t Completo

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

Fundada en 1551

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

ESCUELA DE POST- GRADO

“PRODUCCIÓN DE ENZIMAS PECTINASAS POR ACTINOMYCETOS EN

CULTIVO SUMERGIDO UTILIZANDO PECTINA Y CÁSCARA DE NARANJA”

TESIS

Para optar el Grado académico de:

MAGÍSTER EN BIOTECNOLOGÍA

AUTOR

Alexis Germán Arroyo Orbegoso

LIMA – PERÚ 2002

DEDICATORIA A mis padres: Alipio y Anselma,

por su apoyo y comprensión en

los momentos más difíciles

AGRADECIMIENTOS

Mg. Mirtha Roque Alcarraz y Mg. Juan Carlos Woolcott Hurtado, por la

asesoría y orientación impartida durante el desarrollo de la presente tesis.

Dr. Gerardo Gamarra Ballena, por su enseñanza y colaboración prestada.

Blgo. Luis Vargas Apaza, por su constante aliento, orientación y

colaboración.

Dr. Gerardo Gamarra Ballena, Dra. Amparo Zavaleta Pesantes, Mg. Angel

Narváez Villavicencio, Mg. Mirtha Roque Alcarraz y Mg. Juan Carlos

Woolcott Hurtado, por las sugerencias y correcciones finales realizadas para

el logro de la presente tesis.

ÍNDICE

RESUMEN

SUMMARY

I. INTRODUCCIÓN

II. MARCO TEÓRICO

III. MATERIALES Y MÉTODOS

IV. RESULTADOS

V. DISCUSIÓN

VI. CONCLUSIONES

VII. BIBLIOGRAFÍA

ANEXOS

Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja. Arroyo Orbegoso, Alexís Germán

Elaboración y diseño en formato PDF, por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM

RESUMEN

El objetivo de esta investigación fue seleccionar las condiciones que

permitan la producción de enzimas pectinasas, a partir de cáscaras de naranja,

empleando Actinomyces naeslundii. En la primera fase, se determinaron las

condiciones de pH , temperatura, agitación y aireación, para un buen

crecimiento del microorganismo. En la segunda, se empleó el diseño

experimental Plackett-Burman, mediante la evaluación de ocho nutrientes, con

dos niveles de variación. Los nutrientes fueron: cáscara de naranja, sulfato de

amonio, úrea, sulfato ferroso, cloruro de calcio, cloruro de sodio, sulfato de

magnesio y carbonato de sodio, utilizándose matraces Erlenmeyer con 150 mL

de medio experimental pH 7.00 a 37 ºC y 300 rpm por 5 días. En la tercera

fase, fue realizada la optimización del medio de cultivo experimental, siguiendo

el diseño de Box-Benhken, en el que hubo evaluación de las concentraciones

de cáscara de naranja, sulfato de amonio y sulfato ferroso en tres niveles. Con

los resultados obtenidos, se realizó el análisis de regresión múltiple. Los

cálculos y gráficos estadísticos fueron ejecutados con el software Statistical

2.1. obteniéndose la máxima producción de enzimas, con las siguientes

concentraciones: cáscara de naranja 16.7 g / L, sulfato de amonio 5 g /L y

sulfato ferroso 0.013 g / L, obteniéndose 0.65 U.I. / mL de actividad enzimática,

en tres días de biotransformación.

Palabra clave: biotecnología, enzimas, pectinasas, pectina.



SUMMARY

The objective of this research was to choice the conditions that they

permit to optimize the pectinasas enzymes production using orange skins and

Actinomyces naeslundii; on first phase was used qualitative techniques for to

determinate the conditions of pH, cultivation temperature, agitation and aeration

for a good growth microorganism. On the second phase was used the Plackett-

Burman design through the investigation of eight nutrients with two variation

levels; The eight nutrients was: oranges skin, ammonium sulfate, urea, ferrous

sulfate, calcium chloride, sodium chloride, magnesium sulfate y sodium

carbonate. It was used Erlenmeyer flask with 150 mL of experimental medium

pH 7, to 37 ºC, agitation to 300 rpm for 5 days. Third phase of optimization was

developed through Box- Benhken design, oranges skin, ammonium sulfate and

ferrous sulfate concentration were evaluated on three level. It was realized a

multiple regression analyses with the three variables found previously .

calculus and graphics were developed with Statistical 2.1 software. Optimum

Parameters were: oranges skin 16.7 g / L, ammonium sulfate 5 g / L and

ferrous sulfate 0.013 g / L. it was obtained 0.65 UI / mL of enzymatic activity in

three days of biotransformation.

Key word: biotechnology, enzymes, pectinases, pectin.



I. INTRODUCCIÓN

Las enzimas pectinasas son un conjunto de enzimas que hidrolizan la

pectina. Éstas presentan una extensa aplicación en la industria alimentaria,

principalmente en la obtención y clarificación de jugos, vinos y cervezas

(Fogarty y Ward, 1974; Neubeck, 1975)

Las enzimas pectinasas extracelulares que hidrolizan la pectina pueden

ser producidas por diferentes microorganismos como hongos y bacterias; en

esta investigación trabajamos con una bacteria que en pruebas preliminares

produjo enzimas pectinolíticas.

Siendo el Perú un país rico en productos agrícolas conviene desarrollar

un bioproceso orientado al aprovechamiento integral de recursos provenientes

de la producción agrícola y agroindustrial, además de evitar la contaminación

ambiental, por los residuos provenientes de estas actividades. Uno de estos

residuos por aprovechar es la cáscara de naranja que, por su volumen, resulta

atractivo para la producción industrial de enzimas pectinasas, por lo que, en el

presente trabajo de investigación, se desarrollo un bioproceso a nivel de

laboratorio, para la producción de pectinasas por Actinomyces naeslundii

planteándonos los siguientes objetivos:

- Evaluar los parámetros pH, temperatura, concentración de nutrientes,

aireación y agitación para la producción de enzimas pectinasas en un medio

sintético de laboratorio.

- Evaluar los niveles de producción de pectinasas con los parámetros

establecidos, utilizando un medio natural a base de cáscara de naranja.



II. MARCO TEÓRICO. 2.1. LOS ACTINOMYCETOS:

Los actinomycetos han despertado un gran interés para biotecnólogos,

genetistas y ecologistas, por su habilidad para producir metabolitos

secundarios.

Muchos actinomycetos pueden crecer en los medios comunes usados

en los laboratorios tales como agar nutricio, agar tripticasa soya, agar sangre y

también en agar infusión cerebro corazón.

Los actinomycetos crecerán en caldos, pero necesitan ser cultivadas

bajo condiciones especiales. El crecimiento en un tubo con caldo sin

movimiento se da en la superficie, dejando el resto del caldo intacto. Los

cultivos líquidos requieren considerable agitación y aireación. La agitación

puede estar entre 200 – 250 rpm. para dar la adecuada aireación y

homogenización del medio. De necesitar mayor mezclado, se puede colocar

baffles en la parte interior del recipiente. Conforme avanza el tiempo de cultivo,

el microorganismo crecerá en forma de pellet (Cross, 1980).

Los actinomycetos son un grupo de bacterias filamentosas , GRAM (+) ,

las células que se van a formar son denominadas conidias, además las

encontramos participando en la degradación de desechos orgánicos en los

suelos como el compostaje.

