UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
CENTRO DE TECNOLOGIA
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA
CAROLINE GONDIM DE SOUZA
EXTRAÇÃO DE COMPOSTOS BIOATIVOS E PECTINA DA CASCA DE
MARACUJÁ UTILIZANDO SISTEMA PRESSURIZADO E ULTRASSOM
FORTALEZA
2015
CAROLINE GONDIM DE SOUZA
EXTRAÇÃO DE COMPOSTOS BIOATIVOS E PECTINA DA CASCA DE
MARACUJÁ UTILIZANDO SISTEMA PRESSURIZADO E ULTRASSOM
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em
Engenharia Química, da Universidade
Federal do Ceará, como requisito parcial
para a obtenção do Título de Mestre em
Engenharia Química. Área de
Concentração: Processos Químicos e
Bioquímicos
Orientador: Dr. Edy Sousa de Brito
FORTALEZA
2015
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação
Universidade Federal do Ceará
Biblioteca de Pós-Graduação em Engenharia - BPGE
S714e Souza, Caroline Gondim de.
Extração de compostos bioativos e pectina da casca de maracujá utilizando sistema
pressurizado e ultrassom / Caroline Gondim de Souza. – 2015.
75 f. : il. color. enc. ; 30 cm.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Centro de Tecnologia,
Departamento de Engenharia Química, Programa de Pós-Graduação em Engenharia
Química, Fortaleza, 2015.
Área de Concentração: Processos Químicos e Bioquímicos.
Orientação: Prof. Dr. Edy Sousa de Brito.
1. Engenharia Química. 2. Resíduos. 3. Passiflora. 4. Flavonóides. I. Título.
CDD 660
CAROLINE GONDIM DE SOUZA
EXTRAÇÃO DE COMPOSTOS BIOATIVOS E PECTINA DA CASCA DE
MARACUJÁ UTILIZANDO SISTEMA PRESSURIZADO E ULTRASSOM
Dissertação apresentada à Coordenação
do Curso de Pós-Graduação em
Engenharia Química da Universidade
Federal do Ceará, como parte dos
requisitos para obtenção do título de
Mestre em Engenharia Química. Área de
concentração: Processos Químicos e
Bioquímicos.
Aprovada em: 26/ 02/2015
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, por sempre ter iluminado meus caminhos e por
ter me proporcionado força e coragem durante toda a minha jornada de trabalho.
Aos meus pais, Lucia e José, pelo grande amor, carinho, estímulo, ensinamentos
e dedicação em todas as etapas da minha vida.
Ao meu irmão Ronalty, por sempre acreditar em minha capacidade e por todo
apoio e carinho.
Ao meu orientador, Dr. Edy Sousa de Brito, pela paciência, amizade, confiança
em meu trabalho e conhecimentos compartilhados, de grande importância para minha
vida acadêmica.
Ao Programa de Pós-graduação em Engenharia Química e a todos os seus
professores, pela oportunidade de realização do mestrado e pelos ensinamentos
transmitidos.
À Embrapa Agroindústria Tropical pelas instalações concedidas durante a
realização da parte experimental da minha dissertação.
Aos colegas do laboratório Multiusuário químico de produtos naturais e aos
técnicos: Paulo, Tigressa Helena, Lorena, Adriana, Isabel, Karine, Patrícia, Jeferson,
Ana Maria e Marcelo pela ajuda na concretização deste projeto e pelos bons momentos
vividos.
Aos meus amigos do laboratório de Bioprocessos por me incentivarem sempre,
por estimularem meus conhecimentos e pela amizade desde a graduação.
À turma de mestrado, em especial as amigas Marcia lacerda e Djany Souza, pelo
carinho, amizade, companheirismo, pelas palavras de incentivo principalmente durante
os momentos mais difíceis e energia positiva construída e irradiada durante toda nossa
trajetória.
À Capes, pelo apoio financeiro.
A todos que direta ou indiretamente tornaram possível o cumprimento de mais
esta etapa.
“Plantar ideias ecológicas é a garantia de
um futuro fértil.”
Gabriel Garcia de Oliveira
RESUMO
O resíduo do maracujá, a casca, representa 90% do peso total da fruta fresca, que é
desperdiçado durante o beneficiamento do maracujá. Esse resíduo pode ser aproveitado
com a recuperação das substâncias bioativas e pectina, que possuem valor agregado.
Estes compostos possuem aplicabilidades nas indústrias de alimentos, farmacêuticas,
químicas e cosméticas. Diante do exposto, o objetivo do trabalho foi extrair compostos
bioativos e pectina da casca de maracujá. As extrações foram realizadas utilizando a
técnica de extração com solvente pressurizado (ESP) e extração assistida por ultrassom
(EAU). As condições de processo para a ESP foram: pressão de 10342-11721 kPa;
temperatura de 80ºC; enxague de 5 min; tempo de extração de 10 min em cada ciclo e
purga de 200s. E para a EAU as condições de processo foram: banho de ultrassom na
frequência ultrassônica de 40 kHz, potência real de 135 W, densidade de potência de
112500 W/m3
e tempo de extração de 10 min em cada ciclo. Todas as extrações foram
realizadas sequencialmente por três vezes, gerando três ciclos de extrações para cada
amostra. Os solventes utilizados foram: hexano, água, soluções de metanol/água e
etanol/água, nas proporções de 80:20, 70:30, 60:40 e 50:50 (v/v), respectivamente. A
extração de pectina foi realizada sequencialmente após a extração dos compostos
fenólicos, utilizando uma solução aquosa de ácido cítrico 1%. As extrações da pectina
foram realizadas seguindo as mesmas condições de processo utilizadas na EAU e na
ESP. As determinações analíticas realizadas no presente estudo foram: rendimento em
massa dos extratos, açúcares totais, determinação do teor de polifenóis totais,
identificação e quantificação dos compostos e caracterização do polímero péctico. Os
resultados apontam que a técnica de extração que se destacou foi a ESP, pois apresentou
uma metodologia rápida e simples. O tipo de solvente mais indicado é o etanol, pois
possui menor toxicidade ao consumidor. E a proporção 60:40 (v/v) revelou-se
promissora, pois proporcionou um rendimento de extrato total de 36%, um teor de
antioxidante de 466 mg/100g de casca de maracujá, um teor de 157 mg de
luteolina/100g de amostra e 244 mg de isoorientina/100g de amostra. O rendimento de
pectina extraída foi de 16g/ 100g de amostra tanto na ESP como para a EAU. A
caracterização da pectina aponta que a estrutura péctica possui basicamente galactose e
ácido galacturônico .
Palavras-Chaves: Resíduos. Passiflora. EAU. ESP. Flavonóides.
ABSTRACT
The residue of passion fruit, the peel represents 90% of the total weight of fresh fruit,
which is wasted during the passion fruit processing. This waste can be recycled with the
recovery of bioactive substances and pectin that have added value. These compounds
have applicability in the food, pharmaceutical, chemical and cosmetic industries. In this
context, the aim of this study was to extract bioactive compounds and pectin of passion
fruit peel. The extractions were carried out using the Pressurised Solvent Extraction
(PSE) and Ultrasound-Assisted Extraction (UAE). The PSE process conditions were:
pressure (10342-11721 kPa), temperature (80 °C), rinse (5 min), extraction time of each
cycle (10 min) and purge (200s). And UAE process conditions were: ultrasonic bath at
ultrasonic frequency (40 kHz), actual power (135 W), power density (112 500 W/m3)
and extraction time in each cycle (10 min). All extractions were performed three times
sequentially, yielding three cycles of extraction for each sample. The solvents employed
were: hexane, water, methanol solutions/water and ethanol/water in the proportions of
80:20, 70:30, 60:40 e 50:50 (v/v), respectively. The pectin extraction was performed
sequentially after the phenolic compounds extraction, using an aqueous solution of
citric acid 1%. The pectin extraction were performed following the same parameters
employed in the UAE and PSE. The analytical determinations performed in the present
study were: mass yield of the extracts, total sugars, determination of the content of total
polyphenols, identification and quantification of compounds and characterization of
pectin polymer. The results obtained showed that the extraction technique that
highlighted was the PSE, it presented a fast and simple methodology. The most suitable
type of solvent is ethanol because it has low toxicity to consumer. And the ratio 60:40
(v/v) proved promising, because afforded a yield of 36% total extract, an antioxidant
content of 466 mg/100g of passion fruit peel, a content of 157mg luteolin /100g of
passion fruit peel and 244 mg isoorientin/100g of passion fruit peel. The extracted
pectin yield was 16g/100g for both the PSE and the UAE. The pectin characterization
shows that the pectin structure has basically galactose and galacturonic acid.
Keywords: Waste. Passiflora. UAE. PSE. Flavonoids.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1- Estrutura básica dos flavonóides....................................................................... 7
Figura 2- Estrutura química da cadeia de pectina............................................................. 9
Figura 3-Precipitação alcoólica de pectina. .................................................................... 16
Figura 4- Casca de Maracujá com granulometria inferior ou igual a 50 micrometros. .. 17
Figura 5-Fluxograma da extração com solvente pressurizado. ...................................... 20
Figura 6-Extrato obtido utilizando ESP, na proporção 70:30 de etanol/água,
respectivamente. ............................................................................................................. 21
Figura 7- Fluxograma da extração assistida por ultrassom. ........................................... 23
Figura 8-Pectina purificada obtida nos experimentos. ................................................... 27
Figura 9-Gelatinização do extrato aquoso da casca de maracujá. .................................. 31
Figura 10- Rendimentos dos extratos: comparação entre as técnicas de extração e os
solventes. ........................................................................................................................ 35
Figura 11- Quantificação de luteolina-(7-O-glicopiranosil)-8-C-glicopiranosideo
(orientina-7-O-glicosideo). ............................................................................................. 40
Figura 12- Quantificação de isoorientina nos tratamentos. ............................................ 41
Figura 13- Espectro de RMN 1H da pectina isolada da casca de maracujá (a). Espectro
de RMN 1H da pectina dos estudos de Rosenbohm et al., (2003) (b). ........................... 44
Figura 14- Estrutura de um fragmento de pectina. ......................................................... 45
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Estudos realizados sobre extração de compostos fenólicos em diferentes tipos
de cascas de alimentos reportados na literatura. ............................................................. 13
Tabela 2 - Estudos realizados sobre extração de pectina em diferentes tipos de casca de
frutas reportados na literatura. ........................................................................................ 15
Tabela 3- Solventes extratores utilizados na etapa 1. ..................................................... 18
Tabela 4- Soluções extratoras utilizadas na etapa 2. ...................................................... 18
Tabela 5- Gradiente do método analítico. ...................................................................... 26
Tabela 6-Rendimento em massa dos extratos utilizando diferentes solventes. .............. 31
Tabela 7- Rendimento dos extratos avaliando a influência da concentração dos solventes
e de distintas metodologias de extração. ........................................................................ 33
Tabela 8- Teor de Polifenóis Totais: análise da influência da técnica de extração no teor
de polifenóis toatis. ......................................................................................................... 36
Tabela 9- Compostos que foram encontrados no extrato obtido utilizando ESP, na
proporção 60:40 de etanol/água, respectivamente. ......................................................... 39
Tabela 10- Rendimentos de pectina da casca de maracujá: análise da influência da
metodologia na extração. ................................................................................................ 43
Tabela 11- Dados de RMN-13
C e RMN-1H para pectina de casca de maracujá
comparada com a literatura............................................................................................. 45
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 1
2. REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................. 4
2.1 Maracujá ................................................................................................................. 4
2.2 Resíduos Agroindustriais ........................................................................................ 4
2.3 Aplicação da Casca de Maracujá ............................................................................ 5
2.4 Compostos Bioativos em Passiflora edulis ssp. ..................................................... 6
2.4.1 Flavonóides ...................................................................................................... 7
2.4.2 Pectina .............................................................................................................. 9
2.5. Extração ............................................................................................................... 10
3. MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 17
3.1 Coleta e preparo das cascas para extração ....................................................... 17
3.2 Etapas do Estudo .............................................................................................. 17
3.3 Obtenção dos extratos ........................................................................................... 19
3.3.1 Condições da extração com solvente pressurizado ....................................... 19
3.3.2 Condições da extração assistida por ultrassom ............................................. 21
3.3.3 Condições da extração de Pectina ................................................................. 22
3.4 Determinações analíticas ...................................................................................... 24
3.4.1 Rendimento dos extratos ................................................................................ 24
3.4.2 Rendimento de pectina ................................................................................... 24
3.4.3 Cromatografia líquida e espectrometria de massas ...................................... 25
3.4.4 Condições da análise de cromatografia líquida com detecção por arranjo de
diodos e ionização por electrospray espectrometria de massas ............................. 25
3.4.5 Cromatografia líquida de alta eficiência ....................................................... 26
3.4.6 Ressonância Magnética Nuclear da Pectina ................................................. 27
3.4.7 Polifenóis totais .............................................................................................. 28
3.4.8 Açúcares Totais .............................................................................................. 28
3.4.9 Análise Estatística .......................................................................................... 30
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 31
4.1 Testes utilizando diferentes tipos de solventes ..................................................... 31
4.1.1 Rendimento em massa dos extratos utilizando diferentes solventes .............. 31
4.1.2 Efeito do solvente no perfil de compostos fenólicos ...................................... 32
4.2 Influência da concentração dos solventes e de distintas tecnologia de extração .. 33
4.2.1 Rendimentos dos extratos ............................................................................... 33
4.2.2 Polifenóis Totais ............................................................................................. 35
4.2.3 Perfil de compostos fenólicos ......................................................................... 37
4.2.4 Influência da extração na concentração de flavonóides ................................ 40
4.3 Extração Sequencial da Pectina ............................................................................ 42
4.3.1 Rendimentos de Pectina ................................................................................. 42
4.3.2 Caracterização do polímero péctico por ressonância magnética nuclear .... 43
4.4 Considerações sobre os resultados ........................................................................ 46
5. CONCLUSÃO ........................................................................................................... 48
REFERÊNCIAS ........................................................................................................... 49
APÊNDICE A- Perfil cromatográfico da extração realizada com ESP utilizando água
(a) e metanol-água com solvente (b). ............................................................................. 58
APÊNDICE B- Espectro de RMN 1H usado para a determinação dos açúcares. .......... 59
APÊNDICE C- Perfil cromatográfico da extração realizada com EAU na proporção de
80:90 de Metanol: água, respectivamente (a). Perfil cromatográfico da extração
realizada com ESP na proporção de 80:90 de etanol: água, respectivamente (b). ......... 60
APÊNDICE D- Região referente aos picos identificados. ............................................. 61
APÊNDICE E: Perfis cromatográficos da análise de HPLC: (a) Perfil cromatográfico do
tratamento com solução de metanol (80:20)-ESP. (b) Perfil cromatográfico do
tratamento com solução de etanol (80:20)-EAU. ........................................................... 62
APÊNDICE F: Espectro HSQC da pectina. .................................................................. 63
1
1. INTRODUÇÃO
A fabricação anual de suco de maracujá no Brasil foi estimada em mais de
920.158 toneladas em 2010. O seu largo emprego no processamento industrial torna
inevitável a geração de grandes quantidades de casca como resíduo, causando um
impacto substancial ao meio ambiente. É de extrema importância encontrar alternativas
para a adequada conversão deste resíduo em produtos úteis à população (SEIXAS et al,
2014).
