Tema 8. RNA y la transcripcion

7/26/2019 Tema 8. RNA y la transcripcion

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Tema 8. El RNA y la transcripcin

Tipos y estructuras de RNAs: tRNAs, rRNAs, mRNAs

Biosntesis de RNA: la transcripcin

RNA polimerasas

La burbuja de transcripcin

Sntesis de RNA en procariotas y eucariotas

PromotoresTerminacin de la transcripcin

Maduracin de los RNAs. Splicing

RNA cataltico

Procesamiento de mRNAs en eucariotasTransporte de RNA


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El cido ribonucleico o RNA

El RNA es un polmero lineal de ribonucletidos unidosentre s por enlaces fosfodister 3-5.

El azcar es ribosa y las bases nitrogenadas sonadenina, guanina, citosina y uracilo.

Las molculas de RNA son monocatenarias, peropueden tener zonas de apareamientos parciales de basesA-U y C-G dentro de la misma cadena. Elloprovoca amenudo la formacin de horquillas y bucles.

El DNA de cadena sencilla (ssDNA) puede hibridar conRNA mediante los emparejamientos A-U, T-A, C-G y G-C.

La presencia del grupo 2-OHen la ribosa tiene variosefectos:

impide adoptar la conformacin Ben los hbridos RNA-DNA y en el dsRNA

permite a las molculas de RNA desarrollar msinteracciones yestructuras terciarias

promueve la reactividad qumica. P.e., el RNA esmucho ms susceptible a la hidrlisis alcalina que el DNA


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Tipos de cidos ribonucleicos celulares

5-10 %

80 %

15 %

mRNA : RNA mensajero

Transporta la informacin gentica desde el DNA hasta los ribosomas, donde

acta como molde traduccional para la sntesis proteica. Supone en torno al 5-10%del RNA total.

rRNA: RNA ribosmico

Forma parte de los ribosomasjunto con varias protenas. Hay 3 tipos enProcariotas y 4 en Eucariotas. Supone en torno a un 80% del RNA total.

tRNA : RNA de transferencia

Es el adaptador traduccional. Hay al menos 20 tipos en cada clula. Carga ytransfiere los aminocidos al ribosoma durante la sntesis proteica. Supone entorno al 15% del RNA total.

Otros tipos: microRNA, snRNA, snoRNA, scRNA, lncRNA (% no contabilizados)


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RNA de transferencia (tRNA)

- Hay al menos un tRNA para

cada aminocido, aunque lamayor parte tienen varios

- Estn formados por unacadena sencilla de RNAde 75-85 nucletidos, algunoscon bases modificadas

-

Todos tienen estructuras secundaria yterciaria similares en forma de hoja detrboly L invertida,debido a que tienenzonas de apareamientos internos que a suvez generan horquillas y bucles o lazos

- Tienen dos motivos estructurales esenciales:

- extremo 3,que forma el enlace covalentecon el aminocido correspondiente

- secuencia anticodn, complementaria delos tripletes que codifican aminocidos

Unin del aminocido

Bucle D

Bucle TC

Bucle variable

Bucle anticodn

Anticodn

5

3

Estructuras 2riay 3ria

en hoja de trbol y L

invertida


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RNA ribosmico (rRNA)

rRNA 23 S 3200 nt rRNA 28 S 4700 ntrRNA 16 S 1542 nt rRNA 18 S 1900 ntrRNA 5 S 120 nt rRNA 5 S 120 nt

-- rRNA 5,8 S 160 nt

Procariotas Eucariotas

rRNA 16 SrRNA 5 S

Es el tipo de RNA ms abundante:supone ms del 80% del RNA celular

Es el componente mayoritario (en masa)de los ribosomas: rRNA 60-65% yprotenas 35-40%

En Procariotas hay tres tipos y enEucariotas cuatro, todos ellos denominadospor el valor de su coeficiente de

sedimentacin (S, en Svedbergs)Algunos de ellos son RNAs muy largos y

con muchos apareamientos internos, quegeneran una estructura secundaria conhorquillas y bucles muy compleja


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RNA mensajero (mRNA)

- Son los RNAs menos abundantes, sin tener en cuenta los RNAs pequeos.Suponen un 5-10% del RNA celular.