Vistos al microscopio tiene la forma de un hongo pequeño de tamaño

bacteriano; la pared celular está constituida por una serie de ácidos murámicos

y diaminopiméricos, careciendo de pectidoglucanos, característica que ayuda a

reconocer a las bacterias. La composición de la membrana ayudó a excluir a

los actinomycetos de la denominación hongo, por encontrar esteroles en la

membrana. En cuanto al citoplasma, se ha clasificado como microorganismo

procariote debido a que no posee un núcleo y que su cromatina se encuentra

libre en el citoplasma. Su información genética posee una inestabilidad muy



alta. Los actinomycetos generan metabolitos secundarios al final de la fase

logarítmica. En la naturaleza son los mayores productores de antibióticos,

seguidos por los hongos. Tienen la capacidad de degradar pesticidas y

derivados de petróleo. Se han encontrado actinomycetos termófilos que

interviene en el proceso de compostaje, produciendo una serie de enzimas

como las celulasas y amilasas. Los actinomycetos son considerados como los

médicos del suelo.

En los actinomycetos podemos ver actualmente el gran potencial que

tienen en el campo agrícola, biomédico, en la salud y en la biorremediación

(Franco, 2001).

2.2. PECTINAS

Las pectinas o sustancias pécticas son polisacáridos que se componen

principalmente de ácidos poligalacturónicos coloides (poliurónidos derivados

del ácido galacturónico CHO(CHOH)4COOH. Se hallan en los tejidos de las

plantas. Las pectinas son útiles por su capacidad para formar geles o jaleas

con compuestos polihidroxilados, como los azúcares o con cantidades

diminutas de iones polivalentes. En el presente estudio. El vocablo “jalea” se

usará para designar al muy conocido producto semisólido formado por pectina,

azúcar y ácido en condiciones determinadas.

La sustancia que se había supuesto era la causa de que los jugos de

fruta se convirtieran en jalea, fue aislada por Braconnot en 1824, quien la

denominó pectina. Las extensas investigaciones realizadas en los cien años

siguientes esclarecieron las propiedades de las sustancias pécticas, pero poco

hicieron para aclarar su naturaleza química. Entre 1920 y 1940 quedó

establecida la producción de pectinas en escala comercial en cierto número de

naciones y aquéllas llegaron a formar parte importante en el comercio

internacional (Kirk, 1961).

Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja




2.3. ANÁLISIS FÍSICO-QUÍMICO DEL SUSTRAT O (CÁSCARA DE

NARANJA).

CUADRO 1.

COMPOSICIÓN FÍSICO-QUÍMICA DE LA CÁSCARA DE NARANJA

(Demain A. Y Solomon N., 1986).

materia seca 90.00 proteína 6.00

Componentes carbohidratos 62.70principales Grasas 3.40

(%) fibra 13.00 cenizas 6.90 calcio 2.00 magnesio 0.16

Minerales Fósforo 0.10(%) Potasio 0.62

Azufre 0.06 colina 770.00

Vitaminas Niacina 22.00(mg/Kg) ac. Pantoténico 14.96

riboflavina 22.20 arginina 0.28

Aminoácidos Cistina 0.11(%) lisina 0.20

metionina 0.11 triptofano 0.06



2.4. INVESTIGACIONES REFERENTES A LA PRODUCCIÓN DE

PECTINASAS.

En la Fermentación en Sustrato Sólido (FSS), la concentración del

sustrato es mayor que en la Fermentación en Cultivo Sumergido (FCS), debido

a que contiene entre 1 a 10% de agua.(Laukevics, 1988).

En otra investigación, (Solís-Pereira & col., 1996), demostraron que en

una concentración de 5 g/L de glucosa en una FCS la producción de

pectinasas por Aspergillus niger fue reprimida, igualmente como la producción

de otras enzimas hidrolíticas, tales como poligalacturonasas, pectinesterasas y

celulasas; pero en una FSS con concentración de glucosa de 5 g/L la síntesis

de pectinasas no es afectada.

En la FCS el medio es completamente simple, consistiendo en un

producto de la agricultura no refinado, el cual contiene todos los nutrientes

necesarios para el crecimiento microbiano. Los sustratos más empleados en

FSS son productos agrícolas (soya, arroz, trigo, maíz, etc), o subproductos

agro industriales (salvado de trigo, bagazo de caña, residuos de remolacha,

bagazo de cítricos, bagazo de manzana, cáscaras de diversos vegetales, etc.).

Éstos, generalmente, empleados en combinación y/o, complementados con

fuentes de carbono y energía fácilmente metabolizables (almidón,

maltodextrinas, melazas, etc.) y otros nutrientes (úrea, calcio, fosfatos, etc)

(Agosin, 1995).

Estos sustratos son colocados en agua, aunque pueden requerir de

algún pretratamiento. El pretratamiento de estos sustratos ( térmico

principalmente) tiene un doble propósito; esterilización del sustrato y cambios

en las propiedades fisicoquímicas del sustrato (gelatinización del almidón,

aumento de la porosidad, etc.), que influye favorablemente en la degradabilidad

y accesibilidad de los componentes poliméricos (polisacáridos y proteínas) y

estructurales del sustrato (Milstein y Flowers, 1986).



Una producción de pectinasa usando cáscara de limón con diferentes

pretratamientos, fue realizada determinándose pectin esterasa y

poligalacturonasa. Los resultados menos favorables fueron obtenidos usando

cáscara de limón seca; usando cáscara de limón lavada y no lavada los

resultados fueron similares para la poligalacturonasa, en tanto que el nivel de

pectin esterasa fue particularmente alto con cáscara de limón no lavada. Los

bajos niveles de actividad fueron obtenidos cuando las cáscaras se secaron a

una temperatura final de 120 º C, lo cual indica claramente la importancia de

este tratamiento con las cáscaras, cuando es usado para la producción de

pectinasas (Maldonado, 1986).

Por otro lado, se ha probado sulfato de amonio para suplir la fuente de

nitrógeno, debido al menor costo que el fosfato de amonio. El ensayo dio lugar

a una reducción del 20% de actividad pectinasa (Saval y Huitron, 1983).

El pH óptimo de la enzima poligalacturonasa fue probada usando buffer

acetato para pH 2.5 - 4.5 obteniéndose una actividad pectinolítica máxima a un

pH de 3.5 (El Sayed, 1994).

Las bacterias anaeróbicas productoras de pectinasas presentan un buen

crecimiento a pH 7.0 y una temperatura de 45 ºC. La máxima actividad

poligalacturonasa fue de 4.7 U.I./mL hallada en un caldo de fermentación

(Shivakuman, 1995).

En otra investigación (Abdel - Fattah y Ismail, 1996) trabajaron sobre el

efecto de las reacciones al variar valores de pH y Temperatura de las

preparaciones enzimáticas, hallando valores óptimos de 4.5 y 50 º C,

respectivamente.

La producción de pectinasa extracelular es inducida por sustancias

pécticas o por desechos agroindustriales tales como pulpa de limón o naranja,

los cuales tienen apreciables cantidades de pectina ,(Aguilar y Huitron, 1986).



Pectina y glucosa fueron usadas como comparación de fuente de

carbono, los resultados obtenidos con glucosa fueron pobres, considerando la

naturaleza inducible de las enzimas pectinolíticas (Kilara, 1982).

(Sincere, 1989), seleccionaron tres cepas productoras de enzimas

pécticas (Talaromyces flavus, Penicillium charlessi y Tubercularia vulgaris),

utilizando pellets de pulpa de cítricos se obtuvieron actividades pectinolíticas

más altas que las producidas por Aspergillus níger.

En otro estudio de producción de pectinasas bacterianas, utilizando pulpa de

café como sustrato, se encontró 0.76 U (unidades de actividad enzimática) para

pulpa de café húmedo (Cabello y col.,1982).

La presencia de pectina en la composición del medio de cultivo es un

factor importante, ya que influye sobre la diversidad y cantidad de enzimas

pécticas, sabiendo además que la producción de enzimas pectinasas es

inducible y no constitutivo (Trejo y col., 1991).