Uma boa alternativa para o emprego deste resíduo é a recuperação de suas
substâncias bioativas. Nos últimos anos, a procura por compostos bioativos vêm
aumentando devido a uma grande procura por produtos de origem natural e de seus
efeitos benéficos à saúde, tais como a diminuição de doenças degenerativas,
anticancerígeno, reduzir os fatores de risco cardiovascular, ação antioxidante, ação
antialérgica, efeitos anti-inflamatórios, antimicrobianos e entre outros. Devido a sua
enorme empregabilidade, em indústrias farmacêuticas, indústria de cosméticos, e de
alimentos dentre outras indústrias, estudos foram intensificados com o objetivo de
encontrar frutas, legumes, plantas e resíduos agroindustriais que sejam fonte destas
substâncias bioativas (MARTINS et al, 2011).
Estudos recentes mostram que a casca de maracujá apresenta uma gama de
compostos bioativos. Zuculotto et al. (2011) e Simirgiotis et al. (2013) em seus
experimentos encontraram vários flavonóides C-glicosídeos tanto na casca como no
suco de diversas espécies de Passiflora. Outro composto bastante encontrado na casca
de maracujá é a pectina. Vários autores relatam que a estrutura péctica é um ótimo
agente gelificante e estabilizante, possui aplicações em diversas indústrias e também
possui propriedades terapêuticas (PINEHIRO et al., 2008; WU et al., 2009; Silva et al.,
2011; ASSOI et al., 2014; SEIXAS et al., 2014).
O processo de extração exerce um crucial papel no preparo amostral, na
averiguação experimental e na análise qualitativa dos compostos. Tecnologias para
recuperar tais compostos foram desenvolvidas nos últimos anos, visando à redução do
tempo de processo, diminuição do uso de solventes orgânicos, além de elevar a
eficiência da extração, obtendo assim a redução dos custos de processo e ocasionando
menor impacto ambiental (HUANG et al., 2013; GONZÁLEZ-CENTENO et al., 2015).
2
Dentre as tecnologias recentes podemos citar a extração assistida por
ultrassom (EAU) que é uma das técnicas mais amplamente exploradas em âmbitos
laboratoriais e em escala industrial, devido a sua alta eficiência em extrair componentes,
baixo consumo de solventes, operação simples e baixa poluição ao meio ambiente
(GONZÁLEZ-CENTENO et al., 2015; TAO et al., 2014). Outra tecnologia é a extração
com solvente pressurizado (ESP) que oferece uma maior automação do processo de
extração, fornecendo elevados rendimentos de extrato, recuperação dos compostos e
tempos de processo mais curtos. Extrações simultâneas podem ser programadas, menos
solvente é utilizado durante o processo tornando-o eficiente e ambientalmente correto
(DING et al., 2011; BARROS et al., 2013 ; JENTZER et al., 2015).
Além do método de extração um importante fator que deve ser averiguado é
o tipo de solvente utilizado para promover a remoção dos compostos de interesse da
matriz do vegetal. Para a extração de compostos fenólicos de origem vegetal os
solventes alcoólicos são os mais utilizados. Misturas entre solventes alcoólicos e água
mostram-se mais eficientes, pois a água proporciona um aumento da polaridade do
solvente, com isso maiores teores de compostos fenólicos podem ser extraídos
(SULTANA et al., 2007; GIRONI e PIEMONTE, 2011; WIJEKOON et al., 2011;
HUSSAIN et al., 2012). Com relação à extração de pectina muitos estudos indicam que
o tipo de solvente mais adequado para sua extração são os ácidos fortes (PINHEIRO et
al., 2008; YAPO, 2009; BASANTA et al., 2012; SEIXAS et al.,2014). O ácido cítrico,
por exemplo, é frequentemente utilizado por proporcionar uma melhor propriedade de
solidificação (YAPO, 2009a).
A eficácia do processo de extração é grandemente influênciada pelos
parâmetros do processo, assim investigações são necessárias para elucidar as condições
ideais para a recuperação dos compostos bioativos e de pectina da casca de maracujá.
O objetivo geral deste trabalho foi comparar diferentes processos e
condições de extração de compostos bioativos e de pectina da casca de Passiflora edulis
f. flavicarpa. Os objetivos específicos foram:
- Avaliar o uso de diferentes solventes na extração de compostos fenólicos
da casca de maracujá;
3
- Avaliar a influência do tipo de solvente e sua mistura com a água sobre o
rendimento dos extratos, no teor de polifenóis totais e na quantidade dos compostos
extraídos;
- Avaliar a influência da técnica de extração sobre o rendimento dos
extratos, no teor de polifenóis totais e na quantidade dos compostos extraídos.
- Identificar os compostos bioativos presentes no extrato da casca de
Passiflora edulis ssp.;
- Verificar o rendimento de pectina e realizar a caracterização do polímero
péctico.
4
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Maracujá
O gênero Passiflora compreende cerca de 450 a 600 espécies de
maracujazeiros, sendo 150 originárias do Brasil (FERREIRA 2005; FALEIRO et al.
2008). Os países que se destacam com as maiores produções de maracujá em todo
mundo são Brasil, Equador e Colômbia (DE OLIVEIRA; DOCE ; DE BARROS, 2012).
O Brasil se destaca como principal produtor e consumidor mundial de maracujá (DE
OLIVEIRA et al., 2012). Conforme o censo do Instituto Brasileiro de Geografia e
Estatística (IBGE, 2012), o país produziu 923 mil toneladas de Maracujá em 2011.
As espécies de Passiflora que se destacam economicamente são Passiflora
edulis Sims f. flavicarpa Deg – comumente conhecida como maracujá amarelo ou azedo
ou peroba, Passiflora edulis Sims como maracujá roxo e o Passiflora alata Ait como
maracujá doce (SÃO JOSÉ et al., 2000). A espécie Passiflora edulis f. flavicarpa é a
mais amplamente cultivada devido à qualidade dos seus frutos, sabor apreciado por
muitos consumidores e por incentivo da agroindústria, correspondendo a 95% dos
pomares brasileiros (BERNACCI et al., 2003).
As principais utilizações do fruto do maracujazeiro no processo produtivo
são a sua comercialização in natura, e o seu beneficiamento em indústrias de sucos (DE
OLIVEIRA et al., 2012). A expressiva produção de suco tornam as cascas um fardo
substancial para as empresas e o meio ambiente (PINHEIRO et al., 2008).
2.2 Resíduos Agroindustriais
Toneladas de resíduos de atividades agroindustriais são geradas em todo
mundo (LAROZE; ZUNIGA-HANSEN, 2007). Nascimento, Calado e Carvalho
(2012), mencionam que o mesocarpo do maracujá corresponde a cerca de 90% do peso
total do fruto in natura que é descartado como lixo durante processamento. Este fato
corrobora para um déficit econômico na cadeia produtiva, uma vez que estes resíduos
são ricos em compostos bioativos, que são substâncias de elevado valor comercial
(AYALA-ZAVALA et al., 2011).
5
O emprego de resíduos agroalimentar de maneira eficiente, com um menor
custo e ambientalmente correta é altamente rentável. Uma das alternativas mais eficazes
para o reaproveitamento deste resíduo é a recuperação de constituintes bioativos
alimentares, o que é economicamente vantajoso para as indústrias farmacêuticas,
indústria de cosméticos e de alimentos (DE OLIVEIRA et al., 2009).
Dependendo da tecnologia disponível, os resíduos de commodities agrícolas
podem ser transformados em produtos comerciais, podendo ser utilizados como matéria
prima, como suprimentos operacionais e também na formulação de novos produtos.
2.3 Aplicação da Casca de Maracujá
Produtos oriundos de resíduos de frutas tropicais contêm altos níveis de
compostos bioativos (vitaminas, minerais, compostos fenólicos e fibras dietéticas), que
são benéficos à saúde (LOPEZ-VARGAS et al., 2013). Também podem ser utilizados
como aditivos alimentares (antioxidantes, antimicrobianos, corantes, aromatizantes e
espessantes) (AYALA-ZAVALA et al., 2011). Pesquisas abordam a aplicação da
farinha obtida da casca de maracujá na alimentação humana, visando aumentar o valor
nutricional e o teor de fibras. Vários exemplos podem ser citados: macarrão caseiro tipo
espaguete, barra de cereais, biscoitos, doce em calda entre outros. O consumo da farinha
de casca de maracujá auxilia na regulação da glicose, reduz as taxas de colesterol e
de triglicérides, as fibras presentes na farinha aumentam a capacidade de retenção de
água retardando o esvaziamento gástrico, além de possuir nutrientes importantes ao
nosso organismo, como niacina (vitamina B3), ferro, cálcio e o fósforo (OLIVEIRA,
et.al.,2002; MATSUURA, 2005; ISHIMOTO et al.,2007; SPANHOLI E OLIVEIRA,
2009).