-

Poseen poca estructura secundaria y suelen ser poco estables: tienen una alta

tasa de recambio.- Portan el mensaje genticodel DNA para codificar las protenas. En ellos,sucesiones de tripletes de las cuatro bases posibles forman los codones, quecodifican para los aminocidos de una cadena polipeptdica.

-

Su tamao es muy variable, porque depende en buena parte de la longitud delpolipptido que codifiquen.

Muchos mRNAs procariticos son policistrnicos: codifican varios polipptidosindependientes.

Los mRNAs eucariticos son monocistrnicos: solo codifican un polipptido.

Los mRNAs procariticos son una transcripcin directa del gen que los codifica.

En los mRNAs eucariticos se eliminan muchas de las secuencias de los genes.Estas secuencias se llaman intrones, y las que quedan en el mRNA, exones.

Los mRNAs procariticos son traducidos inmediatamente tras su sntesis.

Los mRNAs eucariticos requieren un procesamiento extenso antes de sertraducidos: se eliminan los intrones y se modifican los extremos 5 y 3.

Diferencias entre mRNAs procariticos y eucariticos


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transcripcin transcripcin

traduccin traduccin

gen A gen B

DNA

RNARNA

A diferencia de lo que ocurre en la replicacin, en la que slo se haceuna copia de la doble hlice del DNA, en la transcripcin los genes suelendar lugar a mltiples molculas de RNA. As, el nivel de transcripcin delos genes est regulado.

En muchos genes, esta regulacin tiene carcter variable, de forma quepueden dar lugar a ms o menos copias de RNA, dependiendo de lasnecesidades de la clula en cada momento.


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Biosntesis del RNA: la transcripcin

La biosntesis es asimtrica: slo se copia una de las cadenas del DNA.

Como las secuencias de las cadenas son distintas, la informacin presente enambas cadenas codifica RNAs distintos, que dan protenas distintos.

Una cadena sirve como molde para la sntesis de un transcrito cuyasecuencia es idntica (con U en lugar de T) a la de la cadena codificante (+).

La sntesis de la cadena de RNA complementaria de la hebra molde

por polimerizacin de ribonucletidos est catalizada por la actividadRNA Polimerasa dependiente de DNA, segn la reaccin:

NTP + (NMP)n (NMP)n+1 + PPi

Cadena codificante (+)

Cadena MOLDE (-)

Transcrito de RNA


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Sntesis de RNA: RNA polimerasas (RNA pol)

La sntesis de RNA corre a cargo de las enzimas RNA polimerasas, quenecesitan los siguientes componentes :

- un molde, preferentemente dsDNA pero tambin ssDNA- precursores activados, los 4 ribonucletidos trifosfato: ATP, GTP, UTP y CTP

- un catin divalente, como Mg2+(in vivo) o Mn2+

La sntesis de RNA es muy similar a la del DNA:

- la direccin de sntesis es 5

3, copiando el DNA molde en 3!

5- el mecanismo de elongacin es por un ataque nucleoflico del grupo 3-OH

de la cadena en crecimiento sobre el fosfato "del nuevo rNTP

- los nucletidos se seleccionan para su incorporacin mediante apareamientode bases de Watson y Crick

- la sntesis es favorecida por la hidrlisis del pirofosfato

A diferencia de la DNA polimerasas, las RNA polimerasas no requieren cebadorpara iniciar la cadena, y carecen de la actividad 35 correctora


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RNA polimerasas

La transcripcin tiene lugar en tres etapas: iniciacin, elongacin yterminacin.

