UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE …€¦ · Art. 114 del CÓDIGO ORGÁNICO DE LA...

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE ODONTOLOGÍA

CARRERA DE ODONTOLOGÍA

Efecto antibacteriano in vitro del extracto etanólico de Prosopis Pallida

sobre Porphyromona Gingivalis

Trabajo de investigación previo a la obtención del Título de Odontólogo

AUTOR: Alvarez Alvarez Bryan Wladimir

TUTORA: Dra. Marina Antonia Dona Vidale

Quito, mayo 2020

ii

DERECHOS DE AUTOR

Yo, Bryan Wladimir Alvarez Alvarez en calidad de autor y titular de los derechos morales

y patrimoniales del trabajo de titulación “Efecto antibacteriano in vitro del extracto

etanólico de Prosopis Pallida sobre Porphyromona Gingivalis”, de conformidad con el

Art. 114 del CÓDIGO ORGÁNICO DE LA ECONOMÍA SOCIAL DE LOS

CONOCIMIENTOS, CREATIVIDAD E INNOVACIÓN, concedo a favor de la

Universidad Central del Ecuador una licencia gratuita, intransferible y no exclusiva para

el uso no comercial de la obra, con fines estrictamente académicos. Conservo a mi favor

todos los derechos de autor sobre la obra, establecidos en la normativa citada.

Así mismo, autorizo a la Universidad Central del Ecuador para que realice la

digitalización y publicación de este trabajo de titulación en el repositorio virtual, de

conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior.

El autor declara que la obra objeto de la presente autorización es original en su forma de

expresión y no infringe el derecho de autor de terceros, asumiendo la responsabilidad por

cualquier reclamación que pudiera presentarse por esta causa y liberando a la Universidad

de toda responsabilidad.

Bryan Wladimir Alvarez Alvarez

C.I. 172294701- 5

Telf: 0992787021

Dirección electronica: [email protected]

iii

APROBACIÓN DEL TUTOR DEL TRABAJO DE

INVESTIGACIÓN

Yo, Dra. Marina Dona Vidale, en mi calidad de tutora del trabajo de titulación, modalidad

de Proyecto de Investigación, elaborado por Bryan Wladimir Alvarez Alvarez; cuyo título

es: “EFECTO ANTIBACTERIANO IN VITRO DEL EXTRACTO ETANÓLICO

DE PROSOPIS PALLIDA SOBRE PORPHYROMONA GINGIVALIS”, previo a la

obtención de grado de odontólogo general, considero que el mismo reúne los requisitos y

méritos en el campo metodológico y epistemológico, para ser sometido a la evaluación

por parte del tribunal examinador que se designe, por lo que APRUEBO, a fin de que el

trabajo sea habilitado para continuar con el proceso de titulación determinado por la

Universidad Central del Ecuador.

En la ciudad de Quito el 21 de Enero de 2020

Dra. Marina Dona Vidale

DOCENTE-TUTORA

CI. 1708884422

iv

APROBACIÓN DE LA PRESENTACIÓN ORAL / TRIBUNAL

El Tribunal constituido por:

Luego de receptar la presentación oral del trabajo de titulación previo a la obtención del

título de Odontóloga por el señor BRYAN WLADIMIR ALVAREZ ALVAREZ

Con el título

EFECTO ANTIBACTERIANO IN VITRO DEL EXTRACTO ETANÓLICO DE

PROSOPIS PALLIDA SOBRE PORPHYROMONA GINGIVALIS

Emite el siguiente veredicto: (Aprobado/Reprobado)……………………

Fecha:…………………..

Para constancia de lo actuado firman:

Nombre apellido Calificación Firma

Presidente:

Vocal 1:

v

DEDICATORIA

A la persona más noble, sabia y virtuosa que Dios

me dio la oportunidad y el privilegio de conocer;

quien se convirtió en mi ejemplo a seguir; a quien

admiro con vehemencia; a la persona que me

apoyo inconmensurablemente a lo largo de mi

carrera; quien día a día me motiva a seguir

adelante, a ser mejor persona; quien me ha

demostrado que la dedicación, la paciencia y el

esfuerzo rinden frutos y que el valor más preciado

es aprovechar al máximo cada momento que nos

regala la vida.

Al hombre más sabio del mundo, Jorge Hugo

Alvarez Rueda.

vi

AGRADECIMIENTOS

Agradezco a mi Dios y a María Auxiliadora quienes desde mi educación primaria han

guiado mi formación académica; quienes han sido mis guardianes y han caminado

junto a mí en este largo viaje.

A mis padres Wladimir Alvarez y Monica Alvarez quienes con paciencia, dedicación y

mucho cariño me han formado y quien ahora soy se los debo enteramente a ellos; y que

no me alcanzara la vida para devolverles todo lo que han hecho por mí.

A mi hermana Melanie, quien con su madurez y amor ha sabido transmitirme paz y

enfoque hacia mi carrera y mis metas, quien siempre me ha brindado un abrazo sincero

y unas palabras de aliento.

A mi abuelita Gloria quien con su don único de segunda madre me ha brindado aliento

y fuerzas para seguir siempre adelante, quien ha cumplido todos mis caprichos, quien

con su bendición ha hecho posible que todo este sueño se haya hecho realidad.

A mis tíos, tías, primos y primas quienes han sido el motor para que todo este esfuerzo

tenga sentido, para demostrarles que si se puede, que no se lucha en vano, que los

buenos somos más y que la familia siempre será el aliciente principal porque cada

logro es por y para ellos y ellas.

A mis amigos y amigas del colegio Spellman y de la Facultad de Odontología quienes

fueron parte fundamental de mi crecimiento tanto personal como académico y quienes

han demostrado que las amistades sinceras aún existen.

Y finalmente a mi tutora Dra. Marina Dona quien ha guiado este proceso desde antes

de iniciar esta carrera, y quien ha sido mi apoyo académico y emocional durante todos

los años de estudio.

vii

CONTENIDO

DERECHOS DE AUTOR ................................................................................................ ii

APROBACIÓN DEL TUTOR DEL TRABAJO DE INVESTIGACIÓN ...................... iii

APROBACIÓN DE LA PRESENTACIÓN ORAL / TRIBUNAL ................................ iv

DEDICATORIA ............................................................................................................... v

AGRADECIMIENTOS ................................................................................................... vi

CONTENIDO ................................................................................................................. vii

LISTA DE TABLAS ........................................................................................................ x

LISTA DE GRÁFICOS ................................................................................................... xi

LISTA DE FIGURAS .................................................................................................... xii

LISTA DE ANEXOS .................................................................................................... xiii

RESUMEN .................................................................................................................... xiv

ABSTRACT ................................................................................................................... xv

1 REVISIÓN DE LA LITERATURA................................................................... 1

1.1 Fitoterapia ........................................................................................................... 1

1.1.1 Definición ........................................................................................................... 1

1.1.2 Características de la fisioterapia ......................................................................... 1

1.1.3 Extractos etanólicos ............................................................................................ 1

1.1.3.1 Definición ........................................................................................................... 1

1.1.3.2 Mecanismo de acción de los extractos etanólicos .............................................. 2

1.1.4 Método de obtención de los extractos etanólicos ............................................... 3

1.1.5 Tipos de extractos ............................................................................................... 3

1.2 Prosopis Pallida (Algarrobo) .............................................................................. 4

1.2.1 Descripción Botánica ......................................................................................... 4

1.2.2 Taxonomía .......................................................................................................... 5

1.3 Clorhexidina ....................................................................................................... 5

viii

1.3.1 Efectos adversos ................................................................................................. 6

1.3.2 Indicaciones y contraindicaciones ...................................................................... 6

1.3.2.1 Indicaciones ........................................................................................................ 6

1.3.2.2 Contraindicaciones ............................................................................................. 7

1.4 Periodontitis........................................................................................................ 7

1.5 Biofilm................................................................................................................ 8

1.5.1 Fases del Biofilm ................................................................................................ 8

1.6 Porphyromona gingivalis ................................................................................... 8

1.6.1 Definición ........................................................................................................... 8

1.6.2 Complejo Microbiano de Socransky .................................................................. 9

1.6.3 Factor de Virulencia ......................................................................................... 10

1.6.3.1 Fimbria ............................................................................................................. 10

1.6.3.2 Enzimas Proteolíticas ....................................................................................... 11

1.6.3.3 Lipopolisacárido ............................................................................................... 11

1.6.3.4 Polisacáridos Capsulares .................................................................................. 12

1.6.4 Nutrición ........................................................................................................... 12

1.7 Evaluación Antimicrobiana .............................................................................. 12

1.8 Revisión de la Literatura .................................................................................. 13

2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ......................................................... 15

2.1 Objetivos .......................................................................................................... 16

2.1.1 Objetivo general ............................................................................................... 16

2.1.2 Objetivos específicos ........................................................................................ 16

2.2 Hipótesis ........................................................................................................... 17

