[Escribir texto]

UNIVERSIDAD DR. JOSÉ MATÍAS DELGADO

RED BIBLIOTECARIA MATÍAS

DERECHOS DE PUBLICACIÓN

DEL REGLAMENTO DE GRADUACIÓN DE LA UNIVERSIDAD DR. JOSÉ MATÍAS DELGADO

Capítulo VI, Art. 46

“Los documentos finales de investigación serán propiedad de la Universidad para fines de divulgación”

PUBLICADO BAJO LA LICENCIA CREATIVE COMMONS

Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 3.0 Unported. http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/deed.es_ES

“No se permite un uso comercial de la obra original ni la generación de obras derivadas.”

Para cualquier otro uso se debe solicitar el permiso a la Universidad

UNIVERSIDAD DR. JOSE MATIAS DELGADO

FACULTAD DE AGRICULTURA E INVESTIGACION AGRICOLA

JULIA HILL O’ “ULLIVAN

SEMIANARIO DE INVESTIGACION:

Evaluación del proceso de fermentación tradicional y no tradicional de la semilla de

cacao Theobrama cacao del Ecotipo Acriollado, por la determinación de factores físicos -

químico y microbiológicos, utilizando cuatro medios de cultivos y levadura Saccharomyces

cerevisiae como iniciador de fermentación en el método no tradicional.

PRESENTADO POR: BR. JUAN JOSE ALAS CASTRO

BR. RICARDO ANTONIO RIOS CANALES

PARA OPTAR AL GRADO DE: INGENIERO EN ALIMENTOS

INGENIERO AGROINDUSTRIAL

ANTIGUO CUSCATLAN, AGOSTO DEL 2012

INDICE

INTRODUCCIÓN

CAPITULO 1 1 1.1 OBJETIVOS DE LA INVESTIGACION 1

1.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 2

1.3 JUSTIFICACION DE LA INVESTIGACION 3

1.4 GENERALIDADES 4 1.5 HISTORIA 4

1.6 CLASIFICACIÓN BOTÁNICA 4 1.7 CACAO ACRIOLLADO 5

1.7.1 CLAVES DE IDENTIFICACION DE CARACTERISTICAS MORFOLOGICAS DE LA PLANTA CACAO ACRIOLLO

6

1.7.2 CLAVES DE IDENTIFICACION DE CARACTERISTICAS DE LAS SEMILLAS CACAO CRIOLLO

7

CAPITULO 2. REVISION DE LITERATURA 8 2.1 PRIMERA FASE 8

2.2 SEGUNDA FASE 9

2.3 TERCERA FASE 9

2.4 MICROORGANISMOS DE LA FERMENTACIÓN DEL CACAO 10

2.4.1 LACTOBACILLUS FERMENTUM 10 2.4.2 GLUCONOBACTER OXYDANS 10

2.5 CONSECUENCIAS DE LA FERMENTACIÓN 11 2.6 MEDIOS DE CULTIVOS 12

2.6.1 AGAR DEXTROSA SABOURAUD 12

2.6.2 AGAR ESTANDAR 13

2.6.2.1 CARACTERÍSTICAS DE LAS COLONIAS DE AGAR ESTANDAR 13

2.6.3 AGAR MRS 13

2.6.4 MEDIO DE ÁCIDO ACETICO-ETANOL RUTHERFORD (RAE) 14

2.7 ANÁLISIS BROMATOLÓGICO 14

2.8 ACTIVIDADES ENZIMATICAS 14

2.9 GENERALIDADES DE LA FERMENTACION DEL CACAO 16

CAPITULO 3. METOLOGIA DE LA INVESTIGACION 20 3.1 CORTE Y SELECCIÓN DEL FRUTO 20

3.2 PESO DE LA MAZORCA 20

3.3 EXTRACCIÓN DE MUESTRAS DE SEMILLAS 21

3.4 PESO Y DIMENCIONES DE LAS SEMILLAS 21

3.5 PREPARACIÓN DEL PROCESO DE FERMENTACIÓN 21 3.6 TÉCNICAS Y PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS FISICO-QUIMICOS DE LA SEMILLAS FERMENTADAS

22

3.6.1 PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DEL PH 22

3.6.2 PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACION DE SOLIDOS SOLUBLES, ÁCIDO ACETICO Y NIVEL DE ALCOHOL

23

3.7 PROCEDIMIENTO MICROBIOLOGICO DE LA FERMENTACION 24

3.7.1 MATERIALES Y EQUIPO 24

3.7.2 MEDIO DE CULTIVO STANDARD 24

3.7.3 MEDIO DE CULTIVO MRS 24

3.7.4 MEDIO DE CULTIVO RAE 25

3.7.5 MEDIO DEXTROSA SABORAUD 25

3.8 INOCULACION DE MICROORGANISMOS 26

3.8.1 MATERIALES Y EQUIPO 26

3.8.2 ANÁLISIS CUANTITATIVO 27

3.9 SECADO DE GRANO DE CACAO 28

3.10. PESO SECO Y DIMENSION DE LA SEMILLA SECA 28

3.11 METODOS DE DETERMINACION BROMATOLOGICA 29

CAPITULO 4: ANALISIS DE RESULTADOS 30 4.1 CUANTIFICACION DE LOS MICROORGANISMOS 30

4.2 EL COMPORTAMIENTO DE MICROORGANISMOS CON RESPECTO AL TIEMPO DE INCUBACION.

32

4.3 CAMBIOS DE COLORACION DE LA SEMILLA DURANTE EL PROCESO DE FERMENTACION

37

4.4 COMPROBACIÓN DEL ALCOHOL, ÁCIDO ACETICO, PH, SOLIDOS TOTALES Y TEMPERATURA DURANTE EL PROCESO DE FERMENTACION

40

4.5 EL COMPORTAMIENTO DEL ALCOHOL, ÁCIDO ACETICO, PH, SOLIDOS TOTALES Y TEMPERATURA DURANTE EL PROCESO DE FERMENTACION.

41

4.6 ESQUEMATIZACIÓN DE DIMENSIONES, PESO Y RENDIMIENTO DE LAS SEMILLAS DE CACAO

46

4.7 OBSERVACIÓN DE LOS A ANÁLISIS BROMATOLÓGICOS EN MT-01 Y EL MNR-02.

48

CONCLUSIONES 49

RECOMENDACIONES 50

ANEXOS 51

GLOSARIO 64 FUENTES CONSULTADAS 66

ÍNDICE DE FIGURAS

Fig. 1 Árbol de Cacao 5 Fig. 2 Mazorca de Cacao Criollo 5

Fig. 3 Semilla de Cacao 6 Fig. 4 Hoja del Árbol de Cacao 6

Fig. 5 Flor del Árbol de Cacao 7 Fig. 6 Esporas Ovales de Hanseniaspora guillermondiid 8

Fig. 7 Esporas de Saccharomyces cerevisiae 9 Fig. 8 Imagen al microscopio de Lactobacillus Fermentum 10

Fig. 9 Vista al microscopio de Gluconobacter oxydans 10 Fig. 10 Selección de Mazorcas de Cacao, Hacienda la Carrera 20

Fig. 11 Pesado de Mazorca de Cacao 20 Fig. 12 Extracción de Semillas 21

Fig. 13 Medición de las Dimensiones de la Semilla del Cacao Fresco 21 Fig. 14 Preparación del Proceso de Fermentación no Tradicional 21

Fig. 15 Medición Electrométrica del pH mediante Tiras de Tornasol 22 Fig. 16 Medición de Ácido Acético 23

Fig. 17 Medición de Alcohol 23 Fig. 18 Medición de Solidos Solubles Totales 23

Fig. 19 Dilución en Agua Peptonada 26 Fig. 20 Inoculación y Siembra en Medio Cultivo 26

Fig. 21 Homogenización de las Muestras 27 Fig. 22 Tinción de Gram 27

Fig. 23 Secado de Grano 28 Fig. 24 Medición con Pie de Rey 28

Fig. 25 levaduras, Hanseniaspora guilliermondii y S. cereviseae. 33 Fig. 26 bacterias, Oxydans Gluconobacter y Lactobacillus Fermentum. 34

Fig. 27 bacterias, Oxydans Gluconobacter 35 Fig. 28 bacterias Lactobacillus Fermentum. 36

Fig. 29 levaduras, Hanseniaspora guilliermondii y S. cereviseae. 37 Fig. 30 grano de cacao del MT0-1 38

Fig.31 grano de cacao del MNT-02 38 Fig. 32 grano de cacao del MT0-1 38

Fig.33 grano de cacao del MNT-02 38 Fig. 34 grano de cacao del MT0-1 39

Fig.35 grano de cacao del MNT-02 39 Fig. 36 grano de cacao del MT-01 39

Fig.37 grano de cacao del MNT-02 39

ÍNDICE DE TABLAS Y GRÁFICOS

TABLA N°1: CLASIFICACIÓN CIENTÍFICA 4

TABLA N°2: BROMATOLOGÍA DEL CACAO 14

TABLA N°3: PROMEDIO DE CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS DE ACUERDO AL MEDIO DE CULTIVO

31

TABLA N°4: TABLA DE INTERACCION DE ALCOHOL, ÁCIDO ACETICO, SOLIDOS TOTALES Y TEMPERATURA

40

TABLA N°5: DIMENSIONES DE LAS SEMILLAS 46

TABLA N°6: RENDIMIENTO DE LOS GRAOS DE CACAO CON RESPECTO AL PESO DE LAS SEMILLAS FRESCAS Y SECAS

47

GRAFICO 1: INDICE DE CRECIMIENTO DE LEVADURAS EN MEDIO ESTANDAR 32

GRAFICO 2: INDICE DE CRECIMIENTO DE BACTERIAS EN MEDIO ESTANDAR 33

GRAFICO 3: INDICE DE CRECIMIENTO DE BACTERIAS ACETICAS EN MEDIO R.A.E. 34

GRAFICO 4: INDICE DE CRECIMIENTO DE BACTERIAS LACTICAS EN MEDIO M.R.S. 35

GRAFICO 4: INDICE DE CRECIMIENTO DE LEVADURAS EN MEDIO DEXTROSA 36

GRAFICO 6: COMPARACIÓN DEL CAMBIO DE COLORACIÓN EN LA SEMILLAS DE LOS MÉTODOS MT-01 Y MNT-02.

39

GRAFICO 7: COMPORTAMIENTO DE LA TEMPERATURA EN LA FERMENTACION DEL CACAO

41

GRAFICO 8: COMPORTAMIENTO DE SOLIDOS TOTALES EN LA FERMENTACION DEL CACAO

42

GRAFICO 9: COMPORTAMIENTO DEL ALCOHOL EN LA FERMENTACION DEL CACAO 43

GRAFICO 10: GRAFICO DE COMPORTAMIENTO DEL ÁCIDO ACETICO EN LA FERMENTACION DEL CACAO

44

GRAFICO 11: GRAFICO DE COMPORTAMIENTO DEL pH EN LA FERMENTACION DEL CACAO

45

GRAFICO 12: GRAFICO COMPARATIVO DEL RENDIMIENTO, EL CAMBIO DE VOLUMEN Y LA PÉRDIDA DE PESO EN MT-01 Y MNT-02.

47

GRAFICO 13: GRAFICO COMPARATIVO DE LOS ANÁLISIS BROMATOLÓGICOS. 48

ii

RESUMEN

Este estudio consiste en determinar el efecto de la adición de levaduras y sacarosa para

aumentar la calidad de las características organolépticas de la especie de Theobroma

cacao de tipo acriollado, manteniendo constante el proceso fermentativo, esto con el

objetivo de que las semillas se mantengan en un medio alcohólico junto a un desarrollo

estable de las levaduras manteniendo los sólidos solubles totales a 22°Brix, colocándolos

en cajas de plástico, adoptando el nombre de Método No Tradicional (MNT-02), ya que a

comparación del método que utilizan en Hacienda Real La Carrera en Usulután; el método

tradicional (MT-01), ellos únicamente extraen los granos de la mazorca de cacao, los

colocan en cajas de madera y dejan que el proceso de fermentación se efectué de forma

natural, únicamente se realiza la práctica de volteo en el cual se mezcla la masa en

fermentación, fue de esta forma como se realizó el experimento comparativo colocándolo

en cajas de madera. Los resultados indicaron que durante el proceso fermentativo la

temperatura aumentó, alcanzando su máximo valor a las 48 horas.

Durante la investigación se determinaron diversos tipos de análisis fisicoquímicos para

determinar el comportamiento de los microrganismos en la fermentación y así, ver cuáles

fueron los factores que influyeron en el cambio físico, químico, y organoléptico del grano

de cacao. Los resultados obtenidos demostraron en el MT-01 una disminución constante

de los sólidos solubles totales debido al consumo de este por las bacterias nativos de la

mazorca de cacao, mientras que el alcohol presenta un aumento durante las primeras 24

horas del proceso, viéndose influida una disminución en las siguientes 12 horas, y eso es

debido a la elaboración de ácido acético que mostro un incremento a las 48 horas del

proceso. A comparación con MNT-02 los sólidos solubles se mantienen constante debido a

la adición de sacarosa al proceso, además el alcohol presenta un incremento considerable

y el ácido acético presenta un aumento a las 24 horas, presentando una disminución en la

última etapa, esto demuestra la efectividad de la adición de sacarosa y de la continuidad

del proceso fermentativo.

Adicionalmente esta investigación determina el tipo de microrganismos que crecen en el

proceso de fermentación en ambos métodos, obteniendo resultados positivos en diversas

fases; al determinar el crecimiento de levaduras en la primera fase, tales como

Sacchacromyces Cereviseae, Anseniaspora guilliermonddii, mientras que en la segunda

fase se encontraron bacterias lácticas como lo es el microorganismo Lactobacillus

fermentum y en la tercera fase se encontraron bacterias acéticas tal como la

Gluconobacter oxydans.

Finalmente, se realizaron análisis bromatológicos para determinar la cantidad de Cenizas,

Fibra, Grasa, Humedad y Proteína presentes en ambos experimentos. Los valores son

comparativamente similares, presentando pequeñas diferencias. En el grafico anterior se

realiza una comparación de los análisis bromatológicos como fibra, humedad, proteína y

iii

grasa en el MT-01 y el MNT-02. En fibra en el MT-01 tuvo 24.36% y en el MNT-02 24.76%,

en la humedad el MT-01 obtuvo 5.85% y en el MNT-02 4.57%, en los análisis de proteína

en el MT-01 se observa un 11.17% y el MNT-02 es de 12.07% y en la determinación de la

grasa se obtuvo en el MT-01 un 20.63% y en el MNT-02 fue de 21.09%. Haciendo una

comparación de los análisis bromatológicos que el MNT-02 fue obtuvo mejores

resultados, que el MT-01. Siendo así se puede decir que el MNT-02 brinda mejores

resultados dando mejor calidad.