Moreno y col.,(1995) reportan un estudio de producción de pectinasa a

partir de fermentación en sustrato sólido utilizando cáscara de yuca y limón con

Aspergillus niger ATCC 10864 obteniéndose una productividad volumétrica de

434.4 U.I./(L*h), mayor que otros autores, 39 U.I./(L*h) ( Abdel-Fattah y col.,

1977)

Con respecto a las desventajas que pueden haber en una FSS tenemos

que es un proceso más lento que una FCS, debido a la gruesa barrera de

sólido; también presenta problemas de disipación de calor limitado por la

transferencia de masa intrapartícula (Trejo y col.,1991).

2.5. BIORREACTORES.

El cultivo de bacterias, levaduras y hongos en un cultivo sumergido es

una práctica universal en la industria de fermentaciones, desde la década de

los 40’s. La aplicación de energía a los sistemas de fermentación hace que los



procesos de transporte convectivos sean órdenes de magnitud más rápidos

que los procesos difusionales que controlan el transporte en el cultivo sólido.

Esto ha permitido el desarrollo de procesos de alta productividad que han

hecho del cultivo sumergido la técnica de más uso en la industria de las

fermentaciones. Aunque la agitación mecánica sigue siendo la forma más

usada de aplicar energía.

Independientemente del tipo de cultivo, existen tres consideraciones,

además de la homogenización y la transferencia de oxígeno, que son de

importancia en el diseño de biorreactores: La primera tiene que ver con la

esterilidad. Llevar a cabo un proceso en ausencia de contaminación es un

requisito fundamental. El diseño de tomas de muestras y sellos mecánicos, el

acabado de la superficie del tanque, así como de la conexión de válvulas y

aditamentos, juega un rol importante en un diseño exitoso. Un segundo aspecto

de importancia es la remoción de calor. En vista de que las temperaturas de

fermentación son moderadas (25 a 40 ºC) y que el cultivo de células es un

proceso exotérmico, el control de la temperatura en un biorreactor requiere de

la remoción de cantidades importantes de calor. Un tercer punto de

fundamental importancia son los aspectos mecánicos, la selección de

reductores de velocidad y el diseño de la flecha de agitación (Miranda y col.,

1996).

2.6. ENZIMAS PECTINASAS COMERCIALES.

La moderna tecnología de los zumos de frutas exige una degradación

rápida e intensa de la pectina, con el fin de que el prensado, la clarificación y la

filtración puedan realizarse de una manera segura y económica.

PECTINEX es una preparación purificada, producida por una cepa de

Aspergillus níger. El producto contiene principalmente pectin-transeliminasa,

poligalacturonasa, pectinesterasa y hemicelulasas, siendo capaz de romper

sustancias pécticas vegetales.



PECTINEX y ULTRAZYM son productos que han sido obtenidos como

resultado de una investigación y un desarrollo de varios años. Por su amplio

espectro de acción, satisfacen de manera ideal las diversas exigencias que se

imponen a su sistema óptimo de enzima en cada una de las etapas individuales

de producción. Por lo tanto, PECTINEX y ULTRAZYM permiten asegurar

buenos resultados en todo el mundo, bajo las más diversas condiciones

tecnológicas.

VENTAJAS:

La utilización de PECTINEX y de ULTRAZYM garantizan:

-Durante la acción de la enzima sobre la pulpa:

La mejora en la extracción del zumo, aumentando con ello el rendimiento

global del zumo.

La reducción de los tiempos de prensado, con incremento subsiguiente de la

producción.

La liberación de componentes fundamentales como color, aroma, etc., por

descomposición específica de la pulpa.

- Durante el tratamiento enzimático de los zumos:

El desdoblamiento rápido y completo de la pectina.

La floculación rápida y la sedimentación compacta de las sustancias

enturbiadoras, con un mínimo de clarificantes.

La filtración óptima, con menor gasto de material filtrante.

La estabilidad segura de los zumos completamente claros, de sus

concentrados y de sus diluidos. (Andersen, 1991).

2.7. SITUACIÓN DEL MERCADO INTERNACIONAL DE LAS ENZIMAS.

En el cuadro 2, se muestra la situación del mercado internacional, de

acuerdo con los datos publicados por (Eveleigh y col.,1990). Es impactante, por

un lado, el hecho de que más de 2000 enzimas registradas sólo 60 sean



producidas comercialmente y de éstas sólo cinco cubran más del 80% del

mercado (García y col., 1993).

Es innegable que la expansión del mercado de enzimas observado en

los últimos años en los países de latinoamericana, es un aliciente para la

creación de nuevas empresas nacionales o mixtas que produzcan enzimas a

nivel nacional o subregional (Illanes, 1994).

Cuadro 2.

PRODUCCIÓN MUNDIAL DE ENZIMAS (García y col.,1993)

Enzima Ton / año % del total Proteasa fungal 13 0.95Pectinasa 25 1.83Amilasa fungal 25 1.83Cuajo microbiano 25 1.83Glucosa isomerasa 75 5.50Amilasa bacteriana 325 23.85Amiloglucosidasa 350 25.70Proteasa bacteriana 525 38.51TOTAL 1363 100.00



III. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1 MATERIALES.

3.1.1 MATERIAL BIOLÓGICO:

En el presente trabajo, se utilizó el microorganismo Actinomyces

naeslundii, el cual fue aislado en el Instituto de Microbiología y Biotecnología

"Simón Pérez Alva" de la UNMSM, a partir de una muestra de suelos

naranjales de la localidad de Huaral, distrito de Huando, del departamento de

Lima, e identificado en el Instituto Nacional de Salud (INS)(ANEXO A).

3.1.2 MEDIOS DE CULTIVO:

a).Medios de cultivo complejos:

- Cultivo en sólido: Constituido por Agar Trypticasa Soya y Agar Trypticasa

Soya, suplementado con 1% de pectina cítrica.

- Cultivo en líquido: Constituido por Caldo Trypticasa Soya y Caldo Trypticasa

Soya suplementado con 1% de pectina cítrica.

b).Medio de cultivo experimental:

Constituido por sales minerales y cáscara de naranja como única fuente de

carbono, variando sus concentraciones de acuerdo al siguiente cuadro:



COMPOSICIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO EXPERIMENTAL

NUTRIENTES CONCENTRACIÓN MÍNIMA (g/L)

CONCENTRACIÓN MÁXIMA (g/L)

X1 Cáscara. de naranja 2.000 16.700 X2 (NH4)2 SO4 1.000 5.000 X3 ÚREA 0.700 5.000 X4 FeSO4.7H2O 0.013 0.080 X5 CaCl2 0.020 0.083 X6 NaCl 1.000 5.000 X7 MgSO4.7H2O 0.200 1.000 X8 Na2CO3 0.800 4.000

3.1.3. MATERIALES:

Mechero

Asa de Kolle

Termómetro

Cronómetro

Erlenmeyers de 250 mL

Beakers de 150, 250, 500, 1000 mL

Pipetas de 1, 2, 5, 10, 25 mL

Probetas de 100, 250, 500, 1000 mL

Baguetas

Tubos de ensayo de 15 * 150 mm.

Placas petri

Embudos de vidrio

Kitasato

Tips de 50, 1000, 5000 µL.

Parafilm

Algodón



Pinzas

Gradillas

Filtro gelman 0.2 µM

Bomba de aire de 500 mL / min (URANUS)

3.1.4. REACTIVOS:

Medio Agar Trypticasa Soya (TSA)

Medio Caldo Trypticasa Soya (TSB)

Úrea

Sulfato de magnesio

Cloruro de calcio

Solución amortiguadora (buffer) de fosfato 0.05 M, pH 7

Ácido sulfúrico q.p.