En ellas, la RNA polimerasa desempea varias funciones:

- busca en el DNA los lugares de iniciacin o promotores

- selecciona el rNTP correcto y forma el enlace fosfodister

- detecta las seales de terminacin para los transcritos

- interacciona con protenas activadoras y represoras que modulan lavelocidad, sobre todo en eucariotas (factores de transcripcin)

RNA Polimerasa procaritica:slo una, que sintetiza todos los RNAs

RNA Polimerasas eucariticas:

Tipo Transcritos Localizacin

I rRNAs 5,8S, 18S y 28S nucleolo

II mRNAs y snRNA nucleoplasma

III tRNAs y rRNA 5S nucleoplasma

Las RNA pol eucariotas reconocen diferentes promotores, forman complejos detranscripcin diferentes, y tienen distinta sensibilidad a la !-amanitina (II > III > I)


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La burbuja es la zona transitoria dondese realiza de forma activa el proceso desntesis de RNA por copia del DNA.

Durante la transcripcin se forma undplexde unos 8-10 pb entre la hebramolde del DNA y el transcrito de RNA.

Este dplex es muy inestable y la cadenade RNA se va separando y saliendo de laRNA pol a medida que sta avanza.

Cuando la RNA pol ha pasado, las dos

hebras del DNA vuelven a aparearsey secierra la burbuja.

El DNA se desenrolla y reenrolla segnpasa la burbuja por l.

Las RNA polimerasasprocariotas y eucariotas son enzimas complejos con muchassubunidades, que tienen el mismo origen evolutivo y mecanismos similares.

La burbuja de transcripcin, consiste en una zona de DNA desenrollado de unos17 pb, que se forma en el interior de la RNA pol por accin de sta.

Burbuja de

transcripcin

Cadena

molde

Cadena

codificante

Desenro-llamiento

Reenro-llamiento

Sitio

activo

Canal de

NTPs

Direccin de transcripcin

HbridoRNA-DNA,

!9 pb

RNA polimerasade Escherichia coli



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El avance de la RNA polimerasa sobre el DNA molde requiere solventar losproblemas topolgicos que ocasiona mediante topoisomerasas especficas

Eliminacin desuperenrollamientospositivos

Regulacin del nivel desuperenrollamientosnegativos

Superenrollamientos

negativos

Superenrollamientos

positivos

Direccin de transcripcin


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La RNA polimerasa y el promotor procariticos

RNA polimerasa procaritica: Holoenzima 2 ##$

La funcin de la subunidad sigma $es reconocer el promotor para la iniciacin.

El resto es el enzima ncleo, que ser el encargado de la elongacin.

Subunidad n kDa Funcin

% 2 37 Se une a secuencias reguladoras#% 1 151 Forma enlaces fosfodister

# 1 155 Se une al DNA molde

$% 1 70 Reconoce al promotor e inicia la sntesis

ssDNA dsDNA

Promotor:

Secuencia de DNA situada en el extremo 5del gen que indica el sitio para el inicio de lasntesis de RNA (tiene secuencias consenso)


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Unin inespecfica de la RNA polimerasa al DNA ybarrido hasta localizar el promotor.

La subunidad $de la RNA pol localiza el promotor(complejo promotor cerrado).

Desenrollamiento del DNA por la propia RNA pol(complejo promotor abierto). Formacin del complejode iniciaciny apertura de la burbuja detranscripcin.

Iniciacin de la sntesis del RNA, casi siempre conun ribonucletido de purina (pppPu), que aparea conla base +1 del molde.

Sntesis en direccin 5-3: formacin del primerenlace fosfodister entre dos rNTPs, emparejadoscon las bases +1 y +2 del molde.

Elongacin del RNA por el enzima ncleo poradicin sucesiva de rNTPs y formacin de enlacesfosfodister.

Liberacin de la subunidad$tras la incorporacinde unos 10 nucletidos.

Proceso de transcripcin en Procariotas

pppPu

rNTPs


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Promotores eucariotas

Los enhancers o intensificadoresson secuencias que regulan la expresinde uno o varios genes, pero que estnalejadas (ms o menos) de ellos

Enhance

r

Los promotores de los geneseucariticos son grandes, variados ycomplejos.

