t o n i t r i l e a s s h o w n b y t h e d o t t e d l i n e a n dd e t e c t e d b y a b s o r b a n c e a t 2 1 4 n m . T h e p u r i f i e d a c t i v e p e a k s a r ei n d i c a t e d b y t h e s o l i d t r i a n g l e s ; t h e s e t w o p e a k s a r e f u r t h e r c h a r a c -t e r i z e d i n t h i s r e p o r t . O t h e r r e g i o n s o f t h e e l u t i o n t h a t e x h i b i t e ds i g n i f i c a n t p r e s y n a p t i c a c t i v i t y i n D r o s o p h i l a a r e i n d i c a t e d b y a r -r o w s ; a l l r e g i o n s w e r e a s s a y e d .

T h e B e h a v i o r o f P u r i f i e d H o l o l e n a T o x i n o n N a D o d S O 4 /PAGE. U s i n g NaDodSO4/PAGE i n n o n r e d u c i n g c o n d i t i o n s ,t h e t w o p u r i f i e d p e a k s f r o m H P L C m i g r a t e d i d e n t i c a l l y , e a c ha s o n e b a n d w i t h a Mr o f 6 0 0 0 ( F i g . 3 B ) . On N a D o d S O 4 /PAGE u n d e r r e d u c i n g c o n d i t i o n s ( w i t h 5% 2 - m e r c a p t o e t h a -n o l ) , b o t h p e a k s a g a i n b e h a v e d i d e n t i c a l l y - e a c h now a s t w od i s t i n c t b a n d s w i t h Mr o f 7 0 0 0 a n d 9 0 0 0 ( F i g . 3 A ) . T h e s e d a t as u g g e s t t h a t H o l o l e n a t o x i n i s c o m p o s e d o f a t l e a s t t w od i s u l f i d e - l i n k e d s u b u n i t s .I t i s u n l i k e l y t h a t t h e t w o b a nd s o b s e r v e d f o r e a c h p e a ku n d e r r e d u c e d c o n d i t i o n s w e r e d u e t o t h e i n c o m p l e t e r e d u c -t i o n o f a s i n g l e b a n d b e c a u s e t h e u s e o f s e v e r a l r e d u c i n gc o n d i t i o n s ( i . e . , 0 . 5 % 1 , 4 - d i t h i o t h r e i t o l f o l l o w e d b y a l k y l a -t i o n o f f r e e s u l f h y d r y l s , 4 M u r e a a d d e d t o t h e n o r m a lr e d u c i n g c o c k t a i l , o r s u b s t i t u t i o n o f 2 . 5 % 1 , 4 - d i t h i o t h r e i t o lf o r 2 - m e r c a p t o e t h a n o l ) d i d n o t c h a n g e t h e r e l a t i v e i n t e n s i t y