2.2.1 Hipótesis de investigación (H1) ....................................................................... 17

2.2.2 Hipótesis nula (H0) .......................................................................................... 17

2.2.3 Conceptualización de variables ........................................................................ 17

ix

2.2.4 Variables independientes .................................................................................. 17

2.2.5 Variables dependientes ..................................................................................... 17

2.2.6 Variables de control.......................................................................................... 17

3 JUSTIFICACIÓN ............................................................................................. 18

4 METODOLOGÍA ............................................................................................ 19

4.1 Diseño de la investigación ................................................................................ 19

4.2 Población de estudio y muestra ........................................................................ 19

4.2.1 Criterios de inclusión y exclusión .................................................................... 19

4.2.2 Definición operacional de variables ................................................................. 20

4.2.3 Estandarización ................................................................................................ 22

4.2.4 Manejo y métodos de recolección de datos ...................................................... 22

4.2.5 Análisis estadístico ........................................................................................... 26

5 RESULTADOS ................................................................................................ 27

6 DISCUSIÓN ..................................................................................................... 37

7 CONCLUSIONES............................................................................................ 39

8 RECOMENDACIONES .................................................................................. 40

BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................ 41

ANEXOS ........................................................................................................................ 45

x

LISTA DE TABLAS

Tabla 1 Operacionalización de Variables ....................................................................... 20

Tabla 2 Pruebas de normalidad ...................................................................................... 27

Tabla 3 Comparación entre todas las sustancias a las 24 horas ..................................... 28

Tabla 4 Medida 24 horas ................................................................................................ 30

Tabla 5 Comparación entre todas las sustancias a las 48 horas ..................................... 30

Tabla 6 Medida 48 horas ................................................................................................ 32

Tabla 7 Comparación entre las 24 horas y las 48 horas ................................................. 33

Tabla 8 Tablas Cruzadas: Sensibilidad a las 24 horas .................................................... 34

Tabla 9 Tablas Cruzadas: Sensibilidad a las 48 horas .................................................... 35

xi

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1 Comparacion de medias a las 24 horas .......................................................... 28

Gráfico 2 Prueba de Kruskal – Wallis para muestras independientes ............................ 29

Gráfico 3 Comparación de medias a las 48 horas .......................................................... 30

Gráfico 4 Prueba de Kruskal – Wallis para muestras independientes ............................ 32

Gráfico 5 Comparación entre 24 horas y 48 horas ......................................................... 33

Gráfico 6 Sensibilidad a las 24 horas ............................................................................. 34

Gráfico 7 Sensibilidad a las 48 horas ............................................................................. 35

xii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Árbol de Algarrobo ........................................................................................... 5

Figura 2 Colonias de Porphyromona Gingivalis .............................................................. 9

Figura 3 Complejo de Socransky ................................................................................... 10

Figura 4 Selección de hojas ............................................................................................ 22

Figura 5 Filtrado final mediante rotavapor y liofilizador ............................................... 23

Figura 6 Dilución en etanol al 80% del extracto etanólico............................................. 23

Figura 7 Sembrado de bacteria en cámara anaerobia con sobre captador de oxígeno. .. 24

Figura 8 Cultivo de Porphyromona Gingivalis. ............................................................. 24

Figura 9 Discos inoculados con el extracto etanólico. ................................................... 25

Figura 10 Cajas Petri con a) Extracto Prosopis Pallida al 100% b) Extracto Prosopis

Pallida al 75% c) Extracto Prosopis Pallida al 50% d) Clorhexidina e) Agua

Destilada ........................................................................................................ 25

xiii

LISTA DE ANEXOS

Anexo 1 Solicitud al Director de investigación de la facultad de biotecnología de la

Universidad Politécnica Salesiana ................................................................. 45

Anexo 2 Protocolo de manejo de desechos ................................................................... 46

Anexo 3 Certificado de Traducción............................................................................... 52

Anexo 4 Certificado de Autenticidad de la cepa de Porphyromona Gingivalis ............ 53

Anexo 5 Ficha para lectura de los halos de inhibición .................................................. 56

Anexo 6 Certificado de renuncia de derechos del estadístico ....................................... 57

Anexo 7 Certificado de la realización de las pruebas microbiológicas ......................... 59

Anexo 8 Certificado de esterilización ........................................................................... 60

Anexo 9 Certificado de desechos .................................................................................. 61

Anexo 10 Certificado de aprobación del SEISH-UCE .................................................. 62

Anexo 11 Certificado uso del laboratorio Universidad Politécnica Salesiana .............. 63

Anexo 12 Análisis URKUND ........................................................................................ 64

xiv

TEMA: Efecto antibacteriano in vitro del extracto etanólico de Prosopis Pallida sobre

Porphyromona Gingivalis.

Autor: Bryan Wladimir Alvarez Alvarez

Tutora: Dra. Marina Antonia Dona Vidale

RESUMEN

El propósito de este estudio fue determinar el efecto inhibitorio por medio de la medición

de los halos del extracto etanólico de Prosopis Pallida sobre cepas de Porphyromona

gingivalis en concentraciones de 50%, 75% y 100%, a las 24 y 48 horas. Se planteó un

estudio experimental, in vitro y comparativo ya que se estableció el efecto del extracto

etanólico de la Prosopis Pallida en concentraciones diferentes frente a la clorhexidina al

0,12% sobre la Porphyromona gingivalis. Previa a la verificación de cumplimiento de

criterios de inclusión y exclusión, se valoró una muestra de 15 cajas Petri con Agar

Mueller Hinton en el cual se encontraba sembrada la cepa de Porphyromona gingivalis

ATCC® 33277™, considerada como una muestra no probabilística por conveniencia.

Los datos obtenidos son organizados en una base de datos en el programa SPSS 23 IBM

®, con la finalidad de realizar los cálculos estadísticos descriptivos e inferenciales, desde

la perspectiva cuantitativa y cualitativa, estadísticamente se emplearán pruebas

pertinentes como Kruskal Wallis y Mann Whitney.

PALABRAS CLAVE: EFECTO ANTIBACTERIANO / ENFERMEDADES

PERIODONTALES / PORPHYROMONA GINGIVALIS.

xv

TOPIC: In vitro antibacterial effect of the ethanol extract of Prosopis Pallida on

Porphyromone Gingivalis.

Author: Bryan Wladimir Alvarez Alvarez

Tutor: Dr. Marina Antonia Dona Vidale

ABSTRACT

The purpose of this study was to determine the inhibitory effect by measuring the halos

of the Prosopis Pallida ethanolic extract on Porphyromone gingivalis strains in

concentrations of 50%, 75% and 100%, at 24 and 48 hours. An experimental, in vitro and

comparative study was proposed since the effect of the ethanol extract of Prosopis Pallida

was established in different concentrations against 0.12% chlorhexidine on

Porphyromone gingivalis. Prior to the verification of compliance with inclusion and

exclusion criteria, a sample of 15 Petri dishes with Mueller Hinton Agar in which the

strain of Porphyromone gingivalis ATCC® 33277 ™ was valued, which was considered

as a non-probabilistic sample for convenience The data obtained are organized in a

database in the SPSS 23 IBM® software, in order to perform descriptive and inferential

statistical calculations, from the quantitative and qualitative perspective, statistically

relevant tests such as Kruskal Wallis and Mann Whitney will be used.

KEY WORDS: ANTIBACTERIAL EFFECT / PERIODONTAL DISEASES /

PORPHYROMONA GINGIVALIS.

1

1 REVISIÓN DE LA LITERATURA

1.1 Fitoterapia

1.1.1 Definición

En la actualidad con el afán de tomar direcciones alternas a los tratamientos usados en la

medicina convencional, se planeta la fitoterapia como un coadyuvante el cual revaloriza

los usos terapéuticos de plantas medicinales con relevancia ancestral que empezó su

desarrollo con el médico francés Henri Leclerc en el año de 1955 y posteriormente tomó

su auge en 1980 ya que transformó su conocimiento empírico en un desarrollo con

fundamento científico (1).

1.1.2 Características de la fisioterapia

Uno de los principales beneficios que posee la fitoterapia es que presentan menos efectos

secundarios, además que varios principios activos que poseen las plantas medicinales son

ampliamente usados en la industria farmacéutica, así mismo es de gran relevancia tomar

en cuenta que el complejo de una planta del cual se puede extraer componentes útiles para

efectos terapéuticos es muy variado (raíz, tallo, hoja, flores, semillas) (1) (2).

Se debe aclarar que en términos específicos se habla de varios efectos terapéuticos los

cuales deben recibir un disolvente ya sea en alcohol o vapor agua para obtener como

resultado un extracto etanólico o un aceite esencial. En cualquier que sea el caso estos

extractos poseen diferentes características físico – químicas al cual se lo conoce como

fitocomplejo. Este fitocomplejo, junto con otras sustancias, actúa en conjunto para

obtener un determinado efecto terapéutico (2).

1.1.3 Extractos etanólicos

1.1.3.1 Definición

Un extracto es aquella sustancia que se obtiene de un componente principal que se lo

puede extraer usando dos solventes principales (agua o etanol), y que se ha extraído

2

mediante el uso del etanol y posteriormente se la ha sometido a un procedimiento para

retirar el excedente del mismo etanol, posee una determinada composición molecular y

una bioquímica determinada que se usará con propósitos terapéuticos frente a diferentes

tipos de microorganismos (3).