Já na alimentação animal, Togashi et al. (2007) abordam que o uso de casca
e semente de maracujá na ração de frangos de corte aumenta consideravelmente os
teores de ácidos graxos insaturados, tanto da família ômega 3 como de ômega 6, nos
músculos das pernas dos frangos. Já Lousada et al. (2005) relatam que o subproduto do
maracujá apresenta bom valor nutritivo, podendo ser utilizado na dieta de ruminantes. A
casca de maracujá torna-se uma alternativa para nutrir rebanhos que enfrentam períodos
de seca e escassez de alimentos, alimentando-se com um subproduto de alto valor
6
nutritivo e de baixo custo. Portanto os resíduos agrícolas surgem como uma opção para
solucionar tal problema (LOUSADA et al., 2006).
A aplicação desses resíduos na alimentação humana ou animal como fonte
alimentar mostra-se vantajosa, uma vez que ocorre uma diminuição dos custos e
concomitantemente tem-se um aumento do valor nutricional do produto, devido ao
acréscimo do teor de fibras e das substâncias bioativas (ZERAIK et al., 2010).
2.4 Compostos Bioativos em Passiflora edulis ssp.
Os compostos bioativos em plantas têm sido estudados, devido à crescente
popularidade dos produtos naturais e de seus benefícios à saúde. Os compostos
bioativos apresentam várias propriedades terapêuticas, como por exemplo, a redução da
incidência de algumas doenças degenerativas como câncer e diabetes, a redução dos
fatores de risco de doenças cardiovasculares. Apresentam também ação antioxidante,
antialérgicos, anti-inflamatório, antimicrobiano entre outros. Pesquisas estão sendo
realizadas em todo mundo para verificar o valor nutritivo das frutas. A identificação das
características físico-químicas e a quantificação das substâncias bioativas são de
interesse para acrescentar qualidade nutricional e valor ao produto final (DE SOUZA et
al., 2012; MARTINS et al., 2011)
Compostos bioativos são normalmente originados do metabolismo
secundário das plantas. A produção desses metabólicos secundários ajudam as plantas a
aumentarem a sua capacidade global para sobreviver e superar os desafios locais,
permitindo-lhes interagir com o meio exterior. Assim, alguns metabólitos secundários
possuem efeitos sobre o sistema biológico que é considerado bioativo. Portanto uma
definição de composto bioativo nas plantas é: metabólitos secundários que provocam
efeitos farmacológicos ou toxicológicos em humanos e animais (AZMIR et al.,2013).
Dentre os compostos que possuem bioatividade destacam-se os compostos
fenólicos, um dos maiores grupos de metabólitos secundários presentes em plantas.
Sendo largamente distribuídos no reino vegetal, apresentando em sua composição
química um anel aromático podendo conter um ou mais grupos de hidroxilas. A origem
destes metabólitos secundários em vegetais é em sua grande maioria, produzida pelo seu
sistema de defesa: contra a radiação ultravioleta, ação ou agressão de patógenos.
7
Entretanto, o organismo humano não é capaz de sintetizar os compostos fenólicos,
assim a fonte destas substâncias bioativas é oriunda da dieta alimentar com vegetais
(ROCHA, 2011).
Pesquisas referentes à composição química de várias espécies de Passiflora
apontam principalmente para a presença de alcalóides e flavonóides. Este último grupo
de fenólicos é o mais importante e diferenciado dentre os produtos de origem natural
(MULLER, 2006). A seguir são apresentadas estruturas químicas encontradas em casca
de maracujá.
2.4.1 Flavonóides
Os flavonóides possuem em sua composição 15 carbonos, composto por
dois anéis aromáticos (A e B, representados na Figura 1), unidos por três átomos de
carbono, originando ou não o terceiro anel aromático, onde geralmente encontra-se o
átomo de oxigênio (anel C, representado na Figura 1) (NOVAK et al., 2008). Existe
uma vasta gama de tipos de flavonóides, há em torno de 2.000 de ocorrência natural. De
acordo com a estrutura química os flavonóides podem ser divididos em seis grupos:
flavonas, flavononas, flavonóis, isoflavonas, flavanóis e antocianinas (DAMODARAM;
PARKIN; FENNEMA, 2010). Diferenciando-se pelo nível de oxidação do anel central
C e pela posição da ligação do anel B.
Figura 1- Estrutura básica dos flavonóides.
Fonte: NOVAK et al., 2008.
8
Estudos referentes à composição química de diversas espécies de Passiflora
edulis mostram principalmente a presença de flavonóides C-glicosídeos (ZERAIK et
al., 2011). Estes compostos possuem uma grande diversidade de atividade biológica,
apresentando funções antioxidantes, efeitos anti-inflamatórios, efeito vasodilatador,
ação antialérgica, atividade contra o desenvolvimento de tumores, antihepatotóxica,
antiulcerogênica, atuação antiplaquetária, bem como ações antimicrobianas e antivirais
(YE et al.,2011).
Zucolotto et al. (2011) em seus experimentos encontraram várias
substâncias bioativas, predominando a presença de flavonóides C-glicosídeos que foram
identificados nas folhas e no pericarpo de P. edulis var. flavicarpa, P. alata, P. edulis
var. edulis e P. tripartita var. molissima. As diferentes espécies e variedades
apresentaram diferentes componentes majoritários. Os flavonóides C-glicosídeos
identificados com maior frequência foram orientina, isoorientina, vitexina e isovitexina.
Devido ao seu valor nutricional e conteúdo de flavonóides, verificações
sobre a potencialidade do maracujá como alimento funcional, ou uma fonte de
substâncias bioativas são de suma importância (ZERAIK et al., 2011). A maioria dos
flavonóides possuem propriedades biológicas e químicas em comum, tais como:
atividade antioxidante, habilidade de retirar espécies reativas de oxigênio, capacidade de
sequestrar eletrólitos, potencial para gerar peróxido de hidrogênio quando entra em
contato com alguns metais, aptidão de modular a ação de algumas enzimas celulares.
Uma alimentação rica em flavonóides pode proteger contra diversos tipos de doenças:
doenças cardiovasculares, distúrbios neurodegenerativos e alguns tipos de câncer
(DAMODARAM; PARKIN ; FENNEMA, 2010).
Alguns flavonóides possuem a capacidade de inibir a replicação viral do
agente causador da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS) (MANTAS et al.,
2000). Também foi verificado que o flavonóide Kaempferol auxilia na regulação das
células cancerosas no tratamento contra o câncer e é menos tóxico para as células
normais, em comparação com os medicamentos utilizados em quimioterapias (CHEN e
CHEN, 2013).
9
2.4.2 Pectina
Outra estrutura química bastante encontrada na casca de maracujá é a
pectina. Pesquisas apontam a grande quantidade deste componente presente no
mesocarpo do maracujá. A pectina pertence a uma família de oligossacarídeos e
polissacarídeos, com características comuns, todavia podem apresentar grande
diversidade em sua estrutura fina. A estrutura péctica primária é um homopolímero de
ácido galacturônico ligada em α-(1,4) com grau variável de grupos carboxilas metil
esterificados (Figura 2) (CANTERI, 2010).
Figura 2- Estrutura química da cadeia de pectina.
Fonte: Autor, 2015.
O que é interessante na estrutura péctica é a sua capacidade de formar gel e
essa propriedade oferece muitas oportunidades para sua aplicação. Em determinadas
condições os géis são utilizados como agente gelificante e estabilizante nas indústrias
farmacêuticas, cosméticas e por muitas indústrias de alimento principalmente na
produção de doces, geleias entre outros (PINHEIRO et al.,2008; ASSOI et al.,2014;
SEIXAS et al.,2014). Também é um substituto de gordura em cremes para sorvetes e
temperos para saladas (THIRUGNANASAMBANDHAM; SIVAKUMAR; PRAKASH,
2014).
10
A pectina também apresenta propriedades terapêuticas, por exemplo, auxilia
na diminuição do colesterol total, reduzindo as frações das lipoproteínas de baixa
densidade; auxilia na redução da glicemia; retarda o esvaziamento gástrico, que leva à
menor digestão e absorção, aumentando a sensação de saciedade, consequentemente
auxilia na perda de peso corporal e entre outros (CANTERI, 2010; SILVA et al. 2011).
Outra aplicação para a pectina é a produção de películas biodegradáveis
tornando-se uma fonte de carbono para a produção de biopolímeros. As películas
biodegradáveis não originam resíduos sólidos e podem ser ingeridas juntamente com os
alimentos, pois são degradadas pela ação de micro-organismos que estão presentes em
meio natural (NASCIMENTO; CALADO; CARVALHO, 2012).
O uso da casca de maracujá para a produção de pectina comercial é uma
solução viável para solucionar a problemática de eliminação deste resíduo, pois a
pectina extraída da casca de maracujá atende as exigências tecnológicas da pectina
exigidas no mercado (KULKARNI E VIJAYANAND, 2010).
As pectinas são industrialmente obtidas principalmente a partir de casca de
frutas cítricas e bagaço de maçã (PINHEIRO et al.,2008; BASANTA et al., 2012).
Entretanto, devido a grande demanda industrial, outras fontes estão sendo pesquisadas,
tais como ameixas japonesas (BASANTA et al., 2012), casca de palmyra (Lima et al.,
2010), casca de pitaia (THIRUGNANASAMBANDHAM; SIVAKUMAR; PRAKASH,
2014), casca de banana (EMAGA et al.,2008), casca de maracujá (PINHEIRO et al.,
2008; KULKARNI; VIJAYANAND, 2010; NASCIMENTO; CALADO; CARVALHO,
2012; SEIXAS et al., 2014), entre outras. A produção e a qualidade da pectina variam
muito e depende da fonte e das condições da extração.
2.5. Extração
O processo de extração de substâncias a partir de materiais de plantas é uma
das etapas mais importantes para a recuperação destes compostos. Diversas
metodologias de extração foram desenvolvidas nos últimos anos. Dentre as
metodologias recentes de extração podemos citar: extração assistida por ultrassom
(EAU) e a extração com solvente pressurizado (ESP) (WANG et al., 2010).
11
A EAU é um sistema que utiliza a energia acústica e solvente para promover
o processo de extração dos compostos alvos de diversas estruturas vegetais
(MINJARES-FUENTES et al., 2014). O mecanismo de extração envolve o fenômeno
de difusão, em que ocorre a formação de bolhas de cavitação que proporciona um
melhor rompimento celular através da formação de micro jatos perto da superfície
sólida da célula do vegetal, o que permite a maior penetração do solvente na matriz
celular aumentando assim a taxa de transferência de massa (CHEMAT; ZILL; KHAN,
2011). Vários fatores podem afetar o processo de extração assistida por ultrassom:
intensidade da onda sonora, tempo de exposição à frequência sonora, temperatura do
processo, granulometria da amostra entre outros (TAO et al., 2014). A EAU é utilizada
para extração de uma vasta gama de compostos alimentares, tais como pigmentos,
aromas, antioxidantes e outros compostos orgânicos e minerais oriundos de diversas
matrizes (tecido, principalmente de origem animal, alimentos e materiais de plantas)
(CHEMAT; ZILL; KHAN, 2011).
Já a ESP é uma técnica com extração automatizada que utiliza temperatura e
pressões elevadas para obter extratos em um curto intervalo de tempo. A temperatura
elevada possibilita uma melhor solubilização do composto, aumentando as taxas de
difusão e com isso tem-se o enfraquecimento das interações soluto-matriz. A alta
pressão permite trabalhar com solvente acima do seu ponto de ebulição, acelerando o
processo de extração total (JENTZER et al., 2015).
A ESP é uma técnica que oferece vantagens em relação aos métodos de
extrações tradicionais (BARROS et al., 2013). Menos solvente é utilizado durante o
processo, extrações simultâneas podem ser realizadas, combinações de solventes podem
ser programadas e tem-se uma rápida recuperação dos constituintes extraídos (DING et
al., 2011). A ESP é utilizada para muitas finalidades: extrações de pesticidas, de
compostos bioativos / nutricionais, entre outros (BARROS et al., 2013).