o r p o s i t i o n s o f t h e t w o b a n d s ( d a t a n o t s h o w n ) . A l t h o u g h i ti s p o s s i b l e t h a t t h e r e a r e t w o u n r e l a t e d p r o t e i n s i n e a c h o f t h ea c t i v e f r a c t i o n s a n d t h a t t h e s e t w o p r o t e i n s a r e r e s o l v e du n d e r r e d u c e d c o n d i t i o n s b u t n o t u n d e r n o n r e d u c e d c o n d i -t i o n s , t h e d o u b l e o c c u r r e n c e o f t h a t i d e n t i c a l s i t u a t i o n ( i . e . ,o n c e f o r e a c h a c t i v e p e a k ) s e e m s u n l i k e l y .H o l o l e na T o x i n C a u s e s P r e s y n a p t i c B l o c k o f N e u r o m u s c u l a rT r a n s m i s s i o n . T h e p u r i f i e d H o l o l e n a t o x i n ( e i t h e r o f t h e t w oa c t i v e p e a k s f r o m HPLC) p r o d u c e d a c o m p l e t e i n h i b i t i o n o ft r a n s m i s s i o n ( f r o m a q u a n t a l c o n t e n t o f > 3 0 t o a q u a n t a lc o n t e n t o f s 0 . 5 ) i n D r o s o p h i l a l a r v a e w i t h n o c h a n g e i n t h em e m b r a n e p o t e n t i a l o f t h e m u s c l e a n d n o c h a n g e i n t h ea m p l i t u d e s o f s p o n t a n e o u s m E J P s ( F i g . 4 ) . F o r i n s t a n c e , i no n e e x p e r i m e n t , t h e mEJP a m p l i t u d e s , m e a s u r e d b e f o r e a n da f t e r i n h i b i t i o n b y t h e t o x i n , w e r e 0 . 5 9 0 . 0 2 mV ( n = 9 8 )a n d 0 . 6 1 0 . 0 3 mV ( n = 9 2 ) , r e s p e c t i v e l y ( v a l u e s a r e t h em e a n s S E M ) . A c o m p l e t e f a i l u r e o f t r a n s m i s s i o n g e n e r a l l yo c c u r r e d w i t h i n 1 - 1 0 m i n , d e p e n d i n g o n t h e d o s e o f t o x i n . N oe x c i t a t o r y p h a s e o f t h e b l o c k ( i . e . , i n c r e a s e d f r e q u e n c y o ra mp l i t u d e o f m E J P s ) w a s e v e r o b s e r v e d . A f t e r n e u r o m u s c u -l a r b l o c k a d e o f t h i s t y p e , c o n t i n u o u s w a s h i n g o f t h e p r e p a -r a t i o n f o r 2 h r w i t h f r e s h m e d i u m w i t h o u t t o x i n r e s u l t e d i n n os i g n i f i c a n t r e c o v e r y o f t h e q u a n t a l c o n t e n t . I n o n e p r e p a r a -t i o n , f o r e x a m p l e , t h e q u a n t a l c o n t e n t d e c r e a s e d f r o m 3 0 t o0 . 0 5 i n r e s p o n s e t o H o l o l e n a t o x i n a n d r e m a i n e d a t 0 . 0 4 a f t e r2 h r o f w a s h i n g .

P r e s y n a p t i c B l o c k b y H o l o l e n a T o x i n I s N o t Due t o a B l o c ko f N e r v e C o n d u c t i o n . O n e e x p l a n a t i o n f o r a n o n e x c i t a t o r yA

-HoTX

LB

+ H o T X

A BC

+HoTX

e lo

F I G . 3 . NaDodSO4/PAGE o f p u r i f i e d H o l o l e n a t o x i n u n d e rr e d u c i n g ( 5 % 2 - m e r c a p t o e t h a n o l ) ( A ) a n d n o n r e d u c i n g ( B ) c o n d i -t i o n s . F o r b o t h A a n d B , l a n e s 1 a n d 4 r e p r e s e n t Mr s t a n d a r d s ,w h e r e a s l a n e s 2 a n d 3 r e p r e s e n t t h e f i r s t a n d s e c o n d e l u t e d H P L C -p u r i f i e d t o x i n p e a k s , r e s p e c t i v e l y ; 1 0 u n i t s o f a c t i v i t y w e r e a p p l i e di n e a c h case. S t a n d a r d s ar e f r a g m e n t s o f a m y o g l o b i n d i g e s t w i t h Mrv a l u e s o f 2 6 0 0 , 6 4 0 0 , 8 2 0 0 , 1 4 , 6 0 0 , a n d 1 7 , 2 0 0 . N o t e t h a t t h e b a n d si n t h e t o p q u a r t e r o f t h e g e l s ar e p r e s e n t i n s t a n d a r d l a n e s as w e l l ass a m p l e l a n e s a n d ar e a n a r t i f a c t u a l r e s u l t o f t h e s i l v e r s t a i n .