Suelen tener una caja TATA (-25/-35)y otros sitios de unin (GC, CCAAT)para factores de transcripcin

proteicos.Estos sitios que conformanlos

promotores y dirigen la regulacin dela transcripcin, tienen secuenciasconsensocaractersticas, que sonreconocidas por los factores detranscripcin. stos pueden ser de

carcter generalo especfico.

Promotor con

secuencias tipo

Ejemplos de promotores

Accin adistancia de

los enhancers

Caja

CCAAT Caja GCCaja

TATA

Muchos

otros


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Las RNA pol eucariticas no contienen subunidad $.Varias protenas accesorias identifican los promotoresy reclutan a las RNA pol para la iniciacin.

Adems de las RNA pol, en la iniciacin de latranscripcin participan factores de transcripcin(TFs) y otras protenas asociadas (TAFs).

La protena TBP se une a la caja TATA yes parte deTFIID, que es el primer TF que se une al promotor.

El resto de los TFs se van uniendo en un ordendeterminado, hasta formar el complejo cerrado.

Tras su unin, TFIIH abre el dsDNA (helicasa) yfosforilael dominio carboxilo de la s.u. mayor de laRNA pol II, lo que permite la liberacin de los TFs(excepto TFIIF) y la sntesis del RNA.

Adems de estos TF generales existen factoresespecficos de respuesta a cambios ambientales ymetablicos, que se unen a distintas secuencias delpromotor y regulan la actividad transcripcional.

El esquema de iniciacin para RNA pol I y IIIessimilar, con TBP y factores auxiliares

Transcripcin por RNA pol II en eucariotas

Molde de DNA

DNA abierto

CTD fosforilado


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Terminacin de la transcripcin

La sntesis de RNA es muy procesivay transcurre hasta que la RNA polencuentra una seal que provoca su disociacin: cesa la formacin de enlaces,se disocia el hbrido DNA-RNA, se rebobina la regin fundida del DNA, y se

libera la RNA pol.

No se conocen los sistemas de terminacin de Eucariotas. En ellos losRNAs se maduran a partir de transcritos primarios mucho ms grandes.

En Procariotasla RNA pol se detiene endiversas secuencias de DNA, algunas de lascuales son terminadores.

La aparicin de esas secuencias provoca lapausa o parada de la RNA pol, que puede o nosufrir terminacin. En este caso se deshace el

hbrido DNA-RNA y se libera la RNA pol.Las seales de terminacin pueden ser

dependientes de &oindependientes de & %

PausaDerivacin

Isomerizacin

Escape

Terminacin


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Terminacin independiente de &

Los terminadores independientes de &presentan secuencias palindrmicas ricasen G y Cque forman en el propio transcritoestructuras en horquilla.

Tras la secuencia palindrmica hay otra

con un grupo de adenosinas (al menos 6),que originan un grupo de U al ser transcritas.

El dplex de A-U que se forma es muyinestable, y el transcrito de RNA se liberaespontneamente al formarse la horquilla enel transcrito.

estructuraen horquilla


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Terminacindependiente de &

5

5

5

5

3

3

3

3

El transcrito no se libera espontneamente, sino que laprotena &(rho) se une a una regin rica en CA del RNA yse mueve por el RNA en direccin 5-3, con gasto de ATP.

Cuando llega al dplex RNA-DNA, su actividad helicasalo deshace y permite la liberacin del RNA, de la RNA pol yde la propia protena &.


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Diferencias en los procesos de transcripcin y traduccinde los mRNAs entre Procariotas y Eucariotas

En los organismos Procariotas, que carecen de membrana nuclear que separe elmaterial gentico del citoplasma, los mRNAs son accesibles para los ribosomas desde el

momento en que comienzan a ser sintetizados. La transcripcin y la traduccin sonprocesos simultneos. Los mRNAs procariotas son mRNAs maduros desde quecomienzan a ser sintetizados.

Los mRNAs de Eucariotas se sintetizan en el interior del ncleo como hnRNAs(heterogeneous nuclear RNAs), y antes de alcanzar el citoplasma son procesados paratransformarse en los mRNAs maduros.