O processo de extração de compostos a partir de materiais de plantas é uma
das etapas mais importantes para a recuperação destas substâncias. Para tal processo
vários tipos de solventes são utilizados: metanol, etanol, acetona ou a sua combinação
com a água e acetato de etila. As ótimas condições de extração dependem do composto
bioativo em questão e do tipo de material que está sendo analisado (BIESAGA, 2011).
Solventes alcoólicos são frequentemente utilizados na extração de
compostos fenólicos oriundos de fontes naturais, eles fornecem um rendimento muito
12
elevado de extrato total. Em particular, misturas de álcoois e água revelaram-se mais
eficientes na extração de constituintes fenólicos do que um sistema contendo somente
um solvente (GIRONI; PIEMONTE, 2011). Esta mistura de solvente com a água
proporciona um aumento da polaridade do solvente, com isso maiores teores de
compostos fenólicos podem ser extraídos (SULTANA et al., 2007, WIJEKOON et al.,
2011, HUSSAIN et al., 2012).
Outro solvente frequentemente utilizado é a própria água, que em certas
condições de pressão e temperatura adquire propriedades semelhantes à de solventes
orgânicos, a exemplo do metanol (KO; CHEIGH; CHUNG, 2014). O interesse pela
água subcrítica como meio reacional tem aumentado devido: a água não ser tóxica,
custo relativamente baixo, não é um combustível, atua como solvente e parceira de
reações, ambientalmente segura, extremamente reativa e a água subcrítica pode agir
como um catalisador ácido ou básico (KO et al., 2011).
Na tabela 1 são apresentadas condições encontradas em alguns estudos
sobre extração de compostos fenólicos em diferentes tipos de cascas de alimentos,
considerando método de extração, solvente, tamanho de partícula, temperatura, tempo e
quantidade de amostra.
13
Tabela 1- Estudos realizados sobre extração de compostos fenólicos em diferentes tipos de cascas de alimentos reportados na literatura.
Material Método de
extração Solvente
Tamanho da
Partícula
(mm)
Temperatura
(°C)
Tempo
(min.)
Quantidade de
Amostra (g) Referência
Casca de
cebola,
cenoura
,limão, laranja
entre outras
Extração
Subcrítica
Metanol, água e
acetoni-trila <10
110, 130, 150,
170, 190 e 200 5, 10 e 15 1
(KO;
CHEIGH;
CHUNG,
2014)
Casca de citrus
unshiu
Extração
Subcrítica Água Milli –Q - 110-200 5-20 1
(CHEIGH;
CHUNG;
CHUNG, 2012) Casca de citrus
unshiu
Extrações
convencionais
Etanol (70%),
metanol (70%) e
água
- 79, 65, e 90
180 20
Cascas de
Uvas
Vermelhas
Ultrassom
3 ml de metanol
com
Ácido clorídrico:
99/1 ( v / v )
- 25 15 8,29 (NOVAK et al.,
2008)
Casca de
Cebola
Extração
Subcrítica Água Milli –Q <10 100-190 180 1-2
(KO et al.,
2011).
Fonte: Autor, 2015.
14
Com relação à extração de pectina, os métodos mais comumente
empregados para sua extração incluem ebulição direta e aquecimento por micro-ondas.
Novos métodos de extração de pectina estão sendo empregados, visando obter um maior
rendimento nas extrações, aumentar a qualidade da estrutura péctica extraída,
diminuição da poluição ambiental com a redução do uso de solventes utilizados durante
o processo, aumentar a eficiência de energia entre outros. As atuais técnicas são:
extração assistida por ultrassom, extração com fluido supercrítico, extração assistida por
micro-ondas e extração acelerada com solvente (GUO et al., 2012;
THIRUGNANASAMBANDHAM; SIVAKUMAR; PRAKASH, 2014).
De acordo com YAPO (2009a) o tipo de ácido exerce influência
significativa na propriedade do polímero e na gelificação da pectina isolada. Os mais
frequentemente utilizados são ácido cítrico, acético, lático, málico, tartárico, clorídrico,
nítrico, fosfórico e sulfúrico (YAPO, 2009a). O referido autor cita que a extração de
pectina com ácido cítrico é menos degradante e leva a fração de pectina isolada a uma
melhor propriedade de solidificação.
Na Tabela 2 encontram-se as condições relatadas por algumas pesquisas
sobre a extração de pectina em diferentes tipos de cascas de frutas, considerando
método de extração, solvente utilizado para extrair a pectina, quantidade de amostra,
temperatura e tempo.
15
Tabela 2 - Estudos realizados sobre extração de pectina em diferentes tipos de casca de frutas reportados na literatura.
Material Método de
Extração
Solvente usado
na extração
Quantidade de
Amostra (g)
Temperatura
(ºC)
Tempo
(min) Referência
Casca de
Maracujá
Aquecimento por
micro-ondas
Ácido tartárico,
ácido acético e
ácido nítrico
4 - 3, 6 e 9 SEIXAS et al., 2014
Casca de
Maracujá
Extração com
ácido quente Ácido cítrico - - 17-102 PINHEIRO, E. R. et al., 2008
Casca de
unshiu Por Contato Ácido cítrico 10 50, 65, e 80 120
KURITA; FUJIWARA;
YAMAZAKI, 2008
Casca de
banana
Agitador
magnético
termostática
Ácido sulfúrico
Proporção
líquido-sólido
de 01: 29, m / v
80 ou 90 60 ou
240 EMAGA et al., 2008
Casca de
Maracujá Por Contato Ácido cítrico - - 10
NASCIMENTO; CALADO;
CARVALHO, 2012
Casca de
Uva Ultrassom Ácido cítrico - 35–75 20–60
MINJARES-FUENTES et al., 2014
Casca de
Laranja
Aquecimento por
micro-ondas
Etanol, ácido
clorídrico,
hidróxido de
sódio, ácido
galacturónico
50 80 21 GUO et al., 2012
Fonte: Autor, 2015.
16
Posteriormente a etapa de extração da pectina tem-se o processo de
precipitação da estrutura péctica. Os solventes comumente utilizados são o etanol e o
metanol. A precipitação da pectina ocorre quando os solventes alcoólicos entram em
contato com o polímero de pectina, que estão eletricamente carregados devido à
extração com solventes acidulados, assim os solventes alcoólicos diminuem a constante
dielétrica do meio e consequentemente ocorre o fenômeno de precipitação da estrutura
péctica (Figura 3) (CANTERI, 2010).
Figura 3-Precipitação alcoólica de pectina.
Fonte: Autor, 2015.
Muitas pesquisas utilizam o etanol como agente precipitante (EMAGA et
al.,2008; KURITA; FUJIWARA;YAMAZAKI, 2008; PINHEIRO et al., 2008; GUO et
al.,2012; NASCIMENTO; CALADO; CARVALHO, 2012; MINJARES-FUENTES et
al., 2014; SEIXAS et al.,2014). Essa etapa tem por objetivo também eliminar sais,
açúcares e compostos solúveis em álcool, assim convertendo a pectina a sua forma de
ácido livre (YAPO, 2009b).
17
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Coleta e preparo das cascas para extração
Neste estudo foram utilizados frutos de Passiflora edulis ssp., adquiridos na
Central de Abastecimento S/A de Fortaleza - CEASA-CE. Os frutos foram
recepcionados na Embrapa Agroindústria Tropical, localizada em Fortaleza, Ceará,
onde foram encaminhados à planta piloto de processamento da unidade para serem
higienizados e despolpados. As cascas foram picadas e secas em estufa de circulação de
ar a 60ºC por 48 horas, em seguida foram moídas em moinho de facas tipo Willey,
modelo BT 602. Posteriormente, as cascas moídas foram classificadas com tamanho de
partícula menor ou igual a 50 micrometros (Figura 4). O material foi mantido em
temperatura ambiente até o início das extrações.
Figura 4- Casca de Maracujá com granulometria inferior ou igual a 50 micrometros.
Fonte: Autor, 2015.
3.2 Etapas do Estudo
O presente estudo foi dividido em três etapas. Na etapa 1 foram realizados
testes para avaliar a extração dos compostos bioativos utilizando diferentes tipos de
solventes. Os solventes utilizados nas extrações encontram-se na Tabela 3. A
metodologia utilizada para a extração dos compostos nesta etapa foi à ESP. Esta etapa
inicial foi realizada para verificar a afinidade do solvente em extrair os constituintes da
casca de maracujá. As determinações analíticas realizadas nesta etapa foram análise de
18
rendimento em massa das extrações e também cromatografia líquida e espectrometria de
massas.
Tabela 3- Solventes extratores utilizados na etapa 1.
Solventes Extratores Relação Solvente / Água (v/v)
Hexano -
Água -
Metanol 80:20
Etanol 80:20
Na etapa seguinte foram realizados testes para avaliar a influência de duas
metodologias de extração: a EAU e a ESP. E também a influência do tipo de solvente e
de sua concentração na extração dos compostos bioativos. Na Tabela 4 encontram-se as
soluções extratoras testadas.
Tabela 4- Soluções extratoras utilizadas na etapa 2.
Solventes Extratores Relação Solvente / Água (v/v)
Metanol
80:20
70:30
60:40
50:50
Etanol
80:20
70:30
60:40
50:50
As determinações analíticas realizadas nesta etapa foram análise de
rendimento em massa das extrações, açúcares totais, teor de polifenóis totais,
cromatografia líquida com detecção por arranjo de diodos e ionização por electrospray
espectrometria de massa e cromatografia líquida de alta eficiência.
Na última etapa foi realizada a extração de pectina. A extração de pectina
foi realizada sequencialmente após a extração dos compostos fenólicos. O solvente
utilizado para a extração de pectina foi uma solução aquosa de ácido cítrico 1%. E o
solvente utilizado para a precipitação da pectina foi o etanol. As determinações
19
analíticas realizadas nesta etapa foram análise de rendimento em massa das extrações e
ressonância magnética nuclear.
3.3 Obtenção dos extratos
3.3.1 Condições da extração com solvente pressurizado
A técnica de ESP foi realizada em extrator automático – modelo: ASE 350
Dionex. Inicialmente pesou-se 2g de amostra e misturou-se com 4g de terra diatomácea,
posteriormente colocou-se em uma célula de extração de aço inoxidável de volume de
66 mL. As condições de processo foram: pressão de 10342-11721 kPa; temperatura de
80ºC; rinse de 5 min; tempo de extração de 10 min em cada ciclo e purga de 200 s. As
condições das extrações foram baseadas em estudos reportados na literatura (Tabelas 1 e
2).
Todas as extrações foram realizadas sequencialmente por três vezes,
gerando três ciclos de extrações de substâncias bioativas para cada amostra, e na
sequência mais três ciclos de extração de pectina para cada amostra. A Figura 5 ilustra o
processo de extração sequencial realizada na ESP.
20
Figura 5-Fluxograma da extração com solvente pressurizado.
Fonte: Autor, 2015.
21
Todos os experimentos foram realizados em triplicata e as amostras obtidas
(Figura 6) foram evaporadas e liofilizadas em um liofilizador piloto da marca Terroni
modelo LC 1500, durante 5 dias. Os extratos liofilizados foram armazenados a -18°C.
Figura 6-Extrato obtido utilizando ESP, na proporção 70:30 de etanol/água, respectivamente.
Fonte: Autor, 2015.
3.3.2 Condições da extração assistida por ultrassom
As condições de processo da EAU foram baseadas seguindo os mesmos
parâmetros utilizados na ESP. Inicialmente pesou-se 2g de amostra; adicionou-se 40 mL
de solução extratora em cada ciclo de extração (o volume de solvente utilizado em cada
ciclo foi baseado no volume de extrato total obtido na ESP, ou seja, o volume de extrato
total na ESP foi de aproximadamente 120 mL, assim dividindo este volume em três
ciclos de extração fica 40 mL de solução extratora para cada ciclo); levou-se para um
banho de ultrassom - modelo: USC-1400, cuja frequência ultrassônica padrão do
equipamento é de 40 kHz; potência real de 135 W; volume de água utilizado no banho
de ultrassom de 0,0012 m3; densidade de potência de 112500 W/m
3; o tempo de
extração foi de 10 minutos em cada ciclo. Posteriormente as amostras foram
centrifugadas por 15 minutos a 3500 rpm, em seguida o sobrenadante foi coletado.
