UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA · 2019-09-20 · tese de doutorado rodrigo carvalho de oliveira...

TESE DE DOUTORADO

RODRIGO CARVALHO DE OLIVEIRA

IMUNOPATOGENIA DO LÚPUS ERITEMATOSO SISTÊMICO NA BAHIA: ENVOLVIMENTO DE

AUTOANTICORPOS E PROLACTINA

SALVADOR 2015

UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA

RODRIGO CARVALHO DE OLIVEIRA

IMUNOPATOGENIA DO LÚPUS ERITEMATOSO SISTÊMICO NA BAHIA: ENVOLVIMENTO DE

AUTOANTICORPOS E PROLACTINA

Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Imunologia, da Universidade Federal da Bahia como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Imunologia. Orientador: Prof. Dr. Ajax Mercês Atta

SALVADOR 2015

Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca Universitária de Saúde, SIBI - UFBA.

A474 Oliveira, Rodrigo Carvalho de

Imunopatogenia do Lúpus Eritematoso Sistêmico na Bahia: envolvimento de autoanticorpos e prolactina. / Rodrigo Carvalho de Oliveira. – Salvador, 2015.

77 f. : il. Orientador: Prof. Dr. Ajax Mercês Atta.

Tese (Doutorado) – Instituto de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Imunologia, 2015.

1. Lúpus eritematoso sistêmico. 2. Anticorpo anti-dsDNA de alta avidez. 3. Artropatia de Jaccoud. 4. IL-6. 5. Hiperprolactinemia. 6. Autoanticorpo anti-RNP-70. I. Atta, Ajax Mercês. II. Universidade Federal da Bahia. III. Título.

CDU: 796

Dedico este trabalho a todos os portadores de lúpus eritematoso sistêmico, em especial àqueles que participaram desta pesquisa, contribuindo de forma voluntária para um maior entendimento desta doença.

APOIO FINANCEIRO

Trabalho experimental desenvolvido com apoio financeiro do CNPq (Auxílio 306.097/2010-9). Durante a realização do Doutorado em Imunologia o autor foi bolsista da FAPESB.

AGRADECIMENTOS

A Deus e a todos os Espíritos de Luz que me acompanharam nessa jornada, permitindo que concluísse esse trabalho com saúde e sabedoria;

Ao Prof. Dr. Ajax Mercês Atta, pela brilhante orientação, pela amizade, pela disponibilidade, estando presente em todos os momentos desta pesquisa;

À Profa. Dra. Maria Luiza Atta , pelos ensinamentos, pela presença constante em toda a pesquisa;

Ao Prof. Dr. Mittermayer Santiago, pela colaboração oferecida neste trabalho;

Ao meu pai, Wagner Ribeiro d’ Oliveira , e a minha mãe, Maria das Graças Carvalho de Oliveira , pelo esforço e dedicação na minha formação educacional;

Ao meu irmão, Wagner Ribeiro d’Oliveira Júnior , pelo exemplo de homem e de profissional que sempre foi;

A toda minha família que me estimulou em momentos difíceis da minha vida, que me apoiou em minhas decisões e que esteve sempre presente em minhas conquistas torcendo e acreditando em minhas vitórias;

À Sara Arêas Costa, pelo apoio e compreensão nos momentos finais desse trabalho e por fazer parte da minha vida;

Às colegas de Doutorado e amigas do Laboratório LAPIM/DILDA, Isabela Oliveira, Mariana Pereira, Milena Cabral, Taciana SantÁnna, com as quais divido o resultado desse trabalho, pela imensa e incondicional ajuda, uma grande família sem dúvida;

À grande profissional e amiga Atailza Pereira da Silva, que sem a sua disposição, habilidade e amizade, eu não teria conseguido;

A todos os estudantes de Mestrado, que integram a “Grande Família LAPIM” , pelo apoio e pela companhia em todos esses anos;

Ao PPGIm, representado pelos professores e funcionários, fundamentais na nossa formação;

À FAPESB e ao CNPq, pelo apoio financeiro;

“A doença é uma espécie de escoadouro de nossas imperfeições;

inconscientemente, o espírito quer jogar para fora o que lhe seja

estranho ao próprio psiquismo...”

Chico Xavier

OLIVEIRA, Rodrigo Carvalho De. Imunopatogenia do lúpus eritematoso sistêmico na Bahia: envolvimento de autoanticorpos e prolactina. 77 f. 2015. Tese (Doutorado) – Instituto de Ciências da Saúde, Universidade Federal da Bahia.

RESUMO

Introdução: O lúpus eritematoso sistêmico (LES) é uma doença reumática autoimune que pode acometer uma em cada 1.700 mulheres brasileiras. Trata-se de doença cuja etiologia se fundamenta na associação da predisposição genética dos pacientes com fatores ambientais e hormonais, perda da tolerância imunológica e propagação da autorreatividade inata e adaptativa, resultando em manifestações clínicas complexas e multivariadas. Diversos aspectos associados com a atividade do LES, especialmente a doença renal presente em importante proporção dos pacientes, têm sido objeto de intensa investigação. Entre estes, a participação de autoanticorpos e a contribuição de componentes bioativos como citocinas e hormônios na nefrite lúpica ocupam posição de destaque. Objetivo: No presente estudo foi investigada a participação dos anticorpos anti-dsDNA totais e de alta avidez, antinucleossomo (ANuA) e hiperprolactinemia na atividade do LES e nas suas manifestações clínicas com destaque para Artropatia de Jaccoud, usando como população alvo mulheres lúpicas residentes na Bahia. Material e Métodos: Cento e quarenta e duas mulheres portadoras de LES foram investigadas para a prevalência e níveis de anticorpos anti-dsDNA totais, anticorpos anti-dsDNA de alta avidez e ANuA, além de hiperprolactinemia. Adicionalmente, foram testadas as correlações dos níveis destes componentes com a atividade da doença e suas associações com as manifestações clínicas mais prevalentes nestas pacientes. Autoanticorpos antinucleares foram determinados por testes de imunofluorescência indireta e ELISA. Níveis séricos de prolactina e citocinas foram determinados por imunoensaios de captura de antígeno, enquanto os níveis de C3 e C4 foram determinados por imunonefelometria. Os níveis de creatinina e proteinúria foram medidos por métodos colorimétricos e a atividade lúpica avaliada com o protocolo SLEDAI-2K. Testes de estatística univariada foram usados nas análises dos resultados. Resultados: Os níveis de anticorpos anti-dsDNA de alta avidez e de anti-dsDNA totais se correlacionaram diretamente com os níveis de anticorpos antinucleossomo, sendo esta correlação mais forte com os primeiros. Correlações significativas entre os níveis de C3, C4, VHS, proteinúria e SLEDAI foram observadas com os níveis de anticorpos anti-dsDNA de alta avidez e, exceto proteinúria, com os níveis de ANuA. Os níveis de anticorpos anti-dsDNA totais se correlacionaram apenas com os níveis de C3 e SLEDAI, porém de forma menos significativa que os anticorpos anti-dsDNA de alta avidez e ANuA. Pacientes com artropatia de Jaccoud apresentaram níveis mais altos de anticorpos anti-dsDNA totais e IL-6. Hiperprolactinemia leve a moderada foi encontrada em 19,7% das pacientes, observando-se níveis séricos de prolactina mais altos nas pacientes com comprometimento renal, além de existir correlação entre os níveis séricos deste hormônio com os níveis de creatinina sérica e proteinúria. Adicionalmente, existiu uma aparente supressão da produção de anticorpos anti-RNP-70 em pacientes lúpicas hiperprolactinêmicas com fenômeno de Raynaud. Conclusões: Anticorpos anti-dsDNA constituem-se em importantes biomarcadores de doença ativa em pacientes portadoras de LES residentes na Bahia, podendo complementar o diagnóstico da artropatia de Jaccoud nestas pacientes, além de sugerir a presença de comprometimento renal quando são de alta avidez e detectados conjuntamente com proteinúria e baixos níveis de C3. Por outro lado, a presença de uma hiperprolactinemia leve a moderada pode ser verificada nestas mulheres, cujo envolvimento na doença renal lúpica foi demonstrado neste estudo, além de inibir a produção de anticorpos anti-RNP-70. Palavras-Chaves: Lúpus eritematoso sistêmico; Anticorpo anti-dsDNA de alta avidez; Artropatia

de Jaccoud; IL-6; Hiperprolactinemia; Autoanticorpo anti-RNP-70.

OLIVEIRA, Rodrigo Carvalho De Immunopathogenesis of systemic lupus erythematosus in Bahia: Involvement of autoantibodies and prolactin. 77 f. 2015. Thesis (Ph.D.) - Institute of Health Sciences, Federal University of Bahia.

ABSTRACT Introduction: Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune rheumatic disease that affect one in 1,700 Brazilian women. This disease is associated with a genetic predisposition of the patients and has the contribution of hormonal and environmental factors. Lupus' patients have a loss of immune tolerance, resulting in uncontrolled autoimmune reactivity and complex and multivariate clinical manifestations. Various aspects associated with the activity of SLE, especially kidney disease, have been the subject of intense investigation. Among these, the participation of autoantibodies and the contribution of bioactive components such as cytokines and hormones occupy a prominent position in these studies. Objective: The present study investigated in SLE women who lived in Bahia (Brazil), the participation of total and high avidity dsDNA, antinucleosome antibodies (ANuA) and hyperprolactinemia in the activity of this disease and its clinical manifestations, especially arthropathy of Jaccoud. Material and Methods: One hundred and forty-two women with SLE were investigated for the presence of hyperprolactinemia and prevalence and levels of total and high avidity anti-dsDNA antibodies and ANuA. Correlations among these components with biomarkers of lupus activity and their associations with the most prevalent clinical manifestations in the patients were also tested. Indirect fluorescent antibody test and ELISA determined antinuclear autoantibodies. Capture immunoassays measured prolactin and cytokine levels while C3 and C4 levels were determined by immunonephelometric tests. Creatinine levels and proteinuria were measured by colorimetric methods and lupus activity assessed with the SLEDAI-2K protocol. Descriptive statistical tests were used in the analyses of the results. Results: The levels of both high avidity and total anti-ds DNA antibodies correlated directly with the levels of antinucleosome antibodies, but this correlation was stronger with dsDNA antibodies of high avidity. Significant correlations among the levels of C3, C4, ESR, proteinuria and SLEDAI were observed with the levels of anti-dsDNA antibodies of high avidity and, except proteinuria, with ANuA levels. The levels of total anti-dsDNA antibodies correlated only with levels of C3 and SLEDAI, but these correlations were lesser than those of high avidity dsDNA antibodies and ANuA. Patients with Jaccoud arthropathy presented higher levels of dsDNA antibodies and IL-6, whereas mild to moderate hyperprolactinemia was found in 19.7% of the lupus patients. Higher serum levels of prolactin were demonstrated in patients with kidney disease, as well as there was a correlation between the levels of this hormone with their serum levels of creatinine and urine protein. In addition, hyperprolactinemia seems to inhibit the production of anti-RNP-70 autoantibodies. CONCLUSIONS: Antibodies to dsDNA are important biomarkers of active disease in SLE patients from Bahia and the increase in dsDNA antibody levels can complement the diagnosis of Jaccoud’s arthropathy. In addition, high avidity dsDNA autoantibodies are a good laboratory evidence of renal impairment in lupus patients when they are detected together with proteinuria and low levels of C3. On the other hand, the presence of a mild to moderate hyperprolactinaemia can be seen in lupus women whose involvement in lupus kidney disease and inhibition of the production of RNP-70 autoantibodies was demonstrated in this study.

Keywords: Systemic lupus erythematosus; High avidity dsDNA antibody; Jaccoud’s arthropathy; IL-6; hyperprolactinemia; RNP-70 antiboy

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

CAPÍTULO 1 - High Avidity dsDNA Autoantibodies in B razilian Women with Systemic Lupus Erythematosus: Correlation with Active Disease and Renal Dysfunction.

Figura 1. Serum levels of C3 in SLE patients without proteinúria (UP negative, P/C ratio ≤ 0.23) and presenting urine protein (UP positive, P/C ratio > 0.23) ……

39

Figura 2. Levels of total dsDNA antibodies, HA dsDNA antibodies, and ANuA in SLE Brazilian women without and with proteinuria (P/C ratio ≤ 0.23 and >0.23, resp.).The medians are represented by horizontal lines and were compared with the � test of Mann-Whitney……………………………………

40

CAPÍTULO 3 - Hiperprolactinemia em mulheres brasileiras com lúpus eritematoso sistêmico: envolvimento na disfunção renal e supressão da produção de auto-anticorpos RNP70. Figura 1. Níveis de prolactina sérica em mulheres controles e em mulheres com LES de acordo com a ausência (GC1 e LES 1) ou presença de menopausa (GC2 e LES2).......................................................................................................................

60

Figura 2. Níveis aumentados de prolactina em mulheres controles (GC, n = 16; mediana = 44,7 ng/mL; IQR = 33,7 – 70,5 ng/mL) e em mulheres portadoras de LES (LES, n = 28; mediana = 33,4 ng/mL, IQR = 27,2 – 38,0 ng/mL)..................

60 Figura 3. Níveis de prolactina em mulheres lúpicas com e sem doença renal (DR positiva e DR negativa, respectivamente)................................................................

63 Figura 4. Níveis de autoanticorpos anti-RNP70 em pacientes lúpicas com níveis normais de prolactina (NPRL) e com hiperprolactinemia (HPRL)...................................

63

Figura 5. Níveis de autoanticorpos anti-RNP70 em pacientes lúpicas sem história clínica de fenômeno de Raynaud e com relato desta manifestação clínica (Raynaud negativo e Raynaud positivo, respectivamente).......................................