L

F I G . 4 . H o l o l e n a t o x i n d o e s n o t a f f e c t t h e a m p l i t u d e s o f t h es p o n t a n e o u s m E J P s . C o n s e c u t i v e o s c i l l o s c o p e t r a c e s w e r e i n t e n -t i o n a l l y D C - s h i f t e d f o r c l a r i t y . ( A ) O s c i l l o s c o p e r e c o r d s h o w i n gs p o n t a n e o u s mEJPs i n n e u r o m u s c u l a r p r e p a r a t i o n b e f o r e t h e a d d i -t i o n o f t o x i n . T h e a m p l i t u d e o f t h e e v o k e d E J P b e f o r e t o x i na p p l i c a t i o n w a s 2 0 mV ( d a t a n o t s h o w n ) . S c a l e b a r s a r e 0 . 5 mV a n d1 0 0 m s . ( B ) R e c o r d s o f t h e s a m e p r e p a r a t i o n a s i n A b u t - 1 0 m i n a f t e rt h e a d d i t i o n o f H o l o l e n a t o x i n ; t r a n s m i s s i o n now f a i l s = 5 0 % 6 o f t h et i m e , a v e r a g i n g

8/8/2019 Spider Venom Research Article

4/5

P r o c . N a t i . A c a d . S c i . USA 8 4 ( 1 9 8 7 ) 3 5 0 9A L

C o n t r o l

CL

T T X

B Dl T T X * TT X + HoTX

F I G . 5 . H o l o l e n a t o x i n i s a c t i n g a t t h e m o t o r n e r v e t e r m i n a l b ya m e c h a n i s m d i s t i n c t f r o m t h a t o f T T X . R e c o r d s A-D w e r e o b t a i n e dc o n s e c u t i v e l y f r o m t h e s a m e p r e p a r a t i o n . A r r o w s i n d i c a t e s t i m u l u sa r t i f a c t s . ( A ) Two s u p e r i m p o s e d t r a c e s o f t h e E J P s e v o k e d b ys u p r a m a x i m a l s t i m u l a t i o n o f t h e m o t o r n e r v e a t a s i t e - 6 0 0 A . m f r o mt h e m u s c l e . S c a l e b a r i s 5 mV a n d 1 0 m s . ( B ) I d e n t i c a l c o n d i t i o n s t oA b u t 1 0 m i n a f t e r t h e a d d i t i o n o f 1 0 - 6 M T J X . Q u a d r u p l i n g t h es t i m u l u s a m p l i t u d e d i d n o t e v o k e a n E J P . T h e s c a l e i s t h e s a m e a sf o r A . ( C ) S t i m u l a t i o n e l e c t r o d e h a s now b e e n m o v e d t o j u s t a p p o s et h e m u s c l e r e g i o n w h e r e t h e m o t o r n e r v e e n t e r s . T h e s u p e r i m p o s e dt r a c e s a r e o f t h e E J P s r e s u l t i n g f r o m s t i m u l a t i o n a t t h i s c l o s e - t o - t h e -t e r m i n a l p o s i t i o n i n t h e p r e s e n c e o f t h e 1 0 - 6 M T T X . N o t e t h a t t h es c a l e b a r i s n ow 2 mV a n d 1 0 m s . ( D ) C o n d i t i o n s w e r e i d e n t i c a l t ot h o s e o f C b u t 1 0 m i n a f t e r t h e a d d i t i o n o f H o l o l e n a t o x i n . N o t e t h eb l o c k o f t h e E J P a n d t h e p e r s i s t e n c e o f t h e s p o n t a n e o u s m E J P s .S a m e s c a l e a s f o r C .p r e s y n a p t i c b l o c k i s t h e i n h i b i t i o n o f a c t i v e n e r v e c o n d u c t i o nf r o m t h e s t i m u l a t i n g e l e c t r o d e t o t h e n e r v e t e r m i n a l . F o ri n s t a n c e , TTX p r o d u c e s s u c h a p r e s y na p t i c b l o c k ( F i g . 5 Aa n d B ) . H o w e v e r , i n t h e p r e s e n c e o f T T X , a n e v o k e d E J P c a nb e p r o d u c e d b y m o v i ng t h e s t i m u l a t i n g e l e c t r o d e t o w i t h i n a f e wh u n d r e d m i c r o ns o f t h e m o t o r t e r m i n a l s a n d d e p o l a r i z i n g t h e md i r e c t l y ( F i g . 