TM. MSc. José Miguel Amaro

Novedades en el diagnóstico de laboratorio de hongos filamentosos y

levaduras

Examen microscópico directo

Medios de cultivos

Diagnóstico inmuno-micológico

Equipamiento en diagnóstico micológico

Actuales tecnologías

Taxonomía moderna

“The molecular revolution in fungal taxonomy

commenced in the early 1990s, with analyses of

PCR-amplified ribosomal RNA genes (White et

al. 1990). Today, fungal molecular systematics

is a mature discipline in which multi-locus

datasets, extensive taxon sampling, and

rigorous analytical approaches are standard.”

Hibbert DS et al., 2007, Mycological Res 111:509-547

1 hongo = 1 nombre

1 hongo = ¿que nombre?

Después del 1 de enero de 2013, un hongo sólo puede tener un nombre.

Un poco de taxonomía …

ejemplos Aspergillus sección Fumigati

5 clados

30 especies

Los mas significativos en clínica

A. fumigatus

A. lentulus

• Penicillium spp. en el subgenero Biverticillium ahora es género Talaromyces

•Talaromyces marneffei (Penicillium marneffei) •Talaromyces purpurogenus (Penicillium purpurogenum) •Talaromyces aurantiacus (Penicillium aurantiacum) •Talaromyces funiculosus (Penicillium funiculosum)

Examen microscópico directo Preparación a fresco - Para todo tipo de muestras - Observación directa (líquidos) y con clarificadores (con o sin colorantes) – Clarificador: Hidróxido de Potasio (KOH al 10 al 40%). + Glicerol + colorante (azul de Metileno, tinta china) + Dimetilsulfóxido (DMSO) + Lactofenol – Colorantes • Tinta china (de buena calidad) controlar • Calcofluor (microscopio de fluorescencia) controlar Preparación en Frotis – Para material líquido

tinción con Giemsa tinción de Gram

“Nubes” P.jiroveci en LBA (T.Giemsa) Dermatofitos en escamas de piel (KOH)

Paracoccidioides en exudado (T.Giemsa) Flujo vaginal (T.gram)

Cryptococcus en calcofluor Rhizopus sp. en calcofluor

Medios de cultivo

Primarios Básico: Agar Sabouraud-Glucosa (ASG).

Selectivo: ASG + cloranfenicol (CAF) y ASG + CAF + cicloheximida.

Indicador: agar lactrimel, agar cromogénico, DTM.

Secundarios Agar Papa dextrosa: hongos filamentosos Agar Corn Meal + T80: levaduras (microcultivo) Agar Urea de Christensen

Medios de cultivo

Susceptibilidad

RPMI 1640

MH+AM+ Glucosa

Medios de cultivo

Macro + Microscopía Observación a través de las paredes del tubo o placa:

estructuras reproductivas

Montajes directos: Lactofenol (con o sin colorante), azul de lactofenol

Microcultivos o cultivos en lámina

Serología Diagnóstico inmuno-micológico

Anticuerpos Inmunocompetente

Inmunocomprometido Antígenos

Antígenos Cryptococcus

Aglutinación en Látex Muestra: LCR, suero, orina Rápida y Sencilla ( ≈15 min) S 90 % ; E 100 % Detecta 3,2 – 12,5 ng/ml

Inmunocromatografía Muestra: LCR, suero, orina Rápida y Sencilla (≈15 min) S >95 %; E >95 % Pruebas cualitativa y cuantitativa Detecta 1,0 -1,5ng/ml

Antígenos Aspergillus-LFD

Ensayo inmunocromatográfico que detecta una glicoproteína extracelular de A. fumigatus

Tiempo: 20 min aprox

Muestra: suero y LBA

E 98%; S 81,8%

Detecta: ~30ng/ml

Utilidad de la prueba Aspergillus-LFD para el diagnóstico de aspergilosis: primera experiencia en Chile. Alvarez E. 2015

Antígenos Galactomanano - Técnica inmunoenzimática sandwich

- Tiempo: 4 hrs aprox.

- Muestra: suero y LBA

- Punto de corte: 0,5

- Detecta 1 ng/ml.

- S 78% E 81%

No antigénico β-1,3-glucano (BDG)

Método colorimétrico

Tiempo : 1 hr aprox.

S 50 al 90%

E 70 al 100%

Detecta : 60 pg / ml

Excepto en mucormycetes y Cryptococcus spp.

Usado en Pneumocystis jirovecii

BDG GMN

Aspergillus + + Fusarium

Candida + -

Mucormycetes - -

Utilidad de GMN - BDG

Anticuerpos Platelia Candida Ab/Ac/Ak (Bio-Rad)

Ensayo inmunoenzimático indirecto realizado en microplaca para la detección de anticuerpos antimanano de Candida en suero.

Tiempo ejecución 4 hrs aprox.

Punto de corte 5 UA/mL

Galerías bioquímicas

API 32 C

Api Candida

Fungichrom

Equipos

Hemocultivos

Botella Específica Botella recomendada

Equipos

Phoenix/ BD Vitek 2/ BMX

Identificación y sensibilidad Identificación

Antigüedad Presencia en Chile Costos determinación Venta/comodato Biblioteca

Tecnología MALDI-TOF

Biblioteca ≠ biblia

FilmArray

Detección de ADN fúngico A través de la reacción de la Polimerasa en cadena

PCR convencional o PCR Panfúngico

PCR a tiempo real (cuantificar, minimizar, identificar)

Comerciales:

PCR tiempo real de algunas especies de Candida y Aspergillus (Septifast Roche®), Aspergillus spp. o Pneumocystis jirovecii (MycAssay Aspergillus, MycAssay Pneumocystis, Myconostica Ltd).

Combined ITS and D1/D2 Mould Identification to Species Without Morphology: Can it be Done?

Sutton DA*, Thompson EH, Fothergill AW, Fan H, Lindner JR, Vadlamudi K, Wickes

BL, Furmaga WB, Wiederhold NP 2013

Sólo 96 de 292 (32,9%) aislamientos podrían ser identificados a nivel de especies utilizando ITS y D1 / D2 por sí solos y comparando con las secuencias disponibles en GenBank.

2/3 no pueden ser identificados solo comparando con la base de datos y sin conocer la morfología.

Mould Identification by ITS rDNA Sequencing: Ready for Prime Time in the Routine Lab?

Sutton, DA, Thompson EH, Fothergill AW, Wiederhold NP.

2013

38,1% no pudieron ser definitivamente identificado usando en el locus ITS combinado con características fenotípicas

N=462

Conclusiones Primera clave, Microscopio sigue siendo una herramienta clave

en el diagnóstico de hongos.

La segunda clave, personal capacitado, actualizado, con conocimientos y experiencia.

Mejorar uso de herramientas actuales.

La combinación de herramientas siempre hará nuestro diagnostico más certero.

No olvidar que las tecnologías actuales son una muy buena ayuda en el laboratorio, pero son parte de un complemento diagnóstico.

Muchas gracias por su atención.