64 Figura 6. Níveis medianos de autoanticorpos anti-RNP70 em pacientes lúpicas com fenômeno de Raynaud, apresentando níveis de prolactina normais (NPRL, 237 U/mL) e com hiperprolactinemia (HPRL, 93,0 U/Ml).....................................

64

LISTA DE TABELAS

REVISÃO DE LITERATURA

Tabela 01 - Critérios do American College of Rheumatology (ACR) entre grupos do estudo LUMINA (Lupus in Minorities: Nature vs Nurture)................ 18 CAPÍTULO 1 - High Avidity dsDNA Autoantibodies in B razilian Women with Systemic Lupus Erythematosus: Correlation with Active Disease and Renal Dysfunction. Tabela 01- Immunological findings in Brazilian SLE women…………………. 38 Tabela 02 - Correlation of total dsDNA antibodies, HA dsDNA antibodies, and ANuA with clinical and laboratory findings in SLE patients……………………………………

39

CAPÍTULO 2 - Higher level of IL ‑‑‑‑6 in Jaccoud’s arthropathy secondary to systemic lupus erythematosus: a perspective for its treatment? Tabela 01 – Demographic and laboratory findings in systemic lupus erythematosus (SLE) patients with and without Jaccoud’s arthropathy (JA)…………………………

45

Tabela 02 – Serum cytokine levels in systemic lupus erythematosus (SLE) patients with and without Jaccoud’s arthropathy………………………………………………………...

46

CAPÍTULO 3 - Hiperprolactinemia em mulheres brasileiras com lúpus eritematoso sistêmico: envolvimento na disfunção renal e supressão da produção de auto-anticorpos RNP70 Tabela 1 - Prevalência de manifestações clínicas e escores da atividade lúpica (SLEDAI) em mulheres brasileiras com níveis normais de prolactina (NPRL) e hiperprolactinêmicas (HPRL)............................................................................................

61

Tabela 2 - Perfil de autoanticorpos em mulheres lúpicas brasileiras apresentando níveis normais de prolactina (NPRL) e hiperprolactinemia (HPRL)................................

62

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AJ Artropatia de Jaccoud

ANA Anticorpo antinúcleo

Anti-SSA/Ro Anticorpos contra o antigeno Ro

Anti-SSB/La Anticorpos contra o antígeno La

ANuA Anticorpo antinucleossomo

ARC Colégio Americano de Reumatologia

BAFF/ BLyS Fator Estimulador de Linfócitos B

BILAG British Isles Lupus Assessment Group

CD Cluster of Differentiation

DC Célula Dendrítica

DR Doença Renal

dsDNA Ácido Desoxirribonucléico de fita dupla

ECLAM European Consensus Lupus Activity Measurement

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

FARR Radioimunoensaio para anticorpos anti-dsDNA

FDA Food and Drug Administration

GC Grupo controle

HEp-2 Human Epidermoid carcinoma strain #2

HPRL Hiperprolactinemia

IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística

IC Intervalo de Confiança

IFI Imunofluorescência Indireta

IgA Imunoglobulina A

IgE Imunoglobulina E

IgG Imunoglobulina G

IgM Imunoglobulina M

IL Interleucina

IQR Intervalo Interquartil

KDa Kilodalton

LES Lúpus Eritematoso Sistêmico

mL Mililítros

NPRL Níveis normais de prolactina

PRL Prolactina

RIA Rádioimunoensaio

Rib-P Ribossomal P

RNP Ribonucleoproteína

RP/C Relação Proteinúria/Creatinina

SAF Síndrome Antifosfolípide

SBR Sociedade Brasileira de Reumatologia

SELENA Safety of Estrogens in Lupus Erythematosus: National

Assessment

SLAM Systemic Lupus Activity Measure

SLEDAI Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index

SLICC Systemic Lupus International Collaborating Clinics

Sm Smith

Th2 T helper 2

TNF Fator de Necrose Tumoral

U UNIDADES

UI Unidades Internacionais

UV Ultra Violeta

VHS Velocidade de Hemossedimentação

β2GPI β2 Glicoproteina I

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO GERAL .................................................................................................... 15

2 REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................................... 17 2.1 EPIDEMIOLOGIA DO LES .......................................................................................... 17

2.2 MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS DO LES ..................................................................... 18

2.3 PATOGENIA ................................................................................................................. 20

2.4 AUTOANTICORPOS .................................................................................................... 22

2.4.1 Anticorpo Anti-dsDNA ............................................................................................. 23

2.4.2 Anticorpo antinucleossomo (ANuA) ........................................................................ 26

2.5 DIAGNÓSTICO DO LES .............................................................................................. 27

2.6 ATIVIDADE DA DOENÇA .......................................................................................... 28

2.6.1 Marcadores de Atividade da Doença ....................................................................... 28

2.6.2 Índice de Atividade de Doença – SLEDAI .............................................................. 29

3 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 31

3.1 OBJETIVO GERAL ....................................................................................................... 31

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................................... 31

CAPÍTULO 1 Research Article High Avidity dsDNA Autoantibodies in Brazilian Women with Systemic Lupus Erythematosus: Correlation with Active Disease and Renal Dysfunction ............................................................................................................................. 32

CAPÍTULO 2 Original Article - Higher level of IL-6 in Jaccoud’ s arthropathy secondary to systemic lupus erythematosus: a perspective for its treatment? ........................................ 43

CAPÍTULO 3 Artigo - Hiperprolactinemia em mulheres brasileiras com lúpus eritematoso sistêmico: envolvimento na disfunção renal e supressão da produção de autoanticorpos anti-RNP-70. ................................................................................................. 49

4 CONCLUSÕES GERAIS ................................................................................................... 65

REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 66

ANEXO - COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA PROF. CELSO FI GUEIRÔA HOSPITAL SANTAN IZABEL ......................................................................... 77

15

1 INTRODUÇÃO GERAL

O lúpus eritematoso sistêmico (LES) é uma doença autoimune, reumática, sistêmica,

de etiologia desconhecida e com envolvimento de múltiplos órgãos com consequências clínicas

que vão desde eventos mais simples até complicações graves. Sua prevalência é maior em

mulheres, chegando a uma proporção de 9:1 em relação aos homens. Além disso, existe uma

influência racial que garante susceptibilidade maior para africano-caribenhas e asiáticas

(MOLOKHIA et al., 2001). Sua etiologia é multifatorial e está relacionada à predisposição

genética, aos hormônios sexuais, ao uso de alguns medicamentos e a fatores ambientais como

infecções, radiação UV e nutrição (MOK & LAU, 2003; LI & ISENBERG, 2005; TSOKOS,

2011), que levam à perda da tolerância imunológica e à produção de autoanticorpos,

principalmente contra antígenos nucleares.

A imunopatogênese no LES é caracterizada pela ativação descontrolada dos linfócitos

B com grande produção de autoanticorpos com mais de 100 especificidades para autoantígenos

celulares e extracelulares. Estes anticorpos formam complexos imunes circulantes persistentes

que se depositam em diferentes órgãos e tecidos, constituindo-se em um dos aspectos mais

importantes da imunopatogenia do LES (MOK & LAU, 2003; LI & ISENBERG, 2005;

MANSON & RAHMAN, 2006). Alguns dos autoanticorpos têm sido associados com aspectos

clínicos do LES: anticorpo anti-dsDNA com doença renal, anticorpos anti-SSA e SSB com

manifestações cutâneas, e anticorpos antifosfolípides com Síndrome Antifosfolípide

Secundária (MOK & LAU, 2003). Entre as principais manifestações clínicas, a nefrite lúpica

é uma das mais sérias complicações do LES e está principalmente associada à presença dos

autoanticorpos anti-dsDNA e antinucleossomo (SUI et al., 2013). Além disso, cerca de 80%

dos pacientes apresentam algum tipo de comprometimento articular, destacando nesse grupo, a

presença em 5% dos pacientes com Artropatia de Jaccoud, uma síndrome com mecanismos

ainda desconhecidos, porém com correlação positiva para alguns autoanticorpos (SANTIAGO,

2011). Embora vários mediadores bioativos estejam envolvidos na patogênese do lúpus, como

interferon de tipo I, BAFF / BLyS, IL-6 e IL-10, hormônios como prolactina também

influenciam a autorreatividade do Lúpus, podendo modular a atividade da doença e

potencializar a produção de autoanticorpos (MC MURRAY, 2001; DE BELLIS et al., 2005).

O diagnóstico do LES é usualmente baseado nos critérios de diagnósticos sugeridos

pelo Colégio Americano de Reumatologia (ARC), embora estes sejam destinados para pesquisa

16

e fins de ensaios terapêuticos. Para a caracterização dos pacientes é necessário que estejam

presentes pelo menos quatro dos critérios elencados pelo ARC, dentre estes estão: eritema

malar, lesão discóide, fotossensibilidade, úlceras orais/nasais, artrite, serosite,

comprometimento renal, alterações neurológicas, hematológicas e imunológicas com presença

marcante de anticorpos antinucleares (HOCHBERG, 1997). O tratamento deve ser avaliado

para cada paciente analisando principalmente o órgão ou sistema acometido (ARINGER et al.,

2012; OCHSENDORF, 2010; LUIJTEN et al., 2013).

17

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 EPIDEMIOLOGIA DO LES

As taxas de incidência do lúpus eritematoso sistêmico (LES) referidas em diversos

estudos variam entre 1 a 10 por 100.000 indivíduos por ano, com prevalência variando de 20 a

200 por 100.000 indivíduos. A variedade desses dados epidemiológicos, relatados entre os

estudos, dependem de fatores como: gênero, etnia e localização geográfica (GOLDBLATT &

OŃEILL, 2013). A ocorrência de LES é caracteristicamente maior entre as mulheres com

relação aos homens, sendo essa diferença demonstrada também quanto ao desenvolvimento do

LES na infância (idade de 3 a 15 anos, onde há proporção maior para gênero feminino, 4:1)

(AMUR et al., 2012).

As prevalências descritas em populações não caucasianas são três a quatro vezes

maiores do que aquelas caucasianas, em populações de todo o mundo (GOLDBLATT &

OŃEILL, 2013). Além de maiores prevalências, a doença de início agudo é mais frequente nas

populações não caucasianas, com manifestações clínicas em geral mais graves (GONZÁLEZ

et al., 2013).

Diferentes populações também têm sido associadas a perfis clínicos distintos, como

maior frequência de manifestações cutâneas (a exemplo de fotossensibilidade e rash malar) em

caucasianos e lúpus discoide em afro-descendentes (ALARCÓN et al., 2002; PESCHKEN et

al., 2009).

A tabela 01, a seguir, exemplifica algumas diferenças com relação a critérios adotados

pelo ARC entre os grupos étnicos de afro-descendentes e caucasianos nos Estados Unidos da

América (GONZÁLEZ et al., 2013).

18

Tabela 1 - Critérios do American College of Rheumatology (ACR) entre grupos do estudo LUMINA (Lupus in Minorities: Nature vs Nurture).

Critérios do ACR Afro-descendentes (N=239)

Caucasianos (N=181)

Rash malar 53,1% 75,1% Rash discóide 33,9% 9,4% Fotossensibilidade 56,1% 81,2% Nefropatia 58,1% 17,1% Danos neurológicos 19,7% 8,3%

Fonte: Adaptado de GONZÁLEZ et al., 2013.

No Brasil, a Sociedade Brasileira de Reumatologia (SBR) estima que uma a cada 1.700

mulheres tenha LES. De acordo com o censo de 2010 do Instituto Brasileiro de Geografia e

Estatística - IBGE, a população feminina estimada no Estado da Bahia correspondia a 7.141.064

mulheres, sendo que desse total feminino, 3.292.923 estavam na faixa etária entre 20 e 49 anos,

existindo, portanto, a possibilidade de 1.937 mulheres baianas terem LES já que segundo a SBR

a doença ocorre principalmente na faixa entre 20 e 45 anos de idade.

2.2 MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS DO LES

O lúpus é uma doença crônica inflamatória responsável pelo comprometimento de

diversos órgãos e sistemas, o que ocorre muitas vezes de forma simultânea, e apresenta aspecto

clínico e laboratorial bastante variado. Assim, têm sido encontrados nos indivíduos acometidos,

em ordem crescente de prevalência: artrite, citopenia hematológica (anemia, leucopenia e

trombocitopenia), fotossensibilidade, eritema discóide, doença renal e comprometimento

neuropsiquiátrico (MOK & LAU, 2003; LI & ISENBERG, 2005; MANSON & RAHMAN,

2006).

A nefrite lúpica é um dos principais determinantes da morbidade e mortalidade dos

pacientes portadores de LES, com prevalência entre 30-50%, variando com os diferentes grupos

étnicos estudados. O curso clínico da nefrite lúpica é altamente variável, apresentando maior

gravidade nos afro-descendentes. Ela pode se manifestar de diferentes formas, desde a proteinúria

leve, assintomática, até manifestações graves de insuficiência renal irreversível. Frequentemente,

ela é evidenciada por perda do volume urinário, edema, hipertensão arterial e anormalidades do

sumário de urina representadas por hematúria, cilindrúria e relação proteinúria/creatinina urinária

19

acima de 0.2 (LAU et al., 2006; BORCHERS et al., 2004; COOPER et al., 2002; DANCHENKO

et al., 2006; ILLEI & BALOW, 2007; DOOLEY, 2007).

Em um estudo realizado na cidade de Natal – Rio Grande do Norte, onde o LES

apresenta incidência de 8,7 casos novos/100 mil habitantes/ano (VILAR & SATO, 2002), foram

estudados 156 pacientes do gênero feminino e oito do gênero masculino, e dentre as

manifestações clínicas mais frequentes observou-se 90,2% com lesões cutâneas, 66,5% com

fotossensibilidade, 60,4% com rash malar, 34,8% com lesão discóide, 87,2% com artrite,

45,1% com nefrite, 97% com positividade para anticorpo antinuclear e 57,8% com alterações

hematológicas (BEZERRA et al., 2005).