5 C ) . T h e E J P p r o d u c e d b y t h i s d i r e c t d e p o l a r i z a -t i o n i n t h e p r e s e n c e o f TTX w a s b l o c k e d b y t h e H o l o l e n a t o x i na t c o n c e n t r a t i o n s s i m i l a r t o t h o s e u s e d w i t h c o n d u c t e d s t i m u l i( F i g . 5 D ) . As e x p e c t e d , t h e m E J P s a p p e a r e d n o r m a l i n b l o c k i n gc o n c e n t r a t i o n s o f b o t h TTX a n d H o l o l e n a t o x i n ( F i g . 5 D ) .T h e s e d a t a s u g g e s t e d t h a t t h e s i t e o f a c t i o n o f H o l o l e n a t o x i nw a s t h e m o t o r n e r v e t e r m i n a l a n d w a s n o t t h e T T X - s e n s i t i v es o d i u m c h a n n e l .E f f e c t o f H o l o l e n a T o x i n o n P r e s y n a p t i c E l e c t r i c a l E v e n t s i nM u t a n t N e r v e T e r m i n a l s . To f u r t h e r c h a r a c t e r i z e t h e m e c h -a n i s m o f a c t i o n o f H o l o l e n a t o x i n , a n a b n o r m a l l y e x c i t a b l ed o u b l e m u t a n t i n D r o s o p h i l a , e a g , S h r K o J 2 o , w a s e x a m i n e d .T h i s m u t a n t h a s b e e n s h o w n t o b e d e f i c i e n t i n v o l t a g e -d e p e nd e nt p o t a s s i u m c h a n n e l s a n d i s c h a r a c t e r i z e d b y a na b no r ma l l y p r o l o ng e d d e p o l a r i z a t i o n o f t h e n e r v e t e r m i n a lc o r r e l a t e d w i t h a p r o l o n g e d E J P ( 8 , 9 ) . I n a d d i t i o n , a n dp r e s u m a b l y d u e t o t h e p r o l o n g e d d e p o l a r i z a t i o n , r e p e t i t i v ep o t e n t i a l s t h a t a r e g e n e r a t e d f r o m t h e t e r m i n a l c a n b er e c o r d e d e x t r a c e l l u l a r l y n e a r t h e t e r m i n a l d u r i n g t h e E J P( 1 0 ) . T h u s , u n l i k e t h e E J P s a n d m E J P s , t h e s e r e c u r r e n tp o t e n t i a l s a r e r e c o r d e d d i r e c t l y f r o m t h e p r e s y n a p t i c n e r v er a t h e r t h a n f r o m t h e m u s c l e c e l l a n d a r e t h e r e f o r e a d i r e c tm e a s u r e m e n t o f e l e c t r i c a l e v e n t s o c c u r r i n g i n t h e r e g i o n o ft h e t e r m i n a l . T h e s e r e c u r r e n t p o t e n t i a l s w e r e c o m p l e t e l yi n h i b i t e d b y H o l o l e n a t o x i n a s w a s t h e m u t a n t E J P ( F i g . 6 ) .T h e s e p o t e n t i a l s w e r e a l s o c o m p l e t e l y b l o c k e d b y 1 0 0 ; L MC d C l 2 , 1 mM C o C l 2 o r c a l c i u m - f r e e s o l u t i o n ( d a t a n o ts h o w n ) .O t h e r P h y s i o l o g i c a l P r e p a r a t i o n s . T h e p u r i f i e d H o l o l e n at o x i n d i d n o t a f f e c t n e u r o m u s c u l a r t r a n s m i s s i o n i n c u t a n e o u sp e c t o r i s o f f r o g ( R a n a p i p i e n s ) , n o r d i d i t a f f e c t a n y o f t h em a j o r i n w a r d o r o u t w a r d c u r r e n t s i n t h e l a t e p u p a l f l i g h tm u s c l e o f D r o s o p h i l a u n d e r v o l t a g e c l a m p ( d a t a n o t s h o w n ) .S i m i l a r l y , t h e t o x i n h a d n o e f f e c t o n t h e a c t i o n p o t e n t i a l i nl a r v a l m u s c l e t h a t i s o b s e r v e d i n t h e p r e s e n c e o f 1 mM