1.1.3.2 Mecanismo de acción de los extractos etanólicos

Los extractos etanólicos que son extraídos de plantas y frutos presentan efectos

antimicrobianos, por lo cual esta actividad inhibitoria frente a ciertos microorganismos

no posee un solo mecanismo de acción sino que estos pueden actuar de diferentes maneras

degradando su pared celular, desnaturalizando proteínas o destruyendo su pared celular.

(3) (4) (5)

Para determinar su mecanismo de acción es de suma importancia que se diferencie entre

la concentración mínima inhibitoria y la concentración mínima bactericida las cuales se

definen como; la concentración mínima inhibitoria (CMI) es definida como la mínima

cantidad del antimicrobiano que impide el crecimiento de un microorganismo en

condiciones normalizadas; mientras que la concentración mínima bactericida (CMB) es

la mínima cantidad del antimicrobiano que destruye la mayor parte de los

microorganismos en condiciones estandarizadas. (5) (6)

La actividad antimicrobiana de los extractos alcohólicos fue probada tomando como

modelo de cepa bacterias gran positivo, Staphylococcus Aureus y de bacterias

gramnegativas como la Porphyromona Gingivalis. (4)

Este estudio en donde las bacterias fueron aisladas se lo realizó por la sección de

Bacteriología del Instituto de Microbiología “Dr. L. Verna”, Facultad de Bioquímica,

Química y Farmacia, Universidad Nacional de Tucumán. (7)

En las bacterias tanto Gram negativas como Gram positivas el extracto etanólico provocó

una interrupción de la capa externa de lipopolisacáridos seguida de una desintegración

parcial de su membrana externa. (5)

3

También se menciona que las bacterias Gram positivas son más susceptibles a los aceites

esenciales por la presencia de lipopolisáridos en su membrana por lo cual las bacterias

gramnegativas tienen mayor inhibición a los extractos etanólicos. (8)

1.1.4 Método de obtención de los extractos etanólicos

Percolación es método descrito en la Farmacopea Americana y consiste en que la

sustancia atraviesa la masa del solvente pulverizado siempre en un solo sentido; (9)

alcanzando concentraciones crecientes de tal modo que el equilibrio entre el solvente

dentro y fuera del marco nunca se alcanza, por lo que el solvente bañado siempre por

nuevas proporciones de sustancia acaba por ceder todos sus componentes solubles de

manera progresiva. (10)

Maceración se entiende el contacto prolongado durante cierto tiempo del solvente con la

sustancia constituyendo un conjunto homogéneamente mezclado en el cual la sustancia

actúa simultáneamente sobre todas las proporciones del solvente, circulando a través en

todas las direcciones y sentidos y disolviendo sus principios activos hasta producirse una

concentración en equilibrio con la del contenido celular. (9)

Infusión es el proceso en cual se somete a la sustancia previamente humedecida al

contacto con el solvente a una temperatura igual a la de ebullición del agua por cinco

minutos, se deja enfriar hasta temperatura ambiente y se prepara al 5%. (9)

1.1.5 Tipos de extractos

Los extractos son preparados concentrados de consistencia sólida, líquida o intermedia,

derivados generalmente de material vegetal desecado, se obtienen al evaporar parcial o

totalmente el disolvente en los líquidos extractivos de origen vegetal.

Extractos Fluidos son extractos de sustancias que, con la concentración prescrita de

etanol, están preparados de forma que una parte de la sustancia corresponde a una parte

o dos partes del extracto fluido; teniendo en cuenta que 85 partes de sustancia seca

corresponden a 100 partes de planta fresca. (10)

4

Extractos secos son aquellos que tienen una consistencia seca y son fácilmente

pulverizables, se obtienen por evaporación del disolvente y desecación del residuo. Los

extractos secos no deben presentar un contenido de humedad mayor del 5%. (3)

Presentan una concentración muy superior de principio activo que la sustancia original,

son preparados bastante estables y de fácil manipulación; como líquido extractor se utiliza

alcohol de diversa concentración y agua. (9) Actualmente es posible obtener extractos

secos nebulizados que son más estables que los tradicionales, por ser menos

higroscópicos. (10)

1.2 Prosopis Pallida (Algarrobo)

1.2.1 Descripción Botánica

Es un árbol espinoso que alcanza los 10 metros de altura, su dura madera se usa para

hacer muebles así como también para la producción de carbón y su resina se usa para

teñir telas. Posee flores de color verde amarillento y legumbres muy largas las cuales

cargan semillas de color marrón, es una planta de rápida propagación debido a su

habilidad de reproducirse ya sea por la gran producción de semillas livianas y de fácil

dispersión así como también por la producción de plantas renovables que compiten con

otras plantes de su cercanía privándolas de luz solar. Posee una alta probabilidad de

supervivencia a la sequedad debido a sus largas raíces. Entre su fruto mencionamos a la

agarroba, una legumbre que se singulariza por sus contenidos en proteínas e hidratos de

carbono. Se caracteriza por sus contenidos fenólicos como los flavonoides y taninos y por

tal motivo se utiliza para combatir la tos, bronquitis, artritis y reumatismo. (11)

5

Figura 1: Árbol de Algarrobo

Fuente: K. Forrest, 2006

1.2.2 Taxonomía

La descripción taxonómica de la Prosopis Pallida es la siguiente:

Es del reino Plantae, clase y división Magnoliopsida, familia y subfamilia Mimosaceae y

género Prosopis. (12)

1.3 Clorhexidina

Lorenzini y cols definen a la clorhexidina como un antiséptico de amplio espectro de

acción sobre bacterias Gram positivas y Gram negativas que actúa alterando la estructura

proteica de la membrana celular bacteriana. Desde hace unas décadas ha sido reconocida

como un auxiliar importante para el mantenimiento de la higiene oral. La clorhexidina

además de su acción bactericida que inhibe la formación de nueva placa bacteriana, posee

la capacidad de disgregar la placa ya adherida por su capacidad de competir con los iones

calcio.

La clorhexidina posee un pH mayor a 3.5 que actúa sobre agentes tensioactivos aniónicos

como sulfatos y fosfatos clorados los cuales se encuentran en las pastas de dientes; así

como también en enjuagues bucales y barnices. (13)

6

Esta sustancia posee gran absorción en las estructuras bucales por su fuerte carga positiva,

así como también posee un gran efecto antimicrobiano. (14)

La clorhexidina también posee gran duración ya que se sigue liberando en las estructuras

dentales durante 24 horas después de su aplicación por lo cual evita que los

microorganismos se organicen y se adhieran.

Esta sustancia actúa destruyendo la membrana plasmática, y dependiendo de su

concentración puede causar la destrucción de los elementos citoplasmáticos en bajas

concentraciones y produciendo coagulación de citoplasma en altas concentraciones. (15)

1.3.1 Efectos adversos

Sin embargo el efecto adverso más conocido de la clorhexidina es la aparición de

pigmentaciones de color café en las superficies dentarias, prótesis, restauraciones y

lengua. Otros efectos colaterales son: (16)

Posee un sabor amargo

Causa alteraciones del gusto

Ocasiona ulceraciones mucosas

1.3.2 Indicaciones y contraindicaciones

1.3.2.1 Indicaciones

El uso de la clorhexidina al 0.2%, demostró su eficacia en inhibir el desarrollo de la placa;

El estudio clásico de Addy y Moran en 8 pacientes demostró que después de cinco días

de terapia tópica la clorhexidina reduce de una forma significativa la formación de placa.

(17)

Otra indicación se centra en las ulceraciones aftosas, ya que ha sido demostrado y

aceptado por su eficacia, así como también en su aplicación en las heridas posquirúrgicas

orales luego de tratamientos como: apicetomías, extracciones de remanentes radiculares,

extracciones de terceros molares y cirugías periodontales.

7

La literatura además nos sugiere también su empleo en la terapia de estomatitis en los

pacientes portadores de prótesis.

En cuanto a su aplicación tópica se debe utilizar una gasa o algodón para tratar el área

deseada; se debe evitar el contacto con los ojos, los oídos y la boca, si esto ocurriera se

debe enjuagar inmediatamente con agua abundante.

En cuanto a su forma de aplicación en cuanto a colutorios se dice que se comercializa en

envases que contienen una medida de unos 15 ml; misma dosis que se debe mantener en

la boca durante aproximadamente 1 minuto.