Sauma e colaboradores realizaram uma análise retrospectiva, entre 1990 e 1999, das

manifestações clínicas e laboratoriais de 104 pacientes com LES atendidos em um consultório

médico privado na cidade de Belém – Pará. Desses pacientes, 91,35% foram do gênero feminino

e 53,8% eram da raça branca, e apresentaram como manifestações mais frequentes: 77,88% de

artrite e/ou artralgia e 83,84% de positividade para anticorpos antinucleares. Entretanto esses

pacientes apresentaram 34,62% de fotossensibilidade, o que difere da literatura, considerando

especificamente este achado como paradoxal. Dentre os resultados laboratoriais que avaliam o

comprometimento renal, 45,08% apresentou proteinúria, 43,04% cilindrúria, 41,86% hematúria

e 15,91% apresentou aumento de creatinina sérica (SAUMA et al., 2004).

Entre as principais manifestações clínicas, a nefrite lúpica é uma das mais sérias

complicações do LES (SUI et al., 2013). Cerca de 40% dos pacientes com LES apresentam

envolvimento renal durante o curso de sua doença (HOUSSIAU & LAUWERYS, 2013). Esta

condição é causada pela ligação de autoanticorpos aos autoantígenos nucleares com formação

de complexos imunes e ativação do sistema complemento (ANDERS & FOGO, 2014).

Outro estudo, realizado em um centro de referência do Estado do Rio Grande do Sul

para atendimentos de doenças reumáticas, descreveu o perfil clínico-laboratorial de 56

pacientes lúpicos, 94% do sexo feminino, sendo 91% destes da raça branca. As principais

manifestações clínicas foram fotossensibilidade (78%), artrite (69%), eritema malar (60%) e

úlceras de mucosas (46%). Laboratorialmente, destacaram-se as alterações de provas

imunológicas (78%), alterações hematológicas (48%) e nefropatia (44%), com 39,2% de

proteinúria, hematúria em 25% dos casos e perda da função renal em 12,5% do total de

pacientes estudados. A presença de anticorpos antinucleares foi encontrada em 98% dos casos

(PRADO et al., 2007).

20

Um importante aspecto do LES é sua associação com outras doenças reumatológicas

como a Síndrome Antifosfolípide (SAF) secundária, descrita inicialmente em pacientes com

lúpus, em baixa frequência, (HAREL et al., 2005) e a artropatia de Jaccoud (AJ), uma forma de

artrite deformante que se confunde com a artrite reumatoide, porém com deformações

“reversíveis” (SANTIAGO & GALVÃO, 2008). Cerca de 80% dos pacientes lúpicos

apresentam manifestações articulares sendo que 5% desenvolvem AJ, mas os seus mecanismos

etiopatogênicos não são totalmente conhecidos (SANTIAGO, 2011). Além disso, não existem

achados laboratoriais capazes de diferenciar os pacientes com e sem artropatia de Jaccoud

(GALVÃO et al., 2009).

Assim, a maior parte dos estudos científicos que avaliam as manifestações clínicas e

laboratoriais dos pacientes com LES mostram um perfil clínico de comprometimento dessa

doença independente da localização geográfica em que esta se desenvolva. Embora a doença

seja de atuação múltipla e variada, é possível estabelecer ou identificar padrões de

comprometimento e possíveis associações com marcadores laboratoriais.

2.3 PATOGENIA

Múltiplos fatores estão associados com a etiopatogênese do LES, a qual envolve um

número expressivo de genes, fatores hormonais e fatores ambientais. Podem ser observadas nos

indivíduos acometidos alterações funcionais nos linfócitos T e B, nas células apresentadoras de

antígenos, deficiência na síntese de componentes do sitema complemento e defeitos nos

mecanismos de apoptose. O paciente com LES apresenta distúrbios imunológicos em linfócitos

B, principalmente caracterizados pela hiperatividade desses linfócitos, documentada pela

produção exuberante de autoanticorpos de diferentes especificidades e presença de complexos

imunes circulantes formados por autoanticorpos e autoantígenos, que persistem no organismo

causando inflamação sistêmica por falha nos mecanismos de depuração (MOK & LAU, 2003;

LI & ISENBERG, 2005; MANSON & RAHMAN, 2006).

O LES acomete indivíduos de todas as raças, de ambos os gêneros e diferentes faixas

etárias. Contudo, embora ocorra no homem, o LES, como já dito anteriormente, é mais

prevalente nas mulheres, manifestando-se predominantemente com idade entre 20 e 40 anos. A

importância dos hormônios sexuais femininos na etiopatogênese do LES tem sido evidenciada

pela associação da atividade da doença com a idade reprodutiva das mulheres acometidas e

21

posterior diminuição da mesma na menopausa. Adicionalmente, o uso de contraceptivos e a

reposição hormonal têm propiciado provas adicionais da influência hormonal dos estrógenos.

Dentre os hormônios que influenciam no desenvolvimento do LES, destacam-se

principalmente o estrogênio e a prolactina. Este último, cuja atividade principal está associada

com a galactopoiese, lactação e desenvolvimento das glândulas mamárias, também participa

ativamente da modulação da resposta imune inata e adaptativa. Embora secretada

principalmente pela hipófise, a prolactina é também secretada por sítios extra-hipofisários como

as células mononucleares do sangue periférico, principalmente os linfócitos. Neste caso, a

prolactina possui peso molecular e atividade biológica diferenciada, agindo nos mecanismos de

tolerância imunológica, interferindo na seleção negativa dos linfócitos B autorreativos, inibindo

a apoptose dessas células (MC MURRAY, 2001; PEEVA & ZOUALI, 2005; PEEVA et al.,

2003). Adicionalmente, a prolactina induz a diferenciação de células dendríticas e monócitos,

além de estimular a produção de interferon-γ e expressão do receptor de IL-2. Nas doenças

autoimunes como o LES, artrite reumatoide e tireoidites autoimunes, a prolactina poderia

potenciar a produção de autoanticorpos. Existem relatos que níveis aumentados de prolactina

poderiam modular positivamente a atividade do LES, e também influenciar algumas das suas

manifestações clínicas como anemia, serosite e pleurite (WALKER et al, 1998; MATERA et

al., 2001; JARA et al., 2008; SAHA et al., 2011).

As diferenças observadas entre os sexos, quando avaliadas as doenças autoimunes,

especificamente o LES, podem ser explicadas por uma imunomodulação por esteróides sexuais,

principalmente entre progesterona e estrogênio, sendo este o responsável por estimular o

desenvolvimento da doença (BOUMAN et al., 2005). A prevalência do LES, com razão de

nove mulheres para um homem (9:1) é, entretanto, comum quando avaliada no período

reprodutor feminino, entre a menarca e a menopausa (PETRI, 2002; SIMARD &

COSTENBADER, 2007). Isso não se verifica quando avaliadas crianças com LES de início

precoce (< 10 anos), em que a razão pode se aproximar a 1:1 (PLUCHINOTTA et al., 2007).

A menarca precoce é, portanto, um fator de risco, mostrando que o momento e a duração da

exposição hormonal pode ser um fator importante no desenvolvimento do LES

(COSTENBADER et al., 2007). Além disso, estudos mostrando correlação entre o LES e uso

de anticoncepcional ou de hormônios para reposição hormonal, ambos a base de estrogênio,

sugerem uma relação direta desse esteróide e a doença (BERNIER et al., 2009; ROJAS et al.,

2014). Um dos mecanismos propostos para explicar a influência desse hormônio no

desenvolvimento e atividade da doença é a estimulação de células dendríticas, favorecendo a

22

secreção de inteferon tipo I, o qual atuaria no desenvolvimento da autoimunidade pela ativação

inadequada da resposta imune inata e adaptativa (HALL & ROSEN, 2010;

THEOFILOPOULOS et al., 2005; SEILLET et al., 2012). Outro mecanismo diz respeito a um

aumento na sobrevida de células B auto-reativas. O estrogênio estaria inibindo o processo de

apoptose natural dessas células e estimulando a produção de BAFF (Fator Estimulador de

Linfócitos B) por células mielóides, favorecendo a liberação de autoanticorpos (BYNOE et al.,

2000; HILL et al., 2011; PANCHANATHAN & CHOUBEY, 2013).

Infecções, dietas e tabagismo são fatores ambientais que também têm sido associados

com o LES (KRISHNAN et al., 2007; ASKANASE & BUYON, 2002; GRIMAILD, 2006;

PETRI, 2008; EDWARDS, 2005).

2.4 AUTOANTICORPOS

O LES tem como principal característica a intensa produção de autoanticorpos

responsáveis, em sua maioria, pelas lesões que acometem esses pacientes. Alguns

autoanticorpos funcionam como marcadores de atividade da doença, facilitando o

acompanhamento e tratamento dos portadores de LES. A especificidade desses anticorpos é

para um número grande de autoantígenos, já tendo sido registrado mais de 160 especificidades

antigênicas, em especial para antígenos nucleares. Dentre esses, autoanticorpos que possuem

maior destaque clínico e laboratorial são aqueles dirigidos para antígenos celulares como o

DNA dupla hélice (dsDNA), nucleossomo, histonas, ribonucleoproteínas SS-A/Ro, SS-B/La,

Sm e RNP e antígenos citoplasmáticos como a proteína ribossomal P (Rib-P). Adicionalmente,

anticorpos para cofatores da coagulação sanguínea e fosfolípides podem ser encontrados em

importante prevalência nos pacientes lúpicos, principalmente aqueles dirigidos para epítopos

de β2-glicoproteína I, protrombina, anexina V e fosfolípides, como cardiolipina e

fosfatidilserina. Esta produção de autoanticorpos está intimamente associada com à expressão

aumentada de importantes mediadores imunológicos como Fator Estimulador de Linfócitos B

(BLyS/BAFF), interleucinas IL-6 e IL-10 (BECKER-MEROK et al., 2006, KIROU & CROW,

1999, LIORENTE et al., 1995).

Embora produzidos em grande número e diversidade, poucos autoanticorpos têm ação

patogênica comprovada e nem sempre é possível demonstrar o envolvimento dos mesmos na

imunopatogenia do lúpus por meio de modelos experimentais. Assim, especial atenção tem sido

23

dada aos autoanticorpos antiproteínas complexadas com fosfolípides negativos como a β2-

Glicoproteína I, que estariam envolvidos em eventos trombóticos no LES; anticorpos contra

antígenos eritrocitários, mediadores da anemia hemolítica nesta doença e também

autoanticorpos dirigidos para epítopos do ácido desoxirribonucléico com a configuração de

dupla hélice ou nativa (WANDSTRAT et al., 2006).

2.4.1 Anticorpo Anti-dsDNA

Os anticorpos anti-dsDNA foram descritos pela primeira vez em 1957 (CEPPELLINI

et al., 1957; ROBBINS et al., 1957) e fazem parte do grupo de autoanticorpos antinucleares,

cujo alvo é o DNA celular. A sua identificação é valorizada nos critérios para classificação de

LES do Colégio Americano de Reumatologia (ACR) (HOCHBERG, 1997), inclusive tendo

sido mais uma vez validada em 2012 pelo grupo Systemic Lupus International Collaborating

Clinics (SLICC), (PETRI et al., 2012).

Anticorpos anti-ds DNA podem ser de diferentes isotipos, entretanto o anticorpo IgG

anti-dsDNA é o que mais se relaciona com a imunopatogenia do LES, principalmente com a

sua manifestação renal, além de ser o mais utilizado nos testes laboratoriais para diagnóstico

do LES (OHNISHI et al., 1994; EHRENSTEIN et al., 1995). A presença de IgA anti-dsDNA

no soro desses pacientes vem sendo descrita em muitos estudos, seja em associação com outros

isotipos ou isoladamente. Além disso, uma possível correlação com a atividade lúpica e

envolvimento renal nesta doença começa a ser explorada, indicando a contribuição dessa classe

de imunoglobulina na imunopatogenia do LES (ATTA et al., 2009; VILLALTA et al., 2013).

Quanto ao IgM anti-dsDNA, muitos trabalhos têm mostrado seu caráter protetor, possivelmente

pela sua capacidade de se ligar a um maior número de antígenos e consequentemente diminuir

a formação de complexos com IgG anti-dsDNA, por inibição competitiva (VILLALTA et al.,

2013; KEISERMAN et al., 2013).

Recentemente, foi demonstrado em nosso laboratório que anticorpos anti-dsDNA de

diferentes isotipos (IgA, IgE, IgG e IgM) podem ser encontrados em uma população de

portadores de LES com forte afro-descendência, atendidos no Ambulatório de Lúpus do

Hospital Santa Izabel, em Salvador-Bahia. Embora os anticorpos IgG fossem mais prevalentes

nestes indivíduos, existiram pacientes que tinham até três diferentes isotipos de anticorpos anti-

dsDNA simultaneamente, e, em teste de imunofluorescência, outros que apenas reagiram no

24

teste de ELISA para anticorpos IgG. Uma importante observação neste estudo foi a falta de

associação entre os achados laboratoriais sugestivos de doença renal lúpica (proteinúria,

hematúria e cilindrúria) e a presença de anticorpos anti-dsDNA (ATTA et al., 2009). Em outro

estudo também recente, confirmando observações anteriores realizadas envolvendo IgE e LES,

foi demonstrada a presença de anticorpos IgE para dsDNA por técnica de Line immunoblotting,

confirmando a necessidade de mais estudos relacionados com o envolvimento destas

imunoglobulinas na imunopatogênese do LES (ATTA et al., 2010). Tal fato reveste-se de

especial importância face à recente demonstração que basófilos e o ambiente Th2 podem

promover o desenvolvimento de nefrite lúpica (CHARLES et al., 2010).