INTRODUCCIÓN

En los procesos de fermentación del cacao existen etapas muy importantes en la

transformación del grano, ya que en éstas etapas es donde se producen los cambios

bioquímicos que dan origen a los precursores sensoriales más importantes como son el

aroma y el sabor. Existen diversos factores que influyen sobre el proceso fermentativo,

dentro de los que destaca la zona de cultivo (edafoclimático), el tipo de cacao y el manejo

post-cosecha, así como la técnica empleada en la fermentación. Así mismo, el tipo de

fermentador, el volumen de la masa y el volteo durante el proceso afectan la

fermentación y en consecuencia la calidad del grano fermentado.

Para el desarrollo de ésta investigación primeramente se realizó una evaluación

agromorfológica del cacao en la Hacienda San José Real De La Carrera ubicada en la región

costera en el departamento de Usulután, cantón San José, municipio de Jiquilisco, en el

Km 109, sobre la carretera del Litoral. Se inició desde la selección de arboles más

productores y de las mazorcas de mayor tamaño así como de su punto de madurez

óptima, luego de su traslado a los laboratorios se llevó acabo las diferentes evaluaciones

para determinar la presencia de microorganismos que crecen durante el tiempo que tarda

la fermentación de los ecotipos acriollados (tres días), utilizando cuatro diferente medios

de cultivo (M.R.S, R.A.E, Dextrosa Saburaud y Estándar) para cuantificar y cualificar la

presencia de levaduras, bacterias lácticas y acéticas; además se efectuaron análisis a las

variables físico-químicas que interviene en el proceso fermentativo, mediante un método

tradicional (MT-01, cajas de madera) en seco versus un método no tradicional (MNT-02,

cajas plásticas) en húmedo, añadiendo sacarosa al 22% y levadura al 0.05% como iniciador

de la fermentación en MNT-02; en ambos ensayos se evaluaron el pH, % de Ácido Acético,

% Alcohol, % Sólidos Solubles (°Brix), los índices variación como pérdida o ganancia de

peso (Pp), cambio de volumen y rendimiento de las semillas; todos éstos análisis fueron

realizados en el laboratorio de microbiología de alimento de CENSALUD, en la Universidad

Nacional de El salvador.

Al finalizar el proceso de fermentación se efectuó el secado de la semilla durante tres días

en bandejas de aluminio las que servirían para realizar los respectivos análisis

bromatológicos que determinen los % de ceniza, % de fibra y % de humedad mediante el

método gravimétrico así como el % de grasa mediante el método de extracción de Soxlet y

el % proteínas mediante el método Micro Kjeldahl, basados en técnicas descritas por la

AOAC 17TH edición, 2003. Realizados en el laboratorio control de calidad de la facultad de

agricultura e investigación agrícola de la Universidad Doctor José Matías Delgado ;

ubicado en Km 8 1/2 carretera a Santa Tecla, Antiguo Cuscatlán. Edificio 5 nivel 3, los

análisis bromatológicos como fibra, humedad, proteína y grasa en el MT-01 y el MNT-02.

En fibra en el MT-01 tuvo 24.36% y en el MNT-02 24.76%, en la humedad el MT-01

obtuvo 5.85% y en el MNT-02 4.57%, en los análisis de proteína en el MT-01 se observa un

11.17% y el MNT-02 es de 12.07% y en la determinación de la grasa se obtuvo en el MT-01

un 20.63% y en el MNT-02 fue de 21.09%. Haciendo una comparación de los análisis

bromatológicos que el MNT-02 se obtuvo mejores resultados, que el MT-01. Siendo así se

puede decir que el MNT-02 brinda mejores resultados dando mejor calidad.

CAPÍTULO 1

1.1 OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN

1.1.1 Objetivos Generales

Evaluar el proceso de fermentación tradicional y no tradicional de la semilla de

cacao Theobrama cacao del Ecotipo Acriollado, por la determinación de factores físicos -

químico y microbiológicos, utilizando cuatro medios de cultivos y levadura Saccharomyces

cerevisiae como iniciador de fermentación en el método no tradicional

1.1.2 Objetivos Específicos

1. Identificar descriptores agromorfológico del ecotipo acriollado.

2. Evaluar los factores físicos y químico que influyen en el proceso de fermentación

dichos factores son la temperatura, pH, alcohol, ácidos acéticos y sólidos solubles

(°Brix).

3. Identificar en cuatro medios de cultivo la presencia de Levaduras, Bacterias

Lácticas y Acéticas en la fermentación por proceso tradicional y no tradicional.

4. Evaluaciones bromatológicas de las semillas secas de teobroma cacao obtenidas de

los procesos de fermentación tradicional y no tradicional.

1.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

La investigación estuvo orientada al estudio de los cambios que ocurren durante la

fermentación de la semilla del cacao a través de microorganismo auténticos de la

fermentación natural y fermentaciones inducidas este será evaluado a través de un

proceso no tradicional que consistió en dos ensayos; uno de forma tradicional en cajas de

madera y otro inoculando la semilla con Saccharomyces cerevisiae en plástico.

Se realizó específicamente con variedades de cacao Acriollado que se encuentran

en la Hacienda San José del Real de la Carrera, Usulután. El objetivo de la investigación fue

Identificar descriptores agromorfológico en los ecotipos acriollados, Evaluar los factores

que influyen en el proceso de fermentación Utilizando cuatro medios de cultivo para

cuantificar y cualificar la presencia de Levaduras, Bacterias Lácticas y Acéticas en la

fermentación tanto en proceso tradicional y no tradicional y establecer una metodología

apropiada que mejore las características sensoriales del grano de cacao con parado con el

método tradicional.

Por lo que se plantió la siguiente incógnita ¿Será posible utilizar inóculos

iniciadores de levaduras en el proceso de fermentación por el método húmedo que pueda

sustituir el método tradicional y mejorar las propiedades bromatológicas del grano de

cacao acriollado?

1.3 JUSTIFICACION DE LA INVESTIGACIÓN

Esta investigación tiene como objetivo general contribuir a hacer más eficiente la

producción y aumentar la calidad de la semilla de cacao acriollado mediante el desarrollo

de nuevas técnicas que ayude a estandarizar el protocolo de beneficiado, controlando los

factores que intervienen en la fermentación; identificando la alta productividad mediante

la selección de árboles élites que en la actualidad no se ha realizado ningún estudio sobre

éstos aspectos y que a partir de ésto se puede mejorar la productividad en la Hacienda

San José del Real de la Carrera, Usulután. Ya que actualmente por falta de conocimientos

científicos, los procesos de fermentación son únicamente bajo el método tradicional de

forma deficiente, por lo que dicha investigación se enfocó en analizar los factores que

intervienen en la fermentación y de ésta manera contribuir a que el proceso se mejore y

se optimice el beneficiado que en la actualidad se está realizando.

Por otra parte El Salvador está sujeto a las importaciones, considerando la

demanda nacional es importante que se realicen estudio que mejoren las tecnologías de

beneficiado para que exista el desarrollo de los productores cacaoteros del país, y así

mantener y desarrollar rentabilidad agroindustrial.

1.4 GENERALIDADES

1.5 HISTORIA

Según Jorge Redmond Schlageter, los primeros árboles del cacao crecían de forma

natural a la sombra de las selvas tropicales de las cuencas del Amazonas y del Orinoco,

hace unos 4000 años. Los primeros cultivadores en Centroamérica fueron los habitantes

del sitio de Puerto Escondido, en Honduras, alrededor de 1100 a. C. Entre 600 y 400 años.

se extendió a Belice también. A la temporada de la civilización Olmeca, cerca de 900 años.

es probable que la siembra de cacao fue extensivo en Mesoamérica.

El cacao son semillas del árbol Teobroma cacao, que vienen en una mazorca.

Ésta tiene entre 30 y 40 granos envueltos en una sustancia mucilaginosa de aspecto

gelatinoso. El cacao crudo tiene un sabor astringente desagradable, de manera que debe

ser tratado mediante un proceso en el que los microrganismos, a través de una

fermentación, modifiquen sus componentes. Posteriormente los granos son secados y

tostados, para que se desarrollen las características sensoriales del chocolate.

1.6 CLASIFICACIÓN BOTÁNICA

Fuente: Juddet al, (1999) citado por Jiménez (2006)

Tabla N°1: Clasificación científica

Reino: Plantae

Subreino: Tracheobionta

División: Magnoliophyta

Clase: Magnoliopsida

Subclase: Dilleniidae

Orden: Malvales

Familia: Malvaceae

Subfamilia: Byttnerioideae

Tribu: Theobromeae

Género: Theobroma

Especie: T. cacao

Fig. 1 Árbol de Cacao

1.7 CACAO ACRIOLLADO.

El cacao de tipo criollo presenta las mismas características que los antiguos

iollos ve ezola os o a aos hi os e Cuba, y en particular todos aquéllos que

te ga otiledo es la os, ultivados e A é i a Ce t al su de Mé ico. Debido a la

gran variabilidad de los cacaos cultivados, con relación al color, dimensiones y formas de

las pa tes ue o stitu e la flo , f uto se illa , o e iste e la a tualidad u ite io

con verdadero rigor científico que explique las características distintivas de los diferentes

grupos cultivados del género Theobroma. Por éllo se recomienda no dar la denominación

de va iedad , si o del tipo o fo a e i luso g upo genético. Esa variabilidad de los

cacaos cultivados en la actualidad deriva de los numerosos cruces, mutaciones y

selecciones (naturales y dirigidas) que se han sucedido a lo largo de tantos años.

El árbol en general es más pequeño que el del tipo forastero, de

copa redonda, follaje menos denso y hojas más pequeñas,

ovaladas, gruesas, de color verde claro, las flores tienen pedicelos

cortos, los estaminodios y líneas guías de los pétalos de color

rosado pálido, las espátulas de los pétalos son de forma y color

muy variables. El árbol es más susceptible a los ataques de

enemigos naturales (patógenos y plagas) en comparación a los

forasteros.

Las mazorcas son grandes, con diez surcos bien definidos, de los

cuales cinco de éllos (en forma alterna) son más profundos que

los otros, cáscara (pericarpio) rugosa, delgada o gruesa, con una

ligera capa lignificada en el centro del pericarpio, con o sin

depresión en el cuello, puntas agudas en cinco ángulos, rectas o

recurvadas.

Fig. 2 Mazorca de Cacao Criollo

El color de la mazorca puede variar del verde al rojo cuando está inmadura, de amarillo

dorado a rojo oscuro cuando maduras, el tamaño oscila entre unos 35 cm de longitud y 35

a 40 granos/mazorca a 12 cm con 10-15 granos/mazorca.

Las semillas tienen los cotiledones blancos o ligeramente

pigmentados cuando frescos y de color canela claro al estar

beneficiadas; cilíndricos u ovales, son grandes, rollizos y muy

aromáticos, pueden pesar hasta 6 g frescos y con mucílago (2,4

g seco), el sabor del grano es ligeramente astringente,

fermenta en 36-48 horas (1 ½ a 2 días), de alta calidad.

1.7.1 CLAVES DE IDENTIFICACIÓN DE CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DE LA PLANTA

CACAO ACRIOLLO

A continuación se describen las diferentes características morfológicas que se

observan en el Cacao Criollo:

Árboles bajos, poco vigorosos excepto en ambientes

favorables (con riego y fertilización).

Algunos genotipos no emiten verticilo (horqueta).

Hojas pequeñas, ovaladas, color verde claro y gruesas.

Flores con pedicelos cortos, estaminoides y líneas guía

de los pétalos de color rosado claro.

Por lo general son auto-compatibles.

Usualmente toman cinco años para producir las

primeras mazorcas.

Produce bajos rendimientos respecto a los forasteros y trinitarios.

Fig. 3 Semilla de Cacao

Fig. 4 Hoja del Árbol de Cacao

Mazorcas cilíndricas, con 10 surcos profundos,

simples o en cinco pares.

Cáscara verrugosa, delgada o gruesa con una ligera

capa lignificada en el centro del pericarpio.

Con o sin depresión en el cuello

(angoleta/cundeamor).

Punta aguda en cinco ángulos, recta o curvada.

Color de la mazorca inmadura varía del verde al amarillo.

Semillas blancas o ligeramente pigmentadas, cilíndricas u ovales.

Algunos genotipos presentan semillas con embriones necróticos o vacíos.

Son altamente susceptibles a monilia, escoba de bruja, mazorca negra y buba Floral

(Astorga, 2009).

1.7.2 CLAVES DE IDENTIFICACION DE CARACTERÍSTICAS DE LAS SEMILLAS CACAO

CRIOLLO

Período de fermentación de 2 á 3 días.

Son considerados de alta calidad del chocolate

Confieren un sabor fuerte parecido a la pimienta, sus principales características son:

Sabor medio a cacao

Sabor medio a frutas

Poco sabor floral

Alto sabor a nueces

Fuente: Castañeda, Vianney; Bonilla, Guillermo; Pérez, Juan Manuel

Fig. 5 Flor del Árbol de Cacao

Fig. 6 Esporas Ovales de

Hanseniáspora guillermondiid

CAPÍTULO 2. REVISIÓN DE LITERATURA

Según Wacher M. (2007) en su artículo Microrganismos y Chocolate, el proceso de

fermentación del cacao es natural o espontáneo, ya que no se añaden intencionalmente

los microrganismos a los granos, que de hecho se encuentran estériles dentro de las

vainas. Se contaminan con microrganismos provenientes de todas las superficies con las

que entran en contacto: los utensilios y las manos de las personas que manipulan el cacao.

Durante la fermentación, que puede dividirse en fases, ocurre una sucesión de

poblaciones de microrganismos:

2.1 PRIMERA FASE

La pulpa es rica en carbohidratos y tiene un pH

bajo. En ésas condiciones se favorece el desarrollo de

levaduras.

En la primera fase aparecen entre 5 y 6 especies

diferentes de levaduras, que luego desaparecen dejando

su lugar a Hanseniáspora guilliermondii, que es la

levadura predominante durante las primeras 24 horas. La

Hanseniáspora sólo se le encuentra ocasionalmente en

las fases posteriores. La levadura Cándida zemplinina es

una nueva especie que sólo se pudo detectar hasta que

aparecieron las técnicas modernas de la biología

molecular que detectan la presencia de microrganismos por sus genes, más no

cultivándolos. Cándida silvae, Cándida zemplinina y Cándida diversa son levaduras que se

encuentran comúnmente en las fermentaciones en charolas, posiblemente por la mayor

concentración de oxígeno en ese tipo de fermentación. Se reporta que a las 36-38 horas

dominan Saccharomyces cerevisiae y Pichia membranaefaciens, que se encuentra al final

de la fermentación; Cándida krusei y Hanseniaspora guilliermondiid, en las

fermentaciones en charolas, y predomina también Saccharomyces cerevisiae (Nielsen et

Fig. 7 Esporas de Saccharomyces cerevisiae

al., 2007). En las fermentaciones por pilas, Pichia

kudriavzevii, Saccharomyces cerevisiae y Hanseniaspora

opuntiae

En la fermentación del cacao participan un gran

número de especies de microorganismos, algunos de los

cuales no se han reportado en otros ambientes o fueron

aislados inicialmente del cacao. Éste es el caso de

nuevas levaduras como Cándida halmiae, Geotrichum

ghanense, Cándida awuaii (Nielsen et al., 2010).