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Maduracin de los RNAs: modificaciones post-transcripcionales

El RNA recin transcrito se conoce como transcrito primario o RNA primariode transcripcin.

La mayora de ellos no se liberan de la RNA polimerasa en su forma definitiva yhan de sufrir modificaciones para adoptar sus estructuras maduras y desarrollarsus funciones. Estas modificaciones son de tres tipos generales:

- Eliminacin de secuencias del transcrito primario:

Recorte de los extremos 5 y 3

Escisin de intrones y unin de exones: splicing- Adicin de secuencias de RNA no codificadas por los genes:

capy poli(A)en mRNAs eucariotas; extremo CCAen tRNAs

- Modificacin covalente de ciertas bases:

tiouridina, metilguanosina, inosina, isopentenil adenosina,

ribotimidina, seudouridina, dihidrouridina

La ltima modificacin post-transcripcional es la degradacin de los RNAs.La velocidad de recambiode los RNAs permite determinar cundo debedejar de expresarse un gen cuyo producto ya no es necesario.


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Experimento de hibridacin entre el

DNA genmico de la ovoalbmina y sutranscrito de mRNA, que demostr laexistencia de los intrones (lazos A-G):secuencias de DNA que no hibridabancon el mRNA y por tanto no estabanpresentes en el transcrito maduro

Intrones, exones y splicing

Intrn: secuencia del gen que se transcribe pero no aparece en el RNA maduro

Exn: secuencia del gen que aparece en el RNA maduro

Splicing: trmino que indica eliminacin de los intrones de los pre-RNAs y unin

de los exones contiguos. Se traduce por corte y empalme


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Hay cuatro grupos principales de intrones: I, II, III y IV

- Los intrones de los Grupos I y II son autoprocesantes, mediante reaccionesde transesterificacin.

-

Los del Grupo I estn en genes de mRNAs, tRNAs and rRNAs, en genomasnucleares, mitocondriales y de cloroplastos. Necesitan un cofactor nucleotdico

- Los del Grupo II estn en genes de mRNAs de mitocondrias y cloroplastos enhongos, algas, y plantas. El cofactor proviene del propio intrn, que se escinde enforma de estructura en lazo

- Los intrones del Grupo III son procesados por espliceosomas

-

Son los intrones ms comunes, caractersticos de los genes de las protenascodificadas en los ncleos eucariotas

- En su procesamiento intervienen los complejos ribonucleoproteicos llamadosespliceosomas. Los intrones tambin son escindidos en forma de lazos

- Los intrones de tRNAs de eucariotas (Grupo IV) son procesados por enzimasde carcter proteico. No hay transesterificacin, sino un corte endonuclesico yempalme posterior.

- Se encuentran en tRNAs de eucariotas y arqueas

- El transcrito primario es cortado por una endonucleasa, y los exones son luegounidos por una ligasadependiente de ATP


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Ribozimas: RNAs catalticos con actividad enzimtica

Algunos intrones del grupo I y II son ribozimas capaces de catalizar su propiosplicing.

El descubrimiento de las propiedades auto-catalticas del RNA supuso el PremioNobel de Qumica a Thomas R. Cech ySidney Altman en 1989.

La capacidad cataltica del RNA fue un gran cambio conceptual, pues hastaentonces la catlisis solo se haba descrito asociada a protenas.

El primer ribozima descrito cataliza su propio splicing:Intrn tipo I Thomas Cech

RNasas P: procesan pre-tRNAs y otros RNAs pequeos. Sydney Altman

Son ribonucleoprotenas: tienen un RNA M1 que in vivo acta con la parteproteica, pero in vitro puede actuar solo

Ejemplos fuera del procesamiento de RNAs

Telomerasa: Replicacin

Peptidil transferasa de los ribosomas: Traduccin


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Procesamiento del pre-mRNA del gen de la ovoalbmina