22
A Figura 7 ilustra o processo de extração sequencial realizada na EAU. No
qual as extrações foram realizadas sequencialmente por três vezes, gerando três ciclos
de extrações de substâncias bioativas para cada amostra, e na sequência mais três ciclos
de extração de pectina para cada amostra. Todos os experimentos foram realizados em
triplicata e as amostras obtidas foram evaporadas e liofilizadas em um liofilizador piloto
da marca Terroni modelo LC 1500, durante 5 dias. Os extratos liofilizados foram
armazenados a -18°C.
3.3.3 Condições da extração de Pectina
A extração de pectina foi realizada sequencialmente após a extração dos
compostos fenólicos, ou seja, a massa residual da extração dos compostos bioativo foi
utilizada para extrair a pectina (Figura 6 e 7). O solvente utilizado para a extração de
pectina foi uma solução aquosa de ácido cítrico 1%. As extrações foram realizadas
seguindo as mesmas condições de processo utilizadas na EAU e na ESP.
Para a etapa de precipitação foi utilizada a metodologia descrita por
(MUNHOZ; SANJINEZ-ARGANDONA; SOARES-JÚNIOR, 2010) com adaptações:
logo após a extração ácida, a amostra foi refrigerada a 4ºC por 24 horas, filtrada em
tecido de náilon de serigrafia. Ao filtrado, contendo a pectina, adicionou-se álcool
etílico (99,8%) na proporção 1:2 (v/v) de solução extratora-álcool, respectivamente.
Após 1 hora de repouso, houve precipitação da pectina, sendo esta separada por
filtração. O gel obtido foi liofilizado e obteve-se a pectina seca.
23
Figura 7- Fluxograma da extração assistida por ultrassom.
Fonte: Autor, 2015.
24
3.4 Determinações analíticas
3.4.1 Rendimento dos extratos
Os rendimentos dos extratos, contendo os compostos bioativos, foram
calculados de acordo com a Equação 1:
Rendimento do Extrato =Extrato
Massa de farinha (seca)× 100 (1)
Onde:
Extrato = massa de extrato obtido após a extração seco em gramas;
Massa farinha (seca) = Quantidade de amostra utilizada para a extração, no caso foram
utilizadas 2g de farinha de casca de maracujá.
3.4.2 Rendimento de pectina
O rendimento de pectina foi calculado de acordo com a Equação 2:
Rendimento de Pectina = Pectina extraída
Massa de farinha (seca)× 100 (2)
Onde:
Pectina extraída = massa de pectina seca em gramas obtida após a extração;
Massa farinha (seca) = Quantidade de amostra utilizada para a extração, no caso foram
utilizadas 2g de farinha de casca de maracujá.
25
3.4.3 Cromatografia líquida e espectrometria de massas
A presença de compostos bioativos foi verificada por cromatografia líquida
e espectrometria de massas no equipamento de cromatografia líquida de ultra eficiência
(Aquity) e QToF (Xevo). Foi utilizada a coluna analítica Acquity UPLC BEH C18 (1,7
µm, 2.1 mm x 150 mm) com fluxo de 0,5 mL/ min, volume de injeção de 1 µL e o
tempo total da corrida foi de 15 minutos. A fase móvel utilizada foi água / ácido
fórmico 0,1 % e acetonitrila / ácido fórmico 0,1 % (v/v).
3.4.4 Condições da análise de cromatografia líquida com detecção por arranjo de
diodos e ionização por electrospray espectrometria de massas
A cromatografia líquida com detecção por arranjo de diodos e ionização por
electrospray espectrometria de massas (LC-DAD-ESI-MS) foi utilizada como
procedimento geral para a investigação de compostos fenólicos. Foi utilizada a
metodologia de Lin e Harnly, 2007 com modificações. O instrumento LC-DAD-ESI-
MS consistiu de um HPLC Varian 250 (Varian, CA) acoplada a um detector de arranjo
de diodos (DAD) e um espectrómetro de massa 500-TI MS (Varian,). Uma coluna
Symetry C18 (Varian Inc., de Lake Forest, CA) (3 um, 250 x 2 mm) foi utilizada a uma
velocidade de fluxo de 0,4 ml / min. A temperatura do forno da coluna foi fixado em 30
oC. A fase móvel consistiu de uma combinação de A (0,1% de ácido fórmico em água) e
B (0,1% de ácido fórmico em acetonitrilo). O gradiente variou linearmente a partir de
10% a 26% de B (v / v) em 40 min, a 65% de B em 70 min, e finalmente a 100% de B
em 71 minutos e mantida a 100% de B a 75 min. O DAD foi fixado em 270 e 512 nm
em tempo real de leitura e do UV / Vis, 190-650 nm, foram recolhidos de forma
contínua. Os espectros de massas foram adquiridos em simultâneo utilizando ionização
por electrospray nos modos de ionização positivo e negativo (PI e NI) a uma tensão de
80 V de fragmentação para a gama de massas de 100-1000 amu. Foi utilizada uma
pressão do gás de secagem de 241 kPa, pressão do gás nebulizador de 275 kPa, a
temperatura do gás de secagem de 370 oC, tensões capilares de 3500 V para PI e 3500 V
para NI e tensões escudo de pulverização de 600V. O sistema LC foi acoplado ao MSD
com uma divisão de 50%.
26
3.4.5 Cromatografia líquida de alta eficiência
A cromatografia líquida de alta eficiência foi utilizada para quantificar os
compostos bioativos majoritários. O modelo do equipamento utilizado foi o 920 LC da
marca Varian, munido de bomba quaternária, auto-injetor e detector de arranjos de
diodos (DAD). Uma coluna Microsorb 100 C18 analítica de 250 mm x 4,6 mm e
diâmetro de partícula 5 µm, protegida por uma pré-coluna de mesma composição ( 4
mm x 4,6 mm) foi empregada neste estudo.
A fase móvel foi constituída por metanol grau HPLC e uma solução aquosa
de ácido fosfórico (H3PO4) 0,1% na proporção de 20:80 (v/v) em metanol; fluxo de 1,0
mL/ min e temperatura do forno de 35° C. O volume de injeção foi de 20 µL e a eluição
foi realizada no modo gradiente. A tabela 5 mostra a composição desse gradiente, que
variou de 20 a 100 % de MeOH, em 35 minutos. Para a determinação dos teores dos
compostos bioativos foram pesados aproximadamente 30 mg dos extratos das amostras
e diluídos com uma solução aquosa de MeOH/H2O (60:40) em um balão volumétrico de
5 mL, em seguida, aferido e homogeneizado. Essas soluções foram filtradas em filtros
Millipore® de membrana de teflon com poro de 0,45 µm.
Tabela 5- Gradiente do método analítico.
Tempo (min) %MeOH %H2O com H3PO4 0,1% v/v
0 20 80
5 27 73
18 47 53
24 61 39
25 100 0
28 100 0
29 20 80
35 20 80 Fonte: Autor, 2015.
O comprimento de onda utilizado na leitura das amostras foi 350 nm. A
quantificação das substâncias foi realizada por meio de uma curva padrão de quercetina.
Onde a área de cada pico foi relacionada com a concentração da curva padrão de
quercetina para posteriormente efetuar a quantificação das substâncias.
27
A curva analítica de quercetina (y = 40079x-66,745; r = 0,9975), mostrou-se
linear com valor de r > 0,99. A quantificação das substâncias foi realiza em duplicata e
expressa em mg de quercetina/ 100g de farinha de casca de maracujá.
3.4.6 Ressonância Magnética Nuclear da Pectina
Para a caracterização do polímero péctico por ressonância magnética
nuclear a pectina seca foi purificada por diálise contra água Mili-Q, por 7 dias.
Referência da membrana: D9652 - capacidade: 110mL/ft - largura: 33mm - diâmetro
interno: 21mm (quando cheio), marca: Sigma-Aldrich. O extrato de pectina purificado
foi posteriormente liofilizado (Figura 8). As amostras foram armazenadas em
temperatura ambiente.
Figura 8-Pectina purificada obtida nos experimentos.
Fonte: Autor, 2015.
Os espectros de ressonância magnética nuclear foram obtidos em um
equipamento Agilent DD2 de 600 MHz (para núcleo de 1H) e equipado com uma sonda
One Probe de 5 mm de diâmetro interno (H-F/15N-31P) de detecção inversa e gradiente
de campo no eixo “z“. As amostras foram preparadas dissolvendo-se 5 mg de pectina
purificada em 500 μL de água deuterada. Os espectros unidimensionais de 1H foram
obtidos a 80ºC, com um tempo de espera entre cada aquisição de 5 s, ganho de 20,
28
aquisição de 128 transientes em uma janela espectral de 22 ppm e 66k de número de
pontos. Para auxiliar na atribuição dos sinais, foram realizados experimentos
bidimensionais de gHSQC AD, com TSP, com 56 transientes, um tempo de espera em
cada aquisição de 1 s, janela em F1 de 200 ppm e em F2 de 16 ppm, com números de
pontos em F1 de 200 e F2 de 1974. O espectro é obtido em duas dimensões. Uma é do
hidrogênio (F2) e a outra do carbono (F1). Isso ocorre para que seja obtida a correlação
dos núcleos de 1H e
13C.
3.4.7 Polifenóis totais
Para a determinação do teor de polifenóis totais, utilizou-se a metodologia
descrita por Singleton e Rossi (1965), com adaptações. Os extratos foram previamente
diluídos com uma solução de etanol 10% em água, e alíquotas variando de 0,1 a 0,5 mL
foram usadas. As alíquotas foram adicionadas a tubos de ensaio, sendo os volumes
completados para 0,5 mL com a solução de etanol 10%. Adicionou-se 0,5 mL do
reagente Folin-Ciocalteu e, após 3 minutos, 0,5 mL de carbonato de sódio a 20%. Em
seguida completou-se para 5 mL adicionando água e os tubos foram agitados. Após 90
minutos de repouso, as absorbâncias foram lidas em espectrofotômetro a 725 nm. Como
solução padrão, usou-se ácido gálico nas concentrações de 0,001 a 0,012 mg/mL em
etanol 10%. Foi gerada uma curva a partir dos valores de absorbância e concentrações
do padrão. Os resultados foram expressos em mg de equivalente de ácido gálico por
100g de amostra.
3.4.8 Açúcares Totais
A quantificação dos açúcares totais foi realizada por RMN. Os espectros de
RMN foram obtidos em um equipamento Agilent DD2 de 599,94 MHz (para núcleo de
1H) e equipado com uma sonda One Probe de 5 mm de diâmetro interno (H-F/15N-
31P) de detecção inversa e gradiente de campo no eixo “z“. As amostras foram
preparadas em triplicata, dissolvendo-se aproximadamente 50 mg do extrato de casca
de maracujá em 500 μL de uma solução de 60:40 (v/v) de MeOD:D2O, a qual foi
29
submetida a ultrassom por 30 minutos. Para garantir a completa relaxação de todos os
núcleos amostrais, a sequência de inversão recuperação foi utilizada após a calibração
do pulso de 90°. Esta sequência consiste em um pulso de 180° que inverte o vetor
resultante da magnetização longitudinal (T1) do eixo “z” para “-z”, seguido de um
intervalo de tempo (Ʈ) onde a magnetização evolui segundo o processo de relaxação
longitudinal, com um subsequente pulso de 90° para leitura do FID (Free Induction
Decay). A amplitude dos sinais avaliados é diretamente proporcional a resultante da
magnetização no eixo “z” no intervalo Ʈ. Com isso, o valor do tempo de relaxação
longitudinal dos núcleos foi determinado e distribuído foi entre os tempos de AQ e d1.