2.2 SEGUNDA FASE

En la segunda fase del proceso de fermentación del cacao, se favorece el desarrollo

de bacterias lácticas, que fermentan los carbohidratos residuales y continúan el consumo

del ácido cítrico. En las fermentaciones de pilas se han aislado sobre todo bacterias del

tipo Lactobacilos (Lb.collonides, Lb. fermentum, Lb. mali y Lb. plantarum), aunque

también se han identificado bacterias como Leuconostoc pseudomesenteroides,

Leuconostoc pseudoficulneum, y Pediococcus acidilactici. Por otro lado, Lb fermentum y

Lb plantarum son indígenas de ésta fermentación.

Las levaduras contienen enzimas del tipo pe ti olíti o , lo ue les permite

hidrolizar las pectinas, ocasionando una disminución de la viscosidad de la pulpa de

mucílago y favoreciendo la entrada de aire. Con éste ambiente aerobio y menos ácido -

debido al consumo de ácido cítrico- se favorece el desarrollo de bacterias acéticas.

2.3 TERCERA FASE

En la tercera fase del proceso de fermentación ocurre un cambio importante en

términos de los productos de la fermentación, ya que intervienen bacterias acéticas que

llevan a cabo la transformación del etanol que produjeron las levaduras en ácido acético,

tal como ocurre en la industria productora de vinagre. Dado que la transformación de

etanol en ácido acético es una reacción exotérmica, se produce calor. El etanol y el ácido

Fig. 9 Vista al microscopio de Gluconobácter oxydans

acético se difunden hacia el interior de los granos y, junto con la temperatura alta, matan

al embrión. Las más importantes bacterias acéticas que se han aislado de la fermentación

del cacao, son: Gluconobacter oxydans.

2.4 MICROORGANISMOS DE LA FERMENTACIÓN DEL CACAO 2.4.1 LACTOBACILLUS FERMENTUM Es una especie de bacterias gram-positivas del género

lactobacilos. Es miembro generalizada del género

Lactobacillus, comúnmente se encuentran en muchos

alimentos fermentados, así como materia de la planta

anaeróbica. Toleran bien concentraciones relativamente altas

de ácidos y valores de pH más bajos que el resto de las

bacterias por lo que pueden desplazarlas de los hábitats que

colonizan. Bacterias muy importantes en la producción de

alimentos fermentados y en el deterioro por fermentación de

alimentos

2.4.2 GLUCONOBÁCTER OXYDANS

Oxydans Gluconobácter, anteriormente conocido como

suboxydans acetobacter, son Gram-negativas varilla o

bacterias en forma de óvalo que van desde

aproximadamente 0,5 a 0,8 mm x 4,2 mm a. El nombre

de oxi oxydans Gluconobacter en latín significa "fuerte"

y "ácida", y se dans "dar".

Gluconobácter oxydans es una bacteria gram-negativa

que pertenece a la familia Acetobacteraceae. G. oxydans es un aerobio obligado, que

tiene un tipo de metabolismo respiratorio utilizando oxígeno como aceptor terminal de

electrones.

Fig. 8 Imagen al microscopio de

Lactobacillus Fermentum

Las cepas de Gluconobácter florecen en nichos de dulces, por ejemplo, uvas maduras, las

manzanas, las fechas, la tierra del jardín, la tierra del pan, las abejas, las frutas, sidra,

cerveza, vino.

2.5 CONSECUENCIAS DE LA FERMENTACIÓN

Se sabe que en el sabor a chocolate participan por lo menos 500 compuestos

diferentes y que éste sabor depende de muchos factores, como el tipo de grano de cacao,

la época en la cual se cosechó, la fermentación (la acción de microorganismos), la acción

de enzimas endógenas (enzimas del cacao), el rostizado y el secado. Es por lo mismo muy

difícil definir de cuál de todas estas etapas depende la producción de aromas. Las enzimas

endógenas, por ejemplo, pueden actuar sobre los carbohidratos, proteínas y polifenoles

del grano de cacao, generando aromas. Lo que es un hecho es que el sabor característico

del chocolate no se desarrolla si no hay fermentación.

Durante la fermentación los microorganismos juegan papeles muy importantes: las

levaduras eliminan la pulpa que rodea a los granos de cacao frescos, des-polimerizando o

rompiendo la pectina y en las condiciones anaeróbicas (sin oxígeno) que imperan en el

ambiente, llevando a cabo la fermentación de los azúcares para producir etanol. Las

bacterias lácticas fermentan los azúcares y producen ácido láctico, ácido acético y manitol.

Según Ba ale, L. 2007 , E su o a Mate ias Primas: chocolate: fe e ta ió ,

el proceso del volteo tiene el efecto inmediato de aumentar la aireación y por

consiguiente la actividad bacteriana, lo que se refleja en la rápida elevación de

temperatura, que puede superar al efecto del enfriamiento provocado por el volteo. Uno

de los objetivos del volteo es asegurar el grado de fermentación uniforme, pero se ha

encontrado considerable variación entre diferentes zonas aún cuando se practica el

volteo. El Criollo necesita menos fermentación y suele bastar con dos días.

Sorprendentemente, aunque el cacao tipo Criollo no parecen quedar excesivamente

fermentadas. Las alteraciones químicas en el interior del haba de cacao, dependen de la

muerte de las células del cotiledón. Sus membranas celulares se degradan y permiten que

se pongan en contacto los diferentes constituyentes que estaban separados en el tejido

vivo. La muerte, que tiene lugar durante el segundo día es producida principalmente por

el ácido acético.

Las antocianinas y otras sustancias polifenólicas de las células pigmentadas,

pueden difundirse entonces hacia las células adyacentes de almacenamiento, donde se

encuentran con diversas enzimas que provocan reacciones hidrolíticas en las condiciones

anaerobias del haba.

Los cambios internos en los granos durante la fermentación. Los granos de cacao

están compuestos por células blancas (grasa/manteca, proteínas) y células moradas

(polifenoles).Alta temperatura y efecto del ácido interrumpen la estructura molecular

interna, A causa de ésta interrupción, los compuestos del grano se mezclan y reaccionan

entre éllos. Reacciones entre proteínas, enzimas y polifenoles son cruciales para la

formación de los precursores del sabor a chocolate.

2.6 MEDIOS DE CULTIVOS

2.6.1 AGAR DEXTROSA SABOURAUD

El Agar Dextrosa Sabouraud es un medio utilizado para el cultivo de hongos y levaduras. El

Agar de Dextrosa Sabouraud es una modificación a la fórmula original del Agar de

Dextrosa desarrollado por Raymand Sabouraud. Éste medio es utilizado para el cultivo de

hongos patógenos, particularmente de aquellos asociados con infecciones de piel. La alta

concentración de dextrosa y la acidez del pH hacen a éste un medio selectivo para hongos.

Con la adición de cicloheximida, estreptomicina y penicilina, se obtiene un excelente

medio para el aislamiento primario de dermatofitos. Éste medio es también utilizado para

la determinación microbiológica en cosméticos y para evaluar la presencia de hongos en

alimentos. En éste medio las peptonas proveen la fuente de carbono y nitrógeno para el

crecimiento de los microorganismos, la dextrosa actúa como fuente de energía y el agar es

agregado como agente solidificante.

2.6.2 AGAR ESTANDAR

El Agar Estándar es un medio utilizado para el recuento de bacterias aeróbicas a

partir de agua, aguas residuales, alimentos y productos lácteos. Éste medio también es

conocido como Agar Cuenta Estándar. El Agar Métodos Estándar fue desarrollado por

Buchbinder Baris and Goldstein en 1953 como un requerimiento de la American Public

Health Association. Éste medio se formula con los ingredientes originales. El extracto de

levadura y la peptona de caseína han sido utilizados en medios diseñados para estudiar la

presencia de microorganismos termofílicos en productos lácteos desde 1928. La peptona

de gelatina y el extracto de levadura proporcionan la fuente de carbono y nitrógeno. La

dextrosa es el carbohidrato fermentable y el agar es adicionado como agente solidificante.

2.6.2.1 CARACTERÍSTICAS DE LAS COLONIAS DE AGAR ESTANDAR

Las colonias son generalmente pequeñas, blanco-grisáceas, lisas o rugosas. Se

observa el crecimiento de microorganismos de Lactobacillus fermentum ATCC 9338 y

Lactobacillus gasseri ATCC 33323 . Las levaduras llevan a cabo el proceso de

fermentación, transformando los azúcares sencillos del mucílago o pulpa en etanol,

degradando la pectina, lo que modifica la textura del grano y elimina el ácido cítrico, lo

que trae como consecuencia una disminución de la acidez. Por otro lado, el consorcio de

levaduras consume el oxígeno, creando un ambiente anaerobio que favorece el desarrollo

de bacterias lácticas.

2.6.3 AGAR MRS

A menudo abreviado como MRS, éste tipo de medio de crecimiento bacteriano se

llama así por sus inventores: Man, Rogosa y Sharpe. Desarrollado en 1960, éste medio fue

diseñado para favorecer el crecimiento exuberante de lactobacilos para el estudio de

laboratorio. Contiene acetato de sodio, que suprime el crecimiento de muchas bacterias

competidoras (aunque algunos Lactobacillus, otros, como Leuconostoc y Pediococcus,

pueden crecer). Éste medio tiene un color marrón claro. La levadura y extractos de carne y

peptona proporcionan fuentes de carbono, nitrógeno y vitaminas para el crecimiento

bacteriano en general. El extracto de levadura contiene también vitaminas y aminoácidos

específicamente requeridos por lactobacilos. polisorbato 80 es un tensioactivo que

contribuye a la absorción de nutrientes por lactobacilos. El sulfato de magnesio y sulfato

de manganeso proporcionan cationes utilizados en el metabolismo.

2.6.4 MEDIO DE ÁCIDO ACÉTICO-ETANOL RUTHERFORD (RAE)

Éste medio de cultivo, contiene los componentes necesarios para observar el

crecimiento de bacterias acéticas. Junto con los elementos de Peptona, Glucosa, Fosfato

Sódico, Agar y Ácido Cítrico evitan el crecimiento de otros microorganismos, lo que lo

convierte en un medio selectivo muy particular.

2.7 ANÁLISIS BROMATOLÓGICO

A continuación se muestra un cuadro donde se exponen los índices de Humedad,

Grasa, pH y el sabor del grano de cacao previo a su tostado.

PORCENTAJE DE HUMEDAD 6 á 6.5

PORCENTAJE DE GRASA 52 á 55

pH 5.0 á 5.5

SABOR Amargo

2.8 ACTIVIDADES ENZIMATICAS

Según Selamat Jinap Misnawi. La fermentación es un aspecto muy importante de la

transformación del grano de cacao. Un estudio ha demostrado que los granos no

fermentados no desarrollan ningún sabor a chocolate cuando se tuestan y son

excesivamente astringentes y amargos. Por lo tanto, los granos no son los preferidos por

los fabricantes de cacao. Para aumentar la calidad de la aceptación y el sabor, los granos

fermentados en general, se mezclan con los granos bien fermentados. En virtud de

fermentación se refiere a los granos que se secan (en el secado al sol) sin fermentar o

Fuente: fedecacao.com.co

TABLA N°2: BROMATOLOGÍA DEL CACAO

fermentado durante 1-2 días, los granos se produjeron por lo general por los pequeños

agricultores.

La evaluación de los demás enzimas clave en la seca en los granos de cacao

fermentados muestra que el proceso de secado de la proteasa significativamente

inactivada y la invertasa en los granos de cacao. El efecto de la inactivación de la

fermentación (2 días) fue menor que el efecto de secado. Las actividades restantes

aspártico endoproteasa en granos secos de cacao sin fermentar y fermentadas en parte,

fue de 34 y el 31% de la actividad en los granos frescos, respectivamente, mientras que los

de la actividad carboxipéptidasa fueron del 20 y el 16%. Inactivación efecto de secado y la

fermentación fue mayor en la invertasa que cualquiera de la endoproteasa asparlic o

carboxipéptidasa. Se encontró que las actividades de invertasa restantes en los granos de

cacao fermentados y se secó-fermentado parcialmente eran 19 y 7% de la actividad en los

granos frescos, respectivamente.

Las anteriores actividades el resto de la enzima clave fueron lo suficientemente

alta como para formar los precursores del aroma de incubación de la activación. De

acuerdo con estudios previos realizados en la reacción enzimática en cotiledón podría

continuar durante la fermentación, aunque en un grado limitado.

Las enzimas restantes parcialmente pierden su actividad inmediatamente después de la

reacción empieza. Ésto puede ser debido al hecho de que los polifenoles se unen a la

proteína in situ de las enzimas durante la incubación. Secos sin fermentar y parcialmente

fermentados, los granos de cacao son ricos en polifenoles, que comprende 12-18% de su

peso seco de los productos de la oxidación de los polifenoles inactivan las enzimas

hidrolíticas durante el proceso de fermentación del cacao en la transformación del grano,

por lo tanto, si la oxidación se produce inmediatamente después de la muerte de los

granos, el cacao producido sería deficiente en sabor a chocolate. El grupo hidróxilo

fenólico es un donador de hidrógeno de excelente unión, y forma enlaces de hidrógeno

fuertes con el carbonilo de la amida del esqueleto peptídico. La interacción entre los

polifenoles y las proteínas en un sistema modelo. También encontró que la oxidación

enzimática de polifenoles produce quinonas, que son agentes muy reactivos y pueden

reaccionar adicionalmente con los aminoácidos y proteínas, o polimerizar uno con el otro

para formar productos de alto peso molecular, los llamados " taninos condensados ",

mientras que en peso molecular superior a 3000, forman complejos con proteínas a través

de enlaces de hidrógeno.

Endoproteasa aspártico, carboxipéptidasa y la invertasa son inactivados de

manera significativa durante la fermentación y el secado de los granos de cacao. El efecto

de inactivación de las enzimas en la fermentación es significativamente menor que el

proceso de secado. La actividad de las enzimas que quedan en los granos de cacao se

secan sin fermentar y fermentadas en parte, son suficientes para llevar a cabo reacciones

enzimáticas durante la incubación. Patrones peptídicos de desgrasada, sin fermentar y

parcialmente fermentado de soja en polvo después de la incubación son muy similares a

los patrones fermentados. Las concentraciones de aminoácidos en los granos fermentados

se incrementaron significativamente durante las primeras 4 h de incubación y luego se

mantuvo constante, mientras que en los granos fermentados en parte, la formación

continuada y la concentración de hidrófobos y el total de aminoácidos libres alcanzado el

valor de los granos bien fermentados después de 24 h de incubación. La reducción de las

concentraciones de azúcar de granos bien fermentados podría ser alcanzado por la

incubación de ambos sin fermentar y fermentadas en parte, los granos de cacao. Éstos

resultados indican claramente que la calidad del sabor de las semillas sin fermentar los

granos de cacao puede ser mejorado mediante la activación de las enzimas clave

pendientes.