Hidróxido de sodio

Alcohol etílico de 96 º

Agar-agar

Solución amortiguadora (buffer) de acetato 0.05 M, pH 4.8

Solución de pectina al 1%

Reactivo de Ácido 3,5- dinitrosalicilico (DNS) (Miller, 1959)

Estándar de Ácido D-galacturónico para análisis (SIGMA)1 mg /mL

Sulfato de amonio

Tartrato de sodio y potasio

Estándar de Albúmina sérica de bovino 10 mg / mL

Pectina (sigma)

Pectina cítrica de grado alimentario

Cáscaras de naranja

Sulfato ferroso

Cloruro de sodio

Rojo de rutenio



3.1.5. EQUIPOS

Autoclave

Biorreactor de 1 litro

Espectrofotómetro de rango visible SPECTRONIC 20

Estufa con temperatura controlada a 37 º C MEMMERT S 30

Baño maría con temperatura controlada a 37 ºC INSTRUMENTAL.

Horno a 180 º C

Centrífuga

Agitador a 200 r.p.m.

Cocinilla

Refrigeradora

Balanza analítica

Balanza de platillos

Bomba de vacío

Vortex

Equipo de destilación

Micro pipetas de 50, 1000, 5000 µL

3.2. MÉTODOS

3.2.1. ACONDICIONAMIENTO DEL MICROORGANISMO (Cabello y

col.,1982).

El microorganismo que utilizamos en esta investigación fue sembrado

periódicamente, tanto en un medio sólido como en el líquido, de la siguiente

manera:

- Se sembró una colonia de Actinomyces naeslundii en un tubo con Caldo

Trypticasa Soya, suplementado con 1% pectina cítrica, y luego se incubó

durante 5 días a 37 º C.



- A continuación, se realizó una siembra del medio líquido en Agar Trypticasa

Soya, suplementado con 1% pectina cítrica, y se realizó la incubación durante 3

días a 37 º C.

- Posteriormente, se repitieron los pasos anteriores por 60 días.

3.2.2. EVALUACIÓN PRELIMINAR DE LOS PARÁMETROS pH,

TEMPERATURA Y AIREACIÓN-AGITACIÓN EN UN MEDIO SINTÉTICO,

PARA LA PRODUCCIÓN DE PECTINASAS.

a) DETERMINACIÓN DEL pH ÓPTIMO ( Becker y col.,1999).

En primer lugar, el microorganismo fue Inoculado en caldos de TSB,

amortiguados a tres pH (5, 7 y 8.5); a continuación, se incubó en estufa a 37

ºC por 72 horas; y, finalmente, se midió la masa celular por espectrofotometría

a 600 nm.

b) DETERMINACIÓN DE LA TEMPERATURA ÓPTIMA (Becker y col.,1999).

En el presente caso, se siguió el siguiente procedimiento:

- Inoculación del microorganismo en caldos de TSB

-Incubación de los tubos los tubos a temperaturas de 28ºC, 37ºC y 45 ºC

durante 72 horas

-Medición de la masa celular, por espectrofotometría a 600 nm.

c) DETERMINACIÓN DE LA AIREACIÓN-AGITACIÓN (Becker y col.,1999).

La aireación-agitación se evaluó a las 72 horas de incubación, a 37 ºC,

comparando el aumento de la masa microbiana por espectrofotometría, a 600

nm de los tubos con caldo control de TSB, en dos condiciones

experimentales:

-Tubos con sello de parafina estéril y sin agitación (SIN aireación-agitación)

-Tubos sin sello de parafina estéril y con agitación (CON aireación-agitación)



3.2.3. CONDICIONES DEL PROCESO DE BIOTRANSFORMACIÓN:

a) ACONDICIONAMIENTO DEL SUSTRATO

Se utilizó cáscara de naranja como sustrato para la biotransformación, la cual

tuvo el siguiente tratamiento:

La cáscara de naranja fue recolectada de comerciantes de jugo de naranja

cercanos a la UNMSM. Enseguida, se extrajo el aceite de la cáscara de naranja

utilizando un equipo de arrastre al vapor; a continuación, la cáscara fue secada

a 80 º C por 24 horas en estufa. Posteriormente, la cáscara de naranja fue

triturada en un molino manual de tornillo sin fin y tamizada a un tamaño de

partícula menor a 0.5 mm de diámetro

b) MANTENIMIENTO DEL MICROORGANISMO: El microorganismo

Actinomyces naeslundii se mantuvo por resiembras periódicas en el medio

Agar Trypticasa Soya (TSA), suplementado con 1 % de pectina cítrica. Las

condiciones de crecimiento del microorganismo fueron de 37 ºC durante 24

horas.

c) PREPARACIÓN DEL INÓCULO: El inóculo se preparó a partir de un cultivo

de 24 horas, haciendo diluciones de éste en solución fisiológica estéril, hasta

obtener una suspensión de células de 3 x 10 9 u.f.c./mL. De aquí, se tomaron

alícuotas de 45 mL, que se transfirieron a matraces erlenmeyer cuyos

contenidos fueron de 150 mL.

d) DISEÑO DEL MEDIO DE CULTIVO EXPERIMENTAL : El medio de cultivo

estuvo representado por nutrientes ubicados dentro de un rango mínimo-

máximo:



CUADRO 3. COMPOSICIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO EXPERIMENTAL

NUTRIENTES CONCENTRACIÓN

MÍNIMA (g/L) CONCENTRACIÓN

MÁXIMA (g/L) X1 Cáscara de naranja 2.000 16.700 X2 (NH4)2 SO4 1.000 5.000 X3 ÚREA 0.700 5.000 X4 FeSO4.7H2O 0.013 0.080 X5 CaCl2 0.020 0.083 X6 NaCl 1.000 5.000 X7 MgSO4.7H2O 0.200 1.000 X8 Na2CO3 0.800 4.000

Estos componentes fueron evaluados en una plantilla estadística de PlacKett-

Burman, de donde se obtuvo los nutrientes más significativos para la

producción de enzimas pectinasas.

e). OBTENCIÓN DE PECTINASAS: La obtención del extracto enzimático crudo

fue realizada por centrifugación, a 5000 rpm por 20 minutos de las muestras

constituidas por 5mL de cultivo, tomadas cada 8 horas, durante 7 días.

3.2.4. MÉTODOS DE ANÁLISIS:

a) DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE LA ACTIVIDAD PECTINOLÍTICA:

La Actividad enzimática del extracto obtenido luego de la biotransformación, fue

evaluada por la liberación de azúcares reductores de la pectina (1% p/v pectina

sigma); la cual fue medida colorimétricamente, con el reactivo ácido 3,5 -

dinitrosalicílico (DNS). Se realizó una curva estándar de ácido D-galacturónico

al 1% preparado en solución amortiguadora de acetato 0.1M y pH 4.8 (Miller y

col., 1959) teniendo en cuenta que una unidad enzimática se definió como la



cantidad de enzima que liberó 1µM de ácido D-galacturónico por minuto a 50

ºC (ANEXO M ).

b) DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE BIOMASA: Fue utilizada

la técnica de recuento en placa de células viables, para lo cual se tomaron

alícuotas del cultivo cada 8 horas (1 mL);luego, se realizó diluciones seriadas,

para colocar 0.1 mL de células diluidas en la superficie de una placa TSA,

extendiéndose éstas, con una asa de Drigalski, e incubadas, finalmente, a 37

ºC (ANEXO C).