Em seguida, os espectros unidimensionais de 1H foram adquiridos utilizando uma
sequencia de pulsos padrão, com aplicação de um único pulso de 90 graus seguido da
aquisição espectral. Assim, os espectros foram obtidos a 299K, com 16 transientes em
uma janela espectral de 16 ppm, 66k de número de pontos e um tempo de espera entre
cada aquisição de 30s. Os sinais dos 1H relativo ao TMSP-d4 em 0 ppm, foram utilizado
como padrão interno para a calibração os espectros. Posterior a quantificação
propriamente dita, o equipamento de RMN foi calibrado utilizando uma solução de
sacarose de concentração conhecida. Deste modo, após a integração do sinal de
interesse, o próprio software informa, em mM (mmol/L) a concentração do analito.
Assim, os sinais inerentes a sacarose em δ 5,42, bem como os da glicose livre em δ 5,26
e 4,69 ppm e da frutose em δ 3,93 ppm foram integrados e quantificados. A
metodologia de quantificação foi baseada nos experimentos de Alves, Silva e Ferreira,
2014 onde a concentração do componente principal (Px) pode ser calculado diretamente
utilizando um padrão de concentração conhecida (Pc), conforme a Equação 3.
Px =Ix
Ipc+
Npc
Nx+
Mx
Mpc+
mpc
m (3)
Onde:
Ix = valor da integral do sinal do analito;
Ipc = valor da integral do sinal do padrão;
Npc = número de núcleos do padrão que gerou o sinal;
30
Nx = número de núcleos do analito que gerou o sinal;
Mx = peso molecular do analito;
Mpc = peso molecular do padrão;
Mpc = massa do padrão na amostra;
m = massa do analito na amostra.
3.4.9 Análise Estatística
Os dados obtidos foram tratados por análises estatísticas onde se utilizou o
programa SigmaPlot 12.0. As análises de variâncias foram realizadas utilizando análise
de One Way ANOVA. Diferenças significativas entre as amostras foram determinadas
pelo teste t de Student ao nível de confiança de 95%.
31
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Testes utilizando diferentes tipos de solventes
4.1.1 Rendimento em massa dos extratos utilizando diferentes solventes
De acordo com a Tabela 6 pode-se verificar que as soluções de metanol e
etanol proporcionaram, respectivamente, um rendimento de extrato de 1,8 e 1,6 vezes
maior quando comparadas a extração realizada com água pura. Revelando que os
solventes alcoólicos proporcionam um significativo aumento no rendimento de extrato
quando comparado com a água pura. Os rendimentos dos extratos obtidos com água e
hexano não apresentaram diferença significativa entre si.
Tabela 6-Rendimento em massa dos extratos utilizando diferentes solventes.
Solvente Relação Solvente/Água
(v/v) Rendimento do extrato %
Solução de Metanol 80:20 29,5 ± 2,9a*
Solução de Etanol 80:20 27,8 ± 5,5a
Água - 16,4 ± 1,5b
Hexano - 12,7 ± 0,5b
*Médias com a mesma letra não diferem significativamente pelo teste de Tukey (p>0,05).
Um fato que deve ser considerado para o baixo rendimento do extrato
obtido utilizando água como solvente foi a gelatinização do extrato aquoso, na etapa de
evaporação do solvente, como mostrado na Figura 9.
Figura 9-Gelatinização do extrato aquoso da casca de maracujá.
Fonte: Autor, 2015.
32
A gelatinização do extrato ocorreu devido à água quente pressurizada ter
adquirido propriedades semelhantes à de um ácido, isso ocorreu devido ao aumento da
temperatura da água que resultou em ligações de hidrogênio enfraquecidas e,
posteriormente, tornar-se menos polar e, por conseguinte, favorecendo a extração da
pectina presente na casca de maracujá (PHATSIMO et al., 2015; RAVBER, KNEZ,
ŠKERGET, 2015). A gelatinização do extrato foi um fator preponderante para a
inviabilização da água como solvente, para a recuperação dos compostos bioativos, nas
condições testadas. Pois com a gelatinização do extrato aquoso ocorreu perda de
rendimento de extrato total, devido ao extrato em gel ficar aderido às paredes do balão
de evaporação, impossibilitando a coleta total do extrato. Outra observação a ser
considerada foi que se levou um tempo dispendioso para a evaporação do extrato devido
à gelatinização. Tornando o processo oneroso.
4.1.2 Efeito do solvente no perfil de compostos fenólicos
Nesta etapa inicial foi possível verificar o efeito de diferentes solventes
sobre a extração dos constituintes da casca de maracujá. Os resultados dos
cromatogramas apontam que uma variedade de compostos fenólicos foram extraídos
quando se utilizou misturas de solventes alcoólicos com água. Meneses et al. (2013) em
seus experimentos abordaram que a água pura não é eficiente para extrair substâncias
fenólicas e que misturas de solventes alcoólicos com água são mais eficiente para
recuperar fenóis. Esse fato ocorre porque a mistura de água com solventes alcoólicos
proporciona um aumento da polaridade do solvente extrator, com isso maiores teores de
compostos fenólicos podem ser extraídos (SULTANA et al., 2007, WIJEKOON et al.,
2011, HUSSAIN et al., 2012). No Apêndice A encontram-se os cromatogramas.
Baseado nos resultados de cromatografia e espectrometria de massas e de
rendimento total do extrato foi possível visualizar que misturas de álcoois com água
favorecem a extração de compostos fenólicos. Assim para um maior esclarecimento do
processo de extração de compostos fenólicos oriundos de casca de maracujá na etapa
seguinte foram analisadas diferentes concentrações alcoólicas visando diminuir o uso de
solventes alcoólicos e também verificar sua influência na extração dos compostos. Bem
33
como verificar a influência de outra tecnologia na recuperação das substâncias
bioativas.
4.2 Influência da concentração dos solventes e de distintas tecnologia de extração
4.2.1 Rendimentos dos extratos
Os extratos obtidos com ESP, no sistema metanol/água, nas proporções
70:30, 60:40 e 50:50 (v/v), e também no sistema etanol/água, nas proporções 70:30 e
60:40 (v/v), apresentaram rendimentos significativos comparados aos outros
tratamentos, onde os valores variaram entre 33-36%. Já na técnica de EAU, os
tratamentos que apresentaram bons rendimentos foram quando se utilizou o sistema
metanol/água, na proporção 70:30 (v/v), que apresentou um rendimento de 32% e no
sistema etanol/água, na proporção 50:50 (v/v), que apresentou um rendimentos de 30%
(Tabela 7).
Tabela 7- Rendimento dos extratos avaliando a influência da concentração dos solventes e de distintas
metodologias de extração.
Solvente Técnica
Relação
Solvente/ Água
(v/v)
Rendimento dos Extratos %
Metanol
ESP
80:20 29,55 ± 2,98abc
70:30 33,51 ± 3,04a
60:40 35,15 ± 5,16a
50:50 36,06 ± 4,86a
EAU
80:20 19,00 ± 3,57c
70:30 32,83 ± 1,31a
60:40 29,11 ± 1,86abc
50:50 28,16 ± 3,05abc
Etanol
ESP
80:20 27,82 ± 5,46abc
70:30 35,87 ± 0,26a
60:40 36,85 ± 0,50a
50:50 30,06 ± 4,81ab
EAU
80:20 21,92 ± 1,46cb
70:30 27,06 ± 1,02abc
60:40 29,27 ± 6,59abc
50:50 30,65 ± 0,69ab
* Médias com a mesma letra não diferem significativamente em relação ao sistema de solventes e
técnicas utilizadas pelo teste de Tukey (p>0,05).
34
Diante dos resultados, é possível observar que os rendimentos das extrações
foram expressivos comparados com outras extrações convencionais. Dessa forma foi
realizada uma análise para estimar a quantidade de açúcares presente em um dos
extratos.
O teor de açúcar total foi de 19g/ 100g de casca de maracujá, sendo 11g de
açúcar não redutor e 8g açúcar redutor, estes valores são do extrato obtido utilizando a
ESP, no sistema de etanol/água, na proporção 70:30 (v/v) (o espectro de RMN 1H
utilizado para a quantificação dos açúcares encontra-se no Apêndice B). Portanto dos
35% de rendimento de extrato total obtido nesta extração 19% são açúcares e 16%
representa a massa de compostos extraídos.
A figura 10 esboça um comparativo entre as técnicas de extrações (ESP e
EAU) e as relações de solvente/água. Visualiza-se na presente figura uma tendência de
aumento de rendimento com o aumento da concentração de água para os extratos
obtidos com soluções de metanol utilizando a ESP.
Uma similaridade pode ser observada entre os rendimentos de extratos
obtidos com ESP, utilizando as soluções de metanol/água, nas proporções 70:30 e 60:40
(v/v), com as soluções de etanol/água, nas proporções 70:30 e 60:40 (v/v). Indicando
que ambos os solventes alcoólicos podem ser utilizados, nestas concentrações, sem que
ocorra perda de rendimento de extrato total.
Já na EAU visualiza-se uma diferença significativa de rendimento, quando
comparamos a proporção 80:20 (v/v) com as outras proporções testadas 70:30, 60:40 e
50:50 (v/v), para ambos os solventes alcoólicos utilizados.
Visando um processo ágil e ecologicamente correto é necessário verificar as
etapas do processo como um todo. A técnica de extração que se sobressaiu dentre os
métodos testados foi a ESP, pois proporcionou níveis significativos de rendimento de
extrato total e mostrou-se como uma técnica rápida e simples. Com relação à
concentração de solvente alcoólico as relações 60:40 e 50:50 (v/v) são ideais. Pois
forneceram um bom rendimento em massa, para ambas as soluções alcoólicas testadas.
E também pela diminuição do uso de álcool, que acarreta na diminuição dos custos
operacionais e consequentemente a poluição ambiental.
35
Figura 10- Rendimentos dos extratos: comparação entre as técnicas de extração e os solventes.
Fonte: Autor, 2015.
4.2.2 Polifenóis Totais
As análises de polifenóis totais apontam que a ESP, no sistema
metanol/água, na proporção 60:40 (v/v), destacou-se dentre os demais apresentando um
teor de polifenóis de 576 mg /100g de farinha de casca de maracujá (Tabela 8). Um teor
significativo de polifenóis totais também foi observado quando se utilizou a ESP, no
sistema etanol/água, na proporção de 60:40 (v/v), onde o teor de polifenóis foi de 466
mg /100g de farinha de casca de maracujá. Os resultados indicam que a proporção de
60:40 (v/v) e a ESP proporcionaram um aumento considerável na recuperação de
polifenóis totais, quando comparado às outras proporções de álcool e a técnica de EAU.
Com relação à EAU, o sistema metanol/água, na proporção de 70:30 (v/v) apresentou
um teor de polifenóis de 420 mg/100g de farinha de casca de maracujá.
Uma observação a ser considerada é que o teor de polifénois totais não está
representando a totalidade do rendimento em massa obtido nas extrações, sugerindo que
no extrato ainda existem outras moléculas que não sejam fenólicos.
36
Tabela 8- Teor de Polifenóis Totais: análise da influência da técnica de extração no teor de polifenóis
toatis.
Solvente Técnica Relação Solvente/
Água (v/v) Polifenóis Totais**
Metanol
ESP
80:20 365,56 ± 5,61ed*
70:30 406,07 ± 16,29cd
60:40 576,57 ± 8,85a
50:50 399,61 ± 21,16cd
EAU
80:20 285,86 ± 6,79gh
70:30 420,52 ± 1,30cd
60:40 280,32 ± 1,78gh
50:50 301,42 ± 11,70g
Etanol
ESP
80:20 257,03 ± 12,97hi
70:30 366,19 ± 8,67ed
60:40 466,64 ± 35,82b
50:50 234,35 ± 6,88ij
EAU
80:20 204,97 ± 11,59j
70:30 276,91 ± 8,19gh
60:40 318,39 ± 15,02fg
50:50 348,27 ± 2,92ef
*Médias com a mesma letra não diferem significativamente em relação ao sistema de solventes e técnicas
utilizadas pelo teste de Tukey (p>0,05).