Além da atuação na imunopatogenia do LES e de auxiliarem o monitoramento da

atividade da doença, esses autoanticorpos são os alvos principais dos testes de diagnósticos

laboratoriais, favorecendo a aplicação de técnicas e metodologias diferentes, com diferentes

graus de sensibilidade e especificidade.

Anticorpos anti-dsDNA têm sido investigados por diferentes técnicas no laboratório

clínico. Entre elas, o imunoensaio com isótopos radiativos FARR foi o primeiro a ser usado,

constituindo-se ainda em técnica de referência por sua alta especificidade. Entretanto, é

atualmente usada em poucos centros e está condenada ao desuso pelas suas exigências

operacionais e legais. Com a introdução da técnica de imunofluorescência indireta (IFI), usando

o substrato antigênico de DNA circular do hemoflagelado Crithidia luciliae, foi possível um

teste de boa sensibilidade, bastante específico para detectar estes anticorpos e capaz de

identificar diferentes isotipos destas imunoglobulinas. Sua maior limitação corresponde aos

resultados semi-quantitativos correspondentes aos títulos obtidos por diluições seriadas dos

soros testes. Mais recentemente foi introduzido no laboratório de reumatologia o imunoensaio

em fase sólida usando marcadores enzimáticos (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,

ELISA), o qual tem sido internacionalmente usado devido à possibilidade de automação,

identificação de isotipos de anticorpos anti-dsDNA, uso de uma única diluição dos soros testes

e fornecimento de resultados em unidades internacionais de anticorpos/mL. As maiores críticas

ao ELISA para anticorpos anti-dsDNA correspondem à detecção simultânea de anticorpos de

alta e baixa avidez, contribuindo para sua menor especificidade quando comparado ao

radioimunoensaio e à imunofluorescência indireta. Desta forma, a combinação dos testes de

imunofluorescência e de ELISA tem sido usada como uma boa opção para a pesquisa de

anticorpos anti-dsDNA, permitindo melhores informações sobre as suas especificidades e

25

títulos (TZIOUFAS et al., 1990; SMEENK, 2002; ROUQUETTE & DESGRULLES, 2006;

RAHMAN & HIEPE, 2002; ISENBERG & SMEENK, 2002).

Os anticorpos anti-dsDNA possuem elevado grau de heterogeneidade, representada

pela sua capacidade de reação cruzada, variedade de subclasses de imunoglobulinas e,

principalmente, pela sua variada avidez (SCHIFFER et al., 2002). A utilização de metodologias

diferentes com propósito de garantir a determinação de anticorpos específicos com elevada

avidez e com maior correlação clínica, decorre dos bons valores preditivos alcançados pelas

técnicas de radioimunoensaio e IFI (EDNER, 2000; ISENBERG & SMEENK, 2002;

HAUGBRU et al., 2004).

A técnica de ELISA de alta avidez, desenvolvida para detectar anticorpos IgG anti-dsDNA

tem como princípio básico a precipitação por sulfato de amônia, eliminando os anticorpos de baixa

avidez. Este método é semelhante ao RIA, com a vantagem de não utilizar nenhuma substância

radioativa (SUH-LAILAM et al., 2011). Por outro lado, testes de ELISA para detecção de

anticorpos anti-dsDNA de alta afinidade têm sido desenvolvidos pelas indústrias de diagnóstico de

doenças autoimunes, permitindo informações mais confiáveis das possíveis correlações destes

autoanticorpos com a atividade da doença e suas manifestações clínicas.

Anticorpos contra DNA de dupla hélice têm sido associados com a atividade do LES,

em particular a nefrite lúpica, sendo objeto de intensa investigação e controvérsias. Contribuem

para estas divergências da importância dos anticorpos anti-dsDNA no LES: a detecção destas

imunoglobulinas vários anos antes da manifestação clínica do LES, a ausência destes anticorpos

em cerca de 40-50% dos portadores de LES, a reatividade cruzada com diferentes auto-

antígenos e a falta de demonstração conclusiva do seu envolvimento na imunopatogenia do

LES em modelos murinos experimentais (ARBUCKLE et al., 2003, ISENBERG, 2004, YUNG

& CHAN, 2008, HAHN & TSAO, 2007).

Os mecanismos de ação desses autoanticorpos nos pacientes com LES poderiam seguir

basicamente dois caminhos: formação de complexos imunes com o dsDNA, seguida da fixação

passiva destes agregados imunes nos glomérulos ou a ligação direta desses autoanticorpos em

estruturas glomerulares. Dependendo do local de formação desses complexos, as lesões podem

ser classificadas, mostrando mecanismos patogênicos diferentes associados a classificações

histopatológicas distintas de nefrites (WINFIELD et al., 1977; SCHWARTZ et al., 2008; YU

et al., 2010; NOWLING & GILKESON, 2011; YUNG et al., 2010, 2012). Adicionalmente,

estudos moleculares realizados com a região variável dos anticorpos anti-dsDNA têm revelado

a importância dos resíduos de Arginina, Asparagina e Lisina nos sítios combinatórios destas

26

imunoglobulinas, os quais confeririam caráter nefritogênico a tais anticorpos, conforme

demonstrado em estudos experimentais (RADIC & WEIGERT, 1994).

2.4.2 Anticorpo antinucleossomo (ANuA)

A busca de novos biomarcadores mais sensíveis e específicos para o diagnóstico e

acompanhamento do LES tem atraído a atenção de vários grupos. Entre esses, a pesquisa de

anticorpos dirigidos para epítopos do nucleossomo, unidade básica de cromatina, tem se

mostrado bastante produtiva, existindo relatos que apontam estas imunoglobulinas como

possíveis substitutos dos anticorpos anti-dsDNA como biomarcadores de doença ativa

(KALAAJI et al., 2007; DORIA & GATTO, 2012; JESUS et al., 2012).

Tais anticorpos são produzidos após a apresentação antigênica de epítopos exclusivos

do nucleossomo, unidade básica de cromatina formada por um octâmero de quatro pares de

histonas (H2A, H2B, H3 e H4) rodeado por 200 pares de base de DNA, que são expostos após

a apoptose (BENUCCI et al., 2003; VAN DER VLAQ & BERDEN, 2011).

Existem evidências de que os anticorpos antinucleossomo estariam diretamente

envolvidos na imunopatogênese do LES, principalmente no desenvolvimento da nefrite lúpica.

Em modelos murinos experimentais de LES, a presença de ANuA é precocemente detectada,

antecedendo a detecção de outras especificidades de autoanticorpos, sugerindo a sua

importância clínica e laboratorial (VAN DER VLAQ & BERDEN, 2011). Tais

imunoglobulinas são mais prevalentes que todos os demais autoanticorpos rotineiramente

pesquisados no LES, sendo encontrados em pacientes soronegativos para anticorpos anti-

dsDNA ou anticorpos anti-histonas, demonstrando a sua exclusiva reatividade sorológica. Além

disso, a presença desses autoanticorpos em pacientes soronegativos para anticorpos anti-

dsDNA permite avaliar a atividade do LES nestes indivíduos, existindo uma correlação entre

títulos de aNuA e os escores de atividade de doença medida pelo SLEDAI (MIN et al., 2002;

SIMON et al., 2004).

Mais recentemente, anticorpos antinucleossomo têm sido propostos como importantes

biomarcadores de diagnóstico do LES (MOK et al., 2010; WU et al., 2008; DUZGUN et al.,

2007). Em estudo que avaliou o perfil sorológico de pacientes com nefrite lúpica foi

demonstrada uma forte relação entre a presença de glomerulonefrite e a soropositividade

combinada para autoanticorpos anti-dsDNA e antinucleossomo. Pacientes com esta dupla

27

reatividade sorológica apresentavam alta prevalência de lesões renais, observando-se que essa

associação se tornava mais forte quando a presença de autoanticorpos anti-histona era também

incorporada nesta avaliação (SUI et al., 2013).

Muitos estudos investigaram a presença de marcadores sorológicos em pacientes

lúpicos com ausência de atividade clínica, que possivelmente estariam com o LES em seu

estado latente (GLADMAN et al., 1979; WALZ LEBLANC et al., 1994). Nesta linha de

pesquisa, um grupo de pesquisadores sugeriu que os autoanticorpos antinucleossomo poderiam

ser melhores marcadores sorológicos que os anticorpos anti-dsDNA nestes indivíduos, sendo

relatado que pacientes com altos níveis de ANuA poderiam apresentar as primeiras

manifestações clínicas do LES mais precocemente (NG et al., 2006).

Anticorpos antinucleossomo podem ser de diferentes isotipos, sendo rotineiramente

pesquisados aqueles do isotipo IgG. Embora a presença desses autoanticorpos no soro de

pacientes com LES possa ser sugerida por um padrão nuclear homogêneo nas reações de

imunofluorescência com células HEp-2, a principal forma de identificação e quantificação dos

níveis desses autoanticorpos é a técnica de ELISA indireto. Estudos realizados no nosso

laboratório têm demonstrado uma alta prevalência de ANuA em pacientes lúpicos residentes na

Bahia, inclusive com a detecção de anticorpos IgE com esta especificidade (ATTA et al., 2010).

Contudo, a soropositividade para anticorpos antinucleossomo ainda não foi adotada pelo ACR

como critério para classificação de pacientes como portadores de LES, nem eles têm sido

rotineiramente utilizados no diagnóstico laboratorial do lúpus.

2.5 DIAGNÓSTICO DO LES

O diagnóstico do LES fundamenta-se em uma suspeita clínica a partir de

manifestações características desta enfermidade, como lesões cutâneas ou outra manifestação

sistêmica.

Por suas múltiplas manifestações clínicas e heterogeneidade de anticorpos o seu

diagnóstico exige do profissional responsável formação médica e laboratorial especializada. Na

fase inicial do LES, estão presentes sintomas gerais e inespecíficos, com apenas algumas

anormalidades clínicas e laboratoriais características. Embora os pacientes com estágios mais

avançados do LES atendam aos critérios de classificação de forma mais rápida, outros demoram

em atender ao mínimo de quatro critérios (FISCHER-BETZ & SCHNEIDER, 2013).

28

A utilização dos critérios propostos pelo Colégio Americano de Reumatologia para a

classificação do LES no diagnóstico desta enfermidade é uma prática comum, embora não seja

esta a sua função original. Em 1982, o Colégio Americano de Reumatologia propôs onze

critérios para a classificação de pacientes com LES (TAN et al., 1982). Em 1997, estes critérios

foram revisados, mas não completamente validados. Com este objetivo, foi publicado em

agosto de 2012 no Arthritis & Rheumatism a proposta do Systemic Lupus International

Collaborating Clinics incluindo novos critérios classificatórios para o LES. Este estudo teve

duração de oito anos e envolveu 33 reumatologistas com ampla experiência nesta doença e foi

consubstanciado pelas observações obtidas de 702 pacientes com diagnóstico clínico de LES,

e de pacientes portadores de outras doenças reumáticas como artrite reumatoide, esclerodermia,

fibromialgia, entre outras. Os dados foram validados a partir da análise de uma nova amostra

de 690 casos de pacientes com LES e pacientes-controle. Os seguintes critérios imunológicos

foram propostos: a soropositividade para ANA (Anticorpo Antinúcleo) e para anticorpos anti-

dsDNA, anti-Sm e antifosfolípides; diminuição nos níveis séricos de complemento (CH50, C3

e C4) e teste de Coombs direto positivo, na ausência de anemia hemolítica. Utilizando estes

novos critérios, um paciente seria classificado como portador de LES se atendesse a pelo menos

quatro critérios, incluindo pelo menos um critério clínico e um imunológico.

Os resultados obtidos com os novos critérios de classificação do SLICC foram mais

eficientes quando comparados aos critérios preconizados pelo ACR em 1997, sendo mais

sensíveis e específicos (PETRI et al., 2012).

Embora esses critérios revisados pelo grupo SLICC sejam importantes, eles ainda não

foram aplicados ao diagnóstico do LES, permanecendo os critérios propostos pelo ARC, ainda

mais utilizados. Assim, a validação desses novos critérios deve ser feita mediante estudos

científicos que avaliem pacientes com suspeita de LES e que não atendam aos critérios do ARC.

2.6 ATIVIDADE DA DOENÇA

2.6.1 Marcadores de Atividade da Doença

O monitoramento ou a avaliação da atividade do LES utiliza índices que funcionam

como importantes ferramentas em pesquisas e estudos científicos, mas cuja incorporação na

29

prática clínica é dificultada pelo tempo necessário para concluí-las (NUTTALL & ISENBERG,

2013).

No LES, a flutuação nos níveis de autoanticorpos anti-dsDNA e a redução dos níveis

de componentes do complemento sérico envolvidos na ativação deste sistema pela via clássica

(C3 e C4) tem sido utilizados no monitoramento dos pacientes e como preditores de atividade

de doença. Os autoanticorpos anti-dsDNA têm sido encontrados em aproximadamente 60% dos

pacientes e têm sido associados à nefrite nesses pacientes (KAVANAUGH & SOLOMON,

2002). Muitos estudos têm proposto novos marcadores de atividade do LES, que poderiam

servir para monitorar a doença. Entre estes, a deficiência de vitamina D e sua associação com

atividade da doença é um dos resultados desta busca de novos marcadores laboratoriais de

atividade lúpica (MOK et al., 2012). Também, estudos recentes têm demonstrado que

anticorpos contra o nucleossomo poderiam ser mais apropriados do que anticorpos anti-dsDNA

na avaliação laboratorial do LES, por sua maior prevalência e boa relação com as manifestações

clínicas desta doença (KALAAJI et al., 2007; DORIA & GATTO, 2012; JESUS et al., 2012).

Os anticorpos antinucleossomo têm sido fortemente associados com a atividade do LES e a

análise dos níveis desses autoanticorpos poderia ser útil em pacientes soronegativos para

anticorpos anti-dsDNA (GUTIERREZ-ADRIANZEN et al., 2006, SIMON et al., 2004).