3.2.5. ANÁLISIS ESTADÍSTICO:

a) ANÁLISIS Y SELECCIÓN DE NUTRIENTES MÁS INFLUYENTES EN LA

PRODUCCIÓN DE PECTINASAS.

En una primera etapa de análisis se utilizó el diseño experimental de

Plackett-Burman para identificar los nutrientes de mayor influencia en la

producción de pectinasas, esto permitió evaluar 8 variables en 12

experimentos con 2 réplicas, teniendo en cuenta una concentración alta (+1) y

una baja (-1) de cada uno de los nutrientes. La evaluación de los mismos, se

realizó en frascos erlenmeyers de 250 mL de capacidad, que contenían 150

mL de medio experimental.



CUADRO 4.

PLANTILLA DE PLACKETT BURMAN ( Ayala y Pardo,1995 )

VARIABLES

N

X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 1 1 1 -1 1 1 -1 -1 -12 1 -1 1 1 -1 -1 1 13 -1 1 1 -1 -1 -1 -1 14 1 1 1 -1 -1 1 1 -15 1 1 -1 -1 1 -1 1 16 1 -1 -1 1 -1 1 -1 17 -1 -1 -1 -1 1 1 1 18 -1 -1 1 1 1 -1 1 -19 -1 1 -1 1 -1 1 1 -1

10 1 -1 1 -1 1 1 -1 -111 -1 1 1 1 1 1 -1 112 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1

Donde:

X1= Cáscara de naranja. X5= CaCl2

X2= (NH4)2SO4 X6= NaCl

X3= (NH2)2CO X7= MgSO4

X4= FeSO4*7H2O X8= Na2CO3

b) OPTIMIZACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE NUTRIENTES PARA LA

MÁXIMA PRODUCCIÓN DE PECTINASAS.

Se utilizó el Diseño de Box – Benhken, el cual sirvió para determinar las

concentraciones óptimas de cada variable independiente (X1= Cáscara de

naranja; X2= (NH4)2 SO4 y X4= FeSO4. 7H2O ), para la máxima producción de

pectinasas, diseño que fue complementado con la técnica de análisis de

respuesta superficial a las variables independientes anteriores, para luego

ajustarlas al modelo polinomial cuadrático siguiente:



Z=b0+b1*X1+b2*X2+b3*X4+b4*X1*X2+b5*X1*X4+b6*X2*X4+b7*X12+b8*X2

2+b9*X42

Donde:

Z = Variable dependiente (Producción de enzima)

X1= Cáscara de naranja. X2= (NH4)2SO4. X4= FeSO4*7H2O.

b0 = Constante por determinar

b1, b2, b3 = Coeficientes lineales por determinar

b4, b5, b6, b7, b8, b9 = Coeficientes cuadráticos por determinar

CUADRO 5.

PLANTILLA DE BOX BENHKEN (Robles y Col. 1995)

VARIABLES N

X1 X2 X4 1 1 1 1 2 1 -1 -1 3 1 1 0 4 1 0 -1 5 1 0 -1 6 1 -1 0 7 -1 1 1 8 -1 1 -1 9 -1 0 0

10 -1 0 -1 11 -1 0 1 12 -1 1 0 13 0 1 -1 14 -1 -1 -1 15 0 0 0

16 0 0 0

Para la identificación de un valor óptimo, fue necesario estimar la

curvatura de las variables ensayadas, determinándose los coeficientes del

modelo polinomial, usando la técnica de regresión múltiple, cuyos valores

fueron asignados a las ecuaciones XY polinomiales, para generar respuestas

predictivas (representadas en los gráficos de respuesta en superficie y de

líneas de contorno).



c) BIOTRANSFORMACIÓN FINAL EN BIORREACTOR.

Con las concentraciones óptimas obtenidas del experimento anterior, se

realizó un último experimento, en el cual fueron evaluados el crecimiento

microbiano y la actividad enzimática, utilizando para ello un inóculo en fase

logarítmica con la finalidad de aprovechar la fuente de carbono en el

mantenimiento del microorganismo.

Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja. Arroyo Orbegoso, Alexis Germán


IV. RESULTADOS

4.1. EVALUACIÓN PRELIMINAR DE LOS PARÁMETROS CINÉTICOS pH,

TEMPERATURA Y AIREACIÓN-AGITACIÓN EN UN MEDIO SINTÉTICO,

PARA LA PRODUCCIÓN DE PECTINASAS.

4.1.1. DETERMINACIÓN DEL pH ÓPTIMO

FIGURA 1. EFECTO DEL pH SOBRE EL CRECIMIENTO DEL

MICROORGANISMO

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

5.0 7.0 8.5

pH

Den

sid

ad ó

pti

ca a

600

nm



FIGURA 2. CRECIMIENTO DEL MICROORGANISMO A DIFERENTES pH

Tubo # (1 2 3 ) (4 5 6) (7 8 9 10)

pH = 7.0 pH = 8.5 pH = 5.0

4.1.2. DETERMINACIÓN DE LA TEMPERATURA ÓPTIMA

La evaluación del crecimiento del microorganismo vs. temperatura en

caldo TSB , determinó que la temperatura óptima fue de 37 ºC, luego de 72

horas de incubación (Figura 3).



FIGURA 3. EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE EL CRECIMIENTO

DEL MICROORGANISMO

00.10.20.30.40.50.60.7

28 37 45

Temperatura ( ºC )

Den

sid

ad ó

pti

ca a

600

n

m

4.1.3. DETERMINACIÓN DE LA AIREACIÓN-AGITACIÓN

En experimentos previos se determinó que la mayor concentración de

biomasa ( D.O. 0.65) se obtuvo en un medio control con aireación-agitación a

300 rpm. Estos resultados, presentaron la necesidad de fijar valores de

agitación 300 rpm y aireación 0.5 vvm, para el proceso de biotransformación

sobre medio natural. (Figura 4).



FIGURA 4. EFECTO DE LA AIREACIÓN-AGITACIÓN EN EL CRECIMIENTO

DEL MICROORGANISMO

00.10.20.30.40.50.60.7

SIN CON

AIREACION-AGITACION

Den

sid

ad ó

pti

ca a

600

nm

4.2. CRECIMIENTO DEL MICROORGANISMO Y PRODUCCIÓN DE

PECTINASAS.

En la Figura 5, se observa que la máxima producción de pectinasas es

alcanzada en la etapa estacionaria del crecimiento microbiano, es decir, a las

64 horas.



FIGURA 5. CURVA DE CRECIMIENTO DEL MICROORGANISMO Y

PRODUCCIÓN DE PECTINASAS EN MEDIO TS- PECTINA 1%

5.00

5.50

6.00

6.50

7.00

7.50

8.00

8.50

9.00

9.50

10.00

0 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80 88 96 104

112

120

Tiempo (horas)

Lo

g (

ufc

/mL

)

0.00

0.10

0.20

0.30

0.40

0.50

0.60

0.70

0.80

0.90

AC

T. P

EC

TIN

AS

A U

I/mL

Log N° DE (ufc/ml). ACTIVIDAD PECTINASA ( U.I/ml )

4.3. PROCESO DE BIOTRANSFORMACIÓN

4.3.1. ANÁLISIS Y SELECCIÓN DE NUTRIENTES MÁS INFLUYENTES EN

LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS PECTINASAS.

El análisis del diseño de Plackett Burman demostró que los nutrientes

que más influyeron sobre la producción de pectinasas fueron: Cáscara de

naranja , (NH4)2SO4 y FeSO4*7H2O, seleccionándose éstos, para un análisis

posterior de optimización ( ANEXO K ).