** mg equivalente ao ácido gálico/100g de amostra.
Martínez et al. (2012) em estudos sobre as propriedades antioxidantes de
resíduos da indústria de suco de manga, goiaba, abacaxi e maracujá relataram que os
teores de polifenóis variaram entre 129 mg/100 g de casca de abacaxi a 546 mg/100 g
de casca e polpa de manga, em extrações realizadas com mistura de metanol-acetona.
Para o maracujá, na mesma condição de extração, o teor de polifenóis totais foi de cerca
de 150 mg /100g de casca, polpa e sementes. Quando se utilizou o etanol, os valores de
polifenóis totais foram inferiores comparados às extrações realizadas com metanol-
acetona, com valores que variaram entre 39 mg/100 g de casca, polpa e sementes de
goiaba a 283 mg/100 g casca e polpa de manga. Para o maracujá o teor de polifenóis
totais foi aproximadamente 75 mg/100g de casca, polpa e semente de maracujá.
O mesmo foi observado no presente estudo, em que os teores de polifenóis
totais se sobressaíram, quando se usou metanol/água como solvente, na ESP. Martínez
et al. (2012) abordam que a recuperação de polifenóis a partir de material vegetal é
influenciada pela solubilidade dos compostos fenólicos no solvente utilizado para o
processo de extração.
37
Vasco, Ruales e Kamal-Eldin (2008) em estudos sobre os compostos
fenólicos totais e capacidade antioxidante de frutas do Equador, encontraram para o
suco de Passiflora edulis var. flavicarpa um teor de polifenóis de 61 mg/100g de
amostra; valor 9,44 vezes menor do que o encontrado na extração com solvente
pressurizado, na relação metanol/água, na proporção 60:40 (v/v), indicando que a casca
de maracujá possui níveis significativamente maiores de antioxidantes do que em seu
suco. Simirgiotis et al. (2013) em seus experimentos com Passiflora tripartita também
relataram que a casca do fruto apresentou maior poder antioxidante e elevado teor de
compostos fenólicos do que o suco.
Vasco, Ruales e Kamal-Eldin (2008), abordam que a espécie Passiflora
molíssima apresentou um teor de polifenóis superior (cerca de 1010 mg/100 g de
amostra) aos encontrados na espécie Passiflora edulis var. flavicarpa evidenciando que
as diferentes espécies de Passiflora possuem diferentes níveis de fenólicos totais.
O teor de fenólicos é um indicativo importante para verificar a capacidade
antioxidante da casca de maracujá, assim revelando sua aplicabilidade em inúmeros
processamentos de alimentos, evitando a oxidação dos produtos alimentícios em todas
as etapas de elaboração e armazenamento. Outra razão importante para adequação da
casca de maracujá como ingrediente alimentar é a sua origem natural, no qual os
consumidores apreciam os seus benéficos e também é ambientalmente correto (VIUDA-
MARTOS et al., 2011).
4.2.3 Perfil de compostos fenólicos
Os resultados da análise de cromatografia e espectrometria de massas
revelaram que para as distintas metodologias utilizadas nas extrações, bem como o tipo
de solvente e suas concentrações não influenciaram nas extrações das substâncias, tendo
extraído substâncias de massas moleculares semelhantes (Apêndice C).
A cromatografia líquida, com detecção por arranjo de diodos e ionização
por electrospray espectrometria de massa (LC-DAD-ESI-MS), foi utilizada para
identificar os compostos fenólicos presente na casca de maracujá. Foram selecionados
22 picos cromatográficos relevantes, que apareceram com maior frequência nos
cromatogramas (Apêndice D). Os compostos foram tentativamente identificados a partir
38
de dados das massas moleculares encontrados na literatura e subsequente comparação
com dados obtidos na análise de LC-DAD-ESI-MS.
No presente estudo foi possível identificar 10 compostos, sendo 9 já
relatados para espécies de Passiflora. Os compostos encontrados, em sua grande
maioria, foram compostos fenólicos, predominando a presença de flavonóides (Tabela
9). Os compostos correspondentes aos picos 5 e 14 (Apêndice D) apresentaram-se em
expressiva intensidade e foram identificados como sendo a luteolina-(7-O-
glicopiranosil)-8-C-glicopiranosideo (orientina-7-O-glicosideo) e isoorientina,
respectivamente. Este dois compostos foram quantificados.
Os flavonóides identificados no presente estudo também foram encontrados
por outros pesquisadores. Simirgiotis et al. (2013) encontraram dezoito compostos que
foram caracterizados como flavonóides C-glicosídeos em espécie de Passiflora
tripartita var. Mollissima. Zucolotto et al. (2011) também identificaram nas folhas e no
pericarpo de Passiflora edulis var. flavicarpa, Passiflora alata, Passiflora edulis var.
edulis e Passiflora tripartita var. molíssima flavonóides C-glicosídeos. As diferentes
espécies e variedades apresentaram diferentes componentes majoritários.
Os flavonóides encontrados no presente estudo possuem diversas
propriedades benéficas à saúde humana. Fu et al. (2014) relataram que a luteolina
apresenta potencial no uso terapêutico para hipoperfusão cerebral associado a disfunção
cognitiva e também tem mostrado efeito antioxidante e anti-inflamatório. Lee, Ku e Bae
(2014) relataram em seus experimentos que a orientina e a isoorientina podem ser
consideradas como um potencial candidato no tratamento de doenças inflamatórias de
origem vasculares. A orientina é amplamente utilizada no tratamento de resfriados,
febres altas, amidalite crônica e aguda, também é usada como antiviral antimicrobiano e
antioxidante (LI et al., 2008). Islam et al. (2014) descreveram diversos efeitos benéficos
associados a vicenina-2: antioxidantes, antihepatotóxica, antiespasmódico e melhora do
desconforto gastrointestinal. Praveena et al. (2014) evidenciaram que a vitexina,
isovitexina, orientina, isoorientina e vicenina-2 atuam como uma fonte rica em
antioxidantes. Também foi descrito que a orientina é mais eficiente na retirada de
radicais oxidativos em comparação com vitexina. A apeginina elimina radicais livres,
inibi o crescimento de várias células cancerosas como câncer de mama, cólon, pele, da
tireoide e leucemia (HALEAGRAHARA et al., 2014; ISODA et al.,2014).
39
Tabela 9- Compostos que foram encontrados no extrato obtido utilizando ESP, na proporção 60:40 de etanol/água, respectivamente.
Picos
Tempo de
Retenção
(min)
λ max
(nm) [M
-H] [M
+H] Substâncias Encontradas Referências
1 6,67 262 367 Desconhecida -
2 8,59 553 Desconhecida -
3 9,38 407 Desconhecida -
4 9,85 298 407 Desconhecida -
5 10,26 270-350 609 611 Luteolina-(7-O-glicopiranosil)-8-C-glicopiranosideo
(Orientina-7-O-glicosideo)*
(ZUCOLOTTO et al.,2011;
SIMIRGIOTIS et al., 2013)
6 11,54 285 517 Desconhecida -
7 12,47 421 Desconhecida -
8 12,64 611 Luteolina-6,8-di-C-β-D-glicopiranosideo (Leucenina II) * (ZUCOLOTTO et al.,2011;
SIMIRGIOTIS et al., 2013)
9 12,9 421 Desconhecida -
10 13,25 270-350 581 Desconhecida -
11 13,60 270-350 593 595 Apigenina-6,8-di-C-β-D-glicopiranosideo (Vicenina II)* (ZUCOLOTTO et al.,2011;
SIMIRGIOTIS et al., 2013)
12 14,23 270-350 579 581 Luteolina-(6-C pentosil)-8-C-β-D-glicopiranosideo isômero* (ZUCOLOTTO et al.,2011;
SIMIRGIOTIS et al., 2013)
13 17,28 270-350 563 565 (6-C-α-L arabinopiranosil)-8-C-β-D-glucopiranoside
(Isoschaftosideo)*
(ZUCOLOTTO et al.,2011;
SIMIRGIOTIS et al., 2013)
14 17,80 270-350 447 449 Isoorientina* (ZUCOLOTTO et al.,2011;
SIMIRGIOTIS et al., 2013)
15 19,33 265-350 449 Orientina* (ZUCOLOTTO et al.,2011;
SIMIRGIOTIS et al., 2013)
16 19,65 270 577 579 Apeginina 7-rutinoside
(ABU-REIDAH et al., 2012)
17 22,97 433 Desconhecida -
18 24,65 270-350 461 463 4′-Metoxiluteolina-8-C-β-D-glicopiranosideo* (ZUCOLOTTO et al.,2011;
SIMIRGIOTIS et al., 2013)
19 28,84 270-350 431 433 Apigenina-8-C-β-D-glicopiranosideo (Vitexina)* (ZUCOLOTTO et al.,2011;
SIMIRGIOTIS et al., 2013)
20 34,21 433 Desconhecida -
21 37,14 270-350 433 Desconhecida -
22 38,32 433 Desconhecida - *Compostos já relatados na literatura em espécies de Passiflora.
40
4.2.4 Influência da extração na concentração de flavonóides
As análises de HPLC apontam o mesmo perfil cromatográfico para todos os
tratamentos testados (Apêndice E), revelando uma expressiva quantidade das
substâncias luteolina-(7-O-glicopiranosil)-8-C-glicopiranosideo (orientina-7-O-
glicosideo) e isoorientina presente na casca de maracujá.
Os tratamentos que se destacaram apresentando os maiores teores de
luteolina-(7-O-glicopiranosil)-8-C-glicopiranosideo (orientina-7-O-glicosideo) foram:
quando se utilizou a ESP, no sistema metanol/água, na proporção 60:40 (v/v),
apresentando 171 mg de luteolina /100g de farinha de casca de maracujá. Também
quando se utilizou a ESP, no sistema etanol/água, nas proporções de 70:30 e 60:40
(v/v), apresentando respectivamente, 155 e 157 mg de luteolina/100g de farinha de
casca de maracujá. E na EAU, utilizando solução de metanol/água, na proporção 70:30
(v/v), apresentou 166 mg de luteolina/100g de farinha de casca de maracujá ( Figura
11).
Figura 11- Quantificação de luteolina-(7-O-glicopiranosil)-8-C-glicopiranosideo (orientina-7-O-
glicosideo).
Fonte: Autor, 2015.
41
O presente resultado indica que as soluções alcoólicas nas concentrações
70:30 e 60:40 (v/v) proporcionaram uma expressiva recuperação de luteolina-(7-O-
glicopiranosil)-8-C-glicopiranosideo (orientina-7-O-glicosideo) devido à polaridade do
solvente que aumentou efetivamente a solubilidade da substância.
Na Figura 12 observa-se que a concentração de isoorientina foi expressiva
nos tratamentos realizados com ESP, no sistema metanol/água, na proporção 70:30
(v/v), apresentou 256 mg de isoorientina/ 100g de farinha de casca de maracujá. E
também no sistema etanol/água, nas proporções 70:30 e 60:40 (v/v), apresentando
respectivamente, 272 e 244 mg de isoorientina/ 100g de farinha de casca de maracujá.
Já na EAU, o tratamento realizado com a relação etanol/água, na proporção 50:50 (v/v),
apresentou 256 mg de isoorientina/ 100g de farinha de casca de maracujá.
Figura 12- Quantificação de isoorientina nos tratamentos.
Fonte: Autor, 2015.
42
4.3 Extração Sequencial da Pectina
4.3.1 Rendimentos de Pectina
Avaliando o rendimento de pectina nota-se que não ocorreu diferença
significativa entre todas as condições testadas (Tabela 10). Indicando que a recuperação
de pectina não sofreu influência da extração dos compostos fenólicos (na etapa
anterior), bem como das metodologias de extração. O rendimento de pectina extraída no
presente estudo variou entre 13-18%. Estes resultados se sobressaem quando
comparados com a pesquisa de Yapo (2009a) sobre os efeitos do tipo de ácido extrator
sobre a produção e caracterização de pectina de casca de maracujá no qual o ácido
cítrico apresentou um rendimento de 5,1 g/100g de casca de maracujá, valor 3,7 vezes
menor quando comparado a da pectina extraída utilizando a massa residual do
tratamento realizado com solução de metanol na proporção 80:20 (v/v) utilizando a
ESP. Yapo (2009a) também analisou outros ácidos extratores no qual o ácido nítrico
apresentou um maior rendimento de pectina de 13,9 g/100g de amostra e o ácido
sulfúrico com 10,2 g/100g de amostra.