K _ W ' V - v y8 m i n HoTXF I G . 6 . H o l o l e n a t o x i n b l o c k s t h e r e p e t i t i v e p r e s y n a p t i c p o t e n -t i a l s t h a t a r e r e c o r d e d e x t r a c e l l u l a r l y i n t h e h y p e r e x c i t a b l e D r o s o p h -i l a d o u b l e m u t a n t e a g , S h r K O l 2 0 . T h e r e c o r d i n g e l e c t r o d e w a sb e t w e e n t h e s t i m u l a t i n g e l e c t r o d e a n d t h e m u s c l e i n a l l t h r e e r e c o r d s .E a c h r e c o r d i s i n i t i a t e d b y a s i n g l e s t i m u l u s ( a r r o w h e a d ) . C o n s e c u -

t i v e r e c o r d s o f t h e s a m e p r e p a r a t i o n a r e s h o w n . ( T o p ) E x t r a c e l l u l a rr e c o r d o f t h e u n r e s o l v e d s t i m u l u s a r t i f a c t a n d c o m p o u n d a c t i o np o t e n t i a l ( a r r o w h e a d ) , f o l l o w e d b y s i x r e p e t i t i v e p r e s y n a p t i c p o t e n -t i a l s ( a r r o w s ) . ( M i d d l e ) S a m e c o n d i t i o n s a s f o r a b o v e b u t 1 m i n a f t e rt h e a d d i t i o n o f H o l o l e n a t o x i n a n d ( B o t t o m ) 8 m i n a f t e r H o l o l e n at o x i n . S c a l e b a r i s 0 . 2 mV a n d 1 0 m s .s t r o n t i u m ( d a t a n o t s h o w n ) . T h i s s t r o n t i u m s p i k e w a s c o m -p l e t e l y b l o c k e d b y m i l l i m o l a r c o n c e n t r a t i o n s o f c o b a l t a n dn i c k e l a n d p r o b a b l y i s m e d i a t e d b y c a l c i u m c h a n n e l s a s h a sb e e n s h o w n f o r s t r o n t i u m s p i k e s i n o t h e r s y s t e m s ( 1 4 , 1 5 ) .