Finalmente se puede así concluir que la clorhexidina puede ser considerada un antiséptico

de síntesis, que presenta una eficacia comprobada y un amplio espectro de acción. (18)

1.3.2.2 Contraindicaciones

Las reacciones de hipersensibilidad a la clorhexidina por vía oral son muy raras; algunos

pacientes pueden desarrollar una decoloración permanente en sus piezas restauradas. (18)

1.4 Periodontitis

La periodontitis es una enfermedad de carácter inflamatorio e infecciosa la cual afecta los

tejidos de soporte de las piezas dentarias la cual al ser progresiva puede desencadenar

varias afecciones entre ellas la más grave es la perdida de las estructuras circundantes a

la pieza dental terminando en su propia perdida. (19)

Las estructuras que se ven afectadas debido a este proceso inflamatorio e infeccioso son:

el hueso alveolar y el ligamento periodontal, además se produce una reabsorción del

epitelio de unión provocando la formación de bolsas periodontales circundando a la pieza

dentaria afectada. (20)

El factor etiológico principal asociado a la enfermedad periodontal es el llamado biofilm

o placa bacteriana el cual en condiciones de irregularidades en la superficie dental puede

acumularse y desencadenar procesos infecciosos e inflamatorios; aparte del biofilm

8

también es asociada la periodontitis a factores sistémicos, diabetes, consumo regular de

tabaco y estrés. (21)

1.5 Biofilm

El biofilm es un conjunto de bacterias las cuales se han adherido a la superficie del diente

que con el pasar del tiempo se vuelve rígida, este es el factor principal para que se inicie

la enfermedad periodontal; estos microorganismos que se han adherido a la superficie

dental están cubiertos por una matriz extracelular como medio de protección. (22)

1.5.1 Fases del Biofilm

El biofilm presenta cuatro fases los cuales se definen como:

Fase I: Formación de biopelícula la cual está compuesta por glicoproteínas y

anticuerpos en la superficie dentaria la cual favorece a la posterior adhesión de

bacterias.

Fase II: En esta fase se produce la adhesión de microorganismos de carácter gram

positivos y anaerobios los cuales irán aumentando en número.

Fase III: En esta fase se da un aumento en volumen ya que los microorganismos

se reproducen en gran cantidad.

Fase IV: En esta fase se produce una congregación bacteriana, se empiezan a

adherir bacteria de tipo gram negativo. (23)

1.6 Porphyromona gingivalis

1.6.1 Definición

Es una bacteria anaerobia gram negativa involucrada en la patogenia de la periodontitis;

esta especie se encuentra presente en el surco gingival cuando existe una deficiente

higiene bucal. (24) (8)

Forma colonias uniformes de coloración verdosa, parda o negra debido a la hemina que

almacena en la superficie celular; en el nivel externo de su pared celular se localizan las

9

endotoxinas, son capsulados no esporulados sin flagelos y abundantes fimbrias. A nivel

de su superficie presenta vesículas en las cuales se localizan enzima que juegan un papel

importante en su virulencia. (24)

Figura 2 Colonias de Porphyromona Gingivalis

Fuente: Investigación – B. Alvarez, 2020

1.6.2 Complejo Microbiano de Socransky

El complejo microbiano de Socransky se describe como la presencia de cinco complejos

de microorganismos los cuales se relación entre sí; el investigador Socransky asigno un

color para cada complejo en donde los complejos rojo y naranja se relacionaban

mutuamente y los complejos amarillo, purpura y verde se relacionaban entre sí. El

complejo amarillo y purpura son los encargados de realizar una colonización inicial y

posteriormente los complejos verde y naranja son aquellos encargados de la colonización

temprana y finalmente el complejo rojo es el encargado de la colonización tardía. La

Porphyromona gingivalis es una de las especies predominantes en cuanto a las

enfermedades predominantes situada en el complejo rojo. (25)

10

Figura 3 Complejo de Socransky

Fuente: Negroni, 2009

1.6.3 Factor de Virulencia

La Porphyromona gingivalis posee una gran cantidad de factores de virulencia así como

también una diversidad genotípica y serotípica la cual permite que haya una variabilidad

entre su especie la cual provoca inflamación y destrucción periodontal. (26)

La membrana externa se encuentra cubierta de vesículas las cuales poseen enzimas como

proteasas y fosfolipasas las cuales se encargan de dañar a las células periodontales;

además se encuentra una endotoxina la cual está formada de lípidos los cuales causan una

interrupción a la homeostasis inmunológica del huésped por lo que se produce una

inflamación gingival la cual induce a la aceleración de osteoclastos los cuales a su vez

producen destrucción de tejido conectivo y reabsorción del hueso. (27) (25)

1.6.3.1 Fimbria

Esta estructura de tipo filamentosa se localiza en la superficie del microorganismo el cual

le permite adherirse a los tejidos periodontales y posteriormente colonizarlos; además

posee una subunidad llamada fimbrilina y otra subunidad llamada Mfa de tipo proteico.

(28)

11

1.6.3.2 Enzimas Proteolíticas

La P. g. posee un grupo de proteasas las cuales pertenecen al grupo “trypsin – like cystein

proteinases”; además posee gingipaínas de tipo RgpA y RgpB las cuales son codificadas

por los genes rgpA y rgpB, respectivamente, y son específicas para péptidos ricos en

arginina, así como también la gingipaína Kgp está codificada por el gen kgp. (29)

RgpA y Kgp son complejos que contienen dominios de separación catalítica y de

adhesión hemaglutinínico; mientras que RgpB sólo presenta un dominio de catálisis.

RgpB determina el desarrollo del edema mediante la activación de la vía

kalikreína/quinina y la infiltración por neutrófilos mediada por la activación de los

factores quimiotácticos del complemento. En cambio, Kgp y RgpA controlan el sangrado

gingival a través de la degradación del fibrinógeno y fibrina. (29)

Los complejos RgpA y RgpB son capaces de inactivar citoquinas y sus receptores,

estimular la agregación plaquetaria, atenuar la actividad antibacteriana de los neutrófilos

por medio de la inhibición del receptor de LPS, incrementar la permeabilidad vascular y

la apoptosis de los queratinocitos gingivales y destruir macrófagos. Y el complejo Kgp

es capaz de promover la adhesión e invasión bacteriana in vitro. (29)

1.6.3.3 Lipopolisacárido

La P. g. posee un lipopolisacárido el cual posee 3 componentes: polisacáridos en su

exterior, oligosacáridos en el centro y lípido tipo A en su interior siendo este último la

parte inmunogénica más activa; en el transcurso de la enfermedad periodontal la P. g.

libera vesículas que contienen lipopolisacáridos los cuales invaden los tejidos

periodontales y activan la producción de citoquinas en macrófagos, fibroblastos y células

endoteliales los cuales eventualmente son reconocido por células presentadoras de

antígenos con la capacidad de presentar sus antígenos a los linfocitos T y desencadenar

una respuesta inmune específica en el huésped. (29)

12

1.6.3.4 Polisacáridos Capsulares

En la superficie existen macromoléculas que confieren estabilidad estructural y que

cumplen un papel importante en el reconocimiento e interacción con el huésped, en

bacterias patógenas, las macromoléculas de superficie también forman una barrera

defensiva que le permiten evadir respuesta inmune. Por lo tanto, los polisacáridos

capsulares cumplen un rol importante en la mantención de la integridad de la célula en

ambientes con alta presión inmune. (29)

La cápsula de la P. g. se compone principalmente de glucosa, glucosamina, galactosa, 2-

acetamido-2-deoxy-D-glucosa, galactosamina y los ácidos galactosaminurónico,

manurónico, glucorónico y galacturónico. (29)

1.6.4 Nutrición

La nutrición se da con nutrientes endógenos ricos en péptidos y aminoácidos,

proporcionando un ambiente favorable para la colonización de esta especie. Tiene

requerimiento obligado de hierro para crecer, sin embargo cuando hay ausencia en el

sistema de poros utiliza hemina. (26) Los niveles de hemina en boca son variables

dependiendo del sangrado que se obtiene como el resultado de la inflamación gingival,

por ello este es un factor que predispone la acumulación de la bacteria. (30)

1.7 Evaluación Antimicrobiana

Las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana son aplicadas para el descubrimiento de

fármacos, la epidemiologia y la predicción del resultado terapéutico. (31) (24) Posterior a la

revolución en la era dorada, época en la cual se descubrieron casi todos los antibióticos

resolviéndose los principales factores de la quimio terapia, aunque existe el peligro

inminente de que pierdan su eficacia debido al incremento de la resistencia microbiana

por lo que desarrollan estudios de evaluación antimicrobiana especialmente sobre

productos de origen natural. (26)

13

1.8 Revisión de la Literatura

Muchas plantas presentan grandes cantidades de polifenoles, productos del metabolismo

secundario además presenta ácidos fenólicos y flavonoides que son considerados como

los principales grupos de polifenoles. Los ácidos fenólicos participan como agentes

protectores frente a la acción de patógenos como parte de su mecanismo de defensa,

presentan funciones como anticancerígenas, antiinflamatorias y antioxidantes. Los

flavonoides presentan una actividad antioxidante debido a una interacción de sus

propiedades quelantes del hierro y tienen la capacidad de inhibir las oxidasas:

lipooxigenasa, ciclooxigenasa, mieloperoxidasa. Entre los flavonoide recordamos a la

quercetina importante porque presenta una función antioxidante, que es cinco veces

mayor que la de las vitaminas C y E. Otra característica importante de los flavonoides es

la capacidad de retiran oxígeno reactivo, sobre todo en aquellos que se encuentran en

forma de aniones superóxidos, radicales hidroxilos, hidroperóxidos y peróxidos lipídicos,

de tal manera que logran bloquear la acción deletérea de estas sustancias sobre las células

dónde que actúan como protectores antioxidante queratinocitos, fibroblastos dérmicos,

ganglios sensoriales, endotelio, tejido nervioso y en lipoproteínas. (32)

Cushnie y col realizaron un estudio in vitro para verificar la actividad antibacteriana de

los flavonoides y demostraron que presentaron una gran actividad antibacteriana contra

el Staphylococcus aureus. (33) (34)

Ha sido demostrado también que los taninos tienen una función cicatrizante al acelerar la

curación de las heridas y hemostática al detener el sangrado. Además presenta la

propiedad antibacteriana porque son capaces de privar a los microorganismos del medio

apropiado para que puedan desarrollarse.