2.9 GENERALIDADES DE LA FERMENTACIÓN DEL CACAO

Según Ligia Ortiz de Bertolelli. La fermentación es una fase indispensable en el

beneficio del cacao, Theobroma cacao L., ya que en ella se desarrollan los precursores del

aroma y sabor a chocolate. Ésta etapa es afectada por el tipo de cacao tiempo de

almacenamiento del fruto o mazorca antes de la apertura y el desgrane, así como por el

método de fermentación empleado, dependiendo del tipo de fermentador usado el

tiempo del proceso y frecuencia de remoción de la masa fermentante (semillas y pulpa),

entre otros, consecuentemente todos éstos factores influyen sobre la calidad del producto

final.

El tiempo de fermentación está relacionado con el tipo de cacao. El criollo

fermenta más rápidamente que el forastero, tardando el primer tipo de cacao dc 2 a 3

días y el segundo de 5 a 7 días. No obstante, las condiciones climáticas, el volumen de la

masa y el método aplicado ejercen un papel importante sobre la duración del proceso y

pueden causar grandes variaciones, por lo que es conveniente establecer en campo el

tiempo adecuado.

Igualmente se ha detectado que a medida que aumenta el tiempo entre la

cosecha y el desgrane del fruto se incrementa la posibilidad de una sobre-fermentación

por lo que se recomienda reducir el tiempo de fermentación cuando la proporción de

mazorcas desgranadas tardíamente es alta.

En cuánto a la remoción de la masa durante la fermentación del cacao, se ha

encontrado que ejerce un efecto significativo sobre los precursores del sabor. Al remover

la masa fermentante se incrementa la aireación, lo que conlleva a una regulación de la

acidez del producto y de la velocidad del proceso fermentativo, ya que el desarrollo de la

temperatura y de la acidez depende de la aireación de la masa en fermentación. Además,

la remoción impide la aglomeración de los granos y el consecuente desarrollo de hongos

en la superficie y en las esquinas de los fermentadores. Ahora bien, la frecuencia de

remoción de la masa puede alterar la apropiada secuencia microbiana durante la

fermentación y provocar la aparición de metabolitos que, al difundirse por el interior de

los cotiledones, pueden afectar la calidad del producto final, por lo que es importante el

control de dicho factor.

Se ha observado que el almacenamiento de los frutos de cacao por varios días

después de la cosecha realza el sabor. Ésta demora en el desgrane favorece la hidrólisis de

la pulpa y reduce la acidez del cacao, así mismo promueve bajos niveles de ácido láctico,

ácidos volátiles y ácidos totales libres y un incremento de los taninos en el cotiledón. Al

retardar el desgrane, la fermentación es acelerada debido a que la temperatura se

incrementa más rápidamente, dependiendo dicho incremento del tiempo de

almacenamiento de la mazorca, de manera que los valores de la temperatura serán más

altos a medida que aumenta el tiempo entre la cosecha y el desgrane del cacao. Sin

embargo, se ha notado que un ascenso lento de la temperatura es importante para

obtener un mejor potencial del sabor, ya que se forma menos cantidad de ácido acético,

el cual en concentraciones moderadas puede difundir lentamente dentro de los granos sin

causar una sobre acidificación, por lo tanto no es conveniente almacenar la mazorca por

mucho tiempo.

La fermentación del cacao es una etapa muy importante en el procesamiento del

grano, ya que se producen los cambios bioquímicos que dan origen a los precursores del

aroma y del sabor. Diversos factores que influyen sobre el proceso fermentativo, dentro

de los que destaca el tipo de cacao, las condiciones ambientales y el almacenamiento de

la mazorca , así como el sistema empleado en la fermentación. Así mismo, el tipo de

fermentador, el volúmen de la masa y el volteo durante el proceso afectan la

fermentación y en consecuencia la calidad del grano fermentado. El proceso fermentativo

se realiza de distintas maneras y los métodos tradicionalmente más utilizados son la

fermentación en canastas, cajas o en montones.

En la zona de Cumboto, Venezuela, la mayoría de los productores fermentan en

sacos de yute, cajas de plástico y en montones. Sin embargo, en la actualidad varios

productores están efectuando éste proceso en las cajas de madera disponibles en El

Central de Beneficio de Ocumare de La Costa, el cuál ha sido recuperado.

En Cumboto la aplicación de un determinado método de fermentación depende,

básicamente, de la experiencia del productor y el manejo post cosecha, por lo general, es

realizado con una gran variabilidad, que ha impedido garantizar a los compradores un

producto con una determinada calidad, lo cual ha incidido negativamente en el precio y en

el prestigio del cacao. El objetivo del estudio consistió en evaluar los tipos de

fermentadores utilizados por los productores de cacao de la localidad de Cumboto, a fin

de seleccionar el más adecuado para el proceso fermentativo en la zona.

La variación del pH y de la acidez durante La fermentación del cacao se debe a la

degradación microbiana de los ácidos y a la pérdida por difusión de éstos compuestos

hacia el cotiledón.

Durante la fermentación, los azúcares totales de La pulpa + testa y del cotiledón

disminuyeron en los tres fermentadores, con diferencias significativas (P<0,05) entre sí. Ei

descenso de éstos compuestos en la pulpa + testa es ocasionado por la conversión de los

azúcares en alcohol por acción de Las levaduras y por su eliminación a través del exudado,

en cambio en el cotiledón la sacarosa es hidrolizada a fructosa y glucosa por acción de la

invertasa. Entre los fermentadores, los valores de los azúcares totales de la pulpa ÷ testa

fueron significativamente (P<0,05) mayores en la caja de madera que en La caja plástica,

mientras que en el cotiledón no difirieron entre sí.

Fig. 10 Selección de Mazorcas de Cacao, Hacienda la Carrera

Fig. 11 Pesado de Mazorca de Cacao

CAPÍTULO 3. METOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN

Para la realización de ésta investigación se identificaron aquellos eco tipos de

cacao que presenten las características potenciales de buena producción tomando en

cuenta que estén libres de enfermedades, daños físicos, mecánicos que puedan afectar los

resultados en los análisis, a continuación se describe las etapas realizados en esta

investigación.

3.1 CORTE Y SELECCIÓN DEL FRUTO

Ésta operación requiere de mucho cuidado ya que los

frutos o mazorcas que fueron evaluados deben estar en su

óptimo desarrollo de madurez lo cual se estima a partir de

aquellos frutos que tengan cinco a seis meses de desarrollo.

Luego de la identificación se procedió a su corte mediante

tijeras de podar, se realizó el corte cerca del fruto en el

pedúnculo para no dañar el cojinete floral. Los frutos se

trasladaron al laboratorio para efectuar el siguiente proceso.

3.2 PESO DE LA MAZORCA.

El peso de las mazorcas se determinó para estimar

el rendimiento de las masas de semillas que serían

colocada en las cajas de maderas y plástico. Se Pesaron

75 mazorcas en una balanza COBOS PRECISION CB-

JUNIOR MAX/d 600/0.01g. Haciendo un peso total en

mazorca de 72.99lb, cuyo promedio en mazorca fué de

0.86lb.

3.3 EXTRACCIÓN DE MUESTRAS DE SEMILLAS

El proceso consiste en quebrar la mazorca de cacao

utilizando un cuchillo de acero inoxidable de

aproximadamente 20cm de largo de la hoja, teniendo

cuidado de romper solamente el epicarpio para no dañar

la semilla que serian extraídas de la placenta.

3.4 PESO Y DIMENCIONES DE LAS SEMILLAS

El peso total de las semillas fresca extraída con

mucílago fue 21.22lb, y su promedio fue de 0.25lb por

mazorca. Luego se realizaron mediciones a 10 semillas

de la masa obtenida (21.22lb); cuyo promedio en

semillas fue: largo 25.5mm, ancho 15.6mm y grueso

10.6mm, datos determinantes para obtener

rendimientos de fermentación.

3.5 PREPARACIÓN DEL PROCESO DE FERMENTACIÓN

De la masa obtenida de las semillas frescas se

dividieron en tres repeticiones, colocándola en depósitos

plásticos con un diámetro de 32cm, y de alto 14cm, con

peso de 4.56lb para MNT-02 en las cuales se inocularon

con levaduras S. cereviceae al 0.05% y a su vez se

mezclaron con agua purificada en una relación de uno de

semilla y uno de agua cuya solución sirvió para preparar

un jarabe a una concentración 22°Brix.

Fig. 12 Extracción de Semillas

Fig. 13 Medición de las Dimensiones de la Semilla del Cacao Fresco

Fig. 14 Preparación del Proceso de Fermentación no Tradicional

En la muestra MT-01 las semillas se colocaron en cajas de madera cortés blanco

cuyas dimensiones fueron: largo de 30ml, ancho de 20ml, alto 15ml. En éste tratamiento

se le colocó hojas de huerta y para cubrir las semillas tal como se realiza en la Hacienda

San José del Real la Carrera, se efectuaron las mediciones de temperatura con un

termómetro de mercurio con una escalas de 0-100°C de 260mm largo LUDWIG

SCHNEIDER LS-0003, éste proceso se efectuó cada 24 horas durante 72 horas que duró la

fermentación.

3.6 TÉCNICAS Y PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS FÍSICO-QUÍMICOS DE LA SEMILLAS

FERMENTADAS

En ésta etapa se efectuaron medición cada 24 horas en los tratamientos durante el

tiempo que se tardó la fermentación (aeróbica y anaeróbica), teniendo cuidado de

ventilar la masa que fue fermentada cada 24 horas. En éstos períodos de fermentación se

tomo en cuenta el pH, % de azucares, % de alcohol, % de ácido acético y la temperatura.

3.6.1 PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DEL pH

Para la medición del pH se utilizó un potenciómetro

digital modelo PHS-3CW. Se calibra el potenciómetro

utilizando agua destilada y se seca con una toalla absorbente

de material suave, luego se procede a su calibración

utilizando soluciones búffer de 4 y 7; ya que el rango de

acidez del mucílago oscila entre éstos parámetros.

Posteriormente se obtiene una muestra de

aproximadamente 20ml de mucílago en la cual se introduce

los electrodos en diferentes zonas es decir en la porción

superior, media y baja con el objetivo de tener un parámetro de tres puntos para luego

determinar la media de sus valores. Ésto se realizo para el MT-01 y MNT-02.

Fig. 15 Medidor Electrométrica del pH PHS-3CW

Fig. 16 Medición de Ácido Acético

Fig. 17 Medición de Alcohol

Fig. 18 Medición de Sólidos Solubles Totales

3.6.2 PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE SÓLIDOS SOLUBLES, ÁCIDO

ACÉTICO Y NIVEL DE ALCOHOL

Para la determinación de Ácido Acético, Alcohol y la cantidad de Sólidos Solubles totales

(°Brix) presentes, en las muestras se utilizó el método por refractómetria. El dato se

muestra en la pantalla y éste básicamente facilita el procedimiento de medición.

A) DETERMINACIÓN DE ÁCIDO ACÉTICO

En la determinación de Ácido Acético se utilizó un refractómetro

marca ATAGO (PAL-305) digital manual de un rango 0-20g/100g; se

calibra a 0% colocando 0.3ml agua destilada cubriendo el prisma, se

presiona cero; ya calibrado se coloca 0.3ml de mucílago, se presiona start

y se efectúa la lectura en el visualizador de cristal líquido, los datos se

reportan en porcentaje.

Nota: Si éste sobrepasa el 20% se realizó una dilución de 0.1ml

en 1ml de agua destilada.

B) DETERMINACIÓN DE ALCOHOL

En la determinación de Alcohol se utilizó en un refractómetro marca

ATAGO (PAL-34S) digital manual de un rango 0-45g/100g; se calibra a 0%

colocando 0.3ml de agua destilada en el prisma se presiona cero; ya

calibrado se coloca 0.3ml de mucílago, se presiona start y se observa en el

visualizador de cristal líquido, los datos se reportan en porcentaje.

C) DETERMINACIÓN DE SÓLIDOS SOLUBLES TOTALES (°BRIX)

En la determinación de los °Brix, se utilizó en un refractómetro

marca ATAGO (PAL-1) digital manual de un rango 0 – 53%; se calibra a 0%

colocando 0.3ml agua destilada en el prisma se presiona cero; ya calibrado

se coloca 0.3ml de mucílago, se presiona start y se observa en el

visualizador de cristal líquido, los datos se reportan en porcentaje.

3.7 PROCEDIMIENTO MICROBIOLÓGICO DE LA FERMENTACIÓN

3.7.1 MATERIALES Y EQUIPO

Erlenmeyer

Hot Plate

Pipetas graduadas estériles de 10ml

Incubadora con termostato que pueda ser mantenido a 25±1°C y 35°C.

Autoclave

Balanza

3.7.2 MEDIO DE CULTIVO STANDARD

1. Se pesa 11.1g del medio en una balanza SARTORIUS BL60.

2. Se agrega 300ml de agua destilada en Erlenmeyer de 500ml.

3. SE Añade el medio ya pesado al Erlenmeyer.

4. Colocar el Erlenmeyer en un Hot Plate AGITADOR MAGNÉTICO ANALÓGICO

(AGIMATIC-N), calentar a 100°C y mezclarlo por medio del imán a 800r.p.m.

5. Se colocó el Erlenmeyer con la dilución en un auto clave para su esterilización a

120°C durante una hora y media

3.7.3 MEDIO DE CULTIVO MRS

1. Se pesar 15.66g del medio en una balanza SARTORIUS BL60.

2. Se agrega 300ml de agua destilada en erlenmeyer de 500ml.

3. Añadir el medio ya pesado al erlenmeyer.

4. Colocar el erlenmeyer en un Hot Plate agitador magnético analógico (agimatic-n),

calentar a 100°C y mezclarlo por medio del imán a 800r.p.m.

5. Se coloco el Erlenmeyer con la dilución en un auto clave para su esterilización a

120°C durante una hora y media.

3.7.4 MEDIO DE CULTIVO RAE

Los componentes se pesan en una balanza SARTORIUS BL60 y se mide con una pipeta

graduada.

Glucosa 20g

Extracto levadura 5g

Peptona 5g

Fosfato sódico 1.69g

Ácido cítrico .75g

Etanol 10ml

Ácido acético 5ml

Agar 5g

Agua 500ml

1. Agregar 500ml de agua destilada en erlenmeyer de 1000ml.

2. Añadir el medio ya pesado al erlenmeyer.

3. Colocar el erlenmeyer en un Hot Plate agitador magnético analógico (agimatic-n),

calentar a 100°C y mezclarlo por medio del imán a 800r.p.m.

4. Se colocó el erlenmeyer con la dilución en un auto clave para su esterilización a

120°C durante una hora y media.

3.7.5 MEDIO DEXTROSA SABORAUD

1. Pesar 32.5g del medio en una balanza SARTORIUS BL60.

2. Agregar 500ml de agua destilada en erlenmeyer de 1000ml.

3. Añadir el medio ya pesado al erlenmeyer.

4. Colocar el erlenmeyer en un Hot Plate agitador magnético analógico (agimatic-n),

calentar a 100°C y mezclarlo por medio del imán a 800r.p.m.