DISCUSSIONT h i s r e p o r t d e s c r i b e s t h e i n i t i a l p u r i f i c a t i o n o f a new p r e s y n -a p t i c n e u r o t o x i n f r o m t h e venom o f t h e h u n t i n g s p i d e r , H .c u r t a . A f t e r H P L C f r a c t i o n a t i o n o f p a r t i a l l y p u r i f i e d t o x i n ,t w o a c t i v e p e a k s w e r e i s o l a t e d , e a c h o f w h i c h g i v e s r i s e t o as i n g l e b a n d o n NaDodSO4/PAGE u n d e r n o n r e d u c i n g c o n d i -t i o n s . I t i s p o s s i b l e t h a t t h e s e t w o p e a k s r e p r e s e n t v e r yc l o s e l y r e l a t e d m o l e c u l e s b e c a u s e t h e y b e h a v e s i m i l a r l y i n a l lo f t h e b i o c h e m i c a l a n d p h y s i o l o g i c a l s i t u a t i o n s e x a m i n e d .T h e e l e c t r o p h o r e t i c b e h a v i o r o f r e d u c e d a n d n o n r e d u c e dt o x i n s u g g e s t s t h a t t h e t o x i n i s made o f t w o s u b u n i t s o f Mr7 0 0 0 a n d 9 0 0 0 , j o i n e d b y d i s u l f i d e b o n d s . T h e e s t i m a t e d Mro f t h e t o x i n , a s s u m i n g o n e o f e a c h p u t a t i v e s u b u n i t , i s 1 6 , 0 0 0 .T h e Mr o f 6 0 0 0 f o r t h e s i n g l e b a n d w i t h NaDodSO4/PAGEu n d e r n o n r e d u c i n g c o n d i t i o n s i s p r o b a b l y t h e r e s u l t o fa n o m a l o u s m i g r a t i o n t h a t i s o f t e n o b s e r v e d f o r s m a l l p r o t e i n st h a t a r e h i g h l y f o l d e d a n d i s c o n s i s t e n t w i t h t h e p r e s e n c e o fc o n f o r m a t i o n a l l y i m p o r t a n t c y s t i n e l i n k a g e s .T h e d a t a p r e s e n t e d d o n o t e l i m i n a t e t h e p o s s i b i l i t y o f m i n o rc o n t a m i n a n t s i n t h e a c t i v e f r a c t i o n s . T h e m o r e i m p o r t a n ti s s u e i s w h e t h e r t h e m a j o r c o m p o n e n t s o f t h e a c t i v e f r a c t i o n s( i . e . , t h e b a n d s o b s e r v e d o n N a D o d S O 4 / P A G E ) a r e i n f a c tr e s p o n s i b l e f o r t h e a c t i v i t y a t t h e l a r v a l n e u r o m u s c u l a rj u n c t i o n . P r e l i m i n a r y e v i d e n c e u s i n g a h i g h - r e s o l u t i o n H P L Cg e l f i l t r a t i o n c o l u m n ( T S K - 2 5 0 V y d a c ) r e v e a l e d o n l y o n em a j o r a b s o r b a n c e p e a k i n t h e a c t i v e r e v e r s e - p h a s e f r a c t i o n s .T h i s s i n g l e p e a k f r o m g e l f i l t r a t i o n was c o i n c i d e n t w i t h t h ei n h i b i t o r y a c t i v i t y , s u g g e s t i n g t h a t a n y a c t i v e c o n t a m i n a n tm u s t b e b e h a v i n g q u i t e s i m i l a r l y t o t h e m a j o r c o m p o n e n t i nb o t h r e v e r s e - p h a s e a n d g e l f i l t r a t i o n H P L C ( u n p u b l i s h e dw o r k ) . I t i s w o r t h n o t i n g t h a t t h e h y p o t h e s i s t h a t a m i n o rc o n t a m i n a n t i s r e s p o n s i b l e f o r t h e o b s e r v e d a c t i v i t y r e q u i r e st h e c o p u r i f i c a t i o n o f t w o s u c h a c t i v e c o n t a m i n a n t s , o n ec o m i g r a t i n g w i t h e a c h o f t h e t w o a c t i v e a b s o r b a n c e p e a k sf r o m r e v e r s e - p h a s e HPLC. A l t h o u g h s u c h a d o u b l e c o p u r i -

v

, , , + + , A - . -

V

P ~ ~ ~ ~ 7 Z i noTX

.-- -W W I W W W F W - ' V

N e u r o b i o l o g y : B o w e r s e t a l .