Saavedra et al. (2018) realizaron un estudio para verificar el efecto antibacteriano in vitro

del extracto etanólico de Prosopis Pallida sobre Enterococcus faecalis ATCC 29212. La

investigación consistió en realizar un inoculo de Enterococcus faecalis para luego colocar

los discos impregnados con las concentraciones del extracto de Prosopis Pallida,

gluconato de clorhexidina al 2 % y con solución salina fisiológica. Los resultados

demostraron que el gluconato de clorhexidina alcanzó un halo de inhibición promedio de

14

16,9 mm superior a lo obtenido con el extracto alcohólico de Prosopis Pallida que

alcanzó un halo de inhibición de 10mm. (35)

Corzo y cols demostraron que los compuestos bioactivos de la planta de Algarrobo

(Prosopis Pallida) muestra una capacidad antibacteriana contra bacterias gramnegativas

resistentes a antibióticos como la minociclina, cloranfenicol y eritromicina, Este efecto

se pudo deber a las saponinas y taninos presentes en los extractos. (9)

Cárdenas C, también investigó las propiedades de la Propis Pallida utilizando extractos

acuosos de las hojas para mitigar las infecciones bucales y periodontales obteniendo

resultados similares a los obtenidos con colutorios comerciales que contenían gluconato

de clorhexidina. (36)

Castro et al. (37) Propusieron que el efecto antibacteriano del extracto alcohólico

de Prosopis Pallida podría tener respuesta positiva por presentar gran cantidad de

compuesto fenólicos, taninos y flavonoides, presente en las hojas de esta planta. Se ha

establecido que las propiedades antibacterianas y anti fúngicas de estos compuestos

radican en la capacidad de provocar lesiones en la membrana citoplasmática de los

microorganismos. La función de los flavonoides es actuar como metabolitos en el

crecimiento y reproducción de las plantas, y actuar como agente protector en un

mecanismo de defensa; asimismo los taninos ejercen una acción defensiva limitando el

desarrollo de los microorganismos del medio en las superficies de la planta. Los

mecanismos que pueden ser responsables de la toxicidad fenólica a los microorganismos

incluyen la inhibición de la enzima beta-glucano sintasa por los compuestos oxidados,

probablemente por la reacción de los grupos sulfhidrilo o por las interacciones no

específicas con proteínas.

Finalmente se constata de que existe dificultad para comparar los resultados de

susceptibilidad antimicrobiana ya que según la farmacopea Europea el comportamiento

de las plantas y sus metabolitos los cuales contienen los principios activos dependen de

una gran cantidad de factores tales como: ambientales, maduración, época del año, clima,

presión atmosférica por lo cual los efectos pueden diferir dependiendo de las diferentes

condiciones en las cuales se recolecto las hojas de la planta mencionada. (38)

15

2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Orrego et. Al. Hacen referencia que la Porphyromona gingivalis es uno de los principales

precursores en la enfermedad periodontal, siendo un patógeno relevante para el desarrollo

de esta patología (39). La P. g. es considerada como un cocobacilo gram negativo que

habita el surco gingival. Sus factores patogénicos estructurales como las fimbrias,

facilitan su adhesión al tejido, mientras que factores de secreción como proteasas y

hialuronidasas hidrolizan componentes del tejido periodontal, causando daño tisular y

pérdida de soporte dentario. (40)

Mediante el control de placa bacteriana se puede mitigar la enfermedad periodontal,

además del uso complementario de antibióticos sistémicos y locales, éste es el método

más eficaz para contrarrestar sus efectos negativos, sin embargo en la actualidad la

resistencia a los antibióticos va en aumento; por lo cual se pretende buscar nuevas

terapias, que posean una relevancia con sustento científico, razón por la cual la medicina

fundamentada en extractos naturales a recibido mucha atención en los últimos años. (41)

En la actualidad las plantas se han convertido en una alternativa de control a los

padecimientos de salud que afectan a la población y han demostrado propiedades

curativas. La medicina natural es utilizada para el control del dolor y atacar infecciones

que afectan la salud integral de los seres humanos, esta es una de las razones por la cual

se ha incrementado el desarrollo de investigaciones con la única finalidad de encontrar

tratamientos alternativos. Se ha demostrado su efectividad antibiótica y analgésica y

porcentajes mínimos de riesgo y reacciones adversas por ello la Organización Mundial

de la Salud (OMS) promueve el uso de plantas medicinales.(42) Recientemente, los

estudios han investigado métodos complementarios que utilizan nutrientes y alimentos

funcionales para mantener el estado de salud de los tejidos periodontales (43); por ejemplo,

extractos de plantas, incluyendo la Prosopis Pallida.

Por lo que surge el siguiente cuestionamiento ¿Cuál porcentaje de concentración es el

más efectivo para proporcionar un efecto antibacteriano sobre cepas de Porphyromona

gingivalis en concentraciones de 50%, 75% y 100%, a las 24 y 48 horas?

16

2.1 Objetivos

2.1.1 Objetivo general

Evaluar cuál de las diferentes concentraciones del extracto etanólico de Prosopis Pallida

presenta mayor efecto inhibitorio sobre la cepa de Porphyromona gingivalis ATCC®

33277™.

2.1.2 Objetivos específicos

Determinar la actividad antibacteriana del extracto etanólico de Prosopis Pallida a

concentración del 50% sobre la cepa de Porphyromona gingivalis a las 24 y 28 horas.





Comparar los resultados de los diferentes porcentajes en la acción antibacteriana del

extracto etanólico de Prosopis Pallida a concentración de 50%, 75% y 100% sobre la cepa

de Porphyromona gingivalis a las 24 y 28 horas.

Comparar el efecto inhibitorio del extracto etanólico de Prosopis Pallida frente a la

clorhexidina al 0,12% sobre la cepa de Porphyromona gingivalis ATCC® 33277™.

Comparar el efecto inhibitorio del extracto etanólico de Prosopis Pallida frente a agua

destilada sobre la cepa de Porphyromona gingivalis ATCC® 33277™.

17

2.2 Hipótesis

2.2.1 Hipótesis de investigación (H1)

La concentración al 100% del extracto etanólico de Prosopis Pallida es más efectiva que

la Clorhexidina (Gold standard) sobre la cepa de Porphyromona gingivalis.

2.2.2 Hipótesis nula (H0)

La concentración al 100% del extracto etanólico de Prosopis Pallida no es más efectiva

que la Clorhexidina (Gold standard) sobre la cepa de Porphyromona gingivalis.

2.2.3 Conceptualización de variables

2.2.4 Variables independientes

Extracto etanólico de Prosopis Pallida (algarrobo) al 50%, 75% y 100%: elaborado en la

Facultad de Química de la Universidad Politécnica Salesiana, mediante el método de

destilación por arrastre de vapor, utilizando como solvente alcohol etílico al 80%. Con

las siguientes concentraciones al 50%, 75% y 100%.

2.2.5 Variables dependientes

Efecto antibacteriano del extracto etanólico de Prosopis Pallida (algarrobo) al 50%, 75%

y 100%: Capacidad de inhibir o limitar el crecimiento y desarrollo de la bacteria

Porphyromona gingivalis.

2.2.6 Variables de control

Control positivo: Clorhexidina 0.12%.

Es una diguanidina o biguanida que representa uno de los desinfectantes de acción

bactericida mejor conocidos y de uso más extendido, por su eficacia y tolerancia. Su

espectro antimicrobiano alcanza a bacterias grampositivas y gramnegativas.

Control negativo: Suero fisiológico

Es una solución de cloruro de sodio al 0,9% en agua. El cloruro de sodio es una sustancia

química que se encuentra en la sangre.

18

3 JUSTIFICACIÓN

La enfermedad periodontal es una de las condiciones de salud bucal de mayor prevalencia

en la población humana, el tratamiento es mecánico y químico como la clorhexidina, pero

es fundamental el uso de coadyuvantes que mejore la condición de salud de los tejidos en

tratamiento. Por ello se utiliza antisépticos de uso comercial cuya eficacia ha sido

comprobada, la mayoría de estas sustancias ha creado resistencia, o suelen tener efectos

adversos por su uso prolongado, tales como la pigmentación de las piezas dentarias y

alteración del gusto. Es por esto que en la actualidad el uso de la fitoterapia ha adquirido

gran relevancia, en el área odontológica el importante crecimiento de la fitoterapia dentro

de programas preventivos y curativos ha estimulado la investigación, con el fin de evaluar

la actividad antimicrobiana de distintos derivados de plantas con el objeto de ayudar en

el control de la placa bacteriana, y por consiguiente, en la disminución de la incidencia

de caries dental y enfermedad periodontal. En esta investigación se evaluó la actividad

antimicrobiana que posee el extracto etanólico de Prosopis Pallida en diferentes

concentraciones. Por lo cual se planea obtener como resultado un coadyuvante que tenga

beneficios tanto sociales como científicos frente a la enfermedad periodontal.