2.6.2 Índice de Atividade de Doença – SLEDAI

O Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index (SLEDAI) é a ferramenta mais

simples e mais utilizada na avaliação da atividade lúpica nos portadores desta enfermidade. A

avaliação realiza a análise de 24 órgãos/sistemas e itens sorológicos, cada um com escore

estabelecido, variando de 2 a 8 pontos. No método original, a avaliação se processa por dez dias,

enquanto um período de trinta dias é usado no SLEDAI – 2K uma modificação do método

original, validado em estudos científicos, que aumentou o tempo de avaliação e alterou a análise

de alguns marcadores (GLADMAN et al., 2002, TOUMA et al., 2011).

Além do SLEDAI, outros índices são utilizados como o “Safety of Estrogens in Lupus

Erythematosus: National Assessment-SLEDAI” (SELENA-SLEDAI), o “Systemic Lupus

Activity Measure” (SLAM), o “British Isles Lupus Assessment Group” (BILAG), o “Systemic

Lupus International Collaborating Clinics” (SLICC) e o “European Consensus Lupus Activity

30

Measurement “(ECLAM). Todos usam uma combinação entre dados históricos, exames e dados

laboratoriais (ILLEI et al., 2004).

31

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Investigar a imunopatogenia do lúpus eritematoso sistêmico em pacientes portadores

desta doença atendidos em um centro de referência em Reumatologia de Salvador-Bahia, com

especial referência à participação dos anticorpos anti-dsDNA e prolactina.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Investigar a prevalência e os níveis de anticorpos anti-dsDNA e antinucleossomo nos

pacientes com LES;

• Avaliar a participação de anticorpos anti-dsDNA, totais e de alta avidez, e de anticorpos

antinucleossoma na atividade lúpica e nas manifestações clínicas do LES;

• Investigar a presença de hiperprolactinemia nos pacientes com LES e seu envolvimento

com produção de autoanticorpos e manifestações clínicas associadas a esta doença

autoimune.

32

CAPÍTULO 1 –

Research Article - High Avidity dsDNA Autoantibodies in Brazilian

Women with Systemic Lupus Erythematosus: Correlation with Active

Disease and Renal Dysfunction

Research Article High Avidity dsDNA Autoantibodies in Brazilian Women with Systemic Lupus Erythematosus: Correlation with Active Disease and Renal Dysfunction

Rodrigo C. Oliveira,1 Isabela S. Oliveira,1 Mittermayer B. Santiago,2

Maria L. B. Sousa Atta,3 and AjaxM. Atta 3 1 Programa de Pós-Graduação em Imunologia, Instituto de Ciências da Saúde, Universidade Federal da Bahia, 40140-100 Salvador, BA, Brazil 2 Escola Bahiana de Medicina e Saúde Pública, 40050-420 Salvador, BA, Brazil 3 Laboratório de Pesquisa em Imunologia, Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal da Bahia, Rua Barãoo de Jeremoabo 147, 40170-115 Salvador, BA, Brazil Correspondence should be addressed to Ajax M. Atta; [email protected] Received 21 November 2014; Accepted 16 March 2015 Academic Editor: Thomas Dörner Copyright © 2015 Rodrigo C. Oliveira et al. This is an open access article distributed under the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. We investigated in Brazilian women with SLE the prevalence and levels of high avidity (HA) dsDNA antibodies and tested their correlation with lupus activity and biomarkers of renal disease. We also compared these correlations to those observed with total dsDNA antibodies and antibodies against nucleosome (ANuA). Autoantibodies were detected by ELISA, while C3 and C4 levels were determined by nephelometry. Urine protein/creatinine ratio was determined, and lupus activity was measured by SLEDAI-2K. The prevalence of total and HA dsDNA antibodies was similar to but lower than that verified for ANuA. The levels of the three types of antibodies were correlated, but the correlation was more significant between HA dsDNA antibodies and ANuA. High avidity dsDNA antibodies correlated positively with ESR and SLEDAI and inversely with C3 and C4. Similar correlations were observed for ANuA levels, whereas total dsDNA antibodies only correlated with SLEDAI and C3. The levels of HA dsDNA antibodies were higher in patients with proteinuria, but their levels of total dsDNA

Hindawi Publishing Corporation Journal of Immunology Research Article ID 814748

33 Journal of Immunology Research

antibodies and ANuA were unaltered. High avidity dsDNA antibodies can be found in high prevalence in Brazilian women with SLE and are important biomarkers of active disease and kidney dysfunction. 1. Introduction

In lupus, there is an important autoreactivity of B lymphocytes shown by the production

of more than 160 specificities of autoantibodies and circulating immune complexes of

autoantibodies and autoantigens [1–3]. The dsDNA autoantibody is themost important

laboratorybiomarker of SLEassociated with both disease activity and renal dysfunction.

However, the autoantibody’s involvement in lupus immunopathogenesis still deserves

more investigation [4–6]. Although this antibody shows high SLE specificity, its

prevalence in different studies has been estimated to be around 50% [7, 8]. In addition,

dsDNA antibodies can be found in patients regardless of whether they have renal

disease. Interestingly, dsDNA antibodies exhibit a high degree of heterogeneity, as

shown by their cross-reactions with other autoantigens and different isotypes as well

as by changes in their affinity to bind dsDNA epitopes [9–11]. This study investigated

the prevalence of dsDNA autoantibodies of high avidity and their correlations with

clinical and laboratory findings in SLE patients living in northeastern Brazil. In addition,

these correlations were compared to those obtained with total dsDNA antibodies and

nucleosome antibodies.

2. Material and Methods 2.1. Patients. One hundred forty-two SLE female patients from the Rheumatology

Service of the Santa Izabel Hospital (Salvador, Bahia) were consecutively enrolled in

this study. All had a previous diagnosis of lupus and exhibited four or more criteria for

SLE [12]. Lupus activity was scored with the SLEDAI-2K [13]. Prednisone was the main

medication used by the patients (132/142, 93.0%), combined with Chloroquine or

Chloroquine plus Azathioprine (89/132, 67.4%). Thirtytwo patients (32/132, 24.2%)

were taking Methotrexate plus Prednisone and Chloroquine, combined or not with

Azathioprine. Cyclosporine was rarely used (7/132, 5.3%). All patients signed an

informed consent form to participate in this study, which was approved by the Ethics

Committee of the Santa Izabel Hospital.

34

2.2. Laboratory Investigation. Anti-dsDNA IgG antibodies were first tested by the

indirect fluorescent antibody test with Crithidia luciliae (CLIFT), followed by an indirect

ELISA to measure their serum levels (Orgentec Diagnostika GmbH, Germany).

Afterward, the presence and levels of high avidity dsDNA IgG antibodies were

measured with the QUANTA Lite test HA dsDNA ELISA (INOVA Diagnostics Inc., San

Diego, CA, USA). The cutoffs in the ELISA test were 25 IU/mL and 30 IU/mL,

respectively. An indirect ELISA, using a cutoff of 20U/mL (Orgentec), determined the

levels of nucleosome antibodies. Cellular analysis of blood was done with the

cytometer CellDyn-Ruby (Abbot Diagnostic Inc., USA) while inflammation was

measured by erythrocyte sedimentation rate. Serum levels of complement C3

(reference range = 67–149mg/dL) and C4 (reference range = 10–38mg/dL) were

determined by nephelometry in the Image Immunochemistry System (Beckman-

Coulter, USA). In addition, the presence of renal dysfunction was obtained by chemical

and microscopic examination of fresh urine using the analyzer LabUMat UriSed

(Electronic Muszeripari Kft, Budapest). Colorimetric methods measured the levels of

urine protein and urine creatinine. In this study, a significant proteinuria was a urine

protein/creatinine ratio (P/C ratio) >0.23. This cutoff was calculated with a receiver

operating characteristics (ROC) curve using the P/C ratios of patients having negative

or positive diagnosis of lupus nephritis when they were included in the study (cutoff =

0.23, AUC = 0.904; sensitivity = 88.5%, specificity = 80.3%).

2.3. Statistical Analysis. The test of D’Agostino and Pearson analyzed the distribution

of the continuous variables, which were presented as mean ± SD or median and

interquartile range (IQR, 25−75%). The test of Spearman performed correlation

analyses, which were validated for their statistical significance in accordance with the

number of XY pairs tested.Themeans andmedians of two groups were compared with

the unpaired �-test and � test ofMann-Whitney, respectively. The significance level

was significant at � < 0.050. The statistical software GraphPad 6.0 and MedCalc 13.0

were used.

Journal of Immunology Research

35

3. Results 3.1. Clinical and Demographic Data. Lupus patients had a mean age of 40.6 ± 12.9

years (95% CI = 38.5–42.7 years), ranging from 17 to 79 years. The median of lupus

duration in these women was eight years, varying from 0.4 to 40 years. One hundred

twenty-five patients (88.0%) had active lupus. In 80/142 (56.3%) patients, the activity

varied from moderate to very high (median = 9, range 6–31). Sixty patients had a

clinical diagnosis of kidney disorder demonstrated by proteinuria and presence of urine

leukocytes, erythrocytes, and less frequently urinary casts [14]. Autoantibodies and

low C3 and C4 levels were found in different prevalence in the patients, predominating

ANA, AnuA, and dsDNA antibodies (Table 1).

3.2. Correlation Analysis. There was a correlation between the levels of total dsDNA

antibodies and HA dsDNA antibodies (XY pairs = 66, � = 0.50; � < 0.0001). On the

other hand, the levels of total dsDNA antibodies and ofHA dsDNA antibodies were

correlated with ANuA levels (XY pairs =70, � = 0.34; � = 0.004 and XY pairs = 65, �

= 0.61, � < 0.0001, resp.). However, the correlation between HA dsDNA antibodies

and nucleosome antibodies was higher (� = 0.044). The levels of total dsDNA

antibodies were only correlatedwith SLEDAI scores and C3 levels.Differently, the

levels of both HA dsDNA antibodies and ANuA, besides correlating with SLEDAI

scores and the C3 levels, were also correlated with C4 levels and ESR (Table 2).

3.3. Proteinuria, C3, and Autoantibody Levels. The serum levels of C3 were lower in

the patients with a P/C ratio >0.23 (Figure 1). There was a difference between the

levels of HA dsDNA antibodies in patients with and without proteinúria (P/C ratio >

0.23; � = 0.037). However, the levels of total dsDNA antibodies and ANuA were similar

in these two groups of patients (� = 0.571 and � = 0.065, resp.) (Figure 2).

4. Discussion

Anti-dsDNA IgG autoantibodies are important biomarkers in systemic lupus

erythematosus. Nevertheless, the Farr RIA or another immunoassay to detect high

avidity dsDNA antibodies is not routinely used in the rheumatology laboratory, being

widely substituted by ELISA tests that measure total dsDNA antibody levels. These


36

immunoassays do not discriminate between antibodies of low and high affinity or

antibodies that cross-react with dsDNA epitopes. In contrast, ELISA tests that detect

HA dsDNA are comparable to Farr RIA [10, 15–19]. Although dsDNA antibodies have

been associated with lupus activity and lupus nephritis, the role of these antibodies in

SLE pathogenesis still deserves more study. To date, renal disease has been

demonstrated in a large proportion of SLE patients who are seronegative for dsDNA

antibodies and can be absent in patients who have high levels of these autoantibodies.

Previously, we did not find an association between laboratory findings of lupus kidney

disease such as proteinúria and altered urine exam in Brazilian patients with high levels

of total dsDNA antibodies. Such observation suggested the need of more studies to

characterize the avidity of these autoantibodies [20]. In the present study, nucleosome

antibodies were correlated with total dsDNA antibodies and more strongly with HA

dsDNA antibodies. This finding was expected because nucleosome is amolecular

complex constituted by histones, nonhistone proteins, and dsDNA. Thus, the presence

of dsDNA epitopes in nucleosome can elicit specific autoantibodies that also

participate in the immune reactions of tests that detect dsDNA antibodies, mainly of

high avidity, justifying these correlations.

Herein, we demonstrated that total dsDNA antibodies measured by a routine indirect

ELISA can present a correlation with lupus activity and C3 levels. However, the levels

of HA dsDNA antibodies and ANuA, besides exhibiting good correlation with SLEDAI

and C3 levels, were also correlated with low C4 levels and ESR. In lupus, immune

complexes formed by IgG and IgM autoantibodies and selfantigens activate

complement lowering both C3 and C4 levels. Both low C3 and C4 are biomarkers of

disease activity and were recently included as immunologic criteria for SLE by the

Systemic Lupus International Collaborating Clinics (SLICC) group [21]. Together with

dsDNA antibodies, low C3 and C4 are also biomarkers of lupus nephritis, but low C3

levels seem to be more sensitive than low C4 levels to diagnose renal SLE flares. In

the present work, C3 levels were more strongly correlated with the levels of HA dsDNA

antibodies, being that this correlation was higher than that of C4 levels. In contrast with

C4 levels, C3 levels were lower in the patients with renal disorder. Interestingly, only

the levels of HA dsDNA antibodies were higher in SLE patients with proteinuria, here

demonstrated by a urine P/C ratio above 0.23. Compared with 24 h urine protein, the


37

use of spot urine P/C ratio still is controversial. However, several studies have

supported the use of P/C ratio in the clinical practice, and it has been recently adopted

by the SLICC study [21]. The findings presented here do not exclude the participation

of other immune mediators in the pathogenesis of kidney disease in these

individuals.Thus, the contribution of C1q antibodies, as well as the involvement of

different isotypes of dsDNA antibodies, activated T lymphocytes, or inflammatory

cytokines, must also be considered [22–24].