8/8/2019 Spider Venom Research Article

5/5

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 4 ( 1 9 8 7 )f i c a t i o n s e e m s i m p r o b a b l e , f u r t h e r a n a l y s i s i s r e q u i r e d f o r t h eu n e q u i v o c a l i d e n t i f i c a t i o n o f t h e a c t i v e components.T h e H o l o l e n a t o x i n b l o c k s n e u r o m u s c u l a r t r a n s m i s s i o n v i aa p r e s y n a p t i c m e c h a n i s m as e v i d e n c e d b y i t s l a c k o f e f f e c t onmEJP a m p l i t u d e s . I n a d d i t i o n , t h e a b i l i t y o f t h e t o x i n t oi n h i b i t t h e r e l e a s e o f t r a n s m i t t e r t h a t r e s u l t s f r o m d i r e c tt e r m i n a l d e p o l a r i z a t i o n i n t h e presence o f TTX d e m o n s t r a t e st h e s i t e o f a c t i o n t o b e a t o r near t h e t e r m i n a l . B a s e d o n t h ep r e s e n t u n d e r s t a n di n g o f t r a n s m i t t e r r e l e a s e m e c h a n i s m s , ap r e s y n a p t i c b l o c k o f t h i s t y p e must e i t h e r b e a l t e r i n g t h ee l e c t r i c a l p r o p e r t i e s o f t h e t e r m i n a l ( a nd t h e r e b y p r e v e n t i n gt h e o p e n i n g o f t h e v o l t a g e - d e p e n d e n t c a l c i u m c h a n n e l s ) , orb e i n h i b i t i n g e l e c t r i c a l l y s i l e n t e v e n t s t h a t may occur s u b s e -q u e n t t o c a l c i u m e n t r y a n d t h a t ar e neces sary f o r e v o k e dt r a n s m i t t e r r e l e a s e . W e h y p o t h e s i z e t h a t , o f t h e s e two b r o a dc a t e g o r i e s o f m e c h a n i s m , t h e H o l o l e n a t o x i n i s a c t i n g b yc h a n g i n g e l e c t r i c a l e v e n t s i n t h e t e r m i n a l b e c a u s e t h e t o x i nb l o c k s t h e r e p e t i t i v e p r e s y n a p t i c p o t e n t i a l s o b s e r v e d d u r i n gt h e p r o l o n g e d E J P o f t h e d o u b l e mutant-eag, S h r K o l 2 o . I nc o n t r a s t t o t h e a c t i o n o f t h e t o x i n , a m e c h a n i s m s p e c i f i c f o rn o n e l e c t r i c a l e v e n t s w o u l d h a v e b e e n e x p e c t e d t o b l o c ks y n a p t i c t r a n s m i s s i o n i n t h e m u t a n t w i t h o u t a f f e c t i n g t h er e p e t i t i v e p r e s y n a p t i c p o t e n t i a l s .T a k e n t o g e t h e r , t h e d a t a r e p o r t e d h e r e s u g g e s t t h a t t h eH o l o l e n a t o x i n a c t s b y a p o t e n t a n d l o n g - l a s t i n g i n h i b i t i o n o fv o l t a g e - d e p e n d e n t p r e s y n a p t i c c a l c i u m c h a n n e l s . T h e s ec h a n n e l s must b e r e l a t i v e l y s p e c i f i c f o r neu rons , as h a s b e e ns u g g e s t e d i n v e r t e b r a t e s ( 1 6 - 1 8 ) , b e c a u s e n o e f f e c t s o f t h et o x i n ar e o b s e r v e d i n D r o s o p h i l a m u s c l e . A l t h o u g h t h es p e c i f i c i t y o f t h e t o x i n f o r D r o s o p h i l a n e u r o n s m a k e s ar i g o r o u s d e mo n s t r a t i o n o f i t s m e c h a n i s m more d i f f i c u l t , wea n t i c i p a t e t h a t i t s p o t e n c y a n d s p e c i f i c i t y i n t h i s s y s t e m w i l lm a k e t h e H o l o l e n a t o x i n a v a l u a b l e m o l e c u l a r p r o b e f o rs y n a p t i c p h y s i o l o g y .We t h a n k D r . L i h u K o l t o n f o r t h e s t r o n t i u m d a t a i n f l y l a r v a e a n df o r t h e f r o g c u t a n e o u s p e c t o r i s r e s u l t s , D r . L e s T i m p e f o r v o l t a g ec l a m p d a t a f r o m D r o s o p h i l a f l i g h t m u s c l e , D r . F l o r a K a t z f o r h e l p f u l