19

4 METODOLOGÍA

4.1 Diseño de la investigación

Se planteó la ejecución de un estudio de tipo experimental, comparativo e in vitro.

4.2 Población de estudio y muestra

El estudio se realizó en 15 cajas Petri con Agar Mueller Hinton en el cual se encontrará

sembrada la cepa Porphyromona gingivalis ATCC® 33277™, considerada como una

muestra no probabilística por conveniencia.

4.2.1 Criterios de inclusión y exclusión

Criterios de inclusión

1. Agares Mueller Hinton libres de contaminación con Porphyromona gingivalis.

2. Extracto etanólico de Prosopis Pallida en concentraciones del 50%, 75% y 100%.

Criterios de exclusión

1. Agares Mueller Hinton contaminados durante el proceso experimental.

2. Extracto etanólico de Prosopis Pallida en concentraciones diferentes al 50%, 75%

y 100% y/o que se encuentren contaminadas.

20

4.2.2 Definición operacional de variables

Tabla 1 Operacionalización de Variables

Variable Definición operacional Tipo Clasificación Indicador categórico Escala de

Medición

Extracto

etanólico de

Prosopis Palida

Sustancia obtenida por la molienda de

la planta de algarrobo (Prosopis

Pallida) con etanol.

Independiente Cualitativa

nominal

Concentración

50%

75%

100%

Nominal

1

2

3

Tiempo de

inoculación

Periodo entre la introducción de virus o

bacteria en el cultivo y el crecimiento

mínimo esperado de Porphyromona

gingivalis

Independiente Cuantitativa

razón

24 y 48 horas horas

Actividad

antimicrobiana

sobre cepa de

Porphyromona

Gingivalis

Capacidad que poseen ciertas

sustancias o elementos de inhibir el

crecimiento y desarrollo de

Porphyromona gingivalis

Dependiente Cuantitativa

intervalo

Diámetro de halo de

inhibición en milímetros,

según la escala de

Duraffourd & Lapraz

Nula

Sensible

Muy sensible

Sumamente sensible

<8mm

=9mm –

14mm

=15mm

<19mm

≥20mm

Ausencia de crecimiento

bacteriano (actividad

antimicrobiana)

0

21

Presencia de crecimiento

bacteriano (actividad nula)

1

Control positivo

- negativo

Clorhexidina al 0,12% (control

positivo): Sustancia antiséptica

empleada para las lesiones leves de la

mucosa bucal.

Agua destilada (control negativo):

Elemento cuya composición se

encuentra basada en la unidad de

moléculas de H2O, purificada o

depurada mediante destilación.

Independiente Cualitativa

Nominal

Clorhexidina

Agua destilada

0

1

22

4.2.3 Estandarización

La estandarización necesaria para obtener datos confiables, se llevó a cabo por el

investigador, quien estuvo pendiente de todas las indicaciones y capacitaciones dadas por

la tutora de tesis Dra. Marina Dona y por el Ingeniero Paul Villagrán encargado del

laboratorio químico de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Politécnica

Salesiana mismo en el cual se realizó la experimentación del presente estudio una vez

obtenido los permisos correspondientes.

4.2.4 Manejo y métodos de recolección de datos

Se seleccionó de forma unitaria las hojas para descartar hojas con infección o deterioro.

Figura 4 Selección de hojas


Posteriormente fueron lavadas con agua destilada y desinfectadas con una torunda de

algodón embebida con alcohol. Se colocó las hojas sobre papel Kraff y se dejó a

temperatura ambiente durante 24 h, después se llevó a la estufa a 50 °C durante 4 horas

para su secado final.

La molienda del material vegetal seco se realizó utilizando un mortero y posteriormente

un molino casero con el que se obtuvo la pulverización total. A partir del polvo obtenido

se pesó 100 g y se colocó en un frasco de vidrio color ámbar de capacidad de 1 000 ml,

luego se le agregó el solvente que consiste en etanol al 80 %. El extracto total se obtuvo

por maceración con agitación constante durante 14 días, después de los cuales el producto

23

fue filtrado 5 veces con papel de filtro Whatman No. 1 y No. 2. El filtrado final se llevó

a sequedad forzada en rotavapor, obteniéndose el extracto seco de las hojas de Prosopis

Pallida.

Figura 5 Filtrado final mediante rotavapor y liofilizador


A partir del extracto seco se realizó diluciones en etanol al 80 % obteniéndose

concentraciones de 50 mg/ml, 75 mg/ml, y 100 mg/ml. Cada concentración fue colocada

en un vial estéril de color ámbar, tapado herméticamente y refrigerada hasta su utilización.

Figura 6 Dilución en etanol al 80% del extracto etanólico.


Se procedió a sembrar la bacteria en cajas Petri con agar sangre, en cámaras anaerobias

con sobres captadores del oxígeno en una incubadora a 37° C durante un periodo de 7

días.

24

Figura 7 Sembrado de bacteria en cámara anaerobia con sobre captador de oxígeno.


Al transcurrir los 7 días de activación de la cepa en agar sangre se procedió a etiquetar y

sembrar la bacteria P. g. en 15 cajas Petri las cuales de igual forma contenían agar sangre.

Figura 8 Cultivo de Porphyromona Gingivalis.


Se embebieron las sustancias en los discos de papel filtro y se colocaron tres discos en

cada caja Petri en cámaras anaerobias con bolsas captadoras de oxígeno y esto a su vez

en la incubadora a 37°C hasta que se cumpla las 48 horas de exposición de cada

tratamiento.

25

Figura 9 Discos inoculados con el extracto etanólico.


Se realizó la primera medición a las 24 horas de la inoculación de los tratamientos

(extracto etanólico, clorhexidina, agua destilada).

La segunda medición se realizó a las 48 horas de haber inoculado los tratamientos

(extracto etanólico, clorhexidina, agua destilada).

Figura 10 Cajas Petri con a) Extracto Prosopis Pallida al 100% b) Extracto Prosopis Pallida al 75% c)

Extracto Prosopis Pallida al 50% d) Clorhexidina e) Agua Destilada


26

4.2.5 Análisis estadístico

Los datos obtenidos fueron procesados en el programa estadístico SPSS25, bajo una

distribución normal con un nivel de confianza del 95%, lo cual permitió obtener medidas

de tendencia central (estadística descriptiva) que permitirá identificar los valores más

representativos de los datos obtenidos, con el fin de determinar diferencias significativas

entre el efecto antibacteriano del extracto etanólico de Prosopis Pallida.

27

5 RESULTADOS

Se debe verificar previamente al estudio propiamente dicho que las muestras tomadas

provienen de una población con distribución paramétricas o no paramétricas, esto según

el “manual para presentar documentos escritos de trabajo de titulación – modalidad

proyectos de investigación e intervención”, mediante la ayuda de las pruebas de

Kolmogorov - Smirnov o con la prueba de Shapiro - Wilk (menor a 20 datos).

Si las muestras provienen de poblaciones con distribución normal entonces se

realizan pruebas paramétricas (media, desviación estándar): T student, ANOVA.

Si las muestras No provienen de poblaciones con distribución normal entonces se

realizan pruebas no paramétricas (orden, signos): Mann Whitney, Kruskal Wallis,

Wilcoxon

Para cada prueba de Hipótesis, se compara el valor de significación (Sig) con el valor 0,05

(95% de confiabilidad)

Si el nivel de significación es superior a 0,05 se acepta Ho (hipótesis inicial, son

similares)

Si el nivel de significación en inferior a 0,05 se acepta Ha (hipótesis alterna, no

son similares).

Tabla 2 Pruebas de normalidad

Pruebas de normalidad

Kolmogorov-Smirnov Shapiro-Wilk

Estadístico gl Sig. Estadístico gl Sig.

50%, 24 Horas 0,237 15 0,023 0,881 15 0,049

75%, 24 Horas 0,233 15 0,027 0,823 15 0,007

100%, 24 Horas 0,300 15 0,001 0,837 15 0,011

AGUA DESTILADA, 24 Horas 0,453 15 0,000 0,561 15 0,000

CLORHEXIDINA 2%, 24 Horas 0,270 15 0,004 0,882 15 0,050

50%, 48 Horas 0,246 15 0,015 0,901 15 0,100

75%, 48 Horas 0,232 15 0,029 0,883 15 0,052

100%, 48 Horas 0,212 15 0,068 0,817 15 0,006

AGUA DESTILADA, 48 Horas 0,350 15 0,000 0,643 15 0,000

CLORHEXIDINA 2%, 48 Horas 0,270 15 0,004 0,882 15 0,050

Elaborado por Ing. Jaime Molina

En la prueba de Normalidad de Shapiro-Wilk, la mayoría de los valores del nivel de

significación (Sig) son inferiores a 0,05 (95% de confiabilidad), por tanto las muestras

NO provienen de poblaciones con distribución Normal, entonces para la comparación de

grupos se utiliza pruebas no paramétricas: Wilcoxon (antes – después), Kruskal Wallis (3

o más sustancias)

28

Comparación entre todas las sustancias a las 24 horas

Tabla 3 Comparación entre todas las sustancias a las 24 horas Descriptivos: 24 Horas

EXTRACTO N Media DE

95% del intervalo de

confianza para la media Mínimo Máximo

Límite

inferior

Límite

superior

PROSOPIS PALLIDA 50% 15 9,67 0,90 9,17 10,16 8 11



AGUA DESTILADA 15 5,27 0,46 5,01 5,52 5 6

CLORHEXIDINA 2% 15 33,60 0,91 33,10 34,10 32 35

Total 75 16,11 9,76 13,86 18,35 5 35

DE: Desviación estándar

Gráfico 1 Comparacion de medias a las 24 horas

Extracto al 50%: tiene una media de 9,67 mm con una desviación estándar de 0,90 mm,

el intervalo de confianza para la media se ubica entre 9,17 mm y 10,16 mm, el valor

mínimo de la muestra es de 8 mm y el máximo es de 11 mm.