5. Se colocó el erlenmeyer con la dilución en un auto clave para su esterilización a

120°C durante una hora y media.

3.8 INOCULACIÓN DE MICROORGANISMOS

3.8.1 MATERIALES Y EQUIPO

Cajas de Petri estériles

Incubadora con termostato que pueda ser mantenido a 25±1°C y 35°C.

Portaobjetos

Microscópio óptico

Asa bacteriológica.

Recipiente de anaerobio ANAEROCULT A

Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal

cuadriculada y lente amplificador.

Utensilios estériles para la manipulación de muestras: jeringa.

1. Se mide 0.1ml de la muestra con una jeringa estéril y

pasarla a un tubo bacteriológico en 10ml de agua peptonada.

Homogenizar la muestra con la solución anterior durante

10.0seg (dilución primaria).

2. De la solución anterior, tomar 1.0 ml y transferirlo a un

tubo bacteriológico que contenga 10 ml de agua peptonada;

agitar y se repite ésta operación 3 veces.

Se debe utilizar una jeringa estéril para cada dilución.

3. Se coloca por duplicado en cajas petri estériles, 1.0 ml de

cada una de las diluciones de la muestra, utilizando una

jeringa estéril.

4. Se funde el medio. Se enfría y se mantiene a ±45°C.

5. En cada caja de petri con inóculo, se vierte de 15.0 a 20.0

ml de los medios a ±45°C. El tiempo transcurrido entre

la preparación de las diluciones y el momento en que es

vertido el medio de cultivo no debe de exceder de 20.0 min.

Fig. 19 Dilución en Agua Peptonada

Fig. 20 Inoculación y Siembra en Medio Cultivo

6. Se mezcla cuidadosamente el medio con seis movimientos de

derecha a izquierda, seis en el sentido de las manecillas del

reloj, seis en sentido contrario y seis de atrás hacia adelante,

sobre una superficie lisa, teniendo cuidado de no humedecer

con el medio la tapa de la caja de petri. Permitir que la mezcla

en las cajas petri solidifique, dejándolas reposar sobre una

superficie horizontal fría.

7. Se coloca en la incubadora a 25±1°C y 35±1°C

8. Se cuentan las colonias de cada placa después de 2, 3 y 5 días

de incubación (este último para el Medio Dextrosa Sabouraud.)

9. Se realiza una tinción con colorante cristal violeta, lugol,

safranina y etanol (tinción de gram)

10. Se detallan las unidades formadoras de colonias por gramo o

mililitro (UFC/g o ml) de microorganismo (cada uno en forma

independiente).

11. Se describe las características macroscópicas y

microscópicas observadas, de los microorganismos

desarrollados a partir de la muestra analizada.

3.8.2 ANÁLISIS CUANTITATIVO

Se hace un reporte de la parte cuantitativa de éste análisis, se cuentan las colonias

presentes y calcular el número de levaduras y bacterias por separado. De ésta manera se

puede calcular las unidades formadoras de colonias. Ésto se logra multiplicando el número

de UFC encontradas en una caja representativa, por el inverso de la dilución

correspondiente a esa caja (106).

Al no encontrar colonias características de levaduras y bacterias, el resultado a reportado

es: menos de 10 UFC/ml (Sensibilidad del Método).

Para cualquiera de los casos citados se reporta el tiempo de incubación en el que se

realizó la cuantificación.

Fig. 21 Homogenización de las Muestras

Fig. 22 Tinción de Gram

Fig. 24 Medición con Pie de Rey

Para cualquiera de los casos citados se reporta por separado el resultado de la

cuantificación de bacterias y levaduras.

3.9 SECADO DE GRANO DE CACAO

Éste procedimiento se realizó con el objetivo de reducir la

humedad de la semilla fermentada. Para ser crítica la

evaluación de las características físico-química. Éste proceso

se realizó en una superficie al aire libre exponiéndolo al sol

durante un período de tres horas por la mañana y tres en la

tarde por tres días

3.10. PESO SECO Y DIMENSIÓN DE LA SEMILLA SECA

El peso total de las semillas secas en ambos métodos, MT-

01 fue 4.64lb, y MNT-02 de 2.68lb. Luego se realizaron

mediciones a 10 semillas de las masas; cuyo promedio en

semillas fue en MT-01: largo 23,41mm, ancho 12.67mm y

grueso 7.53mm, en el MNT-02: largo 23.68mm, ancho

12.95mm y grueso 7.71mm, datos determinantes para

obtener la pérdida de peso (Pp) y cambios de volumen

mediante las ecuaciones ANEXO N°1.

3.11 MÉTODOS DE DETERMINACIÓN BROMATOLÓGICA

Para la realización de los análisis bromatológicos en las semillas fermentadas de los

métodos MT-01 y MNT-02 se baso en técnicas descritas por la AOAC 17TH edición, 2003;

(ANEXO 3) que determinan los % de ceniza, % de fibra y % de humedad mediante el

método gravimétrico así como el % de grasa mediante el método de extracción de Soxlet y

el % proteínas mediante el método Micro Kjeldahl. Cuyos resultados se describirán en la

discusión y resultados.

Fig. 23 Secado de Grano

29

CAPÍTULO 4: ANÁLISIS DE RESULTADOS

4.1 CUANTIFICACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS

En la tabla que se muestra a continuación, se determinan el promedio de crecimiento de colonias de microorganismos en los

diferentes medios de cultivo. También se presenta la desviación estándar y el promedio de acuerdo a los métodos utilizados; el

método tradicional y el método no tradicional.

MEDIO MICRORGANISMO INSPECCIÓN D1 D2 D3

MT MNT MT MNT MT MNT

Standard

Bacterias

Lácticas/Bacterias

Acéticas/Levaduras

M1 Levaduras 12.5 85 37.5 58 22.5 17.5

Bacterias 204 4 328 138 532 282

M2 Levaduras 230 150 136 45 40.5 16

Bacterias 238 4 534 44.5 704 216

M3 Levaduras 28 65 62 59 26 18

Bacterias 106 5 688 92 246 37

Desviación Estándar –

Levaduras 99.08 36.29 41.87 5.44 7.79 0.85

Promedio Levaduras 67.63 75.00 58.88 38.00 22.25 12.88

Desviación Estándar –

Bacterias 55.96 0.47 147.48 38.17 188.90 103.51

Promedio Bacterias 182.67 4.33 516.67 91.50 494.00 178.33

30

Sabouraud Levaduras

M1 374 136 606 162 416 168

M2 250 324 692 98 434 72

M3 418 116 736 90.00 552.00 46.00

Desviación Estándar 71.1306 93.695 53.9877 32.22 60.32 52.47

Promedio 347.333 192 678 116.67 467.33 95.33

M.R.S. Bacterias Lácticas

M1 214 2.5 552 44 906 63

M2 132 2 462 62 938 40

M3 84 2 528 90 832 30

Desviación Estándar 53.67 0.24 38.05 18.93 44.39 13.82

Promedio 143.33 2.17 514.00 65.33 892.00 44.33

R.A.E. Bacterias Acéticas

M1 506 2.5 300 33 5.5 0

M2 216 1 236 20.5 1 0

M3 63.5 1.5 340 29.5 12.5 0

Desviación Estándar 183.53 0.62 42.83 5.27 4.73 0.00

Promedio 261.83 1.67 292.00 27.67 6.33 0.00

TABLA N°3: PROMEDIO DE CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS DE ACUERDO AL MEDIO DE CULTIVO

D1: 24 Horas / D2: 48 Horas / D3: 72 Horas M1: Muestra 1 / M2: Muestra 2 / M3: Muestra 3

MT: Método Tradicional MNT: Método No Tradicional

inicial 24 Horas 48 Horas 72 Horas

Metodo Tradicional 0 67.63 58.88 22.25

Metodo No Tradicional 0 75.00 38.00 12.88

01020304050607080

Crecimiento de Levaduras en Medio Standard

4.2 EL COMPORTAMIENTO DE MICROORGANISMOS CON RESPECTO AL TIEMPO DE

INCUBACIÓN.

A continuación se hará la descripción interpretativa de la tabla # 1 procedimiento de

crecimiento de microrganismo de acuerdo al medio de cultivo, en los siguientes gráficos.

En el gráfico anterior se muestra el conteo del comportamiento de las colonias de

levadura desarrolladas en medio de cultivo estándar mediante el MT-01y el MNT-02. Se

observa que a las 24 horas en el MT-02 nos dá una cantidad de 67.63X106 de UFC, todo lo

contrario con el MNNT-02 con una cantidad de 75X106 de UFC; siendo un nivel alto

comparado al MT-01. A las 48 horas hubo una baja en el MT-01 con una cantidad de

58.88X106 de UFC, caso del MNT-02 en el cuál existió una baja considerable 38X106 de

UFC. A las 72 horas hubo una baja considerable en MT-01 con una cantidad de 22.25X106

de UFC, al igual que MNT-02 con una baja considerable de 12.88X106 de UFC. Haciendo

una comparación en el MT-01 el comportamiento fué a la baja debido a su muerte a la

alta temperatura como se demuestra en el gráfico 7 ya que estas sobreviven de 25°C a

30°C después de trasformar los Sólidos Solubles en Alcohol y acabando con el oxígeno

dando paso a las bacterias lácticas que éstas son anaeróbicas. En MNT-02 el

comportamiento va a la baja debido a gran cantidad de alcohol que se expresa en el

gráfico 9 que la mayoría de levaduras no sobreviven a más de 17° de alcohol.

GRÁFICO 1: ÍNDICE DE CRECIMIENTO DE LEVADURAS EN MEDIO ESTANDAR

inicial 24 Horas 48 Horas 72 Horas

Metodo Tradicional 0 182.67 516.67 494.00

Metodo No Tradicional 0 4.33 91.50 178.33

0

100

200

300

400

500

600

Crecimiento de Bacterias en Medio Standard

Al observar en el microscópio Niko YS100 se

identificaron en el medio estándar las presencias de

levaduras tales como Hanseniaspora guilliermondii y S.

cereviseae.

En el gráfico anterior se muestra el conteo del comportamiento de las colonias de

bacterias desarrolladas en medio de cultivo estándar mediante el MT-01 y el MNT-02. Se

observa que a las 24 horas en el MT-01 nos dá una cantidad de 182.67X106 de UFC, todo lo

contrario con el MNT-02 con una cantidad de 4.33X106 de UFC; siendo un nivel muy bajo

comparado al MT-01. A las 48 horas hubo aumento apreciable en el MT-01 con una

cantidad de 516.67X106 de UFC, en el MNT-02 en el cual existió un aumento 91.50X106 de

UFC. A las 72 horas se obtuvo baja inapreciable en MT-01 con una cantidad de 494X106 de

UFC, diferente al MNT-02 con un aumento mínima de 178.33X106 de UFC. Haciendo una

comparación de comportamiento de las bacterias en el medio estándar; el MT-01 obtuvo

un aumento y disminución, ya que éstas se desarrollan debido a fermentación de

carbohidratos residuales, al consumo de ácido cítrico y a la trasformación de Alcohol en

GRÁFICO 2: ÍNDICE DE CRECIMIENTO DE BACTERIAS EN MEDIO ESTANDAR

Fig. 25 levaduras, Hanseniaspora guilliermondii y S. cereviseae.

inicial 24 Horas 48 Horas 72 Horas

Metodo Tradicional 0 347.3333333 678 467.33

Metodo No Tradicional 0 192 116.67 95.33

0

100

200

300

400

500

600

700

800

Crecimiento de Levaduras en Medio Dextrosa Sabouraud

ácido acético. En el MNT-02 fué en aumento pero en menor

cantidad de UFC por la gran cantidad de alcohol.

Al observar en el microscópio Niko YS100 se identificaron

en el medio estándar las presencias de bacterias acéticas

tales como Oxydans Gluconobacter y pocas bacterias

lácticas como la Lactobacillus Fermentum.

En el gráfico anterior se muestra el conteo del comportamiento de las colonias de

levadura desarrolladas en medio de cultivo Dextrosa Sabouraud mediante el método

tradicional y el método no tradicional. Se observa que a las 24 horas en el método

tradicional nos dá una cantidad de 347.33X106 UFC, al contrario con el método no

tradicional con una cantidad de 192X106 UFC; que es un nivel bajo comparado al método

tradicional. A las 48 horas hubo aumento considerable en el método tradicional con una

cantidad de 678X106 UFC, caso contrario del método no tradicional que obtuvo un baja

apreciable 116.67X106 UFC. A las 72 horas se obtuvo baja considerable en método

tradicional con una cantidad de 467.33X106 UFC, diferente al método no tradicional con

una baja mínima de 95.33X106 UFC. Haciendo una comparación el MT-01 tiene mayor

Fig. 26 bacterias, Oxydans Gluconobacter y Lactobacillus Fermentum.

inicial 24 Horas 48 Horas 72 Horas

Metodo Tradicional 0 143.33 514.00 892.00

Metodo No Tradicional 0 2.17 65.33 44.33

0

200

400

600

800

1000

Crecimiento de Bacterias Lacticas en Medio M.R.S.

UFC, Las levaduras van en aumento transformando los azúcares sencillos de la pulpa en

alcohol, degradando la pectina, lo que modifíca la textura del grano y elimina el ácido

cítrico disminuyendo la acidez. Por otro lado, levaduras consume el oxígeno, creando un

ambiente anaerobio que favorece el desarrollo de bacterias y disminuye por las alta

temperatura al no por sobrevivir a ésta ver gráfico 7; diferente a la muestra MNT-02 que

éste va en disminución por gran cantidad de alcohol ver gráfico 9, que en la mayoría

levaduras no sobreviven a más de 17°.

Al observar en el microscópio Niko YS100 se

identificaron en el medio sabouraud se encontraron las

Hanseniaspora guilliermondii en pocas cantidades y la

S. cereviseae se encuentran en grandes cantidades

En el gráfico anterior se muestra el conteo del comportamiento de las colonias de

levadura desarrolladas en medio de cultivo M.R.S. mediante el método tradicional y el

método no tradicional. Se observa que a las 24 horas en el método tradicional nos dá una

cantidad de 143.33X106 de UFC, todo lo contrario con el método no tradicional con una

cantidad de 2.17X106 de UFC; siendo un nivel muy bajo comparado al método tradicional.

GRÁFICO 4: ÍNDICE DE CRECIMIENTO DE BACTERIAS LACTICAS EN MEDIO M.R.S.

Fig. 29 levaduras, Hanseniaspora guilliermondii y S. cereviseae.

inicial 24 Horas 48 Horas 72 Horas

Metodo Tradicional 0 261.83 292.00 6.33

Metodo No Tradicional 0 1.67 27.67 0.00

0

50

100

150

200

250

300

350

Crecimiento de Bacterias Aceticas en Medio R.A.E.