a d v i c e o n NaDodSO4/PAGE s y s t e m s , a n d D r . H u n t e r J a c k s o n f o ri n t r o d u c i n g u s t o t h e H o l o l e n a v e n o m . W e a l s o t h a n k K a t h e r i ne C u r ef o r c a r e f u l p r e p a r a t i o n o f t h i s m a n u s c r i p t . T h i s w o r k w a s f u nd e d b yt h e H o w a r d H u g h e s M e d i c a l I n s t i t u t e . C . W . B . w a s s u p p o r t e d b yN a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e al t h G r a n t NS 1 5 7 5 7 a n d H . S . P . w a ss u p p o r t e d b y N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t h G r a nt NS 1 6 0 3 3 .1 . B e n z e r , S . ( 1 9 7 1 ) J . Am . M e d . A s s o c . 2 1 8 , 1 0 1 5 - 1 0 2 2 .2 . J a n , L . Y . & J a n , Y . N . ( 1 9 7 6 ) J . P h y s i o l . ( L o n d o n ) 2 6 2 ,1 8 9 - 2 1 4 .3 . J a n , L . Y . & J a n , Y . N . ( 1 9 8 2 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 9 ,2 7 0 0 - 2 7 0 4 .4 . K e r r , L . M . & Y o s h i k a m i , D . ( 1 9 8 4 ) N a t u r e ( L o nd o n ) 3 0 8 ,2 8 2 - 2 8 4 .5 . O l i v e r a , B . M . , G r a y , W. R . , Z e i k u s , R . , M c I n t o s h , J . M . ,V a r g a , J . , R i v i e r , J . , d e S a n t o s , V . & C r u z , L . J . ( 1 9 8 5 )S c i e n c e 2 3 0 , 1 3 3 8 - 1 3 4 3 .6 . U s h e r w o o d , P . N . R . & D u c e , I . R . ( 1 9 8 5 ) N e u r o t o x i c o l o g y 6 ,2 3 9 - 2 5 0 .7 . J a c k s o n , H . , U r n e s , M . , G r a y , W. R . & P a r k s , T . N . ( 1 9 8 5 )S o c . N e u r o s c i . A b s t r . 1 1 , 1 0 7 .8 . G a n e t z k y , B . & Wu, C . - F . ( 1 9 8 3 ) J . N e u r o g e n e t . 1 , 1 7 - 2 8 .9 . J a n , Y . N . , J a n , L . Y . & D e n n i s , M . J . ( 1 9 7 7 ) P r o c . R . S o c .L o n d o n S e r . B 1 9 8 , 8 7 - 1 0 8 .1 0 . G a n e t z k y , B . & Wu, C . - F . ( 1 9 8 2 ) J . N e u r o p h y s i o l . 4 7 , 5 0 1 -5 1 4 .1 1 . H i l d e b r a n d t , J . D . , C o d i n a , J . , R i s i n g e r , R . & B i r n b a u m e r , L .( 1 9 8 4 ) J . B i o l . C h e m . 2 5 9 , 2 0 3 9 - 2 0 4 2 .1 2 . L a e m m l i , U . K . ( 1 9 7 0 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 2 2 7 , 6 8 0 - 6 8 5 .1 3 . W r a y , W . , B o u l i k a s , T . , W r a y , V . P . & H a n c o c k , R . ( 1 9 8 1 )A n a l . B i o c h e m . 1 1 8 , 1 9 7 - 2 0 3 .1 4 . H a g i w a r a , S . , F u k u d a , J . & E a t o n , D . C . ( 1 9 7 4 ) J . G e n .P h y s i o l . 6 3 , 5 6 4 - 5 7 8 .1 5 . H i l l e , B . ( 1 9 8 4 ) I o n i c C h a n n e l s o f E x c i t a b l e M e m b r a n e s( S i n a u e r , S u n d e r l a n d , M A ) , p . 7 7 .1 6 . K o n g s a m u t , S . & M i l l e r , R . J . ( 1 9 8 6 ) P r o c . N a t I . A c a d . S c i .USA 8 3 , 2 2 4 3 - 2 2 4 7 .1 7 . S u s z k i w , J . B . , O ' L e a r y , M . E . , M u r a w s k y , M. M . & W a n g ,T . ( 1 9 8 6 ) J . N e u r o s c i . 6 , 1 3 4 9 - 1 3 5 7 .1 8 . C r e b a , J . A . & K a r o b a t h , M . ( 1 9 8 6 ) B i o c h e m . B i o p h y s . R e s .Commun. 1 3 4 , 1 0 3 8 - 1 0 4 7 .

3 5 1 0 N e u r o b i o l o g y : B o w e r s e t a l .