Extracto al 75%: presenta una media de 15,00 mm con una desviación estándar de 0,76

mm, el intervalo de confianza para la media se ubica entre 14,58 mm y 15,42 mm, el valor


Extracto al 100%: tiene una media de 17,00 mm con una desviación estándar de 0,85



9,67

15,0017,00

5,27

33,60

PROSOPIS PALLIDA50%

PROSOPIS PALLIDA75%

PROSOPIS PALLIDA100%

AGUA DESTILADA CLORHEXIDINA 2%

COMPARACION DE MEDIAS A LAS 24 HORAS

29

Agua Destilada: tiene una media de 5,27 mm con una desviación estándar de 0,46 mm,

el intervalo de confianza para la media se ubica entre 5,01 mm y 5,52 mm, el valor mínimo

de la muestra es de 5 mm y el máximo es de 6 mm.

Clorhexidina 2%: tiene una media de 33,60 mm con una desviación estándar de 0,91



Para determinar si las diferencias entre las muestras son significativas (p<0,05) se

realiza la prueba no paramétricas de Kruskal Wallis:

Gráfico 2 Prueba de Kruskal – Wallis para muestras independientes

De la Prueba de Kruskal-Wallis, el valor del nivel de significación (Sig. asintótica (prueba

bilateral)) = 0,000) es inferior a 0,05 (95% de confiabilidad), luego si existen diferencias

significativas respecto a la tendencia central de las poblaciones. No todas las medias,

medianas de las muestras son similares. Para determinar cuáles son similares o diferentes

se hace la prueba dos a dos y se tiene el siguiente cuadro resumen:

30

Tabla 4 Medida 24 horas

Medida 24 Horas

SUSTANCIAS N

Subconjunto para alfa = 0.05

1 2 3 4 5

AGUA DESTILADA 15 5,27

EXTRACTO PROSOPIS PALLIDA 50% 15 9,67



CLORHEXIDINA 2% 15 33,60

Sig. 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00

De la prueba dos a dos se tiene que las medidas de las sustancias no son similares, se

forman 5 conjuntos totalmente diferentes, con los menores valores se ubica el agua

destilada con una media de 5,27 mm, con valores más altos está el extracto de Prosopis

Pallida al 50% con una media de 9,67 mm, le sigue el extracto de Prosopis Pallida 75%

con una media de 15,00 mm, a continuación está el extracto de Prosopis Pallida 100%

con una media de 17,00 mm y con los mayores valores se tiene la Clorhexidina 2% con

una media de 33,60 mm.

Tabla 5 Comparación entre todas las sustancias a las 48 horas

Descriptivos: 24 Horas

EXTRACTO N Media DE

95% del intervalo de

confianza para la media Mínimo Máximo

Límite

inferior

Límite

superior




AGUA DESTILADA 15 5,53 0,52 5,25 5,82 5 6

CLORHEXIDINA 2% 15 33,60 0,91 33,10 34,10 32 35

Total 75 16,07 10,00 13,77 18,37 5 35

DE: Desviación estándar

Gráfico 3 Comparación de medias a las 48 horas

7,87

15,4017,93

5,53

33,60

PROSOPIS PALLIDA50%

PROSOPIS PALLIDA75%

PROSOPIS PALLIDA100%

AGUA DESTILADA CLORHEXIDINA 2%

COMPARACION DE MEDIAS A LAS 48 HORAS

31

Extracto al 50%: tiene una media de 7,87 mm con una desviación estándar de 1,13 mm,









Agua Destilada: tiene una media de 5,53 mm con una desviación estándar de 0,52 mm,



Clorhexidina al 2%: tiene una media de 33,60 mm con una desviación estándar de 0,91



Para determinar si las diferencias entre las muestras son significativas (p<0,05) se

realiza la prueba no paramétricas de Kruskal Wallis:

32

Gráfico 4 Prueba de Kruskal – Wallis para muestras independientes

De la Prueba de Kruskal-Wallis, el valor del nivel de significación (Sig. asintótica (prueba

bilateral)) = 0,000) es inferior a 0,05 (95% de confiabilidad), luego si existen diferencias

significativas respecto a la tendencia central de las poblaciones. No todas las medias,

medianas de las muestras son similares. Para determinar cuáles son similares o diferentes

se hace la prueba dos a dos y se tiene el siguiente cuadro resumen:

Tabla 6 Medida 48 horas

Medida 48 Horas

SUSTANCIAS N

Subconjunto para alfa = 0.05

1 2 3 4 5

AGUA DESTILADA 15 5,53




CLORHEXIDINA 2% 15 33,60

Sig. 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00

De la prueba dos a dos se tiene que las medidas de las sustancias no son similares, se

forman 5 conjuntos totalmente diferentes, con los menores valores se ubica el agua

destilada con una media de 5,53 mm, con valores más altos está el extracto Prosopis

Pallida 50% con una media de 7,87 mm, le sigue el extracto Prosopis Pallida 75% con

una media de 15,40 mm, a continuación está el extracto Prosopis Pallida 100% con una

media de 17,93 mm y con los mayores valores se tiene la clorhexidina 2% con una media

de 33,60 mm.

33

Tabla 7 Comparación entre las 24 horas y las 48 horas

Descriptivos

EXTRACTO 24

HORAS

48

HORAS

Wilcoxon

(p =)

PROSOPIS PALLIDA 50% 9,67 7,87 0,003



AGUA DESTILADA 5,27 5,53 0,046

CLORHEXIDINA 2% 33,60 33,60 1,000

Gráfico 5 Comparación entre 24 horas y 48 horas

Extracto al 50%: Se tienen cambios significativos entre las dos etapas (p<0,05), mayores

valores a las 24 Horas

Extracto al 75%: En este caso no se tienen cambios significativos entre las dos etapas

(p>0,05), similares valores entre 24 horas y 48 horas.

Extracto al 100%: Se tienen cambios significativos entre las dos etapas (p<0,05),

mayores valores a las 48 Horas.

Agua Destilada: Se tienen cambios significativos entre las dos etapas (p<0,05), mayores

valores a las 48 Horas.

Clorhexidina al 2%: En este caso no se tienen cambios significativos entre las dos etapas

(p>0,05), similares valores entre 24 horas y 48 horas.

PROSOPIS PALLIDA 50%; 9,67PROSOPIS PALLIDA 50%;

7,87

PROSOPIS PALLIDA 75%; 15,00PROSOPIS PALLIDA 75%;

15,40

PROSOPIS PALLIDA 100%; 17,00 PROSOPIS PALLIDA 100%; 17,93

AGUA DESTILADA; 5,27 AGUA DESTILADA; 5,53

CLORHEXIDINA 2%; 33,60 CLORHEXIDINA 2%; 33,60

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

35,00

40,00

24 HORAS 48 HORAS

COMPARACION ENTRE 24 HORAS Y 48 HORAS

34

Comparación de la sensibilidad (Chi cuadrado de Pearson)

Tabla 8 Tablas Cruzadas: Sensibilidad a las 24 horas

EXTRACTO PROSOPIS PALLIDA

Sensibilidad AL 50% AL 75% AL 100%

AGUA

DESTILADA

CLORHEXIDINA

2% Total

Chi

Cuadrado

(p=) Cant % Cant % Cant % Cant % Cant % Cant %

Nula 1 6,7% 0 0,0% 0 0,0% 15 100,0% 0 0,0% 16 21,3%

0,00

Sensible 14 93,3% 4 26,7% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 18 24,0%

Muy sensible 0 0,0% 11 73,3% 15 100,0% 0 0,0% 0 0,0% 26 34,7%

Sumamente sensible

0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 15 100,0% 15 20,0%

Total 15 100,0% 15 100,0% 15 100,0% 15 100,0% 15 100,0% 75 100,0%

Gráfico 6 Sensibilidad a las 24 horas

En la prueba Chi cuadrado de Pearson, el valor del nivel de significación (Sig. asintótica

(2 caras) = 0,00) es inferior a 0,05 (95% de confiabilidad), luego los porcentajes de

sensibilidad entre las diferentes sustancias no son similares.