4.3.2.OPTIMIZACIÓN DE LOS 3 NUTRIENTES SELECCIONADOS EN LA

ETAPA ANTERIOR.

Mediante la optimización de los 3 nutrientes más influyentes, utilizando

el diseño de Box Benhken, obtuvimos los siguientes resultados:

Cáscara de naranja ( 16.7 g/ L ), (NH4)2SO4 (5 g/ L ), FeSO4*7H2O (0.013 g/ L )

y una producción máxima predictiva de pectinasas de 0.71 U.I./mL (ANEXOS

L, L.1 y L.2).

4.3.3. BIOTRANSFORMACIÓN FINAL EN BIORREACTOR

La cinética microbiana, llevada a cabo con los resultados obtenidos del

diseño de Box Benhken, maximizó la respuesta entre las 60 y 80 horas, tiempo

en el que se logró una producción de 0.65 U.I./mL de la enzima.

CUADRO 6.

CONCENTRACIONES ÓPTIMAS A TRABAJAR EN BIORREACTOR

VARIABLES CONCENTRACIÓN (g / L)

VALORES X1 = Cáscara de naranja 16.700

ÓPTIMOS x2 = (NH4)2 SO4 5.000 X4 = FeSO4.7H2O 0.013 X3 = (NH2)2CO 2.850

VALORES X5 = CaCl2 0.051 MEDIOS X6 = NaCl 3.000

X7 = MgSO4 0.600 X8 = Na2CO3 2.400



Volumen del medio experimental : 1000 mL

Concentración celular del inóculo : 3 x 10 9 u.f.c / mL

Tiempo de biotransformación : 120 horas

Volumen de inóculo : 100 mL

Temperatura : 37 ºC

Aireación : 0.5 vvm.

Agitación : 300 rpm.

pH : 7.0

En el resultado del crecimiento de la población microbiana que se

muestra en la Figura 6, podemos notar que éste obtuvo un máximo valor entre

las 60 y 80 horas de transcurrido el proceso de biotransformación.

En la misma figura, se muestra la producción de pectinasas, durante el

proceso de biotransformación, registrándose una alta producción de 0.65

U.I./mL a las 72 horas, valor muy cercano a lo pronosticado en las Curvas de

Superficie Respuesta 0.71 U.I./mL (ANEXO L.2).



FIGURA 6. CINÉTICA DE CRECIMIENTO Y PRODUCCIÓN DE

PECTINASAS POR Actinomyces naeslundii EN UN BIORREACTOR DE 1

LITRO

5.005.506.006.507.007.508.008.509.009.50

10.00

0 16 32 48 64 80 96 112

Tiempo (horas)

Lo

g (

ufc

/mL

)

0.00

0.10

0.20

0.30

0.40

0.50

0.60

0.70

Act

. pec

tin

asa

(UI/m

L)

Log N° DE ufc/mL. ACTIVIDAD PECTINASA ( U.I/mL )



V. DISCUSIÓN

El crecimiento de Actinomyces naeslundii en caldo TSB suplementado

con 1% de pectina evidenció a las 48 horas un mayor desarrollo a pH 7.0 y

temperatura de 37ºC (Figuras 1,2,3) que a los pH 5.0 y 8.5 y a las

temperaturas de 28 y 45 ºC. Los valores de pH y temperatura óptimos

obtenidos, concuerdan con lo reportado por Bergey(1974), donde menciona un

pH 7.0 y una temperatura de 37 º C, para un buen crecimiento de Actinomyces

naeslundii, por lo que en adelante se trabajó con una solución amortiguadora

de fosfato a pH 7.0.

En el experimento se determinó que el microorganismo necesitó

aireación y agitación, para un mayor crecimiento, concordando con lo expuesto

por Cross (1980). Los valores de 0.5 vvm para la aireación y de 300 rpm para

la agitación fueron fijados en el presente trabajo (Figura 4). No se reportan

resultados comparativos en la literatura citada ya que, dichos trabajos se

realizaron mayormente a nivel de erlenmeyers, procedimientos que dificultan la

evaluación de las variables antes mencionadas.

La producción de pectinasas por Actinomyces naeslundii ,en medio

líquido (Figura 5), evidenció que la enzima alcanza su mayor rendimiento al

final de la etapa logarítmica del crecimiento microbiano, lo cual ratifica lo

expuesto por Franco (2001) y también concuerda con lo obtenido por Aguilar y

Huitron, (1986) en el sentido de que las pectinasas son enzimas inducidas por

la presencia de sustancias pécticas

El análisis estadístico, mediante el diseño experimental de Plackett

Burman, permitió seleccionar los nutrientes más influyentes en el proceso de

biotransformación, los cuales fueron posteriormente ajustados con el diseño de



Box Benhken, obteniendo finalmente valores óptimos para cáscara de naranja,

16.7 g/ L; (NH4)2SO4 ,5 g/ L; FeSO4*7H2O, 0.013 g/ L. La utilización de estos

diseños estadísticos han sido desarrollados también por otros autores como:

Robles H.,(1995); Miranda y col.,(1996);Trujillo y col.,(2001); y Vasquez y

col.,(2001).

En el trabajo de investigación se obtuvo una correlación estadística de

0.84, lo cual significa que la ecuación de coeficientes se acerca al evento

experimental, para la producción de pectinasas. Las Figuras L.1.4, L.1.5, L.1.6,

y L.1.8 muestran un equilibrio inestable que perjudica el análisis de

óptimización y nos aleja de la solución. Mientras que las Figuras L.1.1, L.1.2,

L.1.3, L.1.7 y L.1.9 muestran tendencias hacia la maximización de la

producción de enzimas, siendo la más representativa la Figura L.1.7, donde se

puede apreciar que la elevación de la concentración de X1 (cáscara de

naranja) y la disminución de X4 (FeSO4*7H2O), estimularía la producción de

pectinasas, además de una mejor correlación.

Al comparar las actividades enzimáticas máximas producidas en el

medio TSB, suplementado con 1% de pectina y el medio experimental

desarrollado, cuyos valores fueron 0.80 U.I./mL y 0.65U.I./mL respectivamente,

se encontró que en el primer medio hay mayor actividad enzimática, debido a la

mejor disponibilidad de Actinomyces naeslundii , para utilizar la pectina en

estado libre que, atrapada en partículas de cáscaras de naranja. Asimismo, el

valor de 0.65 U.I./mL de actividad enzimática es menor que lo reportado por

otros investigadores como Cabello y col. (1982), quienes obtuvieron 3.77

U.I./mL de actividad producidas por un Bacillus. Spp. en un medio sumergido,

constituido por pulpa de café, sales minerales y agua.



VI. CONCLUSIONES

1. Se obtuvo una actividad enzimática de 0.65 U.I./mL en cultivo sumergido en

medio óptimizado, compuesto por cáscara de naranja 16.5 g/L, (NH4) 2SO4 5

g/L y FeSO4*7H2O 0.013 g/L.

2. Las condiciones de crecimiento y producción de pectinasas por Actinomyces

naeslundii son: pH 7.0, 37 ºC, 300 rpm y 0.5 vvm de aireación.



VII. BIBLIOGRAFÍA

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PERÚ.



ANEXOS

A. IDENTIFICACIÓN FENOTÍPICA DE Actinomyces naeslundii

Morfología de la colonia: circular, entera, convexa y de color blanco

Estudio microscópico: La observación microscópica se realizó a un cultivo

joven de 24 horas, resultando una coloración GRAM POSITIVO

CUADRO 7.