A las 48 horas hubo aumento considerable en el método tradicional con una cantidad de

514X106 de UFC, al igual el método no tradicional en el cuál existió un aumento

inapreciable 65.33X106 de UFC. A las 72 horas se obtuvo aumento considerable en

método tradicional con una cantidad de 892X106 de UFC, diferente al método no

tradicional con una baja mínima de 44.33X106 de UFC. Haciendo una comparación, el MT-

01 fué en aumento por que las bacterias lácticas que fermentan los carbohidrato

residuales y el consumo de ácido cítrico, caso contrario al MNT-02 que obtuvo en menos

cantidad de UFC por no tener la falta de carbohidratos residuales.

Al observar en el microscopio Niko YS100 se identificaron

en el medio M.R.S bacterias lácticas que son los

Lactobacillus fermentum en grandes cantidades las que

mayoría bien formados y éstos prevalecen en la segunda

fase.

En el gráfico anterior se muestra el conteo del comportamiento de las colonias de

levadura desarrolladas en medio de cultivo R.A.E. mediante el método tradicional y el

método no tradicional. Se observa que a las 24 horas en el método tradicional nos da una

GRÁFICO 3: INDICE DE CRECIMIENTO DE BACTERIAS ACETICAS EN MEDIO R.A.E.

Fig. 28 bacterias Lactobacillus Fermentum.

cantidad de 261.83X106 de UFC, todo lo contrario con el método no tradicional con una

cantidad de 1.67X106 de UFC; siendo un nivel muy bajo comparado al método tradicional.

A las 48 horas hubo aumento mínima en el método tradicional con una cantidad de

292X106 de UFC, al igual que el método no tradicional en el cuál existió un aumento

inapreciable 27.67X106 de UFC. A las 72 horas se obtuvo baja considerable el método

tradicional con una cantidad de 6.33X106 de UFC, al igual qué el método no tradicional con

una pequeña disminución de 0X106 de UFC. Haciendo una comparación ambos métodos

obtiene el mismo comportamiento; pero el MT-01 nos da una gran cantidad de UFC, las

bacterias acéticas llevan a cabo la transformación del alcohol en ácido acético, con

producción de calor, El Alcohol y el ácido acético se difunden hacia el interior de los granos y,

junto con la temperatura alta y matan al embrión ya que nos genero una gran cantidad de UFC

puede perjudicar el grano de cacao dándole un sabor ácido. En el MNT-02 se desarrollaron pocas

cantidades UFC, aunque a las bacterias acéticas convirtieron una gran cantidad de alcohol ácido acético

ver gráfico 10, estas mueren por la falta de temperatura.

Al observar en el microscopio Niko YS100 se identificaron

en el medio estándar las presencias de bacterias

acéticas como Oxydans Gluconobacter qué es la que

predomina en la tercera fase de fermentación y se

encuentran en pocas cantidades.

Fig. 27 bacterias, Oxydans Gluconobacter

En las tablas se observa a continuación se muestra el comportamiento de fermentación

en el grano de cacao en el método tradicional y el no tradicional; se representa con un

porcentaje del 0% al 100%, dependiendo del pardeamiento en el grano de cacao.

En la fíguras anteriores se puede observar que a las 24 horas de fermentado en

ambos métodos no hubo cambios de coloración, se mantuvo el color violeta claro.

En la fíguras anteriores el grano de cacao del MT-01 no se observa cambios de

coloración se mantuvo violeta claro a las 48 horas, al contrario en el grano de cacao del MNT-

02 se observa una pequeña parte un cambio de coloración violeta claro a violeta intensó.

Día 1

Día 2

4.3 CAMBIOS DE COLORACIÓN DE LA SEMILLA DURANTE EL PROCESO DE FERMENTACIÓN

Fig. 30 grano de cacao del MT0-1

Fig.31 grano de cacao del MNT-02

Fig. 32 grano de cacao del MT0-1 Fig.33 grano de cacao del MNT-02

En la fíguras a las 72 horas el grano de cacao del método tradicional se muestra una

coloración café en una diminuta parte de la semilla y en la otra parte se mantiene un color

violeta suave, por lo contrario en grano de cacao del método no tradicional se presenta

una coloración café de la semilla en su mayoría y se mantiene en la otra parte de color

violeta intenso.

Seco

En la fíguras anteriores el Grano de cacao del método tradicional se observa un

color café claro, por lo contrario en el grano de cacao del método no tradicional se

muestra un café oscuro, más intenso que el método tradicional.

Día 3

Fig. 34 grano de cacao del MT0-1 Fig.35 grano de cacao del MNT-02

Fig. 36 grano de cacao del MT-01

Fig.37 grano de cacao del MNT-02

4.4 COMPROBACIÓN DEL ALCOHOL, ÁCIDO ACÉTICO, pH, SÓLIDOS TOTALES Y

TEMPERATURA DURANTE EL PROCESO DE FERMENTACIÓN

TEMPERATURA pH

GRADOS BRIX

ALCOHOL ÁCIDO

ACÉTICO

MTD1 28 3 9.2 18.33 15.8

MTD2 35 3 5.33 10.67 7.07

MTD3 38 4 4.67 9.2 11.47

MNTD1 24 3 15.4 14 10.73

MNTD2 24 3 14.87 31.67 34

MNT3 24 3 13.6 36.67 10

La temperatura alta favorece a la muerte del embrión, entre más masa de granos

de cacao mayor es la temperatura; el pH bajo ayuda al crecimiento de levaduras y

bacterias; los Sólidos Solubles Totales se degradan por medio de las levaduras que

generan alcohol y por el crecimiento de bacterias nos dá ácido acético. Éstos factores

favorecen al sabor y olor.

TABLA N°4: TABLA DE INTERACCIÓN DE ALCOHOL, ÁCIDO ACÉTICO, SÓLIDOS TOTALES Y

TEMPERATURA

inicial 24 Horas 48 Horas 72 Horas

Método Tradicional 25 28 35 38

Método No Tradicional 25 24 24 24

05

10152025303540

Comportamiento de la temperatura en la Fermentacion de Cacao

4.5 EL COMPORTAMIENTO DEL ALCOHOL, ÁCIDO ACÉTICO, pH, SÓLIDOS TOTALES Y

TEMPERATURA DURANTE EL PROCESO DE FERMENTACIÓN.

A continuación se hará la descripción interpretativa de la tabla # 2 de acuerdo a sus

mediciones, en los siguientes gráficos.

En el gráfico anterior se muestra el comportamiento de la temperatura mediante

el método tradicional y el método no tradicional. Se observa que al inicio en el método

tradicional nos dá 25°C, al igual que el método no tradicional. A las 24 horas hubo

aumento en el método tradicional con 28°C, lo contrario el método no tradicional en el

cual existió una baja mínima de 24°C. A las 48 horas se obtuvo aumento considerable en

método tradicional de 35°C, el método no tradicional se mantuvo estable a 24°C. A las 72

horas se obtuvo aumento inapreciable en método tradicional de 38°C, el método no

tradicional se mantuvo estable a 24°C. Haciendo una comparación de comportamiento de

la temperatura, el método tradicional tuvo un comportamiento en aumento gracias a las

bacterias acéticas, caso contrario al método MNT-02 por ser en estado líquido y bajo

crecimiento de bacterias no hubo aumento de temperatura.

GRÁFICO 7: COMPORTAMIENTO DE LA TEMPERATURA EN LA FERMENTACIÓN DEL CACAO

Inicio 24 Horas 48 Horas 72 Horas

Metodo Tradicional 16 9.20 5.33 4.67

Metodo No Tradicional 22 15.40 14.87 13.60

0

5

10

15

20

25

Comportamiento de los Sólidos Solubles en la Fermentación de Cacao

En el gráfico anterior se muestra el comportamiento de los Sólidos Solubles Totales

mediante el método tradicional y el método no tradicional. Se observa que al inicio en el

método tradicional nos dá 16°Brix, con el método no tradicional con 22°Brix; siendo un

nivel alto al método tradicional por la incorporación de azúcar (sacarosa). A las 24 horas

hubo disminución en el método tradicional con 9.20°Brix, al igual el método no tradicional

en el cuál existió una baja de 15.40°Brix. A las 48 horas se obtuvo disminución

considerable en método tradicional de 5.33°Brix, el método no tradicional con una baja

mínima de 14.87°Brix. A las 72 horas se obtuvo disminución inapreciable en método

tradicional de 4.67°Brix, el método no tradicional con una baja mínima de 13.60°Brix.

Haciendo una comparación de comportamiento de los Sólidos Solubles Totales, tanto el

método tradicional y el método no tradicional obtuvieron el mismo comportamiento.

Las concentraciones óptimas de sacarosa para el desarrollo de la fermentación se

manejaron entre 11 y 18%, específicamente en 12% y en algunos ensayos cuando se

aumenta las proporciones de sacarosa al 25%, éstos ensayos formularon defectos

significativos en los procesos fermentativos de ambos métodos.

GRÁFICO 8: COMPORTAMIENTO DE SÓLIDOS TOTALES EN LA FERMENTACIÓN DEL CACAO

inicial 24 Horas 48 Horas 72 Horas

Metodo Tradicional 0.00 18.33 10.67 9.20

Metodo No Tradicional 0.00 14.00 31.67 36.67

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

35.00

40.00

Comportamiento del Alcohol en la Fermentación de Cacao

En el gráfico anterior se muestra el comportamiento del Alcohol mediante el

método tradicional y el método no tradicional. Se observa que al inicio tanto en el

método tradicional como el método no tradicional es de 0%. A las 24 horas hubo aumento

considerable en el método tradicional con 14.00%, al igual el método no tradicional en el

cual existió un aumento considerable de 18.33%. A las 48 horas se obtuvo disminución

considerable en método tradicional a 10.67%, todo lo contrario en el método no

tradicional con una aumento considerable de 31.67%. A las 72 horas se obtuvo

disminución inapreciable en método tradicional de inapreciable 9.2%, el método no

tradicional con una aumento mínima de 36.67%. Haciendo una comparación de

comportamiento de alcohol, en el método tradicional obtuvo un aumento al inicio y

después una baja considerable debido a las bacterias acéticas que trasforman el alcohol a

ácido acético, en el método no tradicional obtuvo un aumento considerable gracias a los

azúcares y levaduras que le incorporamos.

GRÁFICO 9: COMPORTAMIENTO DEL ALCOHOL EN LA FERMENTACIÓN DEL CACAO

inicial 24 Horas 48 Horas 72 Horas

Metodo Tradicional 0.00 15.80 7.07 11.47

Metodo No Tradicional 0.00 10.73 34.00 10.00

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

35.00

40.00

Comportamiento del Ácido Acético en la Fermentación de Cacao

En el gráfico anterior se muestra el comportamiento del Ácido Acético mediante el

método tradicional y el método no tradicional. Se observa que al inicio tanto en el método

tradicional y método no tradicional nos dá un valor de 0%. A las 24 horas hubo aumento

en el método tradicional con 15.8%, al igual el método no tradicional en el cual existió un

aumento de 10.78%. A las 48 horas se obtuvo disminución considerable en método

tradicional de 7.07%, todo lo contrario con el método no tradicional con un aumento

considerable de 34%. A las 72 horas se obtuvo aumento inapreciable en método

tradicional de 11.47%, al contrario en el método no tradicional con una disminución

apreciable de 10%. Haciendo una comparación de comportamiento del Ácido Acético, en

el método tradicional obtiene un aumento por la cantidad de alcohol que las bacterias

acéticas trasforman a ácido acético, pero después hubo una baja por su temperatura de

35°C, ya que las bacterias acéticas se desarrollan arriba de éstas, luego hubo un aumento

de ácido acético por que la temperatura subió a 38°C ver gráfico 7, en el MNT-02 obtuvo

un aumento considerable gracias a la gran cantidad de alcohol, después tuvo una baja por

que no desarrollaron las bacterias acéticas debido a la temperatura baja de 24°C.

GRÁFICO 10: GRÁFICO DE COMPORTAMIENTO DEL ÁCIDO ACÉTICO EN LA

FERMENTACIÓN DEL CACAO

inicial 24 Horas 48 Horas 72 Horas

Metodo Tradicional 0.00 3.00 3.00 4.00

Metodo No Tradicional 0.00 3.00 3.00 3.50

0.00

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

3.00

3.50

4.00

4.50

Comportamiento del pH en la Fermentación de Cacao

En el gráfico se refleja que el comportamiento del pH en ambos métodos MT-01 y MNT-02

se mantuvo a pH 3.00 durante las primeras 48 horas, posteriormente en las siguientes 24

horas (72 horas de iniciado el proceso) el MT-01 experimento un leve incremento llegando

a pH 4.00 y el MNT-02 sólo incremento a pH 3.50.

Éste factor es importante debido al control de contaminación bacteriano que también

puede afectar el crecimiento de lavaduras. El pH mas favorable para las levaduras es 4.4 –

5, son las condiciones óptimas que favorece al proceso de fermentación.

GRÁFICO 11: GRÁFICO DE COMPORTAMIENTO DEL pH EN LA FERMENTACIÓN DEL

CACAO

45

Dimensiones Método No Tradicional seco

Bolsa 1 Bolsa 2 Bolsa 3 PROMEDIO

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Largo 21.1 23.5 25.4 20.3 24.1 23.5 20.7 27.7 24 19.5 29.5 26 27.3 22.1 22.2 22.1 22.3 27 22.3 20 24.6 24.1 22.3 24.3 25.4 21.2 23.2 23.4 26.1 25.2 23.68**

Ancho 11 12.4 13.4 12.5 12 13 12 13.5 11.8 13.4 14.1 10.8 15.2 14.2 12.5 12.4 12.4 14.1 12.2 12 12.5 12.8 15.9 12.3 12.9 12.3 13.2 13.2 14.2 14.2 12.95**

Grosor 12 4.9 8.4 8.9 5.7 6.5 6.9 7 8 10 11.8 9.2 7.1 11.3 10.7 5.7 7.6 7.6 7.3 6 6.4 7.8 5 7.9 7.6 8.5 6.3 6.3 6.4 6.4 7.71**

2.4cm3*

Dimensiones Método Tradicional seco

Bolsa 1 Bolsa 2 Bolsa 3

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Largo 26.2 25 23.3 23.4 24.9 24.3 21.3 21.2 23.1 25.4 23.8 23.2 21.2 22.8 23.8 22.2 21.4 22.1 21.9 22 27.6 22.2 27.7 23.3 25.5 22 23.1 22.7 21.5 23.41**

Ancho 14 13.6 12.2 13.2 12.4 11.8 13 14.2 15.9 11.5 13 13.6 12.1 12.2 12.6 12.5 14.2 12.1 12.7 12 12.1 12.7 12.9 10.6 13.3 12.2 11.7 11.5 12.3 11.8 12.67**

Grosor 10.3 7.9 7 8.5 9.5 7.1 7.7 7.9 6.4 8.3 7.8 7.2 8.4 7.1 7.5 6.3 6 7.9 6.9 7.4 6.1 8.2 7.3 7.5 6.3 7.6 6.7 7.9 6.9 8.3 7.53**