Extracto al 50%: el 6,7% de las muestras son Nulas, el 93,3% son Sensibles, el 0,0%

son Muy sensibles y el 0,0% son Sumamente sensible





6,7

%

0,0

%

0,0

%

10

0,0

%

0,0

%

93

,3%

26

,7%

0,0

%

0,0

%

0,0

%

0,0

%

73

,3%

10

0,0

%

0,0

%

0,0

%

0,0

%

0,0

%

0,0

%

0,0

%

10

0,0

%

AL 50% AL 75% AL 100% AGUA DESTILADA CLORHEXIDINA 2%

SENSIBILIDAD A LAS 24 HORAS

Nula Sensible Muy sensible Sumamente sensible

35

Agua Destilada: el 100,0% de las muestras son Nulas, el 0,0% son Sensibles, el 0,0%


Clorhexidina al 2%: el 00,0% de las muestras son Nulas, el 0,0% son Sensibles, el 0,0%


Tabla 9 Tablas Cruzadas: Sensibilidad a las 48 horas

EXTRACTO PROSOPIS PALLIDA

Sensibilidad AL 50% AL 75% AL 100%

AGUA

DESTILADA

CLORHEXIDINA

2% Total

Chi

Cuadrado

(p=) Cant % Cant % Cant % Cant % Cant % Cant %

Nula 10 66,7% 0 0,0% 0 0,0% 15 100,0% 0 0,0% 25 33,3%

0,00

Sensible 5 33,3% 2 13,3% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 7 9,3%

Muy sensible 0 0,0% 13 86,7% 15 100,0% 0 0,0% 0 0,0% 28 37,3%

Sumamente sensible

0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 15 100,0% 15 20,0%

Total 15 100,0% 15 100,0% 15 100,0% 15 100,0% 15 100,0% 75 100,0%

Gráfico 7 Sensibilidad a las 48 horas

En la prueba Chi cuadrado de Pearson, el valor del nivel de significación (Sig. asintótica

(2 caras) = 0,00) es inferior a 0,05 (95% de confiabilidad), luego los porcentajes de

sensibilidad entre las diferentes sustancias no son similares.


son Muy sensibles y el 0,0% son Sumamente sensible.



66

,7%

0,0

%

0,0

%

10

0,0

%

0,0

%

33

,3%

13

,3%

0,0

%

0,0

%

0,0

%

0,0

%

86

,7% 1

00

,0%

0,0

%

0,0

%

0,0

%

0,0

%

0,0

%

0,0

%

10

0,0

%

AL 50% AL 75% AL 100% AGUA DESTILADA CLORHEXIDINA 2%

SENSIBILIDAD A LAS 48 HORAS

Nula Sensible Muy sensible Sumamente sensible

36



Agua Destilada: el 100,0% de las muestras son Nulas, el 0,0% son Sensibles, el 0,0%


Clorhexidina al 2%: el 00,0% de las muestras son Nulas, el 0,0% son Sensibles, el 0,0%


37

6 DISCUSIÓN

La presente investigación consiste en la determinación in vitro del efecto inhibitorio de

la Prosopis Pallida a tres concentraciones (100%, 75%, 50%) y la clorhexidina al 0.12%

sobre una cepa de P. g. derivada del ATCC 33277.

El investigador Cushnie obtuvo como resultados de su investigación que los componentes

bioactivos de las plantas presentan una gran actividad antimicrobiana; al comparar los

datos frente a los resultados de mi investigación se constata que en efecto los principios

activos de las plantas en este caso planta de Algarrobo (Prosopis Pallida) posee un efecto

antimicrobiano de gran importancia.

El estudio de Saavedra et al. (2006) obtuvo como resultados que el extracto de la planta

de Algarrobo (Prosopis Pallida) tuvo un efecto inhibitorio frente a bacterias

gramnegativas lo cual concuerda con mi investigación ya que los resultados indicaron

que Porphyromona, bacteria de tipo gramnegativo, si tuvo inhibición frente al extracto

etanólico de la planta de Algarrobo (Prosopis Pallida).

Por otro lado, Corzo y cols demostró que los compuestos de la planta de Algarrobo

(Prosopis Pallida) muestran efectos antimicrobianos sobre bacterias gramnegativas lo que

concuerda de gran forma con mi investigación ya que al ser la P. g. una bacteria

gramnegativa se evidencia que el extracto etanólico si obtiene un efecto antimicrobiano

sobre la misma.

Cárdenas realizo su investigación utilizando hojas de la planta de Algarrobo (Prosopis

Pallida) y como resultado obtuvo que la misma mitigaba las infecciones bucales al obtener

efectos antimicrobianos, por tanto, comparando con mi investigación se obtiene

resultados similares al determinar la eficacia del extracto etanólico sobre la P. g.

Castro et al., demostraron que el extracto etanólico presenta un efecto anti fúngico y

también posee un efecto antimicrobiano, también coincidiendo con mi estudio al

determinar que el extracto de Prosopis Pallida si presente inhibición sobre

microorganismos.

38

Cuadro de Discusión

Conclusiones Autor Año

Resultados de su investigación que los

componentes bioactivos de las plantas

presentan una gran actividad

antimicrobiana; al comparar los datos

frente a los resultados de mi

investigación se constata que en efecto

los principios activos de las plantas

poseen un efecto antimicrobiano de gran

importancia.

Tim Cushnie

Andrew Lamb

“Antimicrobial activity of

flavonoids”

2006

Resultados de su investigación que el

extracto de la planta de Algarrobo tuvo

efecto inhibitorio frente a bacterias

gramnegativas lo cual concuerda con mi

investigación ya que los resultados

indicaron que la P. g. bacteria de tipo

gramnegativo, si tuvo inhibición frente

al extracto mencionado.

Alvaro Saavedra

Stephany Lizbeth

“Efecto antibacteriano in vitro

del extracto alcohólico de

Prosopis pallida sobre

Enterococcus faecalis ATCC

29212”

2017

En sus resultados demostró que los

compuestos de la planta de Algarrobo

muestran efectos antimicrobianos sobre

bacterias gramnegativas lo que

concuerda de gran forma con mi

investigación ya que al ser la P. g. una

bacteria gramnegativa se evidencia que

el extracto etanólico si obtiene un efecto

antimicrobiano sobre la misma.

Diana Corzo Barragán

“Evaluación de la actividad

antimicrobiana del extracto

etanólico”

2012

Como resultado se obtuvo que el

extracto mitigaba las infecciones bucales

al obtener efectos antimicrobianos, por

tanto comparando con mi investigación

se obtiene resultados similares al

determinar la eficacia del extracto

etanólico sobre la P. g.

Cynthia Cardenas Camacho

“Actividad antimicrobiana y

antioxidante del extracto

etanólico de Prosopis pallida

"algarrobo"

2017

El extracto etanólico además de

presentar un efecto anti fúngico, posee

un efecto antimicrobiano, también

coincidiendo con mi estudio al

determinar que el extracto de Prosopis

Pallida si presente inhibición sobre

microorganismos.

Erika Pamela Castro Navarro

“Efecto antibacteriano de miel

de Apis mellifera y algarrobina

de Prosopis pallida sobre

coliformes en quesillos

preparados artesanalmente

expendidos en el mercado "La

Unión" - Trujillo

2017

COLOR AZUL – Concordancia con los resultados del presente estudio

COLOR ROJO – No concordancia con los resultados del presente estudio

39

7 CONCLUSIONES

La concentración al 100% del extracto de Prosopis Pallida desempeño mayor

efecto inhibitorio frente a las otras concentraciones (75% y 50%).

Se determinó que la clorhexidina presentó mayor nivel de inhibición bacteriana

en relación al extracto de Prosopis Pallida con una media de 33.60 mm a las 24

horas y 33.60 mm a las 48 horas; confirmando su alta efectividad sobre la cepa

de P. g.

40

8 RECOMENDACIONES

Realizar estudios “in vivo” que evalúen el efecto inhibitorio del extracto de

Prosopis Pallida sobre Porphyromona gingivalis en la cavidad oral.

Realizar estudios aplicando el extracto de Prosopis Pallida sobre otras bacterias

patógenas orales.

Realizar estudios que posean mayor número de colonias sembradas que ayuden a

corroborar el efecto que producen los extractos etanólicos sobre las mismas

41

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45

ANEXOS

Anexo 1 Solicitud al Director de investigación de la facultad de biotecnología de la Universidad Politécnica

Salesiana

46

Anexo 2 Protocolo de manejo de desechos

47

48

49

50

51

52

Anexo 3 Certificado de Traducción

53

Anexo 4 Certificado de Autenticidad de la cepa de Porphyromona Gingivalis

54

55

56

Anexo 5 Ficha para lectura de los halos de inhibición

57

Anexo 6 Certificado de renuncia de derechos del estadístico

58

59

Anexo 7 Certificado de la realización de las pruebas microbiológicas

60

Anexo 8 Certificado de esterilización

61

Anexo 9 Certificado de desechos

62

Anexo 10 Certificado de aprobación del SEISH-UCE

63

Anexo 11 Certificado uso del laboratorio Universidad Politécnica Salesiana

64

Anexo 12 Análisis URKUND

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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE …€¦ · Art. 114 del CÓDIGO ORGÁNICO DE LA...

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