PRUEBAS BIOQUÍMICAS

CARACTERÍSTICAS RESULTADOS Formación de ácidos

Arabinosa Negativo Fructosa Positivo

Galactosa Positivo

Glucosa Positivo Manitol Negativo Ribosa Negativo Xilosa Negativo Almidón soluble Positivo

Catalasa Negativo Motilidad Positiva Indol Negativo NO3 - NO2 Positivo Voges- Proskaeur Negativo Ureasa Negativo Hidrólisis de gelatina Negativo Hidrólisis de Pectina Positivo

Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, I pp .663 –665.

Con las pruebas anteriores y otras adicionales, se identificó que nuestro

microorganismo fue Actinomyces naeslundii



B EVALUACIÓN CUALITATIVA DE LA ACTIVIDAD PECTINASA DE

Actynomices naeslundii.( Mc Kay., 1988)

- Se sembró por puntura en una placa petri con agar control TSA suplementado

con 1% de pectina cítrica, incubándose, enseguida, a 37 º C por 5 días. Luego,

la placa fue colocada a 50 º C por 48 horas. A continuación, se retiró la colonia

crecida por lavados sucesivos con agua destilada estéril. Finalmente, se

adicionó el reactivo rojo de rutenio al 1 % sobre el área donde estuvo la

colonia, tornándose ésta de un color púrpura, lo cual evidenció la degradación

de la pectina.

ACTIVIDAD HIDROLÍTICA DEL MICROORGANISMO SOBRE LA PECTINA



C. RECUENTO DE CÉLULAS VIABLES (Becker y col.,1999)

- Tomar una muestra de cultivo, y hacer diluciones 10X (Cada dilución 10X se

prepara añadiendo 1 mL de células a 9 mL de diluyente estéril).

- Colocar 0.1 mL de células diluidas sobre la superficie de una placa de agar

TSA.

- Después de colocar la alícuota de 0.1 mL de células diluidas sobre la placa de

agar TSA, la gota se extiende sobre la superficie con un asa de Drigalski (a

modo de palo de hockey).

- Una vez que la superficie de la placa está seca, se coloca ésta en la estufa de

incubación a 37 ºC

D. SOLUCIÓN AMORTIGUADORA DE ACETATO DE SODIO pH 5, 0.015M:

CH3COOH 0.3264 g/L

CH3COONa 0.7839 g/L

Agua destilada 1000 mL

E. SOLUCIÓN AMORTIGUADORA DE FOSFATO DE SODIO pH 7, 0.015M:

NaH2PO4 0.497 g/L

Na2HPO4 1.618 g/L


F. SOLUCIÓN AMORTIGUADORA DE FOSFATO DE SODIO pH 8.5,

0.015M:

NaH2PO4 0.04 g/L

Na2HPO4 2.087 g/L




G.1. EVALUACIÓN DE LA TEMPERATURA

N Densidad óptica a 600 nm

28 º C 37 ºC 45 ºC 1 0.18 0.62 0.38 2 0.22 0.75 0.41 3 0.28 0.60 0.34 4 0.30 0.78 0.30 5 0.38 0.55 0.25

PROMEDIO 0.27 0.66 0.34

G.2. EVALUACIÓN DEL pH

N Densidad óptica a 600 nm

5 7 8.5 1 0.15 0.71 0.13 2 0.19 0.60 0.20 3 0.23 0.73 0.15

PROMEDIO 0.19 0.68 0.16

G.3. EVALUACIÓN DE LA AIREACIÓN-AGITACIÓN

N Densidad óptica a 600 nm. sin aireación-agitación con aireación-agitación

1 0.38 0.642 0.31 0.583 0.44 0.72

PROMEDIO 0.38 0.65



H. ANÁLISIS FÍSICO-QUÍMICO DE LA CÁSCARA DE NARANJA

ANÁLISIS FÍSICO-QUÍMICO % materia seca (AOAC, 1961) 92.00 Proteína (AOAC, 1961) 4.00 Pectina (Kirk, 1961) 4.00 Aceites y grasas (UNI,1994) 2.50 Cenizas (AOAC, 1961) 5.00

I. CURVA DE CRECIMIENTO DEL MICROORGANISMO Y

ACTIVIDAD ENZIMÁTICA EN UN MEDIO TSB SUPLEMENTADO

CON 1% PECTINA

II.

TIEMPO Log N° DE ACTIVIDAD (Horas) ufc / mL PECTINASA

( U.I/mL ) 0 6.48 0.00 8 6.49 0.00 16 6.45 0.05 24 6.81 0.10 32 6.48 0.12 40 6.49 0.21 48 9.45 0.22 56 9.48 0.61 64 9.43 0.80 72 9.48 0.77 80 9.46 0.74 88 9.00 0.72 96 8.93 0.68

104 7.15 0.59 112 6.08 0.50 120 5.60 0.40



J. CRECIMIENTO DEL MICROORGANISMO EN UN MEDIO CÁSCARA

DE NARANJA

TIEMPO NÚMERO

DE Log N° DE ACTIVIDAD

ENZIMÁTICA PROTEÍNA

(Horas) CÉLULAS CEL/mL PECTINASA TOTAL ( u.f.c / mL ) ( U.I/mL ) (mg/Ml) 0 3.0*108 8.48 0.00 0.00 8 3.2*108 8.51 0.00 0.00

16 3.1*108 8.49 0.11 0.00 24 6.9*108 8.84 0.26 0.07

32 8.0*108 8.90 0.26 0.11 40 5.8*108 8.76 0.27 0.11 48 10.3*108 9.01 0.40 0.16 56 5.1*108 8.71 0.58 0.23 64 22.0*108 9.34 0.64 0.24 72 3.5*109 9.54 0.65 0.25 80 3.0*109 9.48 0.62 0.26 88 12.3*108 9.09 0.52 0.19 96 96.0*107 8.98 0.49 0.15 104 16.1*106 7.21 0.46 0.12 112 14.2*105 6.15 0.40 0.09

120 3.5*105 5.54 0.38 0.09













L.1. FIGURAS REFERENTES A LAS ECUACIONES XY POLINOMIALES PARA EL CÁLCULO DE LAS RESPUESTAS EN SUPERFICIE Y LÍNEAS DE CONTORNO DE LA PRODUCCIÓN DE PECTINASAS

FIGURA L.1.1

RESPUESTA EN SUPERFICIE DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS CUANDO

X4 = FeSO4 * 7H2O = 0.08 g / L

0.345 0.366 0.387 0.408 0.430 0.451 0.472 0.493 0.514 0.535 above

Function Plot (NEW.STA 10v*10c)

Z=0.7199-0.01064*x-0.1432*y-0.0005*x^2+0.0179*y^2+0.00221*x*y

LÍNEAS DE CONTORNO DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS CUANDO X4 = FeSO4 * 7H2O = 0.08 g / L

0.345 0.366 0.387 0.408 0.429 0.451 0.472 0.493 0.514 0.535

3D Contour Plot (NEW.STA 10v*10c)Z=0.7199-0.01064*x-0.1432*y-0.0005*x^2+0.0179*y^2+0.00221*x*y

X1 = CASC. NARANJA g / Lt

X2

= (

NH

4 )

2SO

4 g

/ Lt

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16



FIGURA L.1.2

RESPUESTA EN SUPERFICIE DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS CUANDO

X4 = FeSO4 * 7H2O = 0.0465 g / L

0.269 0.302 0.334 0.367 0.399 0.431 0.464 0.496 0.529 0.561 above


Z=0.4929+0.0008*x-0.08854*y-0.0005*x^2+0.0179*y^2+0.00221*x*y


0.269 0.302 0.334 0.367 0.399 0.431 0.464 0.496 0.529 0.561

3D Contour Plot (NEW.STA 10v*10c)