2.2cm3*

Dimensiones Semilla Fresca

Bolsa 1 Bolsa 2 Bolsa 3

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Largo 22.9 27.1 26.4 22.7 28.4 25.3 24.6 25.3 24.2 27.1 23.8 22.9 26.3 27.2 24.3 24.3 23.4 24.3 28.1 26.1 25.6 27.4 28.1 23.6 24.5 28.1 25.3 26.2 28.1 23.1 25.5**

Ancho 16.4 15.5 16.2 14.4 15.1 15 16.5 15.6 16.3 16.2 17.1 16.3 16.9 15.2 15.9 14.9 13.8 16.4 15.4 16.2 16.2 16.1 15.2 15.9 14.9 14.8 14.7 15.5 13.4 16.2 15.6**

Grosor 9.8 12.4 8.7 13.1 8.6 13.1 13.6 12.1 10.2 13.3 13.1 12.2 8.7 13.9 9.4 8.4 9.3 8.3 8.5 10.1 10.6 12.3 13.1 8.5 8.5 10.3 9.3 8.3 12.2 9.1 10.6**

4.2cm3*

**Datos expresados en Milímetros mm

* Determinación de Volumen cm3

TABLA N°5: DIMENSIONES DE LAS SEMILLAS

4.6 ESQUEMATIZACIÓN DE DIMENSIONES, PESO Y RENDIMIENTO DE LAS SEMILLAS DE CACAO

TABLA N°6: RENDIMIENTO DE LOS GRANOS DE CACAO CON RESPECTO AL PESO DE LAS

SEMILLAS FRESCAS Y SECAS

Peso Total de Mazorca 72.99

Peso Promedio por Mazorca 0.97

Peso Total de Semillas con Mucílago 21.22

Peso Promedio de Semillas con Mucílago 0.28

Peso Fresco Total Muestra T 13.77

Peso Final de Fermentación T 12.40

Peso Seco Total Muestra T 4.64

Peso Fresco Total Muestra NT 7.45

Peso Final de Fermentación NT 9.35

Peso Seco Total Muestra NT 2.68

Rendimiento de Muestra T 33.70

Rendimiento de Muestra NT 35.98

A partir de las tablas anteriores es posible determinar el rendimiento, el cambio de

volumen y la pérdida o ganancia de peso, antes y después de haber realizado las pruebas

de fermentación en ambos métodos, aplicando las fórmulas. VER ANEXO N°2

GRÁFICO 12: GRÁFICO COMPARATIVO DEL RENDIMIENTO, EL CAMBIO DE VOLUMEN Y LA

PÉRDIDA DE PESO EN MT-01 Y MNT-02.

Perdida depeso

RendimentoCambio deVolumen

Metodo Tradicional 66.23% 33.70% 47.61%

Metodo No Tradicional 64.02% 35.88% 42.68%

0.00%

10.00%

20.00%

30.00%

40.00%

50.00%

60.00%

70.00%

FIBRA HUMEDAD PROTEINA GRASA

Metodo Tradicional 24.36 5.85 11.17 20.63

Metodo No Tradicional 24.76 4.57 12.07 21.09

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

En el gráfico anterior en la pérdida de peso, se observo en el MT-01 un 66.23% y el MNT-

02 un 64.02%; al hacer una comparación el MNT-02 perdió menos peso que el MT-01,

siendo así el MNT-02 favorece a la producción

Por lo tanto Cambio de Volumen en el MT-01 y en MNT-02, el resultado muestra una

reducción mayor de 47.61% en el MT-01, mientras que el MNT-02 tuvo una menor

reducción de 42.68% del volumen.

El rendimiento de la muestra de MT-02 tiene un 33.7% del rendimiento respecto al peso

fresco y seco de las semillas, mientras que en MNT-02 muestra un 35.98%, presentando

un mayor rendimiento el MNT-02.

4.7 OBSERVACIÓN DE LOS A ANÁLISIS BROMATOLÓGICOS EN MT-01 Y EL MNR-02.

En el siguiente gráfico se realiza una comparación de resultados en los respectivos

análisis bromatológicos que determinen los % de ceniza, % de fibra y % de humedad

mediante el método gravimétrico así como el % de grasa en MT-01 y EL MNR-02. VER

ANEXO N°4

GRÁFICO 13: GRÁFICO COMPARATIVO DE LOS ANÁLISIS BROMATOLÓGICOS.

En el gráfico anterior se realiza una comparación de los análisis bromatológicos

como fibra, humedad, proteína y grasa en el MT-01 y el MNT-02. En fibra en el MT-01

tuvo 24.36% y en el MNT-02 24.76%, en la humedad el MT-01 obtuvo 5.85% y en el MNT-

02 4.57%, en los análisis de proteína en el MT-01 se observa un 11.17% y el MNT-02 es de

12.07% y en la determinación de la grasa se obtuvo en el MT-01 un 20.63% y en el MNT-

02 fue de 21.09%. Haciendo una comparación de los análisis bromatológicos que el MNT-

02 se obtuvo mejores resultados, que el MT-01. Siendo así se puede decir que el MNT-02

brinda mejores resultados dando mejor calidad.

CONCLUSIONES

1. En los análisis descriptores agromorfológicos, de la variedad acriollado las semillas

tienen los cotiledones blancos o ligeramente pigmentados de color rosado;

cilíndrico u ovalado, son grandes, rollizos y muy aromáticos, pueden pesar hasta 6

g frescos con mucílago y hasta 2,4 g secos. Su largo es de 25.5mm ± 7.11 %, su

ancho 15.6mm ± 5.6%, su grosor 10.06mm ± 18.34%.

2. Con los resultados de los análisis de variación del volumen de la semilla, pérdida de

peso y rendimiento de peso seco. Se establece que el método de fermentación

MNT-02 obtiene menor variación de volumen, mayor rendimiento y menor

perdido de peso, por su fermentación en medio líquido.

3. Los resultados de los análisis microbiológicos con los medios de cultivo Estándar,

Dextrosa Sabouraud, R.A.E. y M.R.S., permiten establecer que en el MNT-02 el

crecimiento de microorganismo es menor al método tradicional debido a su

fermentación en medio líquido y alto porcentaje de alcohol.

4. Los resultados de los análisis fisicoquímicos realizados durante fermentación

establece que en el método no tradicional se obtuvo mayor porcentaje de alcohol

que confiere sabor y olor característicos; mientras que el menor porcentaje de

ácido acético le brinda sabor y olor agrio al grano.

5. De acuerdo a los resultados obtenidos del análisis bromatológico realizado en las

semillas de cacao acriollado sometidos a los dos tipos de fermentación, podemos

concluir que las sometidas al MNT-02 que tiene mayor porcentaje de grasa y

proteína que brindan mejores resultados organolépticos.

RECOMENDACIONES

1. Es importante continuar con los ensayos físicos, químicos, microbiológicos y

sensoriales de granos o materiales procedentes de otras unidades de producción y

de pequeños productores existentes.

2. Se debe continuar con los estudios a fin de explicar con mayores detalles lo que

acontece con éstos sistemas de fermentación de bajo costo y operativos en su uso

por parte de los productores de cacao.

3. La fermentación del cacao es un proceso complejo, ya que intervienen muchos

microorganismos que actúan de manera secuencial (unos después de otros) para

modificar el grano. Con lo cual se recomienda un estudio genético para determinar

el ADN de microrganismos que se generan en el proceso de fermentación en El

Salvador, ya que el crecimiento de éstos microrganismos nativos de la zona donde

se producen, pueden incidir y variar en la producción de un grano de mayor

calidad.

4. Las condiciones ambientales deben ser mayor de 28°C para generar una buena

fermentación y se recomienda para futuras investigaciones no elevar los sólidos

solubles a más de 25°Brix para no perjudicar el crecimiento de levaduras.

ANEXOS

Anexo 1: Ecuaciones para obtener los resultados de la pérdida o ganancia de peso (Pp) y

cambio de volumen (CV), en el MT-01 y MNT-2.

Pp= (Mpi)– (Mpf) X 100

( Mpi)

DONDE:

Mpi= Peso inicial de la muestra

Mpf= Peso final de la muestra

CV= Vi – Vf X 100

Vi

Donde:

Vi = Volumen inicial (cm3)

Vf = Volumen final (cm3)

Anexo 2: aplicación de las fórmulas en el tiempo de fermentación y después de secado

tanto como el MT-01 y el MNT-2.

Pérdida o ganancia de peso: ( )

( )

Cambio de volúmen:

Anexo 3: análisis bromatológicos

A) PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR MATERIA GRASA-MÉTODO SOXHLET

1.- OBJETIVO

Determinar la concentración de la materia grasa cruda o extracto etéreo libre.

2.- CAMPO DE APLICACIÓN

El método es aplicable en muestras de alimentos en general y en alimentos que no han

sido sometidos a tratamiento térmico. (Carnes, cereales, sopas, granos de semillas, etc.)

3.- FUNDAMENTO

Una cantidad previamente homogeneizada y seca, medida o pesada del alimento se

somete a una extracción con éter de petróleo o éter etílico, libre de peróxidos o mezcla de

ambos. Posteriormente, se realiza la extracción total de la materia grasa libre por soxhlet.

4.- REFERENCIAS

4.1.-Official Methods of Analysis A.O.A.C. 15th Edition, U.S.A.(1990)

5.- TERMINOLOGíA

N/A

6.- MATERIAL Y EQUIPO

6.1.- Sistema extractor Soxhlet

6.2.- Balanza analítica

6.3.- Papel filtro o dedal de celulosa

6.4.- Baño termorregulador

6.5.- Estufa de aire 103 + 2ºC

6.6.-Tamiz de malla de 1 mm

6.7.- Manto calefactor o rota vapor

6.8.- Material usual de laboratorio

7.- REACTIVOS

7.1.- Éter etílico P.E. 40-60ºC

7.3.- Éter de petróleo P.E. 40-60°C

8.- PROCEDIMIENTO

8.1.- Preparación de la muestra:

En muestras con mucha humedad homogeneizar y secar a 103+ °C en estufa de aire

considerando el tipo de muestra.

8.1.1.- Moler y pasar por tamiz de malla de 1 mm

8.1.2.- Pesar en duplicado 2 á 5 gramos de muestra preparada en el dedal de extracción o

papel filtro previamente pesado y tapado con algodón desgrasado. Registrar m

8.1.3.- Secar el matraz de extracción por 30 min a 103+ 2ºC.

8.1.4.- pesar el matraz de extracción registrar m1

8.1.5.- poner el matraz de extracción en el sistema soxhlet el dedal en el tubo de

extracción y adicionar el solvente al matraz.

8.1.6.- Extraer la muestra con el solvente por 6 á 8 horas a una velocidad de condensación

de 3-6 gotas/seg.

8.1.7.- Una vez terminada la extracción eliminar el solvente por evaporación en Rota

vapor o baño María bajo campana. Hasta que no se detecte olor a éter.

8.1.8.-Secar el matraz con la grasa en estufa a 103+ 2°C por 10 min, enfriar en desecados y

pesar. Registrar m2.

9.- CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS

m2 –m1

% grasa cruda = ----------------- x100

M

Donde: m peso de la muestra

m1 tara del matraz sólo

m2 peso matraz con grasa.

100

% grasa cruda en base seca = %grasa cruda x ------------------------

100 -% humedad

Donde: m peso de la muestra

m1 tara del matraz solo

m2 peso matraz con grasa.

Los resultados se informan en % de materia grasa en base seca o húmeda.

Promediar los valores obtenidos y expresar el resultado con 2 decimales.

Repetibilidad: La diferencia de los 2 resultados no debe ser superior al 2 % del promedio.

B) PROCEDIMIENTO PARA DETERMINACIÓN DE PROTEINAS-MÉTODO KJELDAHL

1.- OBJETIVO

Determinar la concentración de nitrógeno presente en la muestra para luego ser

transformado a través de un factor en proteína.

2.- ALCANCE Y CAMPO DE APLICACIÓN

El método es aplicable a alimentos en general.

3.-FUNDAMENTO

El método se basa en la destrucción de la materia orgánica con ácido sulfúrico

concentrado, formándose sulfato de amonio que en exceso de hidróxido de sodio libera

amoníaco, el que se destila recibiéndolo en:

a) Ácido sulfúrico donde se forma sulfato de amonio y el exceso de ácido es valorado

con hidróxido de sodio en presencia de rojo de metilo, o

b) Ácido bórico formándose borato de amonio el que se valora con ácido clorhídrico.

4.- REFERENCIAS

4.1. - A.O.A.C. Official Methods of Analysis 13th Edition, 1984.

4.2. - FAO Food and Nutrition Paper 14/7 Roma, 1986

5. - MATERIAL Y EQUIPO

5.1.- Balanza analítica, sensibilidad 0.1 mg.

5.2.- Equipo Kjeldahl

5.3.- Manto calefactor

5.4.- pH-metro

5.5.- Material usual de laboratorio.

6.- REACTIVOS

6.1.- Ácido sulfúrico concentrado, p.a.

6.2.- Sulfato de potasio o sulfato de sodio, p.a.

6.3.- Sulfato cúprico, p.a.

6.4.- Solución de hidróxido de sodio al 15 %. Disolver 150 g de NaOH y completar a 1 litro.

6.5.- Solución de ácido sulfúrico 0.1 N. Tomar 2.7 ml de H2SO4 concentrado y completar a

1 litro, luego estandarizar con Na2CO3 anhidro p.a.

6.6.- Solución de hidróxido de sodio al 30 %. Disolver 300 g de NaOH y completar a 1 litro.

6.7.- Solución indicadora de rojo de metilo al 1 % en etanol. Disolver 1 g de rojo de metilo

en 100 ml de etanol (95 %).

6.8.- Solución de hidróxido de sodio 0.1 N. Tomar 4 g de NaOH y enrasar a 1 litro con agua

recientemente hervida y enfriada. Valorar con ácido succínico.

6.9.- Ácido bórico al 3 %. Disolver 30 g. de ácido bórico y completar a 1 litro.

6.10.- Indicador de Tashiro: rojo de metilo al 0.1 % y azul de metileno al 0.1 % en relación

de 2:1, en alcohol etílico.

6.11.- Solución de ácido clorhídrico 0.1 N. Tomar 8.3 ml de HCl concentrado. Y enrasar a 1

litro. Valorar con Na2CO3 anhidro.

7.- PROCEDIMIENTO

7.1.- Realizar la muestra en duplicado.

7.2.- Efectuar un ensayo en blanco usando una sustancia orgánica sin nitrógeno (sacarosa)

que sea capaz de provocar la reducción de los derivados nítricos y nitrosos

eventualmente presentes en los reactivos.

7.3.- Pesar al 0.1 mg. alrededor de 1 g de muestra homogeneizada (m) en un matraz de

digestión Kjeldahl.

7.4.- Agregar 3 perlas de vidrio, 10 g de sulfato de potasio o sulfato de sodio, 0.5 g de

sulfato cúprico y 20 ml de ácido sulfúrico concentrado.