Gen de la ovoalbmina 7700 pb: 8 exones y 7 intrones

DNA

Pre-mRNA

RNA maduro

cap

7 intrones RNA cortado en extremo 3

mRNA de Ovoalbmina 1872 nt

Transcripcin RNA Pol II

Procesamiento 5 cap

Splicing y procesamiento 3

1) Procesamiento del extremo 5(adicin del cap)

2) Poliadenilacin del extremo 3(corte y adicin de poli-A)

3) Escisin de intronesy empalme de exones o splicing


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Procesamiento de los pre-mRNAs en el extremo 5:adicin de 7-metil guanosina o cap

La 7-metil-guanosina o capprotege el extremo5 del mRNA del ataque por exonucleasas y esel punto de unin de la protena CBP.

La protena CBP est implicada en eltransporte extranuclear, y en la interaccin conel factor de iniciacin de la traduccin eIF-4E.

Para la iniciacin del proceso de traduccin,el cap se une a la s.u. 40S del ribosoma.

adoMet: S-adenosil-metioninaadoHcy: S-adenosil-homocistena


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Procesamiento de los mRNAs en el extremo 3:corte y adicin de la cola de poli(A)

La Poli(A) polimerasao polinucletido adenililtransferasa aade mltiples nucletidosde adenina al extremo 3, usando ATP como sustrato, y sin precisar de molde.

En el citoplasma, el poli(A) se acorta a medida que envejece el mRNA, debido a laaccin de exonucleasas especficas.

La cola se enrolla en torno a varias unidades de la protena PABP, que interaccionacon el factor de iniciacin de la traduccin eIF-4G

Molde de DNA

RNA naciente Seal de corte a 10-30 nt

Corte por una endonucleasaespecfica

Adicin de la cola porla Poli(A) polimerasa

Precursor de mRNA poliadenilado


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En la escisin de intrones de los

pre-mRNAs participan partculasribonucleicas nucleares snRNPs.

Las snRNPs contienen protenas yRNAsde la serie U. Forman uncomplejo escindidor denominadoespliceosoma, con actividades RNA

nucleasay RNA ligasa.snRNPs especficas reconocen los

sitios 5 y 3 de splicingy el llamadopunto de ramificacin, con una Acuyo grupo 2-OH ataca el fosfato delsitio 5 de splicing.

Luego hay otro ataque nucleoflicodel 3-OH del exn sobre el fosfatodel sitio 3 de splicing, y el intrn seescinde en forma de lazo.

Corte en sitio 5 de splicing y

formacin del lazo intrnico

Corte en sitio 3 de splicing

y unin de los exones

El intrn en lazose degrada en el ncleo

y los snRNPs se reciclan

Porcin de mRNAcon dos exones

El splicing de los intrones de mRNAsse realiza por el espliceosoma


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El procesamiento alternativo de intrones permite obtenerdiferentes productos proteicos del mismo gen

En muchos genes hay varias posibilidades de maduracinde un transcrito

primario, utilizando sitios alternativos de splicingy/o poliadenilacin, y dando lugara mRNAs que codifican distintas protenas o variantes proteicas.


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Procesamiento alternativodel gen de la tropomiosinapara dar isoformasespecficas de tejido

Procesamiento alternativo delgen de la calcitoninapara dardistintas hormonasentiroides y cerebro


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La RNA polimerasa IIcomo fbrica de mRNAs

Los factores necesarios para losprocesos de adicin del cap al extremo5, corte y poliadenilacin del extremo3, y splicing de intrones, se asocian aldominio carboxilo terminal de la RNApol II y van procesando los transcritosprimarios a medida que se vansintetizando, para generar los mRNAs.


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Poro nuclear

Protena de uninal cap (CBP)

CBP

Protenas deunin a poli-A

ProtenasNucleares

CITOSOLNUCLEO

Transporte de mRNA del ncleo al citoplasma

Factores de iniciacin

de la sntesis proteica


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Hay muchos tipos de RNAs no codificantes con distintos papelesen la funcionalidad y en la regulacin de la expresin gnica,especialmente el grupo de small regulatory RNAs

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