Z=0.4929+0.0008*x-0.0885*y-0.0005*x^2+0.0179*y^2+0.002210*x*y

CASC. NARANJA g / Lt

( NH

4 )2

SO

4 g

/ Lt

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16



FIGURA L.1.3

RESPUESTA EN SUPERFICIE DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS CUANDO X4 = FeSO4 * 7H2O = 0.013 g / L

0.274 0.321 0.369 0.417 0.465 0.513 0.561 0.608 0.656 0.704 above


Z=0.7199-0.0106*x-0.1432*y-0.0005*x^2+0.0179*y^2+0.00221*x*y


0.274 0.321 0.369 0.417 0.465 0.513 0.561 0.608 0.656 0.704

3D Contour Plot (NEW.STA 10v*10c)Z=0.7199-0.01064*x-0.1432*y-0.0005*x^2+0.0179*y^2+0.00221*x*y


( N

H4

)2 S

O4

g / L

t

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16



FIGURA L.1.4

RESPUESTA EN SUPERFICIE DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS CUANDO X1 = CASC. NARANJA = 16.7 g / L

0.153 0.195 0.237 0.278 0.320 0.362 0.404 0.446 0.488 0.530 above


Z=0.2184+0.0242*x+4.1914*y+0.0179*x^2-24.895*y^2-1.6309*x*y

LÍNEAS DE CONTORNO DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS CUANDO X1 = CASC. NARANJA = 16.7 g / L.

0.153 0.195 0.237 0.278 0.320 0.362 0.404 0.446 0.488 0.530

3D Contour Plot (NEW.STA 10v*10c)Z=0.2184+0.0242*x+4.1914*y+0.0179*x^2-24.895*y^2-1.6309*x*y

( NH4 )2 SO4 g / Lt

Fe S

O4

* 7

H2O

g /

Lt

0.013

0.018

0.023

0.028

0.033

0.038

0.043

0.048

0.053

0.058

0.063

0.068

0.073

0.078

1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0



FIGURA L.1.5

RESPUESTA EN SUPERFICIE DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS CUANDO X1 = CASC. NARANJA = 9.35 g / L

0.306 0.340 0.375 0.410 0.445 0.479 0.514 0.549 0.583 0.618 above


Z=0.1979+0.01797*x+6.6939*y+0.0179*x^2-24.895*y^2-1.6309*x*y

LÍNEAS DE CONTORNO DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS CUANDO X1 = CASC. NARANJA = 9.35 g / L

0.306 0.340 0.375 0.410 0.445 0.479 0.514 0.549 0.583 0.618

3D Contour Plot (NEW.STA 10v*10c)Z=0.1979+0.01797*x+6.6939*y+0.0179*x^2-24.895*y^2-1.6309*x*y

( NH4 )2 SO4 g / Lt

Fe S

O4

* 7

H2O

g /

Lt

0.013

0.018

0.023

0.028

0.033

0.038

0.043

0.048

0.053

0.058

0.063

0.068

0.073

0.078

1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0



FIGURA L.1.6

RESPUESTA EN SUPERFICIE DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS CUANDO X1 = CASC. NARANJA = 2 g / L

0.259 0.293 0.326 0.360 0.393 0.426 0.460 0.493 0.527 0.560 above

Function Plot (NEW.STA 10v*10c)Z=0.12008-0.00828*x+9.19944*y+0.0179*x^2-24.895*y^2-1.6309*x*y

LÍNEAS DE CONTORNO DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS CUANDO X1 = CASC. NARANJA = 2 g / L

0.259 0.293 0.326 0.360 0.393 0.426 0.460 0.493 0.527 0.560

3D Contour Plot (NEW.STA 10v*10c)Z=0.12008-0.00828*x+9.1994*y+0.0179*x^2-24.895*y^2-1.6309*x*y

( NH4 )2 SO4 g / Lt

Fe S

O4

* 7H

2O

g / L

t

0.013

0.018

0.023

0.028

0.033

0.038

0.043

0.048

0.053

0.058

0.063

0.068

0.073

0.078

1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0



FIGURA L.1.7

RESPUESTA EN SUPERFICIE DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS CUANDO X2 = (NH4)2 SO4 = 5 g / L

0.354 0.394 0.434 0.473 0.513 0.553 0.593 0.633 0.673 0.712 above


Z=0.473+0.02765*x+1.7229*y-0.0005*x^2-24.895*y^2-0.3405*x*y

LÍNEAS DE CONTORNO DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS CUANDO X2 = (NH4)2 SO4 = 5 g / L

0.354 0.394 0.434 0.473 0.513 0.553 0.593 0.633 0.673 0.712


Z=0.473+0.02765*x+1.7229*y-0.0005*x^2-24.895*y^2-0.3405*x*y


Fe

SO

4 *

7H2O

g /

Lt

0.013

0.018

0.023

0.028

0.033

0.038

0.043

0.048

0.053

0.058

0.063

0.068

0.073

0.078

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16



FIGURA L.1.8


0.256 0.275 0.294 0.313 0.332 0.351 0.370 0.388 0.407 0.426 above

Function Plot (NEW.STA 10v*10c)Z=0.06701+0.02323*x+4.9847*y-0.0005*x^2-24.895*y^2-0.34048*x*y


0.256 0.275 0.294 0.313 0.332 0.351 0.370 0.388 0.407 0.426


Z=0.06701+0.02323*x+4.9847*y-0.0005*x^2-24.895*y^2-0.34048*x*y


Fe

SO

4 *

7H2O

g /

Lt

0.013

0.018

0.023

0.028

0.033

0.038

0.043

0.048

0.053

0.058

0.063

0.068

0.073

0.078

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16



FIGURA L.1.9


0.259 0.293 0.326 0.360 0.393 0.426 0.460 0.493 0.527 0.560 above

Function Plot (NEW.STA 10v*10c)Z=0.0942+0.01881*x+8.2465*y-0.0005*x^2-24.895*y^2-0.34048*x*y


0.259 0.293 0.326 0.360 0.393 0.426 0.460 0.493 0.527 0.560


Z=0.0942+0.01881*x+8.2465*y-0.0005*x^2-24.895*y^2-0.34048*x*y


Fe

SO

4 *

7H2O

g /

Lt

0.013

0.018

0.023

0.028

0.033

0.038

0.043

0.048

0.053

0.058

0.063

0.068

0.073

0.078

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16





M. DETERMINACIÓN COLORIMÉTRICA DEL ÁCIDO D-

GALACTURÓNICO (MÉTODO DE MILLER & COL., 1959).

Procedimiento:

BLANCO MUESTRA volúmen de medio 0.5 mL 0.5 mL buffer acetato 1.0 mL 1.0 mL Llevar a ebullición 10 min ------ preincubación 50 ºC x 15 min 50 ºC x 15 min sustrato (pectina al 1%) 0.5 mL 0.5 mL Incubar 50 ºC x 30 min 50 ºC x 30 min DNS 3.0 ML 3.0 mL centrifugar a 4000 rpm x 10 minutos decantar y llevar a 100 ºC x 5 minutos leer la absorvancia a 540 nm

CURVA STANDARD DE ACIDO D-GALACTURÓNICO

00.20.40.60.8

11.21.41.61.8

2

0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1

Acido D-galacturónico (mg/mL)

Ab

sorv

anci

a (5

40 n

m)



Actividad Enzimática ( UI / mL ) = ( M – B ) * 103 ? moles

PM * (Tiempo de reacción de 30 min)

Donde:

M, B = concentración de ácido D - galacturónico en mg / mL

PM = peso molecular del ácido D – galacturónico ( 212.2 )

N.

BIORREACTOR UTILIZADO PARA LA PRODUCCIÓN DE PECTINASAS

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