7.5.- Conectar el matraz a la trampa de absorción que contiene 250 ml de hidróxido de

sodio al 15 %. El disco poroso produce la división de los humos en finas burbujas con el fin

de facilitar la absorción y para que tenga una duración prolongada debe ser limpiado con

regularidad antes del uso. Los depósitos de sulfito sódico se eliminan con ácido

clorhídrico. Cuando la solución de hidróxido de sodio al 15 % adicionada de fenolftaleína

contenida en la trampa de absorción permanece incolora debe ser cambiada (aprox. 3

análisis).

7.6.- Calentar en manta calefactora y una vez que la solución esté transparente, dejar en

ebullición 15 a 20 min. Más, si la muestra tiende a formar espuma agregar ácido esteárico

o gotas de silicona antiespumante y comenzar el calentamiento lentamente.

7.7.- Enfriar y agregar 200 ml de agua.

7.8.- Conectar el matraz al aparato de destilación, agregar lentamente 100 ml de NaOH al

30 o por el embudo, y cerrar la llave.

7.9.- Destilar no menos de 150 ml en un matraz que lleve sumergido el extremo del

refrigerante o tubo colector en:

a) 50 ml de una solución de ácido sulfúrico 0.1 N, 4 á 5 gotas de rojo de metilo y 50 ml de

agua destilada. Asegurar un exceso de H2SO4 para que se pueda realizar la

retro titulación. Titular el exceso de ácido con NaOH 0.1 N hasta color amarillo o

b) 50 ml de ácido bórico al 3 %. Titular con ácido clorhídrico 0.1 N hasta pH 4.6

mediante un medidor de pH calibrado con soluciones tampón pH 4 y pH 7, o en presencia

del indicador de Tashiro hasta pH 4.6.

Cada cierto tiempo es necesario verificar la hermeticidad del equipo de destilación usando

10 ml de una solución de sulfato de amonio 0.1 N (6.6077 g/l), 100 ml de agua destilada

y 1 a 2 gotas de hidróxido de sodio al 30 % para liberar el amoníaco, así como también

verificar la recuperación destruyendo la materia orgánica de 0.25 g de l (-)-Tirosina. El

contenido teórico en nitrógeno de éste producto es de 7.73 %. Debe recuperarse un 99.7

%.

7.-CALCULO Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS

7.1.- % N = 14 x N x V x 100

m x 1000

7.2.- % Proteína = 14 x N x V x 100 x factor

m x 1000

Donde:

V: 50 ml H2SO4 0.1 N - gasto NaOH 0.1 N o gasto de HCl 0.1 N

m: masa de la muestra, en gramos

Factor: 6.25: para carne, pescado, huevo, leguminosas y proteínas en general

5.7: para cereales y derivados de soya

6.38: leche

5.55: gelatina

5.95: arroz

Repetibilidad del método: La diferencia entre los resultados de dos determinaciones

efectuadas una después de otra, por el mismo analista, no debe exceder 0.06 % de

Nitrógeno o 0.38 % de proteína.

En la planilla de resultados se indicará método utilizado, identificación de la muestra, peso

de muestra, gastos de titulación, factor utilizado y resultados obtenidos de la muestras en

duplicado con 2 decimales.

C) PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR FIBRA CRUDA, HUMEDAD, CENIZA-

MÉTODO GRAVIMÉTRICO

1.0. OBJETIVO

Determinar fibra cruda en diversos tipos de alimentos.

2.0. CAMPO DE APLICACIÓN

El método es aplicable a granos, platos preparados, harinas, alimentos para

animales, materiales que contienen fibra de los cuales la grasa ha sido extraída

para dejar un residuo adecuado.

3.0. FUNDAMENTO

Fibra cruda es la pérdida de masa que corresponde a la incineración del

residuo orgánico que queda después de la digestión con soluciones de ácido

sulfúrico e hidróxido de sodio en condiciones específicas.

4.0. REFERENCIAS

4.1.- Official Methods of Analysis. A.O.A.C. 15 the Edition. U.S.A. (1990).

4.2.- Manuals of food quality control. FAO Food Nutrition Paper 14/7. Roma (1986).

5.0. TERMINOLOGÍA

5.1. N.A.

6.0. MATERIALES, INSUMOS Y EQUÍPOS

6.1. Materiales y Equípos

6.1.1. Aparato de calentamiento a reflujo.

6.1.2. Balanza analítica, sensibilidad 0,1 mg.

6.1.3. Crisoles de porcelana o de sílica.

6.1.4. Desecador con deshidratante adecuado (silicagel con indicador u otro).

6.1.5. Dispositivo de succión al vacío.

6.1.6. Embudo Büchner de polipropileno tipo California u otra alternativa

equivalente.

6.1.7. Estufa a 103 ± 2 °C.

6.1.8. Tamiz de malla 1 mm.

6.1.9. Placa calefactora capaz de llevar 200 ml de agua a 25 °C. Hasta ebullición en

15 + 2 min.

6.1.10. Material usual de laboratorio.

6.2. Reactivos

6.2.1. Solución de ácido sulfúrico 0.255 N (1.25 g de H2SO4 / 100 ml). La

concentración debe ser chequeada por titulación.

6.2.2. Solución de hidróxido de sodio 0.313 N (1,25 g de NaOH / 100 ml de agua

libre de Na2CO3). La concentración debe ser chequeada por titulación.

6.2.3. Fibra cerámica: Cerafiber, 8 lb/cu ft. Colocar 60 g en un recipiente, agregar

800 ml de agua y mezclar por un minuto a baja velocidad. Determinar el blanco

tratando aproximadamente 2g (peso seco) de la fibra cerámica preparada con

ácido y álcalis como en la determinación (6.2) Corregir los resultados de fibra cruda

por el blanco, el cual debe ser insignificante (aproximadamente 2 mg).

6.2.4. Silicona Antiespumante.

6.2.5. Etanol al 95%.

6.2.6. Éter de petróleo, P.E. 40 – 60 °C.

7.0. DESARROLLO DEL PROCESO

7.1. Preparación de la muestra

7.1.1. Homogeneizar, secar 103 + 2 °C en estufa de aire o a 70 °C al vacío, de

acuerdo a las técnicas indicadas en la referencia, considerando el tipo de muestra.

Moler la muestra.

7.1.2. Pasar por un tamiz de malla de 1 mm.

7.1.3. Extraer con éter de petróleo sí el contenido de grasa es superior al 1.

7.2.- Determinación

7.2.1. Realizar el análisis en duplicado.

7.2.2. Pesar a 0.1 mg alrededor de 2 g de muestra preparada y transferir en al

matraz de aparato de calentamiento a reflujo. Registrar s

7.2.3. Agregar 1.5 a 2.0 g de fibra cerámica preparada.

7.2.4. Agregar 200 ml de H2SO4 0.255 N, hirviente, gotas de antiespumante y perlas

de vidrio.

7.2.5. Conectar el aparato de calentamiento a reflujo y hervir exactamente durante

30 minutos, rotando el matraz periódicamente.

7.2.6. Desmontar el equipo y filtrar a través del embudo Büchner tipo California o

sus alternativas.

7.2.7. Lavar con 50 a 75 ml de agua hirviente, repetir el lavado con 3 porciones de

50 ml de agua o hasta que cese la reacción ácida.

7.2.8. Retornar el residuo al aparato de calentamiento a reflujo y hervir

exactamente durante 30 minutos, rotando el matraz periódicamente.

7.2.9. Lavar con 25 ml de H2SO4 0.255 N, hirviente, con 3 porciones de 50 ml de

agua hirviente y con 25 ml de etanol al 95%.

7.2.10. Remover el residuo y transferir al crisol.

7.3.10. Secar en estufa a 130 + 2 °C por 2 horas, enfriar en desecador y pesar.

7.3.11. Incinerar 30 minutos a 600 + 15 °C, enfriar en desecador y pesar.

7.3.12. Determinar un blanco en las mismas condiciones que la muestra.

8.0 EXPRESIÓN DE RESULTADOS

% Fibra cruda en muestra molida = C = (Pérdida de peso en la incineración –

pérdida de peso del blanco de fibra cerámica) x 100/ peso de la muestra.

%Fibra cruda (base húmeda) = C x 100 - % Humedad muestra original.

100

Promediar los valores obtenidos y expresar el resultado con dos decimales.

Repetibilidad: La diferencia de los resultados no deberá ser superior al 5 % del

promedio.

Informar el % de fibra al 0,1 %, sobre la base de la muestra original considerando

que ha sido desgrasada en el caso de contener más de 1 % de grasa.

ANEXO 4: Resultados de los análisis bromatológicos

GLOSARIO

Ácido acético: se puede encontrar en forma de ion acetato. Éste es un ácido que se

encuentra en el vinagre, siendo el principal responsable de su sabor y olor agrios.

Alcohol: Líquido transparente, incoloro, de olor penetrante e inflamable que se

obtiene mediante la destilación del vino y otras sustancias fermentadas y se usa

como componente de bebidas y en industria.

Aerobisis: Se denominan aeróbios o aeróbicos a los organismos que necesitan del

oxígeno diatómico para vivir o poder desarrollarse.

Anaérobiosis: Se aplica al organismo que vive y se desarrolla en ausencia del

oxígeno, Proceso que se desarrolla con ausencia total de oxígeno, como la

fermentación.

Astringente: es cualquiera de las substancias que con su aplicación externa local

(tópica), retraen los tejidos y pueden producir una acción cicatrizante,

antinflamatoria y antihemorrágica. Entre los astringentes usuales, con efectos de

muy diverso grado, están el alumbre, los taninos, la quina, el nitrato de plata,

acetato de plomo, sulfato de cinc, sales de bismuto y el suero salino. Las lociones

para después de afeitarse contienen astringentes.

Bromatología: es la ciencia que estudia los alimentos en cuanto a su producción,

manipulación, conservación, elaboración y distribución, así como su relación con la

sanidad

Cotiledones: En botánica, los cotiledones son las hojas primordiales constitutivas

de la semilla y se encuentran en el germen o embrión.

Ecotipos: es una subpoblación genéticamente diferenciada que está restringida a

un hábitat específico, un ambiente particular o un ecosistema definido, con unos

límites de tolerancia a los factores ambientales.

Edafoclimático: Perteneciente en cuanto a las condiciones de suelo y clima.

Término general empleado para las plantas que son fácilmente adaptables a

diferentes tipos de suelo y clima.

Fermentación: Proceso de transformación de un sustrato orgánico producido por

enzimas de bacterias, levaduras u hongos en el cual se pueden liberar gases o no.

La transformación se realiza mediante reacciones de oxidación-reducción

catalizadas por enzimas a través de las cuales muchos microrganismos pueden

obtener energía y, como productos residuales, alcoholes y ácidos orgánicos.

Genotipos: Conjunto de los genes que existen en cada núcleo celular de los

individuos pertenecientes a una determinada especie animal o vegetal.

Inoculación: es la acción de introducir un organismo vivo menor a uno mayor con

el fin de producir la enfermedad que es capaz de generar.

Mucílago: es una sustancia vegetal viscosa, coagulable al alcohol. También es una

solución acuosa espesa de una goma o dextrina utilizada para suspender sustancias

insolubles y para aumentar la viscosidad. son análogos, por su composición y sus

propiedades, a las gomas, dan con el agua disoluciones viscosas o se hinchan en

ellas para formar una pseudodisolución gelatinosa.

pH-metro: Instrumento utilizado en los laboratorios químicos y bioquímicos para

medir el pH de las disoluciones. Consiste en un mini voltímetro con la escala

graduada en unidades de pH, que mide la diferencia de potencial existente entre

dos electrodos, uno de ellos de referencia.

Pedúnculo: se llama pedúnculo, 1 pedículo2 o pedicelo3 (si bien éste último

término se aplica más a setas), a la ramita o rabillo que sostiene una inflorescencia

o un fruto tras su fecundación. Posee la estructura de un tallo y es responsable de

la sustentación y conducción de savia a las flores. Se conecta con el raquis de la

inflorescencia en la base y es el cáliz del ápice. Raramente presenta ramificaciones

o estructuras de origen foliar. En su ausencia, las flores son sésiles. Una compresión

o cambios en la consistencia del pedicelo pueden influir en las características

reproductivas de las flores.

Sólidos solubles totales: nos ayudan a determinar la concentración de sacarosa por

100 mililitros de una solución, los sólidos solubles totales se determinan con el

índice de refracción, el cual se expresaron los grados °Brix

FUENTES CONSULTADAS

Ramírez-Lepe, Mario; Romero-Cortés, Teresa; Robles-Olvera, Víctor José. Fermentación

del Cacao: Microrganismos Esenciales para el Desarrollo del Aroma y Sabor del Chocolate

Castañeda, Vianney; Bonilla, Guillermo; Pérez, Juan Manuel; Manual de Aplicación de

Descriptores Agromorfológicos para la Identificación y Registros Cultivares Salvadoreños

de Theobroma cacao. Antiguo Cuscatlán, El Salvador 2011.

Enríquez, Gustavo A. Curso sobre el Cultivo del Cacao. (1985) CATIE, San José Costa Rica,

240pp.

Prust, C., Hoffmeister, M., Liesegang, H., Wiezer, A., Fricke, W. F., Ehrenreich, A.,

Gottschalk, G. and Deppenmeier, U. (2005) Secuencia Completa del Genoma de la Bacteria

de Ácido Acético Gluconobacter oxydans. Nature Biotechnology. 23: 195-200 (Abstract).

Larone, D.H. 1995. Los hongos de importancia médica, una guía para la identificación –

Agar Dextrosa Sabouraud. 3 ª ed. American Society for Microbiology, Washington DC.

Speck (Ed.). 1984. Compendio de métodos para el análisis microbiológico de los alimentos

– Agar Método Estándar. 2 ª Ed APHA. Washingtong, D.C.

Microrganismos y Chocolate - María del Carmen Wacher Rodarte – [En Línea; consultado

el 15 de junio de 2012] - http://goo.gl/FDlKR

Fermentación del Cacao; Aspectos Generales – Smilija Lambert – [En Linea; consultado el

25 de abril de 2012] - http://goo.gl/5S2Ed

Determinación del Nivel de Fermentación y de las Cantidades de Flavan-3OLS en el Cacao

Seco Comercial mediante Espectrometría de Infrarrojo Cercano - F. Davrieux, R.

Boulanger, S. Assemat, E. Portillo, E. Cros – [En Línea; Consultado el 27 de abril de 2012] -

http://goo.gl/ZqAo0

Clasificación Clásica de las Levaduras según Stelling-Dekker y Guilliermond – José María

Xandri Tagueña – [En Línea: Consultado el 15 de abril de 2012] - http://goo.gl/tRrs3

Gluconobacter oxydans: sus Aplicaciones Biotecnológicas - Gupta A, Singh VK, Qazi GN,

Kumar A. – [En Línea: Consultado el 16 de abril de 2012] - http://goo.gl/8wgpC

M.R.S. Agar – (Anónimo) [En Línea: Consultado el 1 de abril de 2012] - http://goo.gl/4LPoz

El Chocolate: un Arsenal de Sustancias Químicas – Munguía, Agustín – [En Linea:

Consultado el 14 de julio de 2012] - http://goo.gl/AqY9v