Seixas et al. (2014) analisaram a influência do solvente e suas
concentrações na recuperação da pectina da casca de maracujá, o melhor agente extrator
relatado foi o ácido tartárico com rendimentos entre 15,32 e 30,29%, seguido do ácido
acético cujo rendimento permaneceu entre 9,43 e 12,91 e de ácido nítrico entre 9,5 e
13,1%. Entretanto, apesar do ácido tartárico ter proporcionado um elevado rendimento,
a pectina extraída com este agente possui algumas qualidades indesejáveis, tais como:
baixa massa molar e menor teor de ácidos urônicos.
Kulkarni e Vijayanand (2010) em estudos sobre a otimização das condições
de extração de pectina, encontraram resultados próximos aos rendimentos da pectina
extraída posteriormente aos tratamentos realizados com soluções de metanol nas
proporções de 70:30 e 60:40 (v/v) utilizando a ESP e EAU, respectivamente e também
da pectina extraída posteriormente ao tratamento realizado com solução de etanol na
proporção 80:20 (v/v) utilizando a EAU apresentando um rendimento de 14,8 g/100 g
de cascas de maracujá seca quando a extração foi realizada com ácido clorídrico
aquecido, na sua melhor condição ( pH 2, relação entre a casca e o volume de solvente
43
1:30 (g/v), temperatura de 98,7ºC, tempo de extração de 60 minutos e com duas
extrações consecutivas).
Tabela 10- Rendimentos de pectina da casca de maracujá: análise da influência da metodologia na
extração.
Condição da extração dos compostos bioativos* Rendimento de
Pectina% Solvente Técnica
Relação Solvente/
Água (v/v)
Metanol
ESP
80:20 18,8 ± 1,6a**
70:30 14,9 ± 1,7a
60:40 16,0 ± 1,3a
50:50 14,1 ± 2,4a
EAU
80:20 13,7 ± 3,5a
70:30 16,0 ± 0,9a
60:40 14,2 ± 0,1a
50:50 13,7 ±1,9a
Etanol
ESP
80:20 13,8 ± 3,5a
70:30 18,7 ± 0,7a
60:40 16,5 ± 0,9a
50:50 13,2 ± 0,2a
EAU
80:20 14,4 ± 1,4a
70:30 15,9 ± 2,5a
60:40 16,0 ± 2,3a
50:50 13,6 ± 1,9a
* Origem da amostra utilizada para extrair a pectina.
** Médias com a mesma letra não diferem significativamente em relação ao sistema de solventes e
técnicas utilizadas pelo teste de Tukey (p>0,05).
4.3.2 Caracterização do polímero péctico por ressonância magnética nuclear
Espectroscopia de RMN foi utilizada a fim de se obter informações sobre a
composição da estrutura de pectina isolada da casca de maracujá. O espectro de RMN
revela-se semelhante aos estudos de Rosenbohm et al. (2003) sobre a química de
pectinas (Figuras 13 a e b).
Na Figura 13 (a) pode se verificar que a estrutura de pectina isolada da casca
de maracujá contém unidades de galactose na região entre 5,2 e 4,8 ppm. Possui
44
também protóns correspondentes ao ácido galacturônico em 5 ppm, prótons do anel H-5
COO- em 4,6 ppm e o grupo H-4 (COOMe e COO
-) em 4,5 ppm. O pico correspondente
ao H-4 (OH) apresentou-se em maior intensidade comparados aos estudos de
Rosenbohm et al. (2003). No presente estudo não se visualizou o grupo H-5 (OH) na
região de 4,1 ppm, grupo este que é relatado nos experimentos de Rosenbohm et al.
(2003). A Figura 14 mostra a localização de cada hidorgênio na estrutura pectíca.
Figura 13- Espectro de RMN 1H da pectina isolada da casca de maracujá (a). Espectro de RMN
1H da
pectina dos estudos de Rosenbohm et al., (2003) (b).
45
Figura 14- Estrutura de um fragmento de pectina.
Fonte: Autor, 2015.
Na Tabela 11 encontram-se os sinais obtidos no espectro de RMN da
pectina de maracujá. Nota-se que na região anomérica do espectro de RMN de 13
C os
seguintes sinais 71,19 (C-2); 71,44 (C-3); 81,74 (C-4) e 74,71 (C-5) apresentaram
semelhantes aos resultados do estudo de Marcon et al. (2005) onde todos os sinais
foram atribuídos ao ácido galacturônico. O espectro HSQC encontra-se no Apêndice F.
Tabela 11- Dados de RMN-13
C e RMN-1H para pectina de casca de maracujá comparada com a literatura.
Química correspondente C /H (ppm)
1 2 3 4 5
Experimental Ácido
galacturônico 103.08/4.96 71.19/3.76 71.44/3.98 81.74/4.46 74.71/4.67
Literatura*
Ácido
galacturônico 102.7/4.81 70.4/3.65 69.7/3.82 79.2/4.30 72.8/4.43
*Marcon et al. (2005).
Através dos resultados visualiza-se que o polímero de pectina isolada da
casca de maracujá basicamente possui em sua composição carboidrato (galactose) e
ácido galacturônico.
46
4.4 Considerações sobre os resultados
Diante dos resultados do presente estudo, pôde-se verificar que 100g de
farinha de casca de maracujá contém 19g de açúcares totais; 466 mg de polifenóis
totais; 157 mg de luteolina; 244 mg de isoorientina e 16g de pectina (resultados obtidos
na melhor condição de extração - sistema de etanol/água; proporção 60:40 (v/v);
extração com solvente pressurizado; exceto o resultado do teor de açúcar).
Os resultados revelam que o extrato obtido da casca de maracujá pode ser
aplicado como um ingrediente promissor em formulações de produtos nas indústrias
alimentícias, farmacêuticas, químicas e de cosméticos. Sabe-se que existe hoje uma
tendência mundial no desenvolvimento de produtos com ingredientes benefícios à
saúde, devido à busca dos consumidores por alimentos funcionais. Assim, a casca de
maracujá mostra-se como um insumo vantajoso, pois se identificou compostos com
diversos efeitos biológicos importantes já relatados (ação antioxidante, anti-
inflamatória, antiviral e entre outros), e também por acrescentar qualidade nutricional e
valor ao produto final.
Entretanto, dependendo do destino que a indústria deseja utilizar o extrato,
estudos devem ser realizados com a finalidade de verificar a necessidades de etapas
adicionais no fluxograma de produção. Pois, sabe-se que cada processo industrial possui
suas peculiaridades.
Por exemplo, se uma indústria de sucos deseja utilizar o extrato para aplicar
como um antioxidante em seus produtos não é necessário acrescentar etapas de
purificação do extrato, ou seja, o extrato puro pode ser adicionado ao produto.
Entretanto, se o produto for destinado a pessoas com diabetes, a remoção do açúcar
presente no extrato será necessária.
Outra razão relevante para a remoção do açúcar é a estabilidade do extrato,
pois devido à presença do açúcar, que é higroscópico, o extrato liofilizado ao entrar em
contato com a umidade do ar e também devido à mudança de temperatura, poderá
desenvolver caking, assim afetando a qualidade do produto desidratado. Podemos citar
também que o açúcar presente no extrato pode ser uma fonte de carbono para a
proliferação de micro-organismos, que por sua vez podem deteriorar o extrato e também
ocasionar doenças nos consumidores.
47
Estudos devem ser realizados para verificar a melhor forma de remoção dos
açúcares (adsorção ou fermentação), uma vez que esta etapa poderá influenciar
significativamente na recuperação das outras moléculas, visando um processo
sequencial.
Já para uma indústria farmacêutica, que deseja fabricar um medicamento a
base de uma substância bioativa pura, por exemplo, a isoorientina, as etapas de
separação e purificação do extrato podem ser necessárias, pois o extrato vegetal obtido é
uma mistura de compostos. Assim para a obtenção de somente um composto isolado as
etapas de separação e purificação serão necessárias. Entretanto se o objetivo da indústria
for produzir um fármaco rico em flavonóides o extrato pode ser utilizado puro. Assim,
dependendo do interesse industrial, o fluxograma de produção deve ser estudado, a fim
de verificar a necessidade ou não de etapas adicionais ao processo.
A casca de maracujá pode ser utilizada ainda em indústrias químicas, como
por exemplo, em processos fermentativos. Pois, a casca de maracujá apresentou
significativo teor de açúcares, sendo assim uma fonte de carbono alternativa para a
produção de bioetanol. Em indústrias cosméticas, o extrato pode ser aplicado na
produção de sabonetes, cremes faciais, loções de rejuvenescimento e entre outros.
Já a pectina extraída pode ser utilizada em formulações de alimentos, por
exemplo, no preparo de geléias, doces de frutas, produtos de confeitaria, sucos de frutas
e entre outros. Também pode ser utilizada como agente espessante em sopas
instantâneas; texturizante em barra de cereais; emulsificantes e ou estabilizantes. A
pectina ainda pode ser utilizada na produção de produtos não alimentícios, incluído
filmes biodegradáveis, adesivos, espumas, plastificantes, agentes de superfície para
produtos hospitalares, materiais para implantes biomédicos e sistemas de liberação de
fármacos (CANTERI, 2010).
Uma informação relevante obtida no presente trabalho é que o processo
pode ser realizado sequencialmente, ou seja, extrações consecutivas podem ser
realizadas visando extrair moléculas alvos diferentes, sem que ocorra perda de
rendimento.
48
5. CONCLUSÃO
Com o presente estudo pode-se concluir que misturas de álcoois com água
favorecem a extração de compostos bioativos da casca de maracujá.
A técnica de extração que se destacou foi a ESP, pois apresentou uma
metodologia rápida e simples. O solvente mais indicado é o etanol, pois possui menor
toxicidade ao consumidor.
O sistema etanol/água, na proporção 60:40 (v/v) revelou-se promissora, pois
proporcionou um rendimento de extrato total de 36%, um teor de antioxidante de 466
mg/100g de casca de maracujá, um teor de 157 mg de luteolina/100g de amostra e 244
mg de isoorientina/100g de amostra.
A casca de maracujá é um resíduo agroindustrial que deve ser valorizado,
pois se identificou uma variedade de compostos bioativos que podem ser utilizados por
uma ampla gama de indústrias (farmacêuticas, cosméticas, químicas, alimentos entre
outras).
Os resultados de pectina mostram que está substância pode ser recuperada
sem sofre interferência da extração dos fenólicos, assim a extração de pectina pode ser
realizada posteriormente a extração dos bioativos sem sofrer perdas de rendimento de
extrato.
De acordo com a caracterização do polímero péctico a estrutura de pectina
obtida da casca de maracujá é um composto formado principalmente por galactose e
ácido galacturônico.
49
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58
APÊNDICE A- Perfil cromatográfico da extração realizada com ESP utilizando água
(a) e metanol-água com solvente (b).
Fonte: Autor, 2015.
a
b
59
APÊNDICE B- Espectro de RMN 1H usado para a determinação dos açúcares.
60
APÊNDICE C- Perfil cromatográfico da extração realizada com EAU na proporção de
80:90 de Metanol: água, respectivamente (a). Perfil cromatográfico da extração
realizada com ESP na proporção de 80:90 de etanol: água, respectivamente (b).
Fonte: Autor, 2015.
a
b
61
APÊNDICE D- Região referente aos picos identificados.
Fonte: Autor, 2015.
62
APÊNDICE E: Perfis cromatográficos da análise de HPLC: (a) Perfil cromatográfico
do tratamento com solução de metanol (80:20)-ESP. (b) Perfil cromatográfico do
tratamento com solução de etanol (80:20)-EAU.
Fonte: Autor, 2015.
63
APÊNDICE F: Espectro HSQC da pectina.
Fonte: Autor, 2015.