In conclusion, HA dsDNA antibodies can be found with high prevalence in Brazilian

women with SLE and seem to be important biomarkers of active disease and contribute

to kidney dysfunction in these patients.


38


39


40

Conflict of Interests

The authors have no conflict of interests that is directly relevant to the content of this

paper.

Acknowledgments

Research is supported by the National Council for Scientific and Technological

Development (CNPq), Grant 306.097/2010-9. Ajax M. Atta, Maria L. B. Sousa Atta,

and Mittermayer B. Santiago are recipients of CNPq-BPQ fellowships. Isabela

S.Oliveira is a recipient of a CAPES scholarship and Rodrigo C. Oliveira is recipient of

a FAPESB scholarship.

41

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43

CAPÍTULO 2

Original Article - Higher level of IL-6 in Jaccoud’ s arthropathy secondary

to systemic lupus erythematosus: a perspective for its treatment?

Rheumatology InternationalClinical and Experimental Investigations © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2014 10.1007/s00296-014-3069-0

Original Article

Higher level of IL-6 in Jaccoud’s arthropathy secondary to systemic lupus erythematosus: a perspective for its treatment?

Ajax Mercês Atta1, Rodrigo C. Oliveira2, Isabela S. Oliveira2, Mariana P. Menezes2, Taciana P. S. Santos2, Maria Luiza B. Sousa Atta1 and Mittermayer B. Santiago3

(1) Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal da Bahia, Salvador, Bahia, Brazil

(2) Programa de Pós-Graduação em Imunologia, Universidade Federal da Bahia, Salvador, Bahia,

Brazil

(3) Escola Bahiana de Medicina e Saúde Pública, Rua Frei Henrique 8, Nazaré, Salvador, Bahia, 40050-420, Brazil

Mittermayer B. Santiago Email: [email protected] Received: 24 March 2014Accepted: 5 June 2014Published online: 18 June 2014 Abstract Jaccoud’s arthropathy (JA) is a condition characterized clinically by ‘reversible’ joint deformities along with an absence of articular erosions on a plain radiograph. The main clinical entity associated with JA is systemic lupus erythematosus (SLE) with a prevalence of around 5 %. The aim of the present study was to compare the inflammatory markers including cytokine levels in blood of SLE patients with and without JA. Patients with diagnosis of SLE as defined by ACR criteria were screened and divided in two groups, one with JA and one control group without JA. Erythrocyte sedimentation rate (ESR), C-reactive protein (CRP), complement C3 and C4 levels antinuclear antibodies (ANA), anti-dsDNA antibodies and serum levels of IL-2, IL-6, IL-10, IL-21, IL-22 and TNF-α were determined in all patients. Eighty female patients with SLE, 18 (22.5 %) with JA and 62 (77.5 %) without JA, were included in this study. JA patients had higher disease duration (p = 0.008), ESR (p < 0.001), CRP level (p = 0.002), ANA titer (p < 0.001) and dsDNA antibody level (p = 0.009). The serum levels of IL-2, IL-10, IL-21, IL-22 and TNF-α were not significantly different between the two groups (p > 0.05), but

44

the level of IL-6 was higher in JA group (p < 0.001). The serum level of IL-6 might have a correlation with JA secondary to SLE. Keywords: Jaccoud’s arthropathy Systemic lupus erythematosus Cytokines Interleukin-6 Introduction Jaccoud’s arthropathy (JA) is a condition characterized clinically by ‘ reversible’ joint deformities, such as swan neck, thumb subluxation and ulnar deviation, along with an absence of articular erosions on a plain radiograph. It was initially described in patients with rheumatic fever (RF), but presently, the main clinical entity associated with JA is systemic lupus erythematosus (SLE) with a prevalence of around 5 % [1]. The etiopathogenic mechanisms of JA are not known, but some authors have suggested an association with hypermobility syndrome, whereas others have attempted to identify an association of different antibodies with JA in SLE patients, but their findings do not allow for the drawing of any definite conclusions. The aim of the present study was to compare the inflammatory markers including cytokine levels in blood of SLE patients with and without JA.

Patients and methods

Patients

It was a convenience sample including a group of well-studied JA patients and comparing it to an unselected group of SLE patients without JA followed up at our outpatient clinic. The diagnosis of SLE was defined by the American College of Rheumatology criteria [2]. The definition of JA was based on the preliminary criteria we have proposed and recently published [3]: (1) Typical joint deformities, such as swan neck, thumb subluxation, ulnar deviation, ‘boutonniere,’ genu recurvatum, hallux valgus and flat feet, which are correctable in a passive position; (2) presence or history of articular inflammation in the deformed joints, regardless of its intensity or etiology (RF, SLE, etc.); (3) absence of similar deformities in other healthy members of the same family; and (4) no erosion on plain radiographs regardless of the finding of erosions on magnetic resonance or high-performance ultrasound examination. These patients were clinically evaluated, filled out a standard questionnaire, underwent a detailed physical examination and had their medical records revised. Disease activity was evaluated by SLEDAI-2k 30-day score [4]. History of RF was an exclusion criterion. The ethics committee of our institution approved the study, and all patients signed an informed consent form before their voluntary participation.

Laboratory investigation

A blood sample was obtained from the patients for laboratory exams in the next day after clinical evaluation. Erythrocyte sedimentation rate (ESR) was determined using the Wintrobe method. Serum levels of C-reactive protein (CRP) were investigated by nephelometry using an ultrasensitive immunoassay from Beckman-Coulter having an analytical sensitivity of 0.06 mg/L (IMMAGE® 800 Immunochemistry System, Beckman-Coulter, USA). Complement C3 and C4 levels were also determined by nephelometry using the same apparatus. Antinuclear antibodies (ANA) were investigated by indirect fluorescent antibody test (IFAT), whereas anti-

45

dsDNA autoantibodies were tested by indirect ELISA (Orgentec Diagnostika, Germany). Serum levels of IL-2, IL-6, IL-10, IL-21, IL-22 and TNF-α were determined by enzyme-linked immunoassays (ELISA) of antigen capture (Ready-Set-Go!®, Ebioscience, USA). The analytical sensitivity of these immunoassays was for IL-2, IL-6 and IL-10 (2.0 pg/mL), IL-21 (31.0 pg/mL), IL-22 (8.0 pg/mL) and TNF-α (4.0 pg/mL).

Statistical analysis

The variable distribution was analyzed using the D’Agostino and Pearson’s omnibus normality test. Some results were expressed as mean ± standard deviation or median and interquartile interval (IQ) according their distribution. The Student’s unpaired t test and the Mann–Whitney test were used to compare the means and medians of the JA groups, respectively. Two categorical groups were compared by the Fisher’s exact test. All statistical tests used a p value <0.05 for statistical significance. Statistical analysis was performed using the software Prism 6.0 (GraphPad, USA).

Results

The patients were consecutively enrolled, and there was no male patient in this group. There were 80 female patients with SLE, 18 (22.5 %) with JA and 62 (77.5 %) without JA. This represents a sample obtained from the total SLE population attending our institution where the prevalence of JA in SLE previously described is 3.4 % [5]. Patients had a mean age of 40.7 ± 12.2 years, ranging from 17 to 70 years (95 % CI 38.0–43.4 years). The mean age was similar in both groups as well as the SLEDAI score and C3 and C4 levels (p > 0.05). However, these groups differed in disease duration (p = 0.008), ESR (p < 0.001), CRP level (p = 0.002), ANA titer (p < 0.001) and dsDNA antibody level (p = 0.009) (Table 1). In addition, the frequency of patients that were seropositive for dsDNA antibody was higher in JA group (p < 0.001). Table 1 Demographic and laboratory findings in systemic lupus erythematosus (SLE) patients with and without Jaccoud’s arthropathy (JA) JA negative JA positive p value Age (years) 39.9 ± 12.1 43.7 ± 12.6 0.258

Disease duration (years) 7.0 (4.0–12.0) 12.5 (8.0–16.5) 0.008

SLEDAI score 6.0 (3.0–10.0) 6.0 (4.0–13.0) 0.567

ESR (mm/h) 38.4 ± 16.7 51.4 ± 7.2 0.002

CRP (mg/L) 0.45 (0.24–0.78) 0.78 (0.58–1.67) 0.002

C3 (mg/dL) 95.1 (67.0–121.3) 72.9 (55.1–107.0) 0.112

C4 (mg/dL) 15.0 (11.5–20.0) 11.8 (6.4–16.8) 0.053

ANA 320 1,280 <0.001

dsDNA-Ab (IU/mL) 123.5 (60.0–278.3) 264.0 (216.0–373.5) 0.009

Data are presented as mean ± SD or median and IQR (25.0–75.0 %). Significance level p < 0.05 SLEDAI Systemic lupus erythematosus disease activity index, ESR erythrocyte sedimentation rate, CRP C-reactive protein, ANA antinuclear antibodies, dsDNA-Ab anti-double-stranded DNA antibodies

46

The serum levels of IL-2, IL-10, IL-21, IL-22 and TNF-α were not significantly different between the two groups (p > 0.05), but the level of IL-6 was higher in JA group (p < 0.001) (Table 2). We also demonstrated that in the control group, there was no difference in the level of IL-6 between those without synovitis as compared to those with synovitis [6.8 (4.7–14.9) vs. 5.6 (4.1–9.2)]. On the other hand, in patients with JA, the level of IL-6 was higher in those with active synovitis [16.9 (11.2–36.1) vs. 11.8 (8.2–26.7)], p = 0.002. Table 2 Serum cytokine levels in systemic lupus erythematosus (SLE) patients with and without Jaccoud’s arthropathy Cytokine (pg/mL) JA positive JA negative p value IL-2 12.0 (9.2–35.8) 8.2 (5.9–13.5) 0.072

IL-6 12.9 (10.1–27.0) 6.5 (4.3–11.6) 0.0002

IL-10 6.5 (4.1–9.9) 6.6 (5.0–9.8) 0.917

IL-21 110.3 (80.7–166.8) 120.9 (87.8–186.7) 0.500

IL-22 12.6 (9.9–16.0) 15.3 (9.1–24.6) 0.398

TNF-α 10.3 (6.3–29.7) 11.3 (6.2–22.6) 0.710

Cytokine levels are presented as median and interquartile range (Q1–Q3)

Discussion

The reasons why only about 5 % of the SLE or RF patients develop JA are not known. Although some studies have described an association of this arthropathy with autoantibodies namely anti-SSa/Ro, anticardiolipin and anti-DNA, they do not seem to have any etiopathogenic role in this condition as such association was not demonstrated in most studies addressing this issue and these antibodies are not detected in other disorders eventually complicated by JA such as RF (comprehensively reviewed in [1]). A genetic predisposition is an attractive candidate; however, no study has been done testing this hypothesis. Mutation of tenascin-x gene has been linked to the development of Ehlers Danlos syndrome [6]. As joint hypermobility is sometimes observed in JA, studying mutation of tenascin-x in JA would be a reasonable investigational approach. The present study revealed a higher level of IL-6 in serum of JA patients. Interleukin-6 is a pro-inflammatory cytokine that induces the synthesis of acute phase proteins and exerts immune effects on T and B cells, promoting the differentiation of B cells to plasma cells and the production of autoantibodies in SLE [7]. Increased IL-6 level has been correlated with SLE activity and high levels of dsDNA antibodies in this autoimmune disease [8, 9]. Thus, the observed rising in ESR, CRP level, ANA and dsDNA antibody titer could be secondary to higher level of IL-6 in SLE patients presenting JA. A previous study found higher level of IL-6 in SLE patients with joint deformities (either ‘pure’ JA or deforming erosive arthritis) as compared with those with prior or never had arthritis, suggesting that IL-6 might be important

47

in inducing joint deformities [10]. TNF-α is a cytokine actively involved in inflammation that can enhance the production of pro-inflammatory cytokines as IL-1, IL-6 and IL-8 and can either promote or resolve inflammatory responses [11]. This cytokine has a pivotal role in the development of the synovitis in rheumatoid arthritis. The level of this cytokine was not different in SLE with or without JA suggesting that this pro-inflammatory cytokine is not involved in the development of this arthropathy. Although these preliminary findings with a small number of patients do not allow us to establish a direct connection between IL-6 and JA, at least it opens a window for future investigation. Targeting this molecule with drugs such as tocilizumab, besides its proved benefit in rheumatoid arthritis, it has also been successfully utilized in SLE [12] and, in theory, could be an interesting approach for JA patients. Even more important than to demonstrate a higher level of IL-6 in patients with well-established joint deformities is to investigate whether SLE patients with higher serum IL-6 in the beginning of the disease are in greater risk for the development of JA. Larger prospective studies are necessary to evaluate this hypothesis. Acknowledgments Research supported by the National Council for Scientific and Technological Development (CNPq), Grant 306.097/2010-9. A.M. Atta, M.L.B. Sousa Atta and M.B. Santiago are recipients of CNPq-BPQ fellowships. J.P.M. Machado is a recipient of a CAPES scholarship and R.C. Oliveira and I.S. Oliveira are recipients of FAPESB scholarships.

Conflict of interest The authors have no conflict of interest that is directly relevant to the content of this manuscript. References

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49

CAPÍTULO 3 Artigo - Hiperprolactinemia em mulheres brasileiras com lúpus eritematoso sistêmico: envolvimento na disfunção renal e supressão da produção de autoanticorpos anti-RNP-70.

Hiperprolactinemia em mulheres brasileiras com lúpus eritematoso sistêmico: envolvimento na disfunção renal e supressão da produção de

autoanticorpos anti-RNP-70.

