BIOQUÍMICA-1º de Medicina Dpto. Biología Molecular

Jesús Navas

Tema 6. ENZIMAS. Clasificación. Principios de la catálisis enzimática. Energía de activación. Velocidad de reacción y equilibrio de reacción. Cinética enzimática: ecuación de Michaelis-Menten. Ecuación de los dobles recíprocos. Inhibición enzimática. Tipos de inhibición. Mecanismos de regulación de la actividad enzimática: alosterismo, modificación covalente, proenzimas.Isoenzimas

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ENZIMAS

• Catalizadores de las reacciones biológicas.• La mayoría son proteínas aunque hay moléculas de RNA

con actividad catalítica (ribozimas)• Gran poder catalítico• Alto grado de especificidad• Actúan en soluciones acuosas a 37ºC y pH neutro• Su actividad puede regularse• El 25% de los genes humanos codifican enzimas que

catalizan reacciones metabólicas.

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( ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed. Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)

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IMPORTANCIA DE LOS ENZIMAS

• Cada paso de una vía metabólica está catalizado por un enzima.

• La medida de la actividad enzimática en fluidos biológicos o tejidos es importante para el diagnóstico de muchas enfermedades.

• Muchas fármacos son inhibidores de la actividad enzimática

• Importancia en la industria de alimentación y agricultura.

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ENZIMAS: RESEÑA HISTORICA

• Primera descripción (finales del siglo XVIII)

• 1850. Estudios de Pasteur

• 1897. Buchner

• 1926. Summer cristaliza la ureasa

• Segunda mitad del siglo XX: se purifican y caracterizan millares de enzimas, lo que ha permitido conocer su mecanismo de acción.

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Enzimas. Definiciones:

- Cofactor: necesario para la actividad enzimática. Pueden ser iones metálicos o una molécula orgánica, denominada coenzima. Si el cofactor está unido fuertemente al enzima se denomina grupo prostético.

- Apoenzima: parte proteica del enzima (no activa)

- Holoenzima: apoenzima + cofactor

Nomenclatura de los enzimas:

SUSTRATO + TIPO DE REACCION + ASA

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( ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed. Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)33

Un tercio de los enzimas requieren algún ión metálico para catalizar

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Muchas vitaminas son cofactores o precursores de cofactores de enzimas

( ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed. Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)

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CLASES DE ENZIMAS

TEMA 6 12

Los enzimas aceleran las reacciones disminuyendo la energía de activación

( ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed. Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)

E + S = ES = E + P

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Los enzimas son estereoespecíficas porque forman varias interacciones entre aminoácidos del centro

activo y los distintos grupos del sustrato

(“Bioquímica”, Mathews and van HoldeMcGraw-Hill, 1998)

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El centro activo de los enzimas es complementario al estado de transición de la reacción catalizada

( ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed. Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)

Progreso de la reacción

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Cambio conformacional inducido por glucosa en la hexoquinasa(Hexoquinasa = ATP:glucosa fosfotransferasa = 2.7.1.1 )

D-Glucosa

Encajeinducido

( ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed. Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)

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TEMA 6 17

La Vmax se alcanza cuando todos los centros activos están ocupados con sustrato

1/2 Vmax

Km

Vel

oci

dad

inic

ial

Concentración de sustrato [S]("Biochemistry" 2nd ed. Garrett, R.H. and Grisham, C.M. Saunders College Publishing. 1999.)

Vmax (S) =VoKm + (S)

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Relación entre Vo y [E]

Vo

[E]

La velocidad inicial es función lineal de la concentración de enzima siempre que la concentración de sustrato sea alta

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Ecuación de Michaelis-Menten

Vmax (S)

Km + (S)Vo =

E + S ES P

K1

K-1

K2

K2 + K-1Km =

K1

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La Vmax se alcanza cuando todos los centros activos están ocupados con sustrato

1/2 Vmax

Km

Vel

oci

dad

inic

ial

Concentración de sustrato [S]

("Biochemistry" 2nd ed. Garrett, R.H. and Grisham, C.M. Saunders College Publishing. 1999.)

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Calculo de Km y Vmax por la representación de Lineweaver-Burk

("Biochemistry" 2nd ed. Garrett, R.H. and Grisham, C.M. Saunders College Publishing. 1999.)

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Parámetros enzimáticos

1. Km (constante para cada enzima) = concentración de S a la que la Vo es 1/2 Vmax. Es una medida de la afinidad del enzima por S. Cuanto menor es Km, mayor es la afinidad del enzima por S

2. Kcat (constante para cada enzima) = número de recambio = número de moléculas de sustrato convertidas en producto por molécula de enzima y unidad de tiempo, en condiciones de saturación de sustrato.

3. Vmax = velocidad máxima teórica = la velocidad cuando todos los centros activos están ocupados con sustrato (nunca alcanzada en la realidad)

4. Unidad de enzima = cantidad de enzima que transforma 1 µmol de sustrato por min = una forma común de expresar la velocidad

5. Actividad específica = unidades por mg de proteína total de la preparación enzimática. En el caso de enzimas en suero: unidades/L

TEMA 6 23( ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed. Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)

TEMA 6 24

Inhibición competitiva

+ Inhibidor

Unión del Inhibidor al centro activo, compitiendo con S• Aumenta Km• No cambia Vmax

(Adaptado de: ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed. Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)

Inhibidor competitivoSustrato

TEMA 6 25

Inhibición no competitiva

+ Inhibidor Unión del Inhibidor a un sitio del enzima distinto del centro activo: no compite con S• No cambia Km• Disminuye Vmax

(Adaptado de: ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed. Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)

Sustrato

Inhibidor no competitivo

Sustrato

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+ Inhibidor

Inhibición acompetitiva

Unión del Inhibidor a enzima-S, estabilizando el complejo enzima-S pero impidiendo la formación de producto:• Disminuye Km• Disminuye Vmax

(Adaptado de: ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed. Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)

Inhibidor acompetitivoSustrato

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Inhibidor acompetitivoSustrato

Inhibidor competitivo

Inhibidor no competitivo

Sustrato

Sustrato

("Biochemistry" 5th ed. Berg, Tymoczko and Stryer. Freeman and Co. 2002)

TEMA 6 28

INHIBICION COMPETITIVA INHIBICION NO COMPETITIVA

TEMA 6 29

Efecto del pH sobre la actividad enzimática

(Garret and Grisham)

TEMA 6 30

MECANISMOS DE REGULACIÓN ENZIMÁTICA

• Regulación de la cantidad de enzima presente en las células

• Inhibición reversible por productos

• Interacción con moduladores (proteínas u otros)

- Activacion/inhibición alostérica

- El modulador alostérico se une a un sitio distinto del centro activo- La unión del modulador es reversible e implica cambio conformacional - Suelen ser enzimas multiméricas - Tienen cinética sigmoidea

- Modificación covalente:- fosforilación- ADP-ribosilación- metilación

• Activación proteolítica de pro-enzimas

TEMA 6 31

Efectos alostéricos de moduladores positivo y negativo

( ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed. Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)

El sustrato es modulador positivo

+ Modulador alostéricopositivo: favorece la forma R

+ Modulador alostériconegativo: favorece la forma T

TEMA 6 32( ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed. Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)

Activación/inactivación de enzimas por fosforilaciónEjemplo: glucógeno fosforilasa

TEMA 6 33

Una enzima puede tener varios mecanismos de regulación

("Biochemistry" 2nd ed. Garrett, R.H. and Grisham, C.M. Saunders College Publishing. 1999.)

TEMA 6 34

Activación de proenzimas por proteolisis

( ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed. Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)

Auto-activaciónde quimotripsina