Rodrigo Carvalho Oliveiraa, Isabela Silva Oliveiraa, Mittermayer Barreto Santiagob, Maria

Luiza Brito de Sousa Attac, Ajax Mercês Attac,*

a Programa de Pós-Graduação em Imunologia, Instituto de Ciências da Saúde, Universidade

Federal da Bahia, Salvador, Bahia, Brasil

b Escola Bahiana de Medicina e Saúde Pública, Serviço de Reumatologia, Hospital Santa Izabel,

Salvador, Bahia, Brasil

c Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Faculdade de Farmácia, Universidade

Federal da Bahia, Salvador, Bahia, Brasil

*Autor correspondente: Laboratório de Pesquisa em Imunologia, Departamento de Análises

Clínicas e Toxicológicas, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal da Bahia, Rua Barão

de Jeremoabo 147, 40.170-115, Salvador, BA, Brasil. Tel./fax +5571 3283-6972. E-mail:

[email protected]

RESUMO ___________________________________________________________________________ Objetivo: O presente estudo investigou a presença e os efeitos da hiperprolactinemia na

atividade do lúpus, suas manifestações clínicas e produção de autoanticorpos em mulheres

brasileiras com LES. Métodos: O grupo alvo foi formado por 142 mulheres com LES, enquanto

o grupo controle foi representado por 307 mulheres sem lupus da população geral.

Prolactinemia foi determinada usando um imunoensaio quimioluminescente e cutoffs ajustados

para níveis deste hormônio antes e após a menopausa. A atividade da doença foi medida com o

SLEDAI-2K e os autoanticorpos detectados por imunofluorescência indireta e ELISA.

Resultados: Hiperprolactinemia leve a moderada foi encontrada em 19,7% das pacientes,

50

sendo verificado correlação entre os níveis de prolactina e os níveis de creatinina sérica e de

proteína na urina (p = 0,003 e p = 0,004, respectivamente). Pacientes com distúrbio renal,

apresentaram níveis mais altos de prolactina (p = 0,023). Exceto a observação de níveis mais

baixos de autoanticorpos RNP70 em mulheres com hiperprolactinemia (p = 0,003), os perfis de

anticorpos nucleares e de anticorpos antifosfolipídes foram inalterados em pacientes com

hiperprolactinemia. Adicionalmente, a prevalência e os níveis de anticorpos anti-RNP70 em

pacientes com fenômeno de Raynaud foram menores nas pacientes com hiperprolactinemia

Conclusões: Hiperprolactinemia pode ser encontrada em importante poporção de mulheres

brasileiras com LES, e poderia estar envolvida com disfunção renal e supressão da produção de

auto-anticorpos anti-RNP70 em pacientes com fenômeno de Raynaud.

Palavras-chave: Hiperprolactinemia; Lúpus; Distúrbio renal; auto-anticorpos RNP70;

mulheres brasileiras

______________________________________________________________________

ABSTRACT ______________________________________________________________________ Objective: This study investigated the presence and effects of hyperprolactinemia on lupus

activity, clinical manifestations and autoantibody production in Brazilian SLE women.

Methods: On hundred and forty-two female patients with SLE and 307 healthy control women

participated of the study. Prolactinemia was determined using a chemiluminescent

immunoassay and menopausal-adjusted cutoffs. Disease activity was scored with the SLEDAI-

2K and autoantibodies detected by indirect fluorescent antibody test (IFAT) and ELISA.

Results: Mild to moderate hyperprolactinemia was found in 19.7% of patients, and prolactin

levels were correlated with serum creatinine and urine protein levels (p = 0.003 and p = 0.004,

respectively). Patients with renal disorder, had higher prolactin levels (p = 0.023). Except the

lower serum level of RNP70 autoantibodies in hyperprolactinemic women (p = 0.003), the

profile of nuclear and of phospholipid antibodies was unaltered similar in patients with

hyperprolactinemia. Conclusions: Hyperprolactinemia can be found in Brazilian SLE, and

could be involved in renal dysfunction and suppression of RNP70 autoantibody production in

patients with Raynaud phenomenon.

Keywords: Hyperprolactinemia; Lupus; Renal disorder; RNP70 autoantibody; Brazilian

women.

51

1. Introdução

O lúpus eritematoso sistêmico (LES) é caracterizado por múltiplas manifestações

clínicas e importante autorreatividade imune mediada por autoanticorpos e células T,

acometendo predominantemente mulheres em idade fértil, alternando fases de atividade e

remissão. Devido à sua heterogeneidade clínica e sorológica, o LES poderia ser considerado

uma síndrome única apresentando manifestações clínicas variadas e um perfil diversificado de

autoanticorpos, que são influenciadas pela herança genética do paciente e fatores ambientais

[1-4]. Embora vários mediadores bioativos estejam envolvidos na patogênese do lúpus, como

interferon de tipo I, BAFF / BLyS, IL-6 e IL-10, hormônios como o estrogênio e prolactina

também influenciam a autorreatividade do Lúpus, incluindo a produção de autoanticorpos[5-

8].

A prolactina é o hormônio hipofisário responsável pelo desenvolvimento da glândula

mamária, lactogênese e galactopoiese, que tem sido estudado imunologicamente em doenças e

síndromes autoimunes. Além disso, a prolactina estimula a liberação de citocinas inflamatórias,

aumentando a produção de interferon-γ e a expressão do receptor de IL-2. Além disso, ela pode

inibir a apoptose por indução da expressão de supressores da morte celular e pode promover a

alteração no fenótipo de células dendríticas. A prolactina pode modular a atividade do lúpus e

potencializar a produção de autoanticorpos em doenças como as tireoidites autoimunes e o

diabetes mellitus tipo 1. Em camundongos BALB /c trangênicos para a cadeia pesada γ2b do

anticorpo anti-dsDNA patogênico R4A, uma diminuição no título deste autoanticorpo foi

observado tratando estes animais com bromocriptina, melhorando a sobrevida. No lúpus

humano, uma diminuição na atividade desta doença foi verificada nos pacientes com

hiperprolactinemia após o tratamento com este agonista da dopamina [8-18].

No entanto, ainda existem controvérsias quando os resultados de diferentes estudos

sobre o efeito da hiperprolactinemia na produção de autoanticorpos e atividade do lúpus são

confrontados, provavelmente refletindo diferenças de metodologia e características da

população com LES estudada. Neste trabalho, investigamos em mulheres brasileiras residentes

na Bahia os efeitos da hiperprolactinemia sobre a atividade do lúpus e suas manifestações

clínicas, além da sua influência sobre o perfil de autoanticorpos produzidos. Para tanto,

utilizamos um imunoensaio quimioluminescente aceito internacionalmente para determinar os

níveis séricos de prolactina, com valores de referência deste hormônio ajustados para mulheres

na pré e pós-menopausa.

52

2. Pacientes e métodos

2.1. Pacientes

Cento e quarenta e duas mulheres com LES do Serviço de Reumatologia do Hospital

Santa Izabel (Salvador, Bahia, Brasil), apresentando quatro ou mais critérios do Colégio

Americano de Reumatologia para LES [18] participaram deste estudo. A idade média destas

mulheres foi 40,6 ± 12,9 anos (IC 95% = 38,5-42,7 anos) e a duração média da doença foi de

8,0 anos (IQR = 4 -13 anos). A atividade do lúpus medida pelo Systemic Lupus Erythematosus

Disease Activity Index (SLEDAI-2K) apresentou uma mediana de 6,0 (IQR = 2.0 -10.0,

variando de 0 a 31,0). A maioria das pacientes utilizavam prednisona, a qual foi associada com

outros medicamentos quando necessário. O grupo controle foi composto por 307 mulheres sem

lupus, aparentemente saudáveis, também da Bahia (idade = 40,6 ± 12,5 anos; IC95% = 39,2-

42,0 anos). O Comitê de Ética do Hospital Santa Izabel aprovou este estudo, e cada paciente

assinou o consentimento livre e esclarecido para participar do mesmo.

2.2. Avaliação Laboratorial

Análises hematológicas foram realizadas com o citômetro CELL-DYN® Ruby

(Abbott Abbott Diagnostic, Illinois, USA). Os níveis séricos de complemento C3 e C4 foram

determinados por nefelometria imune (Immage Immunochemistry System, Beckman-Coulter,

USA). Os níveis de prolactina foram medidos com um imunoensaio quimioluminescente

automatizado usando o analisador imune Access2 (Beckman-Coulter, EUA; faixa de medição

0,25 a 200 ng/mL). Os níveis normais de prolactina sérica foram 3,34-26,72 ng/mL e 2,74-

19,64 ng/mL para mulheres na pré-menopausa (<50 anos de idade) e menopausadas (≥ 50 anos

de idade) , respectivamente.

Os níveis séricos de creatinina, proteinúria e creatinina urinária foram medidos com

testes colorimétricos automatizados. As análises química e microscópica das amostras frescas

de urina das pacientes com LES foram realizadas com o sistema automatizado LabUMat e

UriSed (77 Elektronika Kft, Budapeste, Hungria).

Anticorpos antinucleares foram detectados por teste de imunofluorescência indireta

com células HEp-2 (IFA ANA HEP-2-IgG, Viro-Immun, Labor-Diagnostika GmbH,

Germany). Autoanticorpos contra antígenos nucleares (nucleossomo, SM, RNP70, SS-A / Ro,

SS-B / La) e contra o antígeno da proteína ribossomal P do citoplasma (Rib-P) foram testados

53

por testes de ELISA indiretos (Orgentec Diagnostika, GmbH, Germany). Por sua vez,

anticorpos de alta avidez para dsDNA foram investigados com o teste de ELISA QUANTA

Lite® HA dsDNA (INOVA Diagnostics, San Diego, CA, EUA). Anticorpos antifosfolípides

(anticardiolipina e anti-β2glicoproteina I) também foram investigados por testes de ELISA

indiretos da Orgentec. Todos os imunoensaios foram realizados de acordo com as instruções

dos fabricantes.

2.3. Analise Estatística

O teste de D'Agostino e Pearson foi utilizado para a análise da distribuição das

variáveis.contínuas. Medianas e intervalo interquartil (Q1-Q3) ou médias ± DP foram usadas

para expressar os resultados após a análise da distribuição. O teste-U de Mann-Whitney

comparou as medianas de dois grupos, e o teste do qui-quadrado analisou diferenças nas

proporções de grupos categóricos. O teste de Spearman foi utilizado para correlacionar duas

variáveis, enquanto que o teste exato de Fisher analisou a associação entre dois grupos

categóricos. As análises estatísticas foram realizadas com o auxílio dos softwares Prism 6.0

(Graphpad Inc., USA) e MedCalc 13.0 (MedCalc Software, USA). Um valor de p inferior a

0,050 foi considerado significante.

3. Resultados

3.1. Achados Clínicos e Demográficos

Cento e oito em 142 pacientes (76,0%) estavam na pré-menopausa (idade mediana =

35,5 anos), enquanto 34 (24,0%) eram mulheres menopausadas (idade mediana = 57,5 anos).

No grupo de controle, 233 de 307 (75,9%) eram mulheres na pré-menopausa (idade mediana =

37,0 anos), enquanto 74 (24,1%) eram mulheres menopausadas (idade mediana = 55,0 anos).

Aumento nos níveis de prolactina foram encontradas em 28/142 mulheres com SLE (19,7%) e

em 16/307 em mulheres do grupo controle (5,2%, p <0,0001). O nível médiano de prolactina

em mulheres tanto na pré-menopausa como na menopausa foi maior nos grupos de SLE em

comparação com os grupos controles (figura 1). Em contraste, a mediana dos níveis de

prolactina acima dos valores de referência (hiperprolactinemia) foram maiores nas mulheres do

grupo controle (figura 2).

Pacientes com e sem hiperprolactinemia apresentaram similares valores de VHS (41 ±

16 mm vs. 41 ± 15 mm) e similares níveis de C3 (86 ± 25 mg / dL vs. 95 ± 35 mg / dL) e C4

54

(15 g / dL, IQR = 10 - 19 mg / dl contra 15 mg / dL, IQR = 11 -. de 21 mg / dL) (p> 0,050). As

prevalências das principais manifestações clínicas das pacientes, bem como a atividade lúpica

das mesmas, não foram afetadas por níveis altos de prolactina (tabela 1). Uma correlação

negativa foi observada entre os níveis de prolactina e a duração do LES (pares XY = 141, r = -

0,24, p = 0,005). Diferentemente, correlações positivas foram observadas entre os níveis de

prolactina e de creatinina urinária (XY pares = 142, r = 0,25, p = 0,003) e entre os níveis de

prolactina e de proteinúria (pares XY = 137, r = 0,25, p = 0,004). Adicionalmente, os níveis de

prolactina foram maiores nos pacientes com comprometimento renal (p = 0,026) (Figura 3).

3.2 Prolactina e Produção de Autoanticorpos

Exceto autoanticorpos anti-RNP70, cujos títulos foram menores nas pacientes com

hiperprolactinemia (fig. 4), a presença de níveis aumentados de prolactina não teve influência

sobre os títulos de ANA ou sobre os níveis e prevalência de anticorpos contra os seguintes

antígenos: nucleossomo, SS-A / Ro, SS-B / La , Sm, e Rib-P (tabela 2). A prevalência de

anticorpos antifosfolípides foi também semelhante nos dois grupos de pacientes. Onze das 28

pacientes com hiperprolactinemia (39,3%) tinham anticorpos anti-β2GPI, predominando

anticorpos IgA anti--β2GPI , enquanto que anticorpos anticardiolipina foram detectados em

três mulheres deste grupo (10,7%). No grupo sem hiperprolactinemia, 27 das 114 pacientes

(23,7%) tinham anticorpos anti-β2GPI, também predominando anticorpos IgA anti-β2GPI,

enquanto 12 (10,5%) foram soropositivas para anticorpos anticardiolipina.

3.3 Anticorpos anti-RNP-70, hiperprolactinemia e fenômeno de Raynaud

Setenta e três das 142 pacientes com LES (51,4%) apresentaram relato clínico de

fenômeno de Raynaud. Destas, 28 tinham anticorpos anti-RNP-70, cujos títulos foram mais

altos quando comparados às pacientes sem tal manifestação clínica (figura 5). Embora a

presença de hiperprolactinemia não tenha sido associada com o fenômeno de Raynaud (teste

exato de Fisher, p = 0,673), os níveis de anticorpos anti-RNP70 foram mais baixos nas mulheres

lúpicas hiperprolactinêmicas que tinham relato do mesmo (figura 4).

55

4. Discussão No presente estudo, investigamos em mulheres com LES residentes na Bahia os

efeitos da hiperprolactinemia sobre a atividade do lúpus, incluindo as suas manifestações

clínicas e produção de autoanticorpos. Para tanto, usamos um imunoensaio quimioluminescente

de captura previamente validado para a população local, com valores de referência para

prolactinemia ajustados de acordo com a menopausa. Adicionalmente, incluímos um grande

grupo controle de mulheres sem lúpus, com idades semelhantes, da população geral. Assim,

demonstramos que valores mais altos de prolactina podem ser encontrados em maior proporção

nos pacientes com LES quando comparados com seus controles, inclusive na menopausa. Esse

aumento nos níveis séricos de prolactina no LES em mulheres brasileiras acometidas desta

doença está de acordo com os resultados de alguns estudos realizados em diferentes países [20].

No entanto, nós observamos que o nível mediano de prolactina em mulheres lúpicas com

hiperprolactinemia foi inferior ao exibido pelas mulheres com hiperprolactinemia do grupo

controle, sugerindo que a prednisona poderia modular negativamente a produção deste

hormônio, em pacientes tratados com este glicocorticóide [21].

Em nosso estudo, a hiperprolactinemia não foi correlacionada com a atividade lúpica,

nem foi associada com algumas manifestações clínicas importantes como anemia ou serosite

como anteriormente documentado em outra população fora do Brasil [22, 23]. No entanto, os

níveis séricos de prolactina foram correlacionados com os níveis de creatinina no soro e de

proteína urinária. Além disso, níveis de prolactina mais elevados foram observados em

pacientes com comprometimento renal documentado por achados de proteinúria, hematúria

e/ou cilindros urinários. Juntos, estes dados sugerem o envolvimento de prolactina nesta

importante manifestação clínica, observada em alta prevalência nas pacientes aqui estudadas, o

que poderia em parte ser justificado por sua ancestralidade africana [4]. A observação que

pacientes com e sem hiperprolactinemia apresentavam similar prevalência de anticorpos anti-

dsDNA de alta avidez e níveis semelhantes de C3 e C4, sugere que fatores adicionais

contribuem para a atividade lúpica e doença renal na população estudada [24-26]. Embora a

participação de hiperprolactinemia na atividade do lúpus ainda seja um achado controverso

[23,27, 28], a presença de níveis elevados de prolactina no soro e na urina de pacientes lúpicos

com doença renal grave, diminuindo após o tratamento, foi relatada anteriormente e poderia

justificar nossos resultados [29].

Em nosso estudo, a hiperprolactinemia não teve efeito sobre a prevalência e títulos de

ANA, nem influenciou a prevalência e os títulos de autoanticorpos antinucleares, anti-Rib P ou

56

antifosfolípides. Contudo, o achado de níveis mais baixos de anticorpos anti-RNP70 em

pacientes com hiperprolactinemia contrastou com estes resultados.

Anticorpos anti-U170KDa têm sido detectados mais frequentemente em pacientes

lúpicos que apresentam o fenômeno de Raynaud e na doença mista do tecido conectivo [30,

31]. Contudo, no nosso estudo não encontramos uma associação entre tais anticorpos e a

presença do fenômeno de Raynaud, o que poderia ser justificado pelas características da

população investigada.

Tem sido demonstrado que a apoptose desempenha papel importante na estimulação

da resposta imune de anticorpos contra a ribonucleoproteína U1-70KDa. Durante o processo de

morte celular, esta ribonucleoproteína pode ser modificada no processo de apoptose pela

enzima caspase 3, resultando em um fragmento de 40 KDa, ou então através da granzima B,

com formação de um fragmento de 60KDa. Este antígeno pode também sofrer fragmentação

oxidativa por espécies reativas de oxigênio, com produção de fragmentos de 33-38KDa, ou

ainda ser degradado durante a necrose celular. Epítopos criptícos são gerados a partir destas

modificações, como demonstrado para o epítopo do fragmento de 40kDa, causando o

espalhamento (epitope spreading) da resposta imune contra outros epítopos da

ribonucleoproteína U1-70K intacta e do complexo U1-RNP (U1-A, U1-C, E U1-70KDa) [32].

Neste estudo, observamos que os níveis de anticorpos anti-RNP70 foram mais altos nas

pacientes com fenômeno de Raynaud, porém mais baixos nas pacientes hiperprolactinêmicas

com esta manifestação clínica. Assim, nossos resultados sugerem que a prolactina ao inibir a

apoptose através da indução da expressão de supressores de morte celular poderia limitar a

produção de anticorpos anti-RNP70 devido a menor geração de autoepítopos crípticos no

processo apoptótico. Contudo, tal possibilidade necessita de comprovação experimental, sendo

importante a análise imunoquímica da especificidade dos anticorpos anti-RNP70 detectados

nas pacientes lúpicas com fenômeno de Raynaud, com e sem hiperprolactinemia, pois tem sido

reportado que nesta manifestação clínica tais imunoglobulinas reagiriam preferencialmente

contra epítopos gerados por modificação oxidativa da U1-70KDa devido ao processo de

isquemia/reperfusão [33]. A partir desta investigação, poderíamos estabelecer definitivamente

a inibição mediada pela hiperprolactinemia sobre a produção de anticorpos anti-RNP70.

No geral, alguns dos nossos resultados diferem aqueles obtidos em estudos realizados

com outras populações de LES. No entanto, essa divergência pode ser justificada por diferenças

no background genético das pacientes e também pela existência de fatores ambientais,

socioeconômicos e culturais distintos que estariam interagindo com o sistema imune das

mesmas [34]. Além disso, diferenças nos imunoensaios para determinação de níveis de

57

prolactina usados anteriormente, incluindo os seus pontos de corte para hiperprolactinemia,

além da inclusão de uma amostragem adequada de pacientes e controles, são aspectos que

também devem ser considerados na comparação dos resultados.

Em conclusão, hiperprolactinemia pode ser encontrada com importante prevalência

em mulheres brasileiras com lúpus eritematoso sistêmico, sendo parcialmente suprimida pelo

uso de prednisona. Embora a hiperprolactinemia não se correlacione com a atividade do lúpus

ou com as suas várias manifestações clínicas nestas mulheres, ela poderia ter envolvimento na

disfunção renal apresentada pelas mesmas e suprimir a produção de autoanticorpos RNP 70 em

pacientes com fenômeno de Raynaud.

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60

Figura 1. Níveis de prolactina sérica em mulheres controles e em mulheres com LES de acordo com a ausência (GC1 e LES 1) ou presença de menopausa (GC2 e LES2). GC1 (n = 233; mediana = 9,1 ng/mL; IQR = 6,8 – 13,8 ng/mL), LES1 (n = 108; mediana = 13,6 ng/mL; IQR = 9,2 – 23,1 ng/mL), GC2 (n = 74; mediana = 6,3ng/mL; IQR = 4,8 – 8,5 ng/mL) e LES2 (n = 34; mediana = 9,2 ng/mL; IQR = 6,5 – 18,2 ng/mL).

Figura 2. Níveis aumentados de prolactina em mulheres controles (GC, n = 16; mediana = 44,7 ng/mL; IQR = 33,7 – 70,5 ng/mL) e em mulheres portadoras de LES (LES, n = 28; mediana = 33,4 ng/mL, IQR = 27,2 – 38,0 ng/mL). Grupos testados pelo teste U de Mann-Whitney.

61

Tabela 1. Prevalência de manifestações clínicas e escores da atividade lúpica (SLEDAI) em mulheres brasileiras com níveis normais de prolactina (NPRL) e hiperprolactinêmicas (HPRL) Clínica NPRL (n 114) HPRL (n 28) Valor de p

Artrite

n 112 (98,2%)

n 28 (100,0%)

> 0,050

Fotossensibilidade Eritema malar

n 85 (74,6%) n 70 61,4%)

n 22 (78,6%) n 16 (57,1%)

> 0,050

> 0,050

F. Raynaud n 59 (51,7%)

n 14 (50,0%) > 0,050

Envolvimento renal n 49 (43,0%) n 16 (57,1%) > 0,050

D neurológica n 27 (23,7%) n 07 (25,0%) > 0,050

Serosite n 28 (24,6%) n 05 (17,9%) > 0,050

Pleurite n 25 (21,9%) n 05 (17,9%) > 0,050

SAF n 17 (14,9%) n 07 (25,0%) > 0,050

SLEDAI (0 - 5)

SLEDAI (6 – 10)

SLEDAI (≥ 11)

n 49 (43,0%)

n 44 (38,6%)

n 21 (18,4%)

n 13 (46,4%)

n 08 (28,6%)

n 07 (25,0%)

> 0,050

> 0,050

> 0,050

SLEDAI (0 sem atividade, 1-5 baixa atividade, 6 -10 atividade moderada, 11 – 19 alta atividade e > 20 muito alta atividade).

62

Tabela2. Perfil de autoanticorpos em mulheres lúpicas brasileiras apresentando níveis normais de prolactina (NPRL) e hiperprolactinemia (HPRL)

ND, não determinado. São mostradas as prevalências, medianas e IQR (25.0%-75.0%) dos autoanticorpos. Título de ANA é a recíproca da maior diluição positiva do soro. Anticorpos anti-dsDNA de alta avidez é apresentada como UI/mL, enquanto os outros anticorpos são expressados em U/mL. Os grupos foram comparados com o teste U de Mann-Whitney.

Autoanticorpo NPRL (N 114)

HPRL (N 28)

Valor de p

ANA (n 104, 91,2%) 320 (160 – 1,280)

(n 27, 96,4%) 320 (80 – 640)

> 0,050

dsDNA (n 54, 47,4%) 184 (86 – 475)

(n 12, 42,8%) 384 (98 – 689)

> 0,050

Nucleosome (n 93, 81,6%) 142 (46 – 198.0)

(n 25, 89,3%) 81 (42 – 188)

> 0,050

SS-A/Ro (n 44, 38,6%)

85 (51 – 225)

(n 11, 39,3%) 87 (68-184)

> 0,050

SS-B/La (n 11, 9,6%) 101 (33 -289)

(n 2, 7,1%) 211 (58 – 364)

ND

Sm (n 27, 23,7%) 84 (50 – 335)

(n 8, 28,6%) 63 (52 – 354)

> 0,050

RNP 70 (n 36, 31,6%) 163 (95 – 252)

(n 12, 42,8%) 93 (37 – 104)

0,003

Rib-P

(n 18, 15,8%) 23 (17 – 200)

(n 2, 7,1%) 13 (11 – 16)

ND

63

Figura 3. Níveis de prolactina em mulheres lúpicas com e sem doença renal (DR positiva e DR negativa, respectivamente). As medianas foram 15,2 ng/mL (IQR = 9,5 – 23,5 ng/mL) e 10,4 ng/mL (IQR = 7,3 – 18,5 ng/mL), respectivamente.

NPR

L

HPR

L

Figura 4. Níveis de autoanticorpos anti-RNP70 em pacientes lúpicas com níveis normais de prolactina (NPRL) e com hiperprolactinemia (HPRL). As medianas corresponderam a 163,5 U/mL e 93,0 U/mL, respectivamente. Os grupos foram comparados pelo teste U de Mann-Whitney.

64

Figura 5. Níveis de autoanticorpos anti-RNP70 em pacientes lúpicas sem história clínica de fenômeno de Raynaud e com relato desta manifestação clínica (Raynaud negativo e Raynaud positivo, respectivamente). As medianas corresponderam a 98,0 U/mL e 188,0 U/mL, respectivamente. Os grupos foram comparados pelo teste U de Mann-Whitney.

An

ti-R

NP

70 (

U/m

L)

Figura 6. Níveis medianos de autoanticorpos anti-RNP70 em pacientes lúpicas com fenômeno de Raynaud, apresentando níveis de prolactina normais (NPRL, 237 U/mL) e com hiperprolactinemia (HPRL, 93,0 U/mL). Os grupos foram comparados com o teste U de Mann-Whitney.

65

4 CONCLUSÕES GERAIS

• Anticorpos anti-dsDNA de alta avidez são encontrados em importante prevalência de

mulheres brasileiras portadoras de LES, constituindo-se em importantes biomarcadores de

doença ativa, além de poderem participar da imunopatogenia da doença renal nestes

indivíduos. Quando detectados conjuntamente com proteinúria e baixos níveis de C3, estes

anticorpos podem fortalecer o diagnóstico da nefrite lúpica.

• Anticorpos anti-dsDNA podem complementar o diagnóstico da artropatia de Jaccoud e

existe uma possível relação entre niveis de citocinas IL-6 e essa artropatia. Embora estes

resultados preliminares tenham sido obtidos com um número pequeno dos pacientes, eles

oferecem a possibilidade de futuras investigações focadas no tratamento biológico desta

manifestação articular no lúpus eritematoso sistêmico.

• A presença de hiperprolactinemia pode ser verificada em mulheres brasileiras com LES,

sendo parcialmente suprimida pelo uso de prednisona. Embora a hiperprolactinemia não

tenha se correlacionado com a atividade do lúpus e várias manifestações clínicas neste

estudo, ela poderia ter envolvimento na disfunção renal e suprimir a produção de anticorpos

RNP-70 em pacientes com LES apresentando fenômeno de Raynaud.

66

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ANEXO - COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA PROF. CELSO FIGUEIRÔA HOSPITAL SANTAN